CN110975012B - 去上皮细胞羊膜的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及去上皮细胞羊膜的制备方法。具体地说，该方法包括以下步骤：羊膜组织的分离；羊膜组织的清洗；羊膜上皮细胞的消化，用含有胰蛋白酶及EDTA的消化液消化羊膜上皮细胞30min；羊膜上皮细胞的刮除；去上皮细胞羊膜的染色鉴定；羊膜组织的冻存。所述消化液中包含胰蛋白酶和EDTA。本发明还涉及一种去上皮细胞羊膜，其是根据本发明所述方法制备得到的。本发明方法呈现如说明书所述优异技术效果。

Description

去上皮细胞羊膜的制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及去除羊膜上皮细胞的方法，尤其涉及一种快速高效的去除羊膜上皮细胞的方法。

背景技术

1、在机体损伤和疾病康复过程中，受损组织和器官的修复与重建一直是生物学和临床医学面临的重大难题。据报道，全世界每年约有上千万人遭受各种形式的创伤，有数百万人因疾病康复过程中的重要器官发生纤维化而导致功能丧失。一直以来，对于只采用药物疗法而不能得以恢复的严重损伤，不得不依靠人工脏器或器官移植来解决。然而，器官移植尽管有其巨大的治疗作用，但它依然是一种有损伤有代价的治疗方法，而且由于受到伦理以及机体免疫排斥等方面的限制，很难满足临床救治的需要。因此，借助于现代科学技术的发展，如何使受损的组织器官再生或在体外复制出所需要的组织或器官进行替代性治疗便成为生物学、基础医学和临床医学关注的焦点。

人羊膜是来源于胎儿的胚胎早期产物，厚约0.02-0.05mm，透明、有韧性，无血管、神经和淋巴管。作为胎盘的一部分，羊膜为胎儿提供可调节的符合局部运动的空间和适宜环境，通过滤过和物理缓冲作用，分泌营养因子，保持羊水中水和电解质平衡，抑制母体对胚胎的免疫反应等方式保护发生中的胚胎。羊膜主要分为上皮层、基底层、致密层、纤维母细胞层和海绵层五部分，其中上皮层为单层上皮细胞。

结膜损伤是常见的眼表疾病。以往大多采用口唇黏膜作为结膜替代物，取材繁琐，术后外观欠佳，给患者增加了一定的痛苦。而采用羊膜替代结膜重建眼表，手术程序相对简单，残存的结膜细胞能很快在羊膜上爬行生长，术后外观及功能均较为满意。羊膜自身的一些特点决定了它比较适用于眼表重建。羊膜组织因其独特的结构也在防止角膜结膜化、血管化、感染及睑球粘连等方面具有独特的作用，目前已广泛应用于眼科临床。并且经处理后羊膜组织在硬脊膜损伤、糖尿病导致的难愈性皮肤溃疡、烧伤、半月板组织工程细胞支架、阴道和宫颈发育不良等方面均具有良好的应用效果。

羊膜应用于临床前需要去除上皮细胞。然而现有方法在清除羊膜上皮细胞方面的效果不甚理想。例如，CN 109321517A(201811259326.0，九州)涉及一种人羊膜间充质干细胞的高效分离、扩增方法，包括：一、试剂；二、两步酶消化法分离羊膜间充质干细胞；三、羊膜间充质干细胞传代培养。据信该发明与现有的羊膜间充质干细胞分离方法相比，使用两步酶消化法分离羊膜间充质干细胞，第一步去除羊膜上皮细胞，且消化两次，使羊膜上皮细胞去除的更充分，获得的羊膜间充质干细胞纯度更高，并且操作简单，无需组织及细胞过滤，使用DNase Ⅰ避免羊膜间充质干细胞进入消化粘液中而无法分离，获得的干细胞数量更多。整个分离过程无动物源性成分，安全性好，便于后续的研究应用。

