CN106552294B - 一种用于心脏修复的生物补片材料 - Google Patents
一种用于心脏修复的生物补片材料 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种生物补片材料，具体地，涉及一种用于促进心脏功能修复的生物补片材料。所述生物补片材料包括(i)至少二个复合在一起的多孔结构层，所述的多孔结构层包括用于防止修复细胞流失的第一结构层和用于负载(或容纳)用于修复心脏的修复细胞的第二结构层，其中所述的修复细胞选自下组：心脏干细胞、心脏祖(前体)细胞、或其组合(其来源包括：胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、心脏的组织干细胞、骨髓和外周血等)；和(ii)负载于所述第二结构层的所述的修复细胞，并且至少一部分或全部所述的修复细胞位于所述第二结构层的空隙中。发明的生物补片材料可负载修复细胞的生长，并具有非常良好的生物相容性和机械强度。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学材料，具体地，涉及一种用于心脏修复的生物补片材料。
背景技术
随着经济水平的不断提高和社会老龄化程度的加深，心血管疾病的发病率不断攀升。心力衰竭是各种心血管疾病发展到终末期的临床综合症状，也是心血管疾病导致死亡的主要原因，号称心血管领域的“头号杀手”。目前，全世界心力衰竭患者约有1.17亿人，其中美洲约1462.1万人，欧洲约1558.6万人，亚洲约8636.4万人。我国约有2997.1万心力衰竭患者，占全世界总数的25.6％。由此而产生的医疗费用逐年增加，社会和家庭负担严重。
虽然传统的药物治疗、介入治疗或外科搭桥手术和心衰晚期使用的器械辅助装置等可以重建血运、减少进一步的疤痕形成和不利的心室重构，并增加未受损心肌的功能，但不能挽救已经死亡的心肌细胞、无法使“死的”疤痕组织转变为有功能的相关细胞，无法逆转伴随而来的心力衰竭。心脏移植是治疗终末期心力衰竭的有效手段，但由于供体的严重短缺无法在临床上广泛应用，而干细胞移植疗法由于可促进梗死局部心肌和血管再生，成为目前最有前景的治疗手段之一。
目前，干细胞治疗心肌梗死后(缺血性)心力衰竭的临床试验多采用经导管心肌内注射细胞的方法，这种方法的局限性在于细胞在心肌内的滞留率极低。除细胞注射方法之外，开发促进心脏功能修复的相关生物材料已经成为近年来业界的研究热点。
然而，目前的促进心脏功能修复的相关生物材料又有诸多问题，如生物相容性差、不能随意制成病理部位相应形态、对细胞组织有毒害、不利于细胞的生长与分化、有免疫原性、不能阻滞炎症细胞的入侵及分解、机械强度不高等等。
因此，本领域迫切需要开发一种生物相容性好、对细胞组织无毒、机械强度高的生物补片材料。
发明内容
本发明的目的是提供一种生物相容性好、对细胞组织无毒、机械强度高的生物补片材料。
本发明的第一方面提供了一种用于心脏修复的生物补片材料，所述补片材料的形状与需修复的心脏部位的形状相匹配，并且所述补片材料包括：
(i)至少二个复合在一起的多孔结构层，所述的多孔结构层包括用于防止修复细胞流失的第一结构层和用于负载(或容纳)用于修复心脏的修复细胞的第二结构层，其中所述的修复细胞选自下组：心脏干细胞、心脏祖(前体)细胞、或其组合(其来源包括：胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、心脏的组织干细胞、骨髓和外周血等)；
(i i)负载于所述第二结构层的所述的修复细胞，并且至少一部分或全部所述的修复细胞位于所述第二结构层的空隙中。
在另一优选例中，所述第一结构层还可防止炎症细胞渗透。
在另一优选例中，所述第一结构层具有第一孔隙度A1；所述第二结构层具有第二孔隙度A2，并且A2大于A1。
在另一优选例中，所述的第二孔隙度A2与第一孔隙度A1之比A2/A1≥5，较佳地≥8，更佳地，≥10。
在另一优选例中，所述的第一孔隙度A1为1-10μm,较佳地为2-6μm。
在另一优选例中，所述的第二孔隙度A2为20-200μm，更佳地为25-100μm。
