CN103071190A - 一种组织引导再生用胶原基复合生物膜的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种组织引导再生用胶原基复合生物膜的制备方法,包括如下步骤:将胶原溶于酸性溶液中;调节所得溶液的pH值至碱性;继续加入无机粉体材料,搅拌均匀;调节所得溶液的pH值至中性,离心,除去上清液,收集胶原复合膜;将所得的胶原复合膜模具成型,冷冻干燥,采用物理或/和化学方法交联,即可。
Description
技术领域
本发明涉及一种组织引导再生用胶原基复合生物膜的制备方法。
背景技术
牙周引导组织再生技术(guided tissue regeneration, GTR) 是目前国际上治疗牙周病最先进的技术。GTR的概念是1982年由Nymans等 (Nyman S.Lindhe J.Karring T,et al. Clin Periodontol.1982;9(4):290-296)首先提出,基本原理是以屏障膜作为空间隔离,在防止牙龈结缔组织细胞和结合上皮细胞向根方迁移的同时,选择性地使牙周膜细胞和牙槽骨细胞粘附于根面分化形成牙周新附着。这种方法被证明在治疗骨内和根尖疾病时较开放皮瓣清创术更能有效的获得临床附着和降低探诊深度(Kim YK, Yun PY, Kim SG, et al, Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod.2009;107: 5-11)。引导膜是GTR技术的核心,随着GTR技术在临床越来越广泛的运用,引导膜的类型和性能已经成为制约其发展的关键因素。
根据临床需要,一种有效的引导膜应该具有适当的机械强度,以阻挡生长快速的修复组织(上皮和牙龈结缔组织)远离牙根表面,在根面维持一个受保护的空间;同时该材料应能够较好地引导牙槽骨细胞生长、分泌,形成新生骨,以增加新生牙槽骨的骨量。另外,良好的生物相容性、临床可操作性好,能够稳定固着并能保持一段足够引导组织起效的时间都是影响其应用的重要因素(Kuo SM, Chang SJ, Niu GC, et al, Applied Polymer Science. 2009;112:3127-3134)。
胶原是结缔组织的主要成分,普遍存在于哺乳动物的皮肤、肌腱、骨骼、韧带中,具有柔韧性,因其螺旋结构及保持良好的主要序列,仅引起轻微的炎性反应。胶原膜作为可吸收性膜它具有低抗原性、生物相容性好、可参与组织愈合过程以及降解速率可根据需要调节等诸多优点。Cirelli 等(Wong HL, Cooke J. Dent Clin N Am .2005(49):637-659.)研究表明胶原膜具有良好的生物相容性和引导组织再生功能,而且引导种植体周围组织再生效果最佳;胶原膜经紫外线消毒后,可在-20℃ 下储存, 在生物体内降解期为6-8 周,其降解由唾液酶溶解、机械性破损及上皮细胞分泌的胶原酶破坏完成。Minabe M 等(Kim M, Kim J, Lee J, et al. In Vivo, 2008,22(3): 231 - 236.)用紫外线等多种方法使胶原分子间产生交联,使胶原膜在体内降解的时间可以控制,增长其降解时间更利于较大的骨缺损。李成章等采用双抗胶原膜的制作方法可应用于成品胶原膜的加工,加工改良后的双抗胶原膜具有较高的交联程度,较强的抗酶降解能力,其形态结构特点及理化性能符合引导骨再生技术要求。但胶原膜作为GTR的研究还存在一些问题:首先是体内降解速度过快,其次相对于GTR膜的要求,目前大部分胶原膜产品的强度较小,在应用过程中容易发生塌陷而失去空间维持能力。
发明内容
本发明的目的在于
本发明所采取的技术方案是:
一种组织引导再生用胶原基复合生物膜的制备方法,包括如下步骤:
(1)将胶原溶于酸性溶液中;
(2)调节步骤(1)所得溶液的pH值至碱性;
(3)往步骤(2)所得溶液中加入无机粉体材料,搅拌均匀;
(4)调节步骤(3)所得溶液的pH值至中性,离心,除去上清液,收集胶原复合膜;
(5)将步骤(4)所得的胶原复合膜模具成型,冷冻干燥,采用物理或/和化学方法交联,即可。
步骤(1)所述酸性溶液为醋酸、盐酸或柠檬酸溶液,浓度为0.1~0.5M。
