CN104826164B - 能在体实现自我重塑的生物人工血管 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种能在体实现自我重塑的生物人工血管，采用如下的方法制备：1、用电纺丝或者3D打印的方法将天然生物材料或者人工合成材料编织成血管支架，或采用去除抗原后的去细胞化同种或异种血管；2、将Klotho蛋白或者GDNF表征到上述血管支架上。本发明获得的生物人工血管具有优良的力学性能、抗凝血性能和生物可降解性。可构建任意口径人工生物血管，在体内诱导循环血内皮祖细胞归巢的同时，能将血管转换为持续释放腺苷的生物反应器，优化局部微环境，实现人工血管的自我重塑，最终形成一个完全自我替代的成熟血管。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术，具体是关于一种能在体实现自我重塑的生物人工血管。
背景技术
目前临床上应用的人工血管多为涤纶制品和聚四氟乙烯（Polytetrafluoroethylene，PTFE）等不可降解的聚合物材料。对于大血管的置换，这些人工血管在一定程度上满足临床需要。然而对于直径小于6mm的小血管的置换，这种材料的人工血管主要通过在内表面涂层抗凝或者抑制血栓形成的药物，可以在早期实现较好的通畅效果，然而在移植后期药物逐渐释放完毕后，很容易形成血栓最终导致血管的移植的失败。随着冠心病和糖尿病发病年龄的提前，进行血管置换的人群也逐渐趋于年轻化，要求移植的人工血管能长时程甚至终生的在体发挥功能，在数十年中不发生血栓和内膜增生等不良事件。因此如何实现生物人工血管的体内重塑和自我完全替代是目前研究的主要方向。
内皮细胞具有抗血栓形成、抑制血小板聚集和平滑肌的病理性增生等重要作用，被认为是最终解决血管血栓形成及内膜增生的最有效方法。内皮祖细胞是内皮细胞的前体细胞，可以通过旁分泌促血管生成因子或者分化形成内皮细胞来促进组织工程血管的快速内皮化。因此内皮祖细胞捕获的生物人工血管是目前的发展趋势，被认为是第三代生物人工血管。科学家通过表征内皮祖细胞的特异性抗体促进组织工程血管的快速内皮化，在移植的早期取得了较好的通畅效果，然而在移植一个月时却出现了不同程度的内膜增生。究其原因，主要是组织工程血管局部的微环境不适合细胞的生存和功能的发挥。
孔隙率和孔径与组织工程材料内的细胞的存活、增殖和分化紧密相关。较大的孔径和孔隙率有利于材料内细胞与外界进行营养和氧气的交换，文章报道形成血管维持充足的能量代谢物质交换的材料最小孔径大约为30 到40 um。然而较大的孔隙率和孔径降低生物材料的结构稳定性。组织工程血管移植后需要经受血液很大的流体剪切力和冲刷力，不稳定的材料结构容易引起生物人工血管的堵塞、变形甚至破裂，造成很严重的后果。有人认为组织工程血管内层的孔径应该小于24um，低于维持物质交换的最小孔径。因此组织工程血管局部的微环境在外层毛细血管长入前是一个严重缺氧和营养匮乏的微环境，不利于生物人工血管的重塑。如何优化局部微环境和实现生物人工血管的重塑是目前研究的难题，目前还未见能实现在体自我重塑的生物人工血管。
腺苷是在体内普遍存在的一种内源性核苷，被认为是一种十分有效的微环境优化分子。腺苷主要通过两个途径发挥生物学功能：第一直接进入细胞内，通过腺苷激酶途径调控能量代谢，促进内皮祖细胞动员和保护细胞抵御外界的损伤；第二是通过与细胞表面的四个G蛋白偶联受体结合，激活下游的信号通路发挥生物学功能，其中A2a受体的效应最为显著，具有调控炎症反应和促进内皮祖细胞归巢的功能。构建一个能稳定释放内源性腺苷的组织工程血管能达到优化局部微环境和实现生物人工血管重塑的目的。Klotho蛋白是一种抗衰老蛋白，具有保护细胞和调控磷代谢的功能；胶质细胞源性的神经营养因子（Glialcell-line derived neurotrophic factor，GDNF）特异性保护多巴胺能神经元，促进损伤神经修复的功能。
发明内容
本发明的目的就在于克服上述现有技术中存在的不足，提供一种具有良好力学性能、能实现自我在体重塑的生物人工血管，能将生物人工血管转换为一个能持续释放腺苷的生物反应器，有效的优化局部微环境和促进其快速内皮化，用于临床上修复血管缺损或血管搭桥。
为实现本发明的上述目的而采用的技术方案是这样的，即一种能自我优化局部微环境和促进人工血管快速内皮化最终实现在体自我重塑的生物人工血管，由如下方法制备：