CN110218697A(201910400511.5，南医)公开了一种羊膜干细胞提取、培养的方法，该方法包括以下步骤：(1)将健康羊膜从胎盘上机械分离后进行洗涤以除去血液和残片；(2)将洗涤后的羊膜用混合液1浸泡0.5～1h后，用三羟甲基氨基甲烷缓冲液清洗，用细胞刮轻刮羊膜表面去除上皮细胞，PBS冲洗3～5次，机械剪碎；其中，所述混合液1为含0.03～0.05％(w/v)十二烷基硫酸钠和0.1～0.5％(w/v)乙二胺四乙酸的三羟甲基氨基甲烷缓冲液；(3)将羊膜碎片加入到混合液2中，消化至羊膜碎片基本消失；其中，所述混合液2为含2～3g/L Ⅱ型胶原酶、0.05～0.1g/L DNase Ⅰ和15％胎牛血清的α-MEM培养基的混和溶液；(4)将羊膜消化悬液1/2X ml叠加在分离液上，1500～2000rpm离心30min，吸取第二层悬液；(5)将所述第二层悬液放在培养基中进行重悬，将悬浮液接种于细胞培养皿后恒温培养。据信该发明羊膜干细胞提取效率更高、纯度更高。

CN108048391A(201711383742.7，睿泰)涉及一种单向式羊膜脱细胞方法，包括以下步骤：a)新鲜羊膜的剥离和清洗；b)将步骤a)所得羊膜平铺固定在具有平面的支撑体上；c)将b)步骤处理的羊膜放入脱细胞溶液中处理；d)将c)步骤处理的羊膜洗涤后放入核酸酶溶液中处理；e)将d)步骤处理的羊膜洗涤后得到人脱细胞羊膜。与现有技术相比，本发明结合了羊膜结构特点，采用单向式脱细胞方法，将羊膜基质层保护起来，使羊膜平铺展开，上皮面充分接触脱细胞溶液，有利于彻底脱出羊膜上皮细胞，而基质层极少量的细胞则由于组织的渗透性只接触少量脱细胞溶液而被脱除。该脱细胞方法操作简单、方便，保证了工艺的稳定性，有利于大规模生产。

CN105497983A(201510945558.1，康婷)涉及一种简单高效的干细胞贴片制备方法，步骤如下：羊膜组织的获取及前处理；羊膜上皮细胞的消化与刮除；羊膜上皮细胞消化后的鉴定；制备干细胞贴片。该种干细胞贴片制备方法，利用自配的羊膜上皮细胞消化液，解决了目前羊膜上皮细胞消化过程复杂，羊膜结构保持不完整的技术难点，该消化液能简单快速的去除羊膜上皮层细胞，不仅可以缩短去羊膜上皮细胞时间，提高上皮细胞消化效率，同时能保持羊膜的完整性及原有的细胞外基质成分，维持其生物学活性，以去上皮细胞的羊膜作为生物支架材料，将脐带来源的间充质干细胞负载在去上皮细胞的羊膜上，制成干细胞贴片，用于临床外敷治疗糖尿病足，起到很好的治疗效果。

CN102631707A(201210136678.3，厦大)公开了一种基于羊膜的生物材料，其是一种去上皮的羊膜组织。所述基于羊膜的生物材料，即去上皮的羊膜组织的制备方法如下：将羊膜组织进行去上皮处理，去除羊膜上皮细胞，得基于羊膜的生物材料。所述基于羊膜的生物材料可作为促进粘膜上皮修复材料或上皮细胞修复材料等，以促进眼表、口腔、呼吸道、胃、阴道粘膜组织重建。实施过程安全可靠易于实施。羊膜来源广，去上皮羊膜制备方便。羊膜移植手术操作简单易行。

CN1369555A(CN1205333C，02116305.7，雪原)涉及用作组织工程支架的一种羊膜组织工程支架及羊膜脱细胞方法。该组织工程支架是去除了上皮细胞层的上皮细胞和纤维母细胞层的纤维母细胞的羊膜，或是去除了上皮细胞层的上皮细胞的羊膜。羊膜脱细胞方法的特征在于:(1)用0.2-5％的胰蛋白酶溶液，在37℃温度下浸泡羊膜20-25分钟；(2)固定羊膜，在浸泡过程中或浸泡后进行搅拌冲洗，将羊膜上皮细胞层的上皮细胞和纤维母细胞层的纤维母细胞冲掉。本发明羊膜组织工程支架及羊膜脱细胞方法，使用羊膜做组织工程支架来源充足，不会产生免疫反应；而本发明提供的羊膜脱细胞方法简单，便于批量生产，成本低。为组织工程大规模产业化创造了前提条件，具有巨大的经济效益和良好的社会效益。

