CN105854087B - 一种具有基质修复能力的角膜修复材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有基质修复能力的角膜修复材料及其制备方法，其包括以下步骤：1）microRNA溶液的配制；2）胶原溶液的配制；3）胶原膜的制备；4）金纳米颗粒溶液的配制；5）microRNA与金纳米颗粒混合溶液的配制；6）将混合溶液滴加到胶原膜上，得到具有基质修复能力的角膜修复材料。本发明的具有基质修复能力的角膜修复材料具有层状结构，透光性好、含水率高、离子通过性能优异，可有效降低、减缓瘢痕修复的发生。本发明的具有基质修复能力的角膜修复材料可用于医疗领域中受损角膜基质的修复，其原料廉价易得、制备工艺简单、设备简易，具有良好的应用前景和科学价值。

Description

一种具有基质修复能力的角膜修复材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种具有基质修复能力的角膜修复材料及其制备方法，本发明的角膜基质修复材料可应用于受损角膜基质的修复，属于生物医用材料领域。
背景技术
角膜病是一种十分常见的眼科疾病，是仅次于白内障的世界第二大致盲眼病。据报道，世界上每年大约有1000万人因为角膜疾病而失明。现在唯一广为接受的治疗方法是用人的角膜供体进行移植，然而，特别是在发展中国家，供体角膜十分短缺，我国每年能够完成的角膜移植手术不超过5000例。因此，人工角膜修复材料的研发就显得十分必要。
常见的角膜疾病包括机械力损伤、酸碱烧伤、细菌或真菌引发的感染或溃疡等，他们都是引起视力减退的重要原因，会导致透明的角膜出现灰白色的混浊，使视力模糊、减退，甚至会导致失明。角膜基质细胞可以分泌胶原以及其他细胞外基质。角膜损伤后由角膜基质细胞分泌胶原对损伤区域进行修复，最终恢复损伤前厚度。然而，角膜在受损时，往往上皮细胞层和基质层都会受损，受损的角膜上皮细胞会释放TGF-β2进入基质层，刺激角膜基质细胞向成肌纤维细胞转化，成肌纤维细胞会分泌紊乱的胶原纤维，是一种不同于健康角膜基质组织的胶原纤维排列方式，会造成细胞透明性下降，最终形成角膜瘢痕化修复，影响视力。在不处理的角膜损伤中，上皮释放的TGF-β2很快会进入基质层，最终形成明显的瘢痕。
胶原（Col）是细胞外至关重要的纤维蛋白，也是组成细胞外基质的骨架。胶原在细胞外基质中构成半晶体的纤维，给细胞供应抗张力和弹性，并在细胞的迁移、发育中起作用，且胶原在各种动物中都有存在。胶原是生物科技产业最重要的原材料之一，其应用领域包括生物医用材料、化妆品和食品工业等，可作为优良的生物基底材料。
MicroRNAs（miRNAs）是真核生物体内一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20～25个核苷酸。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC），通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。最近的研究表明miRNA会参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等。而microRNA-133b已经被证实在体外调控角膜基质细胞向成肌纤维细胞转型上有显著的作用，从而可以进一步实现角膜修复过程中瘢痕减轻的目的。
角膜修复材料想要在实际修复中实现良好的上皮与基质修复效果，就需要角膜修复材料的理化性能和天然组织相近。并且在角膜损伤发生后，角膜修复材料应该能实现上皮修复，即上皮化，还应实现减轻或防止角膜瘢痕的产生，使修复后的角膜清澈、透明，随着材料的逐步降解，最终实现角膜的修复。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有基质修复能力的角膜修复材料及其制备方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种具有基质修复能力的角膜修复材料的制备方法，包括以下步骤：
1)将microRNA用DEPC处理水配制成microRNA溶液；
2)将胶原加入到盐酸DEPC处理水溶液或乙酸DEPC处理水溶液中，搅拌均匀，除去溶液中的气泡，得到胶原溶液；
3)将胶原溶液倒入模具中，干燥成膜，脱除模具，用水多次洗涤，干燥，得到胶原膜；
4)将金纳米颗粒用DEPC处理水配制成金纳米颗粒溶液；
5)将配置好的microRNA溶液与金纳米颗粒溶液混合均匀，得到混合溶液；
6)将步骤5）中的混合溶液均匀滴加到步骤3）中的胶原膜上，干燥，即得到具有基质修复能力的角膜修复材料。
步骤1）所述microRNA溶液的摩尔浓度为15～25μmol/L。