步骤(1)所得溶液中,胶原的浓度为0.5mg/ml-20mg/ml。
步骤(1)是在4~30℃下进行。
步骤(2)的具体操作为:用碱液将步骤(1)所得溶液的pH值调节至8-11后,静置5min-36h。
所述碱液为氢氧化钠溶液或氨水。
步骤(3)所述无机粉体材料包括羟基磷灰石、生物活性玻璃、磷酸三钙、焦磷酸钙中的至少一种,无机粉体材料占胶原重量的1%-50%。
步骤(4)所述离心的转速为1000~7000r/min,时间为3~10min。
所述物理交联法为紫外交联或者真空热交联,交联温度为100℃-180℃。
所述化学交联法所用交联剂为戊二醛溶液、甲醛溶液、或1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合溶液。
本发明的有益效果是:
(1)本发明方法制备得到的胶原基复合生物膜具有良好的力学性能和降解可控性能;
(2)本发明得到的胶原膜具有梯度的孔隙结构,适合于营养物质的传输和细胞的吸附增殖,能够较好地引导缺损组织的修复;
(3)本发明方法工艺简单,成本较低,有利于规模化生产。
附图说明
图1为实施例2组织引导再生用胶原基复合生物膜紧密面电镜照片;
图2为实施例2组织引导再生用胶原基复合生物膜疏松面电镜照片;
图3为实施例2组织引导再生用胶原基复合生物膜剖面电镜照片;
图4为实施例2组织引导再生用胶原基复合生物膜与人牙周韧带细复合培养第6天的电镜照片(×200)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明,但并不局限于此。
以下实施例中所用胶原为sigma公司的胶原蛋白,所用生物活性玻璃为参照文献(陈晓峰,郭常亮,赵娜如,谢林,溶胶-凝胶生物活性玻璃超细粉体的制备与生物矿化性能研究,无机材料学报,2008,23(5):1027)制备得到。
实施例1
一种胶原基复合生物膜的制备方法,包括如下步骤:
(1)将胶原在25℃下溶于0.1M的盐酸溶液中,得到浓度为3mg/ml的胶原溶液;
(2)用0.1N的氢氧化钠缓慢调节步骤(1)所得溶液的pH值至10,保持30分钟;
(3)将生物活性玻璃(BAG)加入至步骤(2)的胶原溶液中,其中BAG的重量为胶原干重的10%,用搅拌器搅拌获得均一的溶液;
(4)用盐酸或氢氧化钠溶液将步骤(3)所得溶液的pH值调至7,以3000r/min的速度离心,时间为5分钟,此时胶原包裹BAG沉淀于离心杯底部成膜,去除上清液,收集胶原复合膜;
(5)将步骤(4)收集得到的胶原复合膜成型,-20℃冷冻干燥,在120℃条件下真空热交联;
(6)包装,辐照灭菌。
所得胶原基复合生物膜的弹性模量为156.47+7.67g/mm2。
实施例2
一种胶原基复合生物膜的制备方法,包括如下步骤:
(1)将胶原在4℃下溶于0.1M的盐酸溶液中,得到浓度为10mg/ml的胶原溶液;
(2)用0.1N的氢氧化钠缓慢调节步骤(1)所得胶原溶液的pH值至9,保持60分钟;
(3)加入羟基磷灰石(HA)至步骤(2)所得溶液中,其中HA的重量为胶原干重的5%,用搅拌器搅拌获得均一的溶液;
(4)用盐酸或氢氧化钠溶液将步骤(3)所得溶液的pH值调节至7,以4000r/min的速度离心,离心3分钟,此时胶原包裹HA沉淀于离心杯底部成膜,去除上清液,收集收集胶原复合膜;
(5)将步骤(4)收集得到的胶原复合膜成型, -20℃冷冻干燥,在100℃条件下真空热交联;
(6)将步骤(5)所得的胶原复合膜放入1%的EDC/NHS溶液(按EDC/NHS=1:4的质量比例称取一定量,置于水中配成质量浓度为1%的溶液)中浸泡10小时,取出,用去离子水浸泡冲洗3次,-20℃冷冻干燥;
(7)包装,辐照灭菌。
所得胶原基复合生物膜的弹性模量为186.47+7.97g/mm2。
实施例3
一种胶原基复合生物膜的制备方法,包括如下步骤:
(1)将胶原在4℃下溶于0.5M的醋酸溶液中,得到浓度为8mg/ml的胶原溶液;
(2)用0.1N的氨水缓慢调节步骤(1)所得胶原溶液的pH值至8,保持5分钟;
(3)加入β-磷酸三钙(β-TCP)至步骤(2)的胶原溶液中,其中β-TCP的重量为胶原干重的1%,用搅拌器搅拌得到均一的溶液;