CN106730001A(201611104584.2，医佳)提供了一种脱细胞生物羊膜的制备方法，包括羊膜的清洗、化学处理和冷冻干燥。该方法是将新鲜羊膜用生理盐水清洗干净，洗去羊膜上的残留血液，再一次用过氧化氢、丙酮、十二烷基硫酸钠、酒精处理后，在～70℃下的环境中深低温冷冻16～25小时，然后将其放入冷冻干燥机中，按照设定好的冻干曲线进行冷冻干燥。辐照灭菌后得到脱细胞生物羊膜的成品。本发明使用过氧化氢、丙酮、十二烷基硫酸钠、酒精联合处理羊膜，可以有效地除去羊膜中的上皮细胞层、纤维膜细胞层和海绵层具有免疫原性的成分，同时保留了其基底膜和致密层，较好的保留了羊膜的生物活性和生物力学性能；另一方面通过冷冻干燥处理可以进一步的减少脱细胞生物羊膜的免疫原性，降低宿主细胞的免疫排斥反应。另外，本发明设计的脱细胞生物羊膜的制备方法简单易行，方便规模化生产操作。该发明制备方法具体包括以下步骤进行：(1)将新鲜羊膜用生理盐水反复清洗，直至无残留血液；(2)将步骤(1)所得的羊膜用体积质量比为5～8:1比例的过氧化氢溶液浸泡2小时；(3)将步骤(2)所得的羊膜用体积质量比为5～8:1比例的分析纯的丙酮浸泡，水浴恒温震荡脱去脂肪成分；(4)将步骤(3)所得的羊膜用体积质量比为5～8:1比例的十二烷基硫酸钠溶液浸泡16～20小时；(5)将步骤(4)所得的羊膜用体积质量比为5～8:1比例的酒精浸泡16～20小时；(6)将步骤(5)所得的羊膜用大量纯化水反复清洗至末道清洗液pH值为6.5～7.5；(7)将步骤(6)所得的羊膜放入～70℃下的环境中冷冻16～25小时；(8)将步骤(7)所得的羊膜放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥；(9)将步骤(8)所得的羊膜进行辐照灭菌。该文献方法使用过氧化氢、丙酮等强腐蚀性试剂或毒性有机溶剂制备的羊膜无法用于眼科领域。

CN101843923A(201010102340.7，海大)公开了一种利用新鲜羊膜制备组织工程人工角膜内皮载体支架的方法，采用1∶1000硫酸妥布霉素液对新鲜羊膜进行浸泡消毒，经胰蛋白酶-EDTA消化液倒置消化后，用细胞刮刀轻刮羊膜上皮面以全部去除残留上皮细胞，获得去上皮层羊膜，平铺在培养板孔中牢固干贴后，用去上皮层羊膜专用包被液进行包被处理，吸出包被液晾干后即可作为组织工程人工角膜内皮的载体支架使用。据信该发明工艺科学合理，所制备的载体支架可批量生产，以满足组织工程人工角膜内皮规模化重建对载体支架的大量需求，为角膜内皮盲通过临床角膜移植而复明创造条件，且该载体支架制备方法应用于组织工程人工角膜内皮体外重建和临床治疗的成本低。该发明的方法具体如下：首先用眼科镊撕除低温保存新鲜羊膜的纤维细胞层和海绵层，用0.9％生理盐水冲洗干净后，放入1∶1000硫酸妥布霉素液中，置无菌操作台内浸泡消毒20～30分钟后，用无菌D-Hanks溶液漂洗3～5分钟；再依次采用倒置消化法和细胞刮刀刮除法制备出去上皮层羊膜，用打孔器将羊膜打成直径15.6毫米的圆片，按上皮面朝上平铺于24孔培养板孔中，放入5％CO2培养箱中、37℃进行干贴15～25小时；在无菌条件下向干贴有羊膜的24孔培养板孔中，按1毫升/孔的量加入去上皮层羊膜专用包被液，将培养板置37℃培养箱中包被处理15～25小时，再无菌吸出包被液，晾干后即可作为组织工程人工角膜内皮的载体支架；所述去上皮层羊膜专用包被液的配方为D-Hanks溶液和0.075‰～0.125‰IV型胶原。

然而，本发明人发现，上述各文献在去除羊膜上皮细胞的过程中，上皮细胞去除的效果并不理想、并不完全，或者不能适用于临床。

因此，本领域技术人员仍然期待有新的用于去除羊膜上皮细胞的方法，例如这种方法能够以更完全的效果除去上皮细胞。

发明内容

本发明内容目的在于提供一种简单高效的羊膜上皮细胞消化方法，快速获得完整光滑的羊膜组织，并且上皮细胞去除更完全，以便于后续组织工程的应用。本发明人已经发现通过本发明方法获取去上皮细胞的羊膜，呈现如本发明说明书所述一个或者多个方面的技术效果。