在另一优选例中，所述的第一结构层的厚度为0.01-0.05cm cm，较佳地为0.01-0.02cm。
在另一优选例中，所述的第二结构层的厚度为0.05-0.5cm，较佳地，0.1-0.25cm。
在另一优选例中，所述的生物补片材料的主表面的面积为10-80cm2，较佳地为25－55cm2。
在另一优选例中，所述第二结构层面向需修复的心脏部位(或组织)。
在另一优选例中，所述的第二结构层朝向心脏表面，而所述的第一结构层在第二结构层外侧。
在另一优选例中，所述需修复的心脏部位至少包括心脏缺血区。
在另一优选例中，所述修复细胞的负载量为1×102-1×105个/mm3，较佳地，5×102-5×104个/mm3,更佳地，1×103-1×104个/mm3，按所述第二结构层的体积计。
在另一优选例中，所述修复细胞来源于人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述的第一结构层和第二结构层的材质是相同的或不同的，优选相同的。
在另一优选例中，所述生物补片材料的材质为生物可降解且生物相容的材料。
在另一优选例中，所述的第一结构层为弹性蛋白基的(elastin-based)。
在另一优选例中，所述的第二结构层为弹性蛋白基的。
在另一优选例中，所述多孔结构层均为弹性蛋白基的结构层。
在另一优选例中，所述的生物补片材料还可含有其他结构层。
在另一优选例中，所述的生物补片材料还包括位于所述第一结构层和所述第二结构层之间的中间结构层。
在另一优选例中，所述的多孔结构层由所述的第一结构层和所述的第二结构层构成。
在另一优选例中，所述的多孔结构层含有交联在一起的以下组分：
(a)弹性蛋白原、弹性蛋白，或其片段；和
(b)粘多糖。
在另一优选例中，所述的多孔结构层由交联在一起的上述组分(a)和组分(b)构成。
在另一优选例中，在所述多孔结构层中，所述弹性蛋白为交联型弹性蛋白，即通过交联剂进行交联反应而形成的交联产物。
在另一优选例中，所述弹性蛋白为动物体中提取的弹性蛋白及弹性蛋白片段，选自下组：弹性蛋白原(Tropoelastin)、α-弹性蛋白(α-elastin)、或其组合。
在另一优选例中，所述粘多糖选自下组：肝素、硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素或其组合。
在另一优选例中，所述的交联剂为赖氨酸交联剂。
在另一优选例中，所述的赖氨酸交联剂选自下组：Bis(sulfosuccinimidyl)suberate sodium salt(BS3)、戊二醛、4,4′-二异氰酸酯二环己基甲烷(HMDI)或其组合。
在另一优选例中，所述的第一多孔结构层和/或第二多孔结构层中，按相应结构层的体积计，各组分的含量如下：
弹性蛋白的含量为5-200mg/cm3，较佳地，1-150mg/cm3，更佳地，50-100mg/cm3；
粘多糖的含量为0.1-100mg/cm3，较佳地，1-50mg/cm3，更佳地，10mg/cm3。
在另一优选例中，所述的生物补片材料具有以下一种或多种特性：
(i)支持所述修复细胞的生长和分化为心脏细胞(包括心肌细胞、血管平滑肌细胞、血管内皮细胞、心脏成纤维细胞等)；
(i i)机械性能；拉伸率≥1.1％。
在另一优选例中，所述的拉伸率指将所述生物补片材料拉伸至发生无法恢复时(或发生破裂时)的拉伸长度与原长度之比。
在另一优选例中，所述的生物补片材料是用本发明第三方面所述的方法制备的。
本发明第二方面提供了一种用于心脏修复的试剂盒，所述的试剂盒包括：
一容器，
以及位于所述容器中的如本发明第一方面所述的生物补片材料。
本发明第三方面提供了如本发明第一方面所述的生物补片材料的制备方法，包括步骤：
(a)提供一多孔结构件，所述的多孔结构件包括至少二个复合在一起的多孔结构层，所述的多孔结构层包括用于防止修复细胞流失的第一结构层和用于负载(或容纳)用于修复心脏的修复细胞的第二结构层；和
(b)将所述的修复细胞接种于所述第二结构层，形成接种有修复细胞的多孔结构件，其中所述的修复细胞选自下组：心脏干细胞、心脏祖(前体)细胞、或其组合(其来源包括：胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、心脏的组织干细胞、骨髓和外周血等)；