步骤1）所述microRNA为具有角膜基质修复功能的RNA。
步骤2）所述胶原为从牛肌腱中提取的经纯化过的I型胶原。
步骤2）所述胶原溶液的质量浓度为6.0～7.0mg/mL。
步骤2）所述盐酸DEPC处理水溶液的摩尔浓度为0.001～0.01mol/L。
步骤2）所述乙酸DEPC处理水溶液的摩尔浓度为0.05～0.15mol/L。
步骤4）所述金纳米颗粒溶液的质量浓度为0.025～0.045mg/mL。
步骤4）所述金纳米颗粒的粒径为70～120nm。
步骤5）所述混合溶液中microRNA、金纳米颗粒的质量比为1：（2～4）。
步骤6）所述混合溶液的体积与胶原膜的表面积的比为250μL：（800～1200）mm2。
本发明的有益效果是：
1）本发明的具有基质修复能力的角膜修复材料具有层状结构，光学透过性能好、含水性能好；
2）本发明的具有基质修复能力的角膜修复材料的离子通过性能优异，便于营养物质的透过和运输，可充分保证上皮细胞生长的需要；
3）本发明的具有基质修复能力的角膜修复材料可以很好的吸附、释放并使microRNA进入到角膜基质细胞中发挥作用，从而降低、减缓瘢痕修复的发生，达到更好的修复效果；
4）本发明的具有基质修复能力的角膜修复材料可用于医疗领域中受损角膜基质的修复，其原料廉价易得、制备工艺简单、设备简易，具有良好的应用前景和科学价值。
附图说明
图1为实施例1的Col-microRNA-133b胶原膜断面的扫描电子显微镜（SEM）照片。
图2为实施例1的Col-microRNA-133b胶原膜的含水率测试结果。
图3为实施例1的Col-microRNA-133b胶原膜的光透过性能测试结果。
图4为实施例1的Col-microRNA-133b胶原膜进行体外实验时的microRNA释放效果图。
图5为实施例1的Col-microRNA-133b胶原膜进行兔体内实验时的microRNA释放效果图。
图6为实施例1的Col-microRNA-133b胶原膜进行兔体内板层角膜移植术7天后修复效果检测照片。
图7为实施例1的Col-microRNA-133b胶原膜进行兔体内板层角膜移植术7天后上皮化效果检测照片。
图8为实施例1的Col-microRNA-133b胶原膜进行兔体内板层角膜移植术7天后的OCT基质扫描图像。
具体实施方式
一种具有基质修复能力的角膜修复材料的制备方法，包括以下步骤：
1)将microRNA用DEPC处理水配制成microRNA溶液；
2)将胶原加入到盐酸DEPC处理水溶液或乙酸DEPC处理水溶液中，搅拌均匀，除去溶液中的气泡，得到胶原溶液；
3)将胶原溶液倒入模具中，干燥成膜，脱除模具，用水多次洗涤，干燥，得到胶原膜；
4)将金纳米颗粒用DEPC处理水配制成金纳米颗粒溶液；
5)将配置好的microRNA溶液与金纳米颗粒溶液混合均匀，得到混合溶液；
6)将步骤5）中的混合溶液均匀滴加到步骤3）中的胶原膜上，干燥，即得到具有基质修复能力的角膜修复材料。
优选的，一种具有基质修复能力的角膜修复材料的制备方法，包括以下步骤：
1)将microRNA用DEPC处理水配制成microRNA溶液；
2)将胶原加入到盐酸DEPC处理水溶液或乙酸DEPC处理水溶液中，2～6℃下搅拌2～5小时，再室温搅拌20～30小时，除去溶液中的气泡，得到胶原溶液；
3)将胶原溶液倒入模具中，室温自然风干成膜，脱除模具，用水多次洗涤，室温下自然风干，得到胶原膜；
4)将金纳米颗粒用DEPC处理水配制成金纳米颗粒溶液；
5)将配置好的microRNA溶液与金纳米颗粒溶液混合均匀，得到混合溶液；
6)将步骤5）中的混合溶液均匀滴加到步骤3）中的胶原膜上，自然风干，即得到具有基质修复能力的角膜修复材料。
优选的，步骤1）所述microRNA溶液的摩尔浓度为15～25μmol/L。
优选的，步骤1）所述microRNA为具有角膜基质修复功能的RNA。
进一步优选的，步骤1）所述microRNA为microRNA-133b。
优选的，步骤2）所述胶原为从牛肌腱中提取的经纯化过的I型胶原。
优选的，步骤2）所述胶原溶液的质量浓度为6.0～7.0mg/mL。
优选的，步骤2）所述盐酸DEPC处理水溶液的摩尔浓度为0.001～0.01mol/L。
优选的，步骤2）所述乙酸DEPC处理水溶液的摩尔浓度为0.05～0.15mol/L。
优选的，步骤4）所述金纳米颗粒溶液的质量浓度为0.025～0.045mg/mL。
优选的，步骤4）所述金纳米颗粒的粒径为70～120nm。
优选的，步骤5）所述混合溶液中microRNA、金纳米颗粒的质量比为1：（2～4）。
优选的，步骤6）所述混合溶液的体积与胶原膜的表面积的比为250μL：（800～1200）mm2。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释和说明。