为此，本发明第一方面提供了一种制备去上皮细胞羊膜的方法，该方法包括以下步骤：

1、羊膜组织的分离：获得新鲜、健康的围产期胎盘组织，将羊膜与胎盘剥离；

2、羊膜组织的清洗：采用含抗生素的生理盐水(例如含青霉素100IU/ml、链霉素100μg/ml)清洗羊膜数次，洗去其上附着的血渍、血块、脂肪之类的杂质；然后区分羊膜上皮细胞层及下层，用细胞刮刀刮去羊膜表面的粘性物质(黏液)，将上皮细胞层向上平铺在硝酸纤维素膜上；

3、羊膜上皮细胞的消化：用含有胰蛋白酶及EDTA的消化液消化羊膜上皮细胞30min；

4、羊膜上皮细胞的刮除：将消化后的羊膜组织平铺于硝酸纤维素膜上，使上皮细胞层向上，用细胞刮刀小心的顺向刮除羊膜上的细胞，然后用含抗生素的生理盐水反复冲洗数次；

5、去上皮细胞羊膜的染色鉴定：利用伊红-苏木精对羊膜进行染色，镜下观察羊膜上皮细胞的消化效果；

6、羊膜组织的冻存：将消化后的羊膜组织置组织冻存液中，于-80℃冰箱中保存。

根据本发明第一方面的方法，其中所述消化液中包含0.3％胰蛋白酶和0.04％EDTA。

根据本发明第一方面的方法，其中所述消化液是照如下操作配制的：称取0.3g胰蛋白酶粉末、0.04g的EDTA粉末倒入烧杯中，加入100mlPBS缓冲液，轻轻搅拌混匀直到溶液中无块状结晶，用0.22μm微孔滤膜过滤，得消化液。

根据本发明第一方面的方法，其中羊膜上皮细胞的消化是照如下操作进行的：

在肾形盘中放入100ml含双抗的PBS缓冲液，打开离心管口，用镊子小心夹出载有羊膜的硝酸纤维素膜，缓慢的放入PBS缓冲液中清洗三次，以洗净羊膜表面的存在的冻存液或者其它物质，羊膜恢复乳白色为宜，清洗过程中勿使羊膜从硝酸纤维素膜上脱落；

将洗净的羊膜放置在无菌平皿上干燥5min，期间始终保持羊膜上皮细胞面向上；

用镊子轻轻夹住硝酸纤维素膜的一端，用手术剪刀将羊膜剪成所需的尺寸，必要时设对照组；

在按照羊膜尺寸的大小选择合适的消化容器内添加PBS缓冲液使容器润洗，吸去PBS，分别将实验组羊膜及对照组羊膜平铺于容器底，用镊子轻轻按压羊膜，使之与孔底贴牢；

在实验容器中添加消化液，并在对照容器中添加等体积的PBS，轻轻晃动使均匀，再将其置于37℃的5％CO2培养箱中，消化30min。

根据本发明第一方面的方法，其中消化过程中使用的容器是6孔板或无菌培养皿。

根据本发明第一方面的方法，其中羊膜上皮细胞的刮除是照如下方式进行的：在烧杯中加入PBS缓冲液，用镊子将消化后的羊膜取出，置烧杯中反复冲洗，以洗净表面的消化液，将羊膜面向上放置在无菌平皿中，用细胞刮刀刮除残留的上皮细胞。

根据本发明第一方面的方法，其中所述组织冻存液是包含甘油和氯化钠的溶液。

进一步的，本发明第二方面提供了一种去上皮细胞羊膜，其是根据如下方法制备得到的：

1、羊膜组织的分离：获得新鲜、健康的围产期胎盘组织，将羊膜与胎盘剥离；

2、羊膜组织的清洗：采用含抗生素的生理盐水(例如含青霉素100IU/ml、链霉素100μg/ml)清洗羊膜数次，洗去其上附着的血渍、血块、脂肪之类的杂质；然后区分羊膜上皮细胞层及下层，用细胞刮刀刮去羊膜表面的粘性物质(黏液)，将上皮细胞层向上平铺在硝酸纤维素膜上；