(c)任选地，对上一步骤中所述接种有修复细胞的多孔结构件进行培养处理，使得接种的修复细胞进行增殖和传代，从而获得经培养处理的多孔结构件；
其中，所述接种有修复细胞的多孔结构件或经培养处理的多孔结构件即为本发明第一方面所述的生物补片材料。
在另一优选例中，所述生物补片材料还可以用如下方法制备：
(i)提供具有第一孔隙度A1的第一结构层(弹性蛋白基的结构层)和具有第二孔隙度A2的第二结构层(弹性蛋白基的结构层)；以及
(i i)将所述的第一结构层(弹性蛋白基的结构层)和第二结构层(弹性蛋白基的结构层)与任选的其他结构层(如中间结构层)复合在一起，形成未接种修复细胞的多孔结构件；
(i i i)将所述修复细胞接种于上一步骤得到的多孔结构件，从而形成本发明第一方面所述的生物补片材料。
在另一优选例中，所述方法还包括：在步骤(a)之前的制备所述多孔结构件的步骤：
(a1)提供一混合物，所述混合物含有弹性蛋白、赖氨酸交联剂、粘多糖和惰性溶剂(如磷酸盐缓冲液)；
(a2)对上一步骤所述的混合物进行压模成型，形成具有所述第一多孔结构层和第二多孔结构层的多孔结构件。
在另一优选例中，所述弹性蛋白与赖氨酸交联剂的重量比为50-200：3-10，较佳地，80-150:4-8，更佳地，100:5.73。
在另一优选例中，所述步骤(a2)的成型温度为20-50℃，较佳地为30-40℃(如37±2℃)。
在另一优选例中，所述步骤(a2)的成型时间为3-48小时，较佳地6-20h。
在另一优选例中，所述混合物的pH值为7.2－7.4。
在另一优选例中，所述混合物中含有磷酸盐缓冲组分；
在另一优选例中，在步骤(c)中，所述培养处理在培养箱中进行。
在另一优选例中，所述步骤(b)中，所述修复细胞的接种量为1×102-1×105个/mm3，较佳地，5×102-5×104个/mm3,更佳地，1×103-1×104个/mm3，按第二多孔结构层的体积计。
本发明第四方面提供了一种如本发明第一方面所述的生物补片材料的用途，用于制备治疗心脏疾病的医用补片。
在另一优选例中，所述的心脏疾病：缺血性心力衰竭，包括冠心病、心肌梗死后心力衰竭等。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了成型弹性蛋白基质的外观。
图2显示了扫描电镜下多孔结构层的第二结构层的孔隙度。
图3显示了扫描电镜下多孔结构层的第一结构层的孔隙度。
图4显示了扫描电镜下多孔结构层两层结构的孔隙度的区别。
图5显示了接种心脏干/祖细胞的补片材料固定切片后，细胞渗透入补片第二层结构的空隙中的情况。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究发现，将弹性蛋白、赖氨酸交联剂、粘多糖等混合、压模、成型，形成弹性类蛋白基(elastin-based)的基质层，之后通过特定形态模具和温度来控制交联剂和蛋白反应合成多层的生物补片材料结构，该生物补片材料可负载心脏干细胞、心脏祖(前体)细胞、或其组合(其来源包括：胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、心脏的组织干细胞、骨髓和外周血等)的生长，并具有非常良好的生物相容性和机械强度。
多孔结构层
如本文所用，所述“多孔结构层”包括用于阻挡或防止炎性细胞渗透的第一结构层和用于负载(或容纳)用于修复心脏的修复细胞的第二结构层，其中所述的修复细胞选自下组：心脏干细胞、心脏祖(前体)细胞、或其组合(其来源包括：胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、心脏的组织干细胞、骨髓和外周血等)。其中，第一结构层具有第一孔隙度A1，第二结构层具有第二孔隙度A2，并且，A2大于A1。具体地，A1为1-10μm,较佳地为2-6μm；A2为20-200μm，更佳地为25-100μm，A2/A1≥5，较佳地≥8，更佳地，≥10。
本发明所述的多孔结构层中，第一结构层的厚度为0.01-0.05cm，较佳地为0.01-0.02cm；所述的第二结构层的厚度为0.05-0.5cm，较佳地，0.1-0.25cm。