实施例1：
1）将microRNA-133b粉末用去DEPC处理水配制成浓度为20μmol/L的microRNA溶液；
2）将从牛筋中提取的Ι型胶原用0.001mol/L的盐酸DEPC处理水溶液配制浓度为6.5mg/mL的胶原溶液，再在4℃冰箱中搅拌4小时，再在室温下搅拌24小时，除去气泡；
3）将步骤2）中的溶液倒入模具中，于室温下自然风干成膜后，用去离子水进行多次洗涤，在室温下自然风干，得到胶原膜；
4）将金纳米颗粒用去DEPC处理水配制成浓度为0.03mg/mL的金纳米颗粒溶液；
5）将microRNA溶液与金纳米颗粒溶液按照microRNA、金纳米颗粒质量比1:3混合均匀，得到混合溶液；
6）将步骤5）中的混合溶液按照液体体积与表面积比为250μL:1000mm2均匀滴加在胶原膜表面后，于室温下自然风干成膜，得到Col-microRNA-133b胶原膜，即本发明的具有基质修复能力的角膜修复材料。
实施例2：
1）将microRNA-133b粉末用去DEPC处理水配制成浓度为25μmol/L的microRNA溶液；
2）将从牛筋中提取的Ι型胶原，用0.1mol/L的乙酸DEPC处理水溶液配制浓度为6.0mg/mL的胶原溶液，再在4℃冰箱中搅拌5小时，再在室温下搅拌20小时，除去气泡；
3）将步骤2）中的溶液倒入模具中，于室温下自然风干成膜后，用去离子水进行多次洗涤，在室温下自然风干，得到胶原膜；
4）将金纳米颗粒用去DEPC处理水配制成浓度为0.025mg/mL的金纳米颗粒溶液；
5）将microRNA溶液与金纳米颗粒溶液按照microRNA、金纳米颗粒质量比1:2混合均匀，得到混合溶液；
6）将步骤5）中的混合溶液按照液体体积与表面积比为250μL:1100mm2均匀滴加在胶原膜表面后，于室温下自然风干成膜，得到Col-microRNA-133b胶原膜，即本发明的具有基质修复能力的角膜修复材料。
实施例3：
1）将microRNA-133b粉末用去DEPC处理水配制成浓度为15μmol/L的microRNA溶液；
2）将从牛筋中提取的Ι型胶原，用0.01mol/L的盐酸DEPC处理水溶液配制浓度为7.0mg/mL的胶原溶液，再在4℃冰箱中搅拌3小时，再在室温下搅拌30小时，除去气泡；
3）将步骤2）中的溶液倒入模具中，于室温下自然风干成膜后，用去离子水进行多次洗涤，在室温下自然风干，得到胶原膜；
4）将金纳米颗粒用去DEPC处理水配制成浓度为0.045mg/mL的金纳米颗粒溶液；
5）将microRNA溶液与金纳米颗粒溶液按照microRNA、金纳米颗粒质量比1:4混合均匀，得到混合溶液；
6）将步骤5）中配置的混合溶液按照液体体积与表面积比为250μL:900mm2均匀滴加在胶原膜表面后，于室温下自然风干成膜，得到Col-microRNA-133b胶原膜，即本发明的具有基质修复能力的角膜修复材料。
测试例：
通过对实施例1中的Col-microRNA-133b胶原膜材料（即本发明的具有基质修复能力的角膜修复材料）进行理化性能表征，可以得出以下结论：
图1为实施例1的Col-microRNA-133b胶原膜断面的扫描电子显微镜（SEM）照片，由图1可知：Col-microRNA133b胶原膜材料呈层状结构。
图2为实施例1的Col-microRNA-133b胶原膜的含水率测试结果，由图2可知：Col-microRNA-133b胶原膜材料与纯胶原（Col）材料都具有较高的含水率。
图3为实施例1的Col-microRNA-133b胶原膜的光透过性能测试结果，由图3可知：Col-microRNA-133b胶原膜材料与纯胶原（Col）材料都具有较高的光透过性能，且均随着光波长的增加其光透过率也增加，与健康角膜相一致。
表1为实施例1的Col-microRNA-133b胶原膜的离子透过性能测试结果，由表1可知：Col-microRNA-133b胶原膜材料与纯胶原（Col）材料都具有较高的离子透过性能，营养物质容易透过，能够很好的支持上皮细胞在膜材料上的增殖、生长。
表1 实施例1的Col-microRNA-133b胶原膜的离子透过性能测试结果
图4为实施例1的Col-microRNA-133b胶原膜进行体外实验时的microRNA释放效果图，由图4可知：通过绿色荧光标记microRNA，再将制得的负载有荧光标记microRNA的Col-microRNA-133b胶原膜材料与兔角膜基质细胞在体外共培养后，能够在兔角膜基质细胞中观察到绿色荧光，说明Col-microRNA-133b胶原膜材料有很好的microRNA释放效果，并且释放的microRNA-133b可以进入兔角膜基质细胞。