3、羊膜上皮细胞的消化：用含有胰蛋白酶及EDTA的消化液消化羊膜上皮细胞30min；

4、羊膜上皮细胞的刮除：将消化后的羊膜组织平铺于硝酸纤维素膜上，使上皮细胞层向上，用细胞刮刀小心的顺向刮除羊膜上的细胞，然后用含抗生素的生理盐水反复冲洗数次；

5、去上皮细胞羊膜的染色鉴定：利用伊红-苏木精对羊膜进行染色，镜下观察羊膜上皮细胞的消化效果；

6、羊膜组织的冻存：将消化后的羊膜组织置组织冻存液中，于-80℃冰箱中保存。

根据本发明第二方面的去上皮细胞羊膜，其中所述消化液中包含0.3％胰蛋白酶和0.04％EDTA。

根据本发明第二方面的去上皮细胞羊膜，其中所述消化液是照如下操作配制的：称取0.3g胰蛋白酶粉末、0.04g的EDTA粉末倒入烧杯中，加入100ml去离子水，轻轻搅拌混匀直到溶液中无块状结晶，用0.22μm微孔滤膜过滤，得消化液。

根据本发明第二方面的去上皮细胞羊膜，其中羊膜上皮细胞的消化是照如下操作进行的：

在肾形盘中放入100ml含双抗的PBS缓冲液，打开离心管口，用镊子小心夹出载有羊膜的硝酸纤维素膜，缓慢的放入PBS缓冲液中清洗三次，以洗净羊膜表面的存在的冻存液或者其它物质，羊膜恢复乳白色为宜，清洗过程中勿使羊膜从硝酸纤维素膜上脱落；

将洗净的羊膜放置在无菌平皿上干燥5min，期间始终保持羊膜上皮细胞面向上；

用镊子轻轻夹住硝酸纤维素膜的一端，用手术剪刀将羊膜剪成所需的尺寸，必要时设对照组；

在按照羊膜尺寸的大小选择合适的消化容器内添加PBS缓冲液使容器润洗，吸去PBS，分别将实验组羊膜及对照组羊膜平铺于容器底，用镊子轻轻按压羊膜，使之与孔底贴牢；

在实验容器中添加消化液，并在对照容器中添加等体积的PBS，轻轻晃动使均匀，再将其置于37℃的5％CO2培养箱中，消化30min。

根据本发明第二方面的去上皮细胞羊膜，其中消化过程中使用的容器是6孔板或无菌培养皿。

根据本发明第二方面的去上皮细胞羊膜，其中羊膜上皮细胞的刮除是照如下方式进行的：在烧杯中加入PBS缓冲液，用镊子将消化后的羊膜取出，置烧杯中反复冲洗，以洗净表面的消化液，将羊膜面向上放置在无菌平皿中，用细胞刮刀刮除残留的上皮细胞。

根据本发明第二方面的去上皮细胞羊膜，其中所述组织冻存液是包含甘油和氯化钠的溶液。

在本发明上述制备方法的步骤中，虽然其描述的具体步骤在某些细节上或者语言描述上与下文具体实施方式部分的制备例中所描述的步骤有所区别，然而，本领域技术人员根据本发明全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。

本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。下面对本发明作进一步的描述。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

羊膜为单层上皮细胞互相连接构成的薄膜。单层上皮细胞具有分泌羊水的作用。随着胚胎的生长发育，羊膜与绒毛密切紧贴，形成胎膜。胎膜随着羊膜腔逐渐扩大而呈半透明的薄膜，无血管，富有韧性(胎膜也就是羊膜腔的囊壁)。羊膜腔内充满的液体为羊水。羊膜仅覆盖在胎盘的儿体面，并不深入胎盘组织中，随着妊娠的进展羊膜腔逐渐扩大，占据整个子宫腔，羊膜是胎膜最内一层，是一层半透明的薄膜，与覆盖在胎盘、脐带的羊膜层相连接。

羊膜是胎盘的最内层，与人眼结膜组织结构相似，含有眼表上皮细胞，包括结膜细胞和角膜上皮细胞生长所需要的物质，其光滑，无血管、神经及淋巴，具有一定的弹性，厚约0.02～0.5mm，在电镜下，其分为五层：上皮层、基底膜、致密层、纤维母细胞层和海绵层，羊膜基底膜和基质层含有大量不同的胶元，主要为i、iii、iv、v、vii型胶原和纤维粘连蛋白、层粘连蛋白等成份，正是这些成份使羊膜可以充当“移植的基底膜”而发挥一种新的健康合适的基质作用来促进上皮化tseng认为人羊膜具有的这层较厚的基底膜及无血管的基质是决定移植成功的关键。