在一优选实施方式中，所述多孔结构层由具有相同或不同材质的所述的第一结构层和所述的第二结构层构成，其中多孔结构层的材质优选为生物可降解材料。
在一优选实施方式中，所述的多孔结构层含有由赖氨酸交联剂(如BS3)交联在一起的以下组分：
(a)弹性蛋白原、弹性蛋白，或其片段；和
(b)粘多糖。
在一优选实施方式中，所述的多孔结构层由交联在一起的上述组分(a)和组分(b)构成。
在一优选实施方式中，所述的第一多孔结构层和/或第二多孔结构层中，按相应结构层的体积计，各组分的含量如下：
弹性蛋白的含量为5-200mg/cm3，较佳地，1-150mg/cm3，更佳地，50-100mg/cm3；
粘多糖的含量为0.1-100mg/cm3，较佳地，1-50mg/cm3，更佳地，10mg/cm3。
在一优选实施方式中，所述第二结构层面向需修复的心脏部位(或组织)；具体地，所述的第二结构层朝向心脏，而所述的第一结构层朝向心包膜侧。
多孔结构件及其制备
如本文所用，所述“多孔结构件”包括至少二个复合在一起的多孔结构层，所述的多孔结构层包括用于阻挡或防止炎性细胞渗透的第一结构层和用于负载(或容纳)用于修复心脏的修复细胞的第二结构层。
所述多孔结构件用如下方法制备：
(a1)提供一混合物，所述混合物含有弹性蛋白、赖氨酸交联剂、粘多糖和惰性溶剂(如磷酸缓冲液)；
(a2)对上一步骤所述的混合物进行压模成型，形成具有所述第一多孔结构层和第二多孔结构层的多孔结构件。
在一优选实施方式中，所述弹性蛋白与赖氨酸交联剂的重量比为50-200：3-10，较佳地，80-150:4-8，更佳地，100:5.73。
生物补片材料及其制备
如本文所用，术语“生物补片材料”是指用于制备医用补片(如心脏补片)的一种多层复合材料。具体地，所述生物补片材料的形状与需修复的心脏部位的形状相匹配，并且所述补片材料包括：
(i)至少二个复合在一起的多孔结构层，所述的多孔结构层包括用于阻挡或防止炎性细胞渗透的第一结构层和用于负载(或容纳)用于修复心脏的修复细胞的第二结构层，其中所述的修复细胞选自下组：心脏干细胞、心脏祖(前体)细胞、或其组合(其来源包括：胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、心脏的组织干细胞、骨髓和外周血等)；和
(i i)负载于所述第二结构层的所述的修复细胞，并且至少一部分或全部所述的修复细胞位于所述第二结构层的空隙中。
本发明所述的生物补片材料用如下方法进行制备：
(a)提供一多孔结构件，所述的多孔结构件包括至少二个复合在一起的多孔结构层，所述的多孔结构层包括用于阻挡或防止炎性细胞渗透的第一结构层和用于负载(或容纳)用于修复心脏的修复细胞的第二结构层；和
(b)将所述的修复细胞接种于所述第二结构层，形成接种有修复细胞的多孔结构件，其中所述的修复细胞选自下组：心脏干细胞、心脏祖(前体)细胞、或其组合(其来源包括：胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、心脏的组织干细胞、骨髓和外周血等)；
(c)任选地，对上一步骤中所述接种有修复细胞的多孔结构件进行培养处理，使得接种的修复细胞进行增殖和传代，从而获得经培养处理的多孔结构件；
其中，所述接种有修复细胞的多孔结构件或经培养处理的多孔结构件即为本发明所述的生物补片材料。
在本发明中，适合用作本发明修复细胞的心脏干细胞、心脏祖细胞没有特别限制，可以来源于哺乳动物，包括人和非人哺乳动物。典型地，这些心脏干细胞和心脏祖细胞可以用本领域的常规方法获得(例如参见申请号为CN200580040364.1、CN200910241630.7、CN201210141965.3、CN201510376913.8中所公开的方法)或通过市售途径获得、或从保藏机构获得。
在一优选实施方式中，所述步骤(b)中，所述修复细胞的接种量为1×102-1×106个/mm3，较佳地，5×102-2×105个/mm3,更佳地，1×103-1×105个/mm3，按第二多孔结构层的体积计。并且，所述修复细胞来源于人或非人哺乳动物。
在一优选的实施方式中，所述生物补片材料还可以用如下方法制备：