(4)用醋酸或氨水将步骤(3)所得溶液的pH值调节至7,以6000r/min的速度离心,离心3分钟,此时胶原包裹β-TCP沉淀于离心杯底部成膜,去除上清液,收集胶原复合膜;
(5)将步骤(4)收集得到的复合胶原膜成型,-20℃冷冻干燥,在140℃条件下真空热交联;
(6)将步骤(5)所得的复合胶原膜放入1%的戊二醛溶液中浸泡10小时,取出,用去离子水浸泡冲洗3次,-20℃冷冻干燥;
(7)包装,辐照灭菌。
所得胶原基复合生物膜的弹性模量为195.47+9.62g/mm2。
实施例4
一种胶原基复合生物膜的制备方法,包括如下步骤:
(1)将胶原在5℃下溶于0.1M的柠檬酸溶液中,得到浓度为0.5mg/ml的胶原溶液;
(2)用0.1N的氨水缓慢调节步骤(1)所得胶原溶液的pH值至10,保持24小时;
(3)加入β-磷酸三钙(β-TCP)至步骤(2)所得的胶原溶液中,其中β-TCP的重量为胶原干重的50%,用搅拌器搅拌得到均一的溶液;
(4)用柠檬酸或氨水将步骤(3)所得溶液的pH值调节至7,以1000r/min的速度离心,离心10分钟,此时胶原包裹β-TCP沉淀于离心杯底部成膜,去除上清液,收集复合胶原膜;
(5)将步骤(4)收集得到的复合胶原膜成型,-20℃冷冻干燥,在180℃条件下真空热交联;
(6)将步骤(5)所得的复合胶原膜放入1%的甲醛溶液中浸泡10小时,取出,用去离子水浸泡冲洗3次,-20℃冷冻干燥;
(7)包装,辐照灭菌。
所得胶原基复合生物膜的弹性模量为185.47+8.7g/mm2。
实施例5
一种胶原基复合生物膜的制备方法,包括如下步骤:
(1)将胶原在30℃下溶于0.5M的醋酸溶液中,得到浓度为20mg/ml的胶原溶液;
(2)用0.1N的氢氧化钠缓慢调节步骤(1)所得胶原溶液的pH值至8,保持20分钟;
(3)加入生物活性玻璃(BAG)至步骤(2)所得的胶原溶液中,其中BAG的重量为胶原干重的30%,用搅拌器搅拌得到均一的溶液;
(4)用醋酸溶液或氢氧化钠溶液将步骤(3)所得溶液的pH值调节至7,以5000r/min的速度离心,离心5分钟,此时胶原包裹BAG沉淀于离心杯底部成膜,去除上清,收集复合胶原膜;
(5)将步骤(4)收集得到的复合胶原膜成型,-20℃冷冻干燥,在120℃条件下真空热交联;
(6)将步骤(5)所得的复合胶原膜放入1%的戊二醛溶液中浸泡10小时,取出,用去离子水浸泡冲洗3次,-20℃冷冻干燥;
(7)包装,辐照灭菌。
所得胶原基复合生物膜的弹性模量为197.4+9.67g/mm2。
实施例6
一种胶原基复合生物膜的制备方法,包括如下步骤:
(1)将胶原在10℃下溶于0.2M的柠檬酸溶液中,得到浓度为8mg/ml的胶原溶液;
(2)用0.1N的氨水缓慢调节步骤(1)所得胶原溶液的pH值至10,保持10分钟;
(3)加入β-磷酸三钙(β-TCP)至步骤(2)所得的胶原溶液中,其中β-TCP的重量为胶原干重的8%,用搅拌器搅拌得到均一的溶液;
(4)用柠檬酸溶液或氨水将步骤(3)所得溶液的pH值调节至7,以5000r/min的速度离心,离心4分钟,此时胶原包裹β-TCP沉淀于离心杯底部成膜,去除上清液,收集复合胶原膜;
(5)将步骤(4)收集得到的复合胶原膜成型,-20℃冷冻干燥,取出后在25度下,254nm紫外照射30秒进行交联;
(6)将步骤(5)所得的胶原膜放入1%的EDC-NHS溶液中浸泡10小时,取出,用去离子水浸泡冲洗3次,-20℃冷冻干燥;
(7)包装,辐照灭菌。
所得胶原基复合生物膜的弹性模量为155.5+6.7g/mm2
实施例7
一种胶原基复合生物膜的制备方法,包括如下步骤:
(1)将胶原在20℃下溶于0.1M的醋酸溶液中,得到浓度为4mg/ml的胶原溶液;
(2)用0.1N的氢氧化钠缓慢调节步骤(1)所得胶原溶液的pH值至11,保持20分钟;
(3)加入焦磷酸钙至步骤(2)的胶原溶液中,其中焦磷酸钙的重量为胶原干重的3%,用搅拌器搅拌得到均一的溶液;
(4)用醋酸溶液或氢氧化钠溶液将步骤(3)所得溶液的pH值调节至7,以7000r/min的速度离心,离心3分钟,此时胶原包裹焦磷酸钙沉淀于离心杯底部成膜,去除上清液,收集复合胶原膜;