动物实验和临床观察显示：羊膜基底膜可促进结膜干细胞分化为结膜上皮细胞、促进结膜上皮向角膜上皮转化，促进角膜缘干细胞增殖及提供一个有助于其生长的微环境，促进角膜上皮细胞移行、促进角膜基质胶元纤维增生、抑制结膜下纤维组织增生、抑制新生血管增生，具有抗炎、抗菌等功能。boudreau等发现羊膜基底膜能阻止上皮细胞凋亡，促进上皮细胞的分化及增殖。羊膜尤其新鲜羊膜能产生一些生长因子如：碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)、肝细胞生长因子(hgf)和转化生长因子-β(tgf-β)等，这些因子能促进上皮化发生，有利于上皮细胞的分化、移行和增强上皮细胞的粘附性。羊膜产生的gb4、gb9、gb11三种单克隆抗体，有助上皮细胞的增殖、移行和分化，有利于创面迅速上皮化。

羊膜可阻止白细胞浸润，抑制多种蛋白酶如：胰蛋白酶、纤维蛋白酶、组织蛋白酶g、胶原蛋白酶等的活性，通过抑制相应的蛋白酶，从而减轻炎症程度、缩短炎症持续时间及抑制新生血管形成；羊膜还含有丰富的溶解酶、裂解体和补体，可以抑制炎症反应和抑制实质溶解。研究显示：羊膜的基质层一侧含有独特的间质成份能抑制转化生长因子β信号增生和抑制正常人类角膜、角膜缘纤维母细胞的肌纤维母细胞的增殖及分化为纤维细胞，因而羊膜具有抑制纤维化，减轻瘢痕形成的功能。akle等于1981年，andinolfi等于1982年分别报道了人羊膜上皮细胞表面不表达hla－a、b、c、dr抗原或β2微球蛋白。houlihan等于1995年研究报道人羊膜表达ib抗原、限制ia抗原，这些免疫学上的特点论证了羊膜无免疫原性。综上所述，羊膜的生物学特点，可见羊膜可作为一种新型、可靠的供体材料而应用于眼科临床。

羊膜的常规制备方法：取产前血清学检查排除乙型肝炎病毒(hbv)、丙型肝炎病毒(hcv)、梅毒及艾滋病病毒(hiv)感染的孕妇剖腹产后即获得的胎盘，无菌操作下，冲洗胎盘上的血迹及污物，在羊膜与绒毛膜之间钝性分离，获得光滑、半透明的羊膜后用含50ug/ml青霉素，50ug/ml链霉素，2.5ug/ml两性霉素及100ug/ml新霉素的平衡盐溶液浸泡20分钟，取出后上皮面朝上，平铺于含0.45um微孔的硝酸纤维素滤纸上，并剪成3cm×4cm大小，卷成筒状并用丝线绑紧。羊膜的常规保存方法有多种，常见的有以下几种：1)新鲜羊膜：取下并处理好的羊膜置于dmem培养基中，4℃冰箱保存，24小时内使用。2)深低温冷冻羊膜：取下并处理好羊膜分装于甘油-生理盐水混合储存液内，放置于-80℃低温冰箱内保存，2周后使用。3)甘油保存羊膜：取下并处理好的羊膜放入100％纯甘油瓶中，4℃冰箱保存，24小时后，无菌操作下，再移至另一个100％纯甘油瓶中，继续4℃冰箱保存。4)冻干羊膜：这种羊膜经r射线消毒，能在室温下保存2年。此材料比较脆、韧性差、易撕裂，手术时可把植片直接贴在植床上而不用缝线固定。使用时，用无菌生理盐水冲洗羊膜，再放入1：2000u庆大霉素溶液中，复水20～30分钟后使用。但是这些常规制备方法和常规保存方法提供的羊膜不能应用于眼科等疾病使用，原因在于这些方法提供的羊膜存在大量的上皮细胞。