(i)提供具有第一孔隙度A1的第一结构层(弹性蛋白基的结构层)和具有第二孔隙度A2的第二结构层(弹性蛋白基的结构层)；以及
(i i)将所述的第一结构层(弹性蛋白基的结构层)和第二结构层(弹性蛋白基的结构层)与任选的其他结构层(如中间结构层)复合在一起，形成未接种修复细胞的多孔结构件；
(i i i)将所述修复细胞接种于上一步骤得到的多孔结构件，从而形成本发明所述的生物补片材料。
BS3
如本文所用，术语“BS3”与“bi s(sulfosuccinimidyl suberate)”可互换使用，是一种同基双功能试剂(homobifuctional agent)，属于赖氨酸交联剂的一种，具有水溶性、不被水解、交联氨基、不能穿透细胞膜等特点，被广泛应用于以下几个方面的研究：细胞膜结构、蛋白质结构、蛋白质间相互作用、生物导弹、载体蛋白与半抗原的连接、蛋白质或其他分子的固相化、抗体的标记、标记转移、蛋白质与核酸的连接等。
在本发明中，BS3能够将弹性蛋白交联到一起，形成交联的弹性蛋白。
用于心脏修复的试剂盒
如本文所用，所述的“用于心脏修复的试剂盒”包括：
一容器，以及位于所述容器中的本发明第一方面所述的生物补片材料。
医用补片
如本文所用，术语“医用补片”是指用本发明所述的生物补片材料制备的一种制品，具体地，该制品包括心脏补片，用于治疗缺血性心力衰竭。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明的生物补片材料以人类及非人哺乳动物来源的弹性蛋白为主要材料，对细胞组织毫无毒害，没有免疫原性的问题，具有良好的生物相容性。
(2)本发明提供了一种全新、高效的促进梗死心肌再生和修复的治疗方法：将干细胞和/或祖细胞添加或接种到生物补片材料中，形成心脏补片。该方法在加强心脏病变部位保护和机械强度的同时，还给予了包括心肌、血管和间质在内的损伤结构一个极佳的修复环境和动力。
(3)本发明的生物补片材料具有很高的机械强度，可以避免组织周遭环境中炎症细胞的入侵，并且可以随着病情的恢复逐渐被病理部位吸收和降解。
(4)本发明的生物补片材料是一种多层结构，其中第一层结构的孔隙度A1较小，对于炎性细胞是不可渗透的；第二层孔隙度A2较大，可渗透和容纳心脏干细胞、心脏祖(前体)细胞、或其组合(其来源包括：胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、心脏的组织干细胞、骨髓和外周血等)。该结构能够更好的阻止炎症细胞入侵，并让细胞得到更好的生长和分化。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计。
实施例1多孔结构层的制备
将弹性蛋白溶解于磷酸缓冲液PBS(10mM磷酸钠，150mM氯化钠，pH7.4)中，形成浓度为100mg/ml的溶液，在溶液中添加浓度为10毫克每毫升的粘多糖(如肝素)，最后添加赖氨酸交联剂(如bis(sulfosuccinimidyl suberate))至10mM，迅速混匀。将准备好的溶液缓慢加入相应的模具，把模具转移至37℃培养箱中静置16小时，直至成型(图1)，从而制得由第一结构层和第二结构层组成的多孔结构层，并且，如图4所示，第一结构层与第二结构层的孔隙度不同。
实施例2生物补片材料孔隙度的检测
用扫描电子显微镜(SEM)和微型CT扫描对生物补片材料进行纵横方向多层的切面观察。
如图2和3所示，第一孔隙度A1为1-10μm，第二孔隙度A2为20-200μm，第二孔隙度A2与第一孔隙度A1之比A2/A1≥5，较佳地≥8，更佳地，≥10。并且，第一结构层的厚度为0.01-0.05cm，第二结构层的厚度为0.05-0.5cm，较佳地，0.1-0.25cm；生物补片材料的主表面积为10-80cm2，较佳地为25－55cm2。
结果表明，第一结构层的孔隙度A1较小，能防止修复细胞流失，并且还可以防止炎性细胞渗透；第二层孔隙度A2较大，可负载或容纳心脏干细胞、心脏祖(前体)细胞、或其组合(其来源包括：胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、心脏的组织干细胞、骨髓和外周血等)。该结构能够更好的阻止炎症细胞入侵，并让细胞得到更好的生长和分化。