（1）血管支架复合材料的获取：用异种或同种血管或皮肤组织提取生物胶原，然后去除生物胶原中的抗原，获得良好生物相容性的生物胶原；
（2）编织血管：a、用电纺丝纺织方法将步骤（1）获得的生物胶原和弹性材料复合，编织成血管支架；或b、采用3D打印的方法，用步骤（1）获得的生物胶原、壳聚糖、粘连蛋白及弹性材料作为打印的基础材料，打印出血管支架；或c、采用去除抗原后的同种或异种脱细胞血管，作为血管支架；
（3）血管的修饰：选用Klotho蛋白和/或GDNF修饰所述血管支架，得到所需生物人工血管。①采用电纺丝纺织方法直接将Klotho蛋白和/或GDNF编织到血管支架中，获得生物人工血管；或②将Klotho蛋白和/或GDNF构建纳米缓释颗粒，采用化学交联或者物理方法涂层到血管支架内表面，获得生物人工血管；或③将Klotho蛋白和/或GDNF加入3D打印的基础材料中，打印获得生物人工血管；
本发明获取的人源性生物胶原已去除抗原性，可控降解，可原位成型。具有良好的生物相容性，较好的力学性能。胶原是血管细胞外基质主要成分，并可在生理条件下自组装形成凝胶，以及可以与壳聚糖形成水凝胶。同时胶原的三维空间结构具有较好的强度，是组成血管的重要成分。用于构建生物人工血管的胶原，在保持三螺旋结构的同时去除其抗原点—尾肽。这种材料为天然生物材料，来源广泛，无毒性，降解产物可被机体吸收，不对机体产生危害，制作简便，易于塑形，并在功能适应性、组织相容性、理化性能、生物降解性、造价等方面优于人工合成材料。
本发明制备的生物人工血管具有良好的可降解性和生物相容性，进一步复合药物Klotho蛋白或者GDNF等后，在捕获内皮祖细胞的同时，将人工血管转换为持续释放腺苷的生物反应器，达到实现自我重塑的目的。
本发明还具有以下优点：一方面药物自身可以捕获循环中的内皮祖细胞实现早期快速内皮化，同时还能诱导浸润的单核细胞或者归巢的内皮祖细胞转化成为持续释放腺苷的细胞生物反应器，达到优化局部微环境和血管逐步重塑的目的；另一方面，采用基因预调控、电纺丝纺织或者3D打印的方法将药物均匀的涂层到整个血管，能实现人工血管的缓释，逐步的诱导人工血管在体的重塑和自我替代。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的内容作进一步说明。本发明中无特殊说明的材料和试剂均为市购产品。本发明中无特殊说明的方法和技术均为本领域常规使用的方法和技术。
1．血管支复合架材料的获取：
1.1 无菌条件下取新鲜异种或同种血管或皮肤组织，去除其上所附软组织，无菌PBS冲洗，去除血栓凝块，无菌包装放入-80℃ 保存。复温于37℃用0.1 mol/L PMSF溶液处理1-3小时，抗生素低渗及高渗缓冲液分别处理3--5小时，每1小时换液一次；组织以其质量4倍体积的2-6%醋酸溶液于33℃-37℃浸泡1-3h,漂洗后加入0.01-0.07%(w/w)脂肪酶于起始pH8.5、37℃-40℃下水解1-5h,无菌蒸馏水浸洗干净，在保持37℃、5%CO2用0.03%--0.2%(w/w)已活化的弹性蛋白酶处理6--24小时，每8小时换液一次，无菌抗生素蒸馏水浸洗干净。得到血管胶原纤维。加入按重量百分比0.05%--0.3%胃蛋白酶于起始pH8.0、25℃-40℃下水解16--24小时，加入0.08%--0.18%胰蛋白酶，保温33-37℃ 2-6小时，降温至4℃，加0.01-0.8%双氧水使酶失活。透析纯化，得到生物相容性良好的生物胶原，4℃冷藏保存，备用。
1.2编织血管：
1）将生物胶原和弹性材料按重量百分比70％：30％用电纺丝纺织方法编织成不低于1mm口径的、能达到不同力学特性的血管支架，所述弹性材料为弹性蛋白和丝素蛋白按重量百分比为35％：65％。
或2）将生物胶原、弹性材料、壳聚糖及粘连蛋白按照重量百分比60%-80%：18%-38%：1.2%-5%:0.8%-2%为按照制成3D打印的基础材料，根据设计好图形，打印出血管支架。
或3）采用去除抗原后的同种或异种血管基质材料，作为血管支架。