(5)将步骤(4)收集到的复合胶原膜成型,-20℃冷冻干燥,在140℃条件下真空热交联;
(6)将步骤(5)所得的复合胶原膜放入1%的戊二醛溶液中浸泡10小时,取出,用去离子水浸泡冲洗3次,-20℃冷冻干燥;
(7)包装,辐照灭菌。
所得胶原基复合生物膜的弹性模量为198.7+7.8g/mm2。
效果实验
一、体外胶原酶降解实验
取胶原膜各lmg分别置于含有100U胶原酶的2mlStock缓冲液中(10mMTris,25mMCaCl2,100ml蒸馏水,PH7.5),370C恒温,记录膜完全降解时间。空白对照组为2mlStock缓冲液。实验结果见表1。
二、胶原基复合生物膜引导牙周组织再生实验
下面设计实验检测实施例1-7制备得到的胶原基复合生物膜对牙周组织再生的影响。
实验选择5 只体重为12 ~ 15 kg,约18 月龄且已完成换牙的健康成年雄性Beagle 犬。通过模拟牙周炎骨缺损形态在Beagle犬双侧下颌第三、四前磨牙颊侧制作3 个大小为5 mm× 5 mm 的急性二壁骨袋的骨缺损模型,深达牙面。采用自体对照方法观察牙周组织再生情况,骨缺损区随机分为3 组:胶原膜组、聚四氟乙烯(e-PTFE)膜组、空白对照组,共5 只Beagle 犬、14 个实验部位。术后12 周将进行大体标本观察、组织学观察、锥形束计算机体层摄影术(CBCT)扫描并重建、扫描电镜Ca、P 元素微区定量测定。实验结果见表2和表3。
以上实施例仅为介绍本发明的优选案例,对于本领域技术人员来说,在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进,都应被视为本发明的一部分。
Claims (10)
1.一种组织引导再生用胶原基复合生物膜的制备方法,包括如下步骤:
(1)将胶原溶于酸性溶液中;
(2)调节步骤(1)所得溶液的pH值至碱性;
(3)往步骤(2)所得溶液中加入无机粉体材料,搅拌均匀;
(4)调节步骤(3)所得溶液的pH值至中性,离心,除去上清液,收集胶原复合膜;
(5)将步骤(4)所得的胶原复合膜模具成型,冷冻干燥,采用物理或/和化学方法交联,即可。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)所述酸性溶液为醋酸、盐酸或柠檬酸溶液,浓度为0.1~0.5M。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)所得溶液中,胶原的浓度为0.5mg/ml-20mg/ml。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)是在4~30℃下进行。
5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)的具体操作为:用碱液将步骤(1)所得溶液的pH值调节至8-11后,静置5min-36h。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述碱液为氢氧化钠溶液或氨水。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(3)所述无机粉体材料包括羟基磷灰石、生物活性玻璃、磷酸三钙、焦磷酸钙中的至少一种,无机粉体材料占胶原重量的1%-50%。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(4)所述离心的转速为1000~7000r/min,时间为3~10min。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述物理交联法为紫外交联或者真空热交联,交联温度为100℃-180℃。
10.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述化学交联法所用交联剂为戊二醛溶液、甲醛溶液、或1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合溶液。
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