实施例3生物补片材料的机械性能测试结果
用单轴压缩-舒张测试(如Bose ELF3400等)来确定生物补片材料的机械强度。在进行测试之前，补片在磷酸缓冲溶液中静置5小时，以避免补片失水造成的弹性损失。整个机械强度测试过程均在磷酸缓冲溶液存在的情况下进行，以保持补片的湿润。测试在每秒30μm的速度下，以50％张力对补片进行压缩和舒张，且记录压缩值(毫米)及载荷值(牛顿)来计算最终的压缩系数和能量流失率。
计算方法如下：
压缩系数：取自压缩和舒张曲线在0-0.2毫米/毫米之间的线性回归值。
能量流失＝100％X(压缩曲线面积–舒张曲线面积)/压缩曲线面积
结果表明，以50％张力对补片进行压缩和舒张，补片均不变形，因此，本发明的生物补片材料具有优良的机械性能。
实施例4生物补片材料的制备
对生物补片材料用乙醇进行消毒，消毒完成后，细胞用磷酸盐缓冲液中清洗数次，去除残余的乙醇。之后将心脏干、祖细胞分别接种于相应干细胞培养基中，进行至少16小时的平衡，并在37℃的培养箱中培养5-7天。具体如下所示：
实验组1：人心脏干细胞，其接种量为1×103(个/mm3)；
实验组2：人心脏干细胞，其接种量为1×104(个/mm3)；
实验组3：人心脏干细胞，其接种量为1×105(个/mm3)；
实验组4：人心脏祖细胞，其接种量为1×103(个/mm3)；
实验组5：人心脏祖细胞，其接种量为1×104(个/mm3)；
实验组6：人心脏祖细胞，其接种量为1×10⒌(个/mm3)；
结果如图5所示。结果显示，第一结构层面向培养板或培养皿底面时，实验组1-6中的心脏干、祖细胞在第二结构层内均生长良好，并且在培养皿里未观察渗透到培养皿的心脏干、祖细胞的存在。
对比例1
方法同实施例4，区别在于：设置以下两个实验组：
实验组1A：人心脏干细胞，其接种量为1×105(个/mm3)；
实验组2A：人心脏祖细胞，其接种量为1×10⒌(个/mm3)；
并且将接种了心脏干、祖细胞的第二结构层面向培养板或培养皿底面，进行培养。
结果显示，在上述两个实验组1A和2A中，均观察到心脏干、祖细胞主要在培养板或培养皿底面生长，而在第二结构层内生长中的心脏干细胞或祖细胞数量较少(＜20％)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (30)
1.一种用于心脏修复的生物补片材料，其特征在于，所述补片材料的形状与需修复的心脏部位的形状相匹配，并且所述补片材料包括：
(i)至少二个复合在一起的多孔结构层，所述的多孔结构层包括用于防止修复细胞流失的第一结构层和用于负载用于修复心脏的修复细胞的第二结构层，其中所述的修复细胞选自下组：心脏干细胞、心脏祖细胞、或其组合；
(ii)负载于所述第二结构层的所述的修复细胞，并且至少一部分或全部所述的修复细胞位于所述第二结构层的空隙中；所述第一结构层具有第一孔隙度A1；所述第二结构层具有第二孔隙度A2，并且A2大于A1，所述的第二孔隙度A2与第一孔隙度A1之比A2/A1≥5，所述的第一孔隙度A1为1-10μm，所述的第二孔隙度A2为20-200μm；
所述的多孔结构层含有交联在一起的以下组分：
(a)弹性蛋白原、弹性蛋白，或其片段；和
(b)粘多糖。
2.如权利要求1所述的生物补片材料，其特征在于，所述第一结构层还可防止炎症细胞渗透。
3.如权利要求1所述的生物补片材料，其特征在于，所述的第二孔隙度A2与第一孔隙度A1之比A2/A1≥8。
4.如权利要求3所述的生物补片材料，其特征在于，所述的第二孔隙度A2与第一孔隙度A1之比A2/A1≥10。
5.如权利要求1所述的生物补片材料，其特征在于，所述的第一孔隙度A1为2-6μm。
6.如权利要求1所述的生物补片材料，其特征在于，所述的第二孔隙度A2为25-100μm。
7.如权利要求1所述的生物补片材料，其特征在于，所述的第一结构层的厚度为0.01-0.05cm。
8.如权利要求7所述的生物补片材料，其特征在于，所述的第一结构层的厚度为0.01-0.02cm。
9.如权利要求1所述的生物补片材料，其特征在于，所述的第二结构层的厚度为0.05-0.5cm。