2. 血管的修饰：基于腺苷生成和降解的相关通路，筛选出相关蛋白或者小分子；利用PubMed网站的大数据进一步筛选出能捕获内皮祖细胞的蛋白或者小分子，如Klotho蛋白和GDNF等；细胞学进一步验证筛选出的药物，采用液相色谱的方法检测腺苷的含量，实验结果显示Klotho蛋白可以改变浸润的单核细胞对磷离子的应答模式，将组织工程血管材料内部升高的磷离子转化为内源性腺苷；而GDNF则可以调控细胞自噬促进内源性腺苷的释放。因此本发明将Klotho蛋白和GDNF等药物应用于组织工程血管的构建，使其成为持续释放腺苷的生物反应器，实现在体的自我重塑。之后采用下面的方法进行修饰：①采用电纺丝纺织方法直接将Klotho蛋白和/或GDNF编织到血管支架中，获得生物人工血管；或②将Klotho蛋白和/或GDNF构建纳米缓释颗粒，采用化学交联或者物理方法涂层到血管支架内表面，获得生物人工血管；或③将Klotho蛋白和/或GDNF加入3D打印的基础材料中，打印获得生物人工血管。
3、动物实验
将制备好的组织工程血管分别移植到大鼠、犬和小型猪颈动脉，分别在第7天、第14天、一个月和六个月等不同时间点取材，取材前用多普勒超声检测血流量。HE染色和电镜检测血管内皮化情况，免疫荧光检测内皮细胞和平滑肌的长入。
下面举例进行说明，但本发明的应用不仅在于此。
实施例1.一种能在体调控磷代谢转化为腺苷实现重构的Klotho蛋白修饰生物人工血管制备，按上述步骤1方法制备血管基质材料，按步骤2进行表面修饰后，进行动物实验。
获得的生物人工血管移植到动物体内，14天经光镜及电镜检测，可见血管腔内皮细胞形态正常，密集排列，沿血管长轴分布，说明在上述条件下，血管成功形成了自体的内皮化，液相色谱检测生物人工血管能持续释放腺苷分子。1个月后进行HE染色、免疫荧光染色和电镜检测，可见血管内皮化良好，无显著的内膜增生和血栓形成。6个月后HE染色、免疫荧光染色和电镜检测，可见已经实现了血管的完全自我重塑。
实施例 2. 一种能在体增强自噬诱导腺苷释放的GDNF修饰生物人工血管制备，按上述步骤1方法制备血管基质材料，按步骤2进行表面修饰后，进行动物实验。
获得的生物人工血管移植到动物体内，14天经光镜及电镜检测，可见血管腔内皮细胞形态正常，密集排列，沿血管长轴分布，说明在上述条件下，血管成功形成了自体的内皮化，液相色谱检测生物人工血管能持续释放腺苷分子。1个月后进行HE染色、免疫荧光染色和电镜检测，可见血管内皮化良好，无显著的内膜增生和血栓形成。6个月后HE染色、免疫荧光染色和电镜检测，可见已经实现了血管的完全自我重塑。
Claims (5)
1.能在体实现自我重塑的生物人工血管，其特征在于，采用如下方法制备：
（1）血管支架复合材料的获取：用异种或同种血管或皮肤组织提取生物胶原，然后去除生物胶原中的抗原，获得良好生物相容性的生物胶原；
（2）编织血管：a、用电纺丝纺织方法将步骤（1）获得的生物胶原和弹性材料复合，编织成血管支架；或b、采用3D打印的方法，用步骤（1）获得的生物胶原、壳聚糖、粘连蛋白及弹性材料作为打印的基础材料，打印出血管支架；
（3）血管的修饰：选用Klotho蛋白和/或GDNF修饰步骤（2）所述血管支架，得到所需生物人工血管；
所述血管修饰为：①采用电纺丝纺织方法直接将Klotho蛋白和/或GDNF编织到血管支架中，获得生物人工血管；或②将Klotho蛋白和/或GDNF构建纳米缓释颗粒，采用化学交联或者物理方法涂层到血管支架内表面，获得生物人工血管。
2.能在体实现自我重塑的生物人工血管，其特征在于，采用如下方法制备：
（1）采用去除抗原后的同种或异种脱细胞血管，作为血管支架；
（2）血管的修饰：选用Klotho蛋白和/或GDNF修饰步骤（1）所述血管支架，得到所需生物人工血管；所述血管修饰为：①采用电纺丝纺织方法直接将Klotho蛋白和/或GDNF编织到血管支架中，获得生物人工血管；或②将Klotho蛋白和/或GDNF构建纳米缓释颗粒，采用化学交联或者物理方法涂层到血管支架内表面，获得生物人工血管。
3.能在体实现自我重塑的生物人工血管，其特征在于，采用如下方法制备：（1）血管支架复合材料的获取：用异种或同种血管或皮肤组织提取生物胶原，然后去除生物胶原中的抗原，获得良好生物相容性的生物胶原；
（2）编织血管：采用3D打印的方法，用步骤（1）获得的生物胶原、壳聚糖、粘连蛋白及弹性材料作为打印的基础材料，将Klotho蛋白和/或GDNF加入3D打印的基础材料中，打印获得生物人工血管。
4.根据权利要求1所述能在体实现自我重塑的生物人工血管，其特征在于：所述弹性材料包括弹性蛋白和丝素蛋白，其重量百分比为35%：65%。
5.根据权利要求4所述能在体实现自我重塑的生物人工血管，其特征在于：所述生物胶原和弹性材料按重量百分比70%：30%进行配制。
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