图5为实施例1的Col-microRNA-133b胶原膜进行兔体内实验时的microRNA释放效果图，由图5可知：通过绿色荧光标记microRNA，再将制得的负载有荧光标记microRNA的Col-microRNA-133b胶原膜材料进行兔体内板层角膜移植术后，能够在兔角膜基质细胞中观察到绿色荧光，说明Col-microRNA-133b胶原膜材料有很好的microRNA释放效果，并且释放的microRNA-133b可以进入兔角膜基质细胞。
图6为实施例1的Col-microRNA-133b胶原膜进行兔体内板层角膜移植术7天后修复效果检测照片，由图6可知：Col-microRNA-133b胶原膜材料进行兔体内板层角膜移植术7天后，手术区域已经恢复透明性，修复观察情况优异。
图7为实施例1的Col-microRNA-133b胶原膜进行兔体内板层角膜移植术7天后上皮化效果检测照片，由图7可知：Col-microRNA-133b胶原膜材料进行兔体内板层角膜移植术7天后内即实现上皮化。
图8为实施例1的Col-microRNA-133b胶原膜进行兔体内板层角膜移植术7天后的OCT基质扫描图像，由图8可知：Col-microRNA-133b胶原膜材料进行兔体内板层角膜移植术后，角膜厚度有所恢复，基质层有了明显的修复，并且并没有产生白色条带，表明在术后7天内最容易形成瘢痕的时间里角膜基质并没有形成瘢痕化修复。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种具有基质修复能力的角膜修复材料的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将microRNA-133b用DEPC处理水配制成microRNA-133b溶液；
2)将胶原加入到盐酸DEPC处理水溶液或乙酸DEPC处理水溶液中，搅拌均匀，除去溶液中的气泡，得到胶原溶液；
3)将胶原溶液倒入模具中，干燥成膜，脱除模具，用水多次洗涤，干燥，得到胶原膜；
4)将金纳米颗粒用DEPC处理水配制成金纳米颗粒溶液；
5)将配置好的microRNA-133b溶液与金纳米颗粒溶液混合均匀，得到混合溶液；
6)将步骤5)中的混合溶液均匀滴加到步骤3)中的胶原膜上，干燥，即得到具有基质修复能力的角膜修复材料。
2.根据权利要求1所述的一种具有基质修复能力的角膜修复材料的制备方法，其特征在于：步骤1)所述microRNA-133b溶液的摩尔浓度为15～25μmol/L。
3.根据权利要求1或2所述的一种具有基质修复能力的角膜修复材料的制备方法，其特征在于：步骤2)所述胶原为从牛肌腱中提取的经纯化过的I型胶原。
4.根据权利要求3所述的一种具有基质修复能力的角膜修复材料的制备方法，其特征在于：步骤2)所述胶原溶液的质量浓度为6.0～7.0mg/mL。
5.根据权利要求4所述的一种具有基质修复能力的角膜修复材料的制备方法，其特征在于：步骤2)所述盐酸DEPC处理水溶液的摩尔浓度为0.001～0.01mol/L；步骤2)所述乙酸DEPC处理水溶液的摩尔浓度为0.05～0.15mol/L。
6.根据权利要求5所述的一种具有基质修复能力的角膜修复材料的制备方法，其特征在于：步骤4)所述金纳米颗粒溶液的质量浓度为0.025～0.045mg/mL；步骤4)所述金纳米颗粒的粒径为70～120nm。
7.根据权利要求6所述的一种具有基质修复能力的角膜修复材料的制备方法，其特征在于：步骤5)所述混合溶液中microRNA-133b、金纳米颗粒的质量比为1：(2～4)。
8.根据权利要求7所述的一种具有基质修复能力的角膜修复材料的制备方法，其特征在于：步骤6)所述混合溶液的体积与胶原膜的表面积的比为250μL：(800～1200)mm2。
9.权利要求8所述的方法制备的一种具有基质修复能力的角膜修复材料。
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microRNA Signature in Wound Healing Following Excimer Laser Ablation: Role of miR-133b on TGFβ1,CTGF, SMA, and COL1A1 Expression Levels in Rabbit Corneal Fibroblasts;Paulette M. Robinson, Tsai-Der Chuang，et al;《biochemistry and Molecular Biology》;20131023;第54卷(第10期);6944页摘要结论部分，6945页左栏第4段，6949页右栏第2段，6946页左栏表格、右栏第1段

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