10.如权利要求9所述的生物补片材料，其特征在于，所述的第二结构层的厚度为0.1-0.25cm。
11.如权利要求1所述的生物补片材料，其特征在于，所述修复细胞的负载量为1×102-1×105个/mm3，按所述第二结构层的体积计。
12.如权利要求11所述的生物补片材料，其特征在于，所述修复细胞的负载量为5×102-5×104个/mm3,按所述第二结构层的体积计。
13.如权利要求12所述的生物补片材料，其特征在于，所述修复细胞的负载量为1×103-1×104个/mm3，按所述第二结构层的体积计。
14.如权利要求1所述的生物补片材料，其特征在于，所述的生物补片材料还包括位于所述第一结构层和所述第二结构层之间的中间结构层。
15.如权利要求1所述的生物补片材料，其特征在于，在所述的多孔结构层中，所述弹性蛋白为交联型弹性蛋白，即通过交联剂进行交联反应而形成的交联产物。
16.如权利要求1所述的生物补片材料，其特征在于，所述的第一结构层和/或第二结构层中，按相应结构层的体积计，各组分的含量如下：
弹性蛋白的含量为5-200mg/cm3；
粘多糖的含量为0.1-100mg/cm3。
17.如权利要求16所述的生物补片材料，其特征在于，弹性蛋白的含量为5-150mg/cm3。
18.如权利要求16所述的生物补片材料，其特征在于，弹性蛋白的含量为50-100mg/cm3。
19.如权利要求16所述的生物补片材料，其特征在于，粘多糖的含量为1-50mg/cm3。
20.如权利要求16所述的生物补片材料，其特征在于，粘多糖的含量为10mg/cm3。
21.如权利要求1所述的生物补片材料，其特征在于，所述的生物补片材料具有以下一种或多种特性：
(i)支持所述修复细胞的生长和分化为心脏细胞，所述的心脏细胞包括心肌细胞、血管平滑肌细胞、血管内皮细胞和心脏成纤维细胞；
(ii)机械性能；拉伸率≥1.1％。
22.一种用于心脏修复的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：
一容器，
以及位于所述容器中的如权利要求1所述的生物补片材料。
23.如权利要求1所述生物补片材料的制备方法，其特征在于，包括步骤：
(a)提供一多孔结构件，所述的多孔结构件包括至少二个复合在一起的多孔结构层，所述的多孔结构层包括用于防止修复细胞流失的第一结构层和用于负载用于修复心脏的修复细胞的第二结构层；和
(b)将所述的修复细胞接种于所述第二结构层，形成接种有修复细胞的多孔结构件，其中所述的修复细胞选自下组：心脏干细胞、心脏祖细胞、或其组合；
(c)任选地，对上一步骤中所述接种有修复细胞的多孔结构件进行培养处理，使得接种的修复细胞进行增殖和传代，从而获得经培养处理的多孔结构件；
其中，所述接种有修复细胞的多孔结构件或经培养处理的多孔结构件即为权利要求1所述生物补片材料。
24.如权利要求23所述的制备方法，其特征在于，所述方法还包括：在步骤(a)之前的制备所述多孔结构件的步骤：
(a1)提供一混合物，所述混合物含有弹性蛋白、赖氨酸交联剂、粘多糖和惰性溶剂；
(a2)对上一步骤所述的混合物进行压模成型，形成具有所述第一结构层和第二结构层的多孔结构件。
25.如权利要求24所述的制备方法，其特征在于，所述弹性蛋白与赖氨酸交联剂的重量比为50-200：3-10。
26.如权利要求25所述的制备方法，其特征在于，所述弹性蛋白与赖氨酸交联剂的重量比为，80-150:4-8。
27.如权利要求23所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(b)中，所述修复细胞的接种量为1×102-1×105个/mm3，按第二结构层的体积计。
28.如权利要求27所述的制备方法，其特征在于，所述修复细胞的接种量为5×102-5×104个/mm3，按第二结构层的体积计。
29.如权利要求28所述的制备方法，其特征在于，所述修复细胞的接种量为1×103-1×104个/mm3，按第二结构层的体积计。
30.如权利要求1所述生物补片材料的用途，其特征在于，用于制备治疗心脏疾病的医用补片。
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