根据本文实施例1～3的方法，对同一胎盘来源的羊膜进行6次处理，计算方法的上皮细胞去除率(％)平均值为87.3％，六次处理的上皮细胞去除率均在86.5～88.1％范围内。补充试验1：对同一胎盘来源的羊膜，分别照CN108048391A之[0084]段的方法、照CN105497983 A之[0055]至[0070]段的方法、照CN101843923B之[0014]至[0019]段的方法制得三种除上皮细胞羊膜，接着将此三种羊膜照本发明实施例3的方法测定并计算其上皮细胞去除率平均值，结果上述三种羊膜的上皮细胞去除率平均值分别为82.6±1.8％、84.3±2.3％、89.2±1.4％。补充试验2：参照本发明实施例1～3的方法，不同的仅是在配制消化液时，将所用EDTA用等量的乙二胺四乙酸钙钠代替(C10H12N2O8CaNa2，若乙二胺四乙酸钙钠为水合物例如C10H12N2O8CaNa2.2H2O，则折算成其无水物计)并随其增补添加0.25％组氨酸，即向PBS缓冲液添加胰蛋白酶、乙二胺四乙酸钙钠和组氨酸并使三者浓度分别为0.3％、0.04％和0.25％，用此组成的消化液进行试验；经测定，本补充试验2所得除上皮细胞羊膜的上皮细胞去除率平均值为98.9％，六次处理的上皮细胞去除率均在98.7～99.4％范围内。补充试验3：参照本发明实施例1～3的方法，不同的仅是在配制消化液时，将所用EDTA用等量的乙二胺四乙酸钙钠代替(C10H12N2O8CaNa2，若乙二胺四乙酸钙钠为水合物例如C10H12N2O8CaNa2.2H2O，则折算成其无水物计)，即向PBS缓冲液添加胰蛋白酶、乙二胺四乙酸钙钠并使二者浓度分别为0.3％和0.04％，用此组成的消化液进行试验；经测定，本补充试验3所得除上皮细胞羊膜的上皮细胞去除率平均值为87.3％，六次处理的上皮细胞去除率均在85.8～88.5％范围内。补充试验4：参照本发明实施例1～3的方法，不同的仅是在配制消化液时，随所用EDTA一起还增补添加0.25％组氨酸，即向PBS缓冲液添加胰蛋白酶、EDTA和组氨酸并使三者浓度分别为0.3％、0.04％和0.25％，用此组成的消化液进行试验；经测定，本补充试验4所得除上皮细胞羊膜的上皮细胞去除率平均值为85.4％，六次处理的上皮细胞去除率均在83.8～86.7％范围内。上述结果表明，本发明方法中采用包含0.3％胰蛋白酶、0.04％乙二胺四乙酸钙钠、0.25％组氨酸的PBS缓冲液作为消化液时，能够显著提高上皮细胞去除率。因此，根据本发明的任一方面的去上皮细胞羊膜，其中所述消化液包含0.3％胰蛋白酶、0.04％乙二胺四乙酸钙钠、0.25％组氨酸。根据本发明的任一方面的去上皮细胞羊膜，其中所述消化液是包含0.3％胰蛋白酶、0.04％乙二胺四乙酸钙钠、0.25％组氨酸的PBS缓冲液。

眼表疾病的化学烧伤、热烧伤引起的眼表疾病严重的眼表烧伤在急性期往往会导致角膜和结膜坏死、融解，甚至角膜穿孔，治疗的策略主要是去除坏死的组织，促进眼表上皮化，减轻炎症和阻止结、角膜的融解等，药物和传统的单纯手术切除效果往往不理想；陈旧性眼表烧伤者，其角膜表面坏死，血管新生，睑球粘连，组织瘢痕化，传统的角膜移植术常因发生严重的排斥反应而致手术失败。近几年来，国外anderson、国内周世有、陈俊洪等利用羊膜具有促进上皮粘附生长及增殖，减轻炎症，抑制新生血管形成，减少瘢痕增生，抗粘连等特性而把其应用于严重急性期或陈旧性眼表烧伤的治疗中去，获得了很好的临床效果。羊膜移植于缺损的眼表，提供一个含基底和基质成份的胶质支架，使增殖的上皮细胞可在其上扩展及移行；羊膜产生的gb4、gb9、gb11等单克隆抗体，有助上皮细胞的增殖、移行和分化，有助于角膜上皮缺损的修复；并且，羊膜有助于角膜缘干细胞的增殖并提供一个适合其生长的微环境，因此，羊膜移植可以促进正常结膜、角膜上皮化，达到真正结膜及角膜眼表的重建。

感染性及非感染性角膜溃疡的治疗方法有多种，如有：药物、软性接触镜、结膜瓣遮盖术和角膜移植术等。前三种方法疗效不肯定，常致视力丧失；后一种效果相对较好，但移植材料来源困难，且术后出现排斥反应、继发性青光眼等并发症的机率大而令其难以广泛开展。近几年来，国外lee等、kruse等、国内丁亚莉、吴护平等分别报道了利用羊膜移植治疗不同病因的角膜溃疡，取得了理想的临床效果，国内王宇宏报道应用羊膜移植治疗24例真菌性角膜溃疡，均获得成功。羊膜可产生多种生长因子如：bfgf、hgf、tgf-β等，它们有利于上皮细胞的分化、移行，可增强上皮细胞的粘附性和调节结膜上皮细胞转化为角膜型上皮细胞，并可作为支架组织代替部分角膜组织，补充角膜基质内被破坏的胶原，为上皮生长提供基底膜；羊膜可抑制多种蛋白酶及多种白细胞溶解酶的活性，促进成纤维细胞的再生及胶原组织的再构造，从而可以清除角膜坏死组织、促进组织的愈合和阻止角膜溶解。可见，羊膜移植治疗角膜溃疡，可以有效控制炎症，促进溃疡愈合，重建眼表结构，是一种行之有效的方法。

大泡性角膜病变的起因是角膜内皮功能失代偿，导致基质水肿，乃至上皮出现大泡。治疗方法有药物、软性接触镜、角膜移植、角膜层间灼烙术等，但疗效不是不理想，就是难以普及。近年来，随着羊膜在眼科领域的逐渐开展，它也被用来治疗大泡性角膜病变并取得了可喜的临床疗效。羊膜具有一层人体最厚的基底膜，富含iv、v型等胶原和层粘连蛋白，可作为一个“底物”供正常健康的上皮细胞在其上分化、移行；且具有活跃物质转运功能，允许一些小分子物质如氯化钠等通过，这样可以确保移植之羊膜和病损的组织易于进行物质和能量交换；再者，羊膜可产生多种生长因子，从而促进上皮细胞的分化、移行，增强基底上皮细胞的粘附，阻止上皮细胞的凋亡；而且羊膜具有抑制纤维化、减轻瘢痕、抑制新生血管及降低炎症的功能。因而用羊膜来治疗大泡性角膜病变能够提供一个理想的基底膜促进角膜上皮修复，重建一个相对健康的眼表组织结构。

原发性或复发性翼状胬是眼科常见疾病，治疗以手术切除为主，而单纯的手术切除复发率较高，一般为30％～50％，甚至高达69％。不少眼科医生在翼状胬肉切除手术中联合丝裂霉素或联合结膜移植、角膜缘干细胞移植等，这些复合的术式虽可降低复发率，但由于丝裂霉素会对正常的结膜、角膜、巩膜组织，甚至晶体、视神经、视网膜都有可能带来毒性作用；联合异体结膜移植或角膜缘干细胞移植由于异体移植材料来源狭窄而令手术难以开展，且术后可能出现排斥反应，而自体的结膜、角膜缘干细胞移植可能造成局部组织缺损、瘢痕形成等，会影响未来手术如白内障、青光眼手术的操作。近年来，羊膜作为一种新型的生物材料，不少眼科医生把它应用到原发性或复发性翼状胬肉切除术中，取得了令人满意的效果，因为羊膜基质中含有的多种蛋白酶抑制剂，不但能抑制胬肉纤维细胞的分化，并能促进角膜缘干细胞的增殖、分化，有利于角膜上皮细胞的生长、移行和防止其调亡，且羊膜具有抗纤维化和抗新生血管形成等功能。因此翼状胬肉切除联合羊膜移植术，可促进角膜上皮创面的修复，降低术后复发率，且羊膜覆盖于裸露的巩膜创面上，可降低术后炎症反应，减轻病人痛苦。

其他结膜疾病某些眼部或全身系统性疾病所致的结膜囊狭窄，stevens～johson综合征引起的睑球粘连，大面积结膜肿瘤，义眼座暴露等疾病的治疗对眼科医生来说是一个棘手的问题，这些疾病病变范围往往较大，病损组织往往亦较多，因此手术切除的区域相对较大，修复的难度亦相对较高。既往应用自体结膜、唇粘膜、鼻粘膜，甚至阴道粘膜来进行修复，但由于材料来源困难而影响手术的开展。国内卢蓉等人根据保存羊膜的基底膜利于上皮细胞分化、移行，能加强上皮细胞的粘附，阻止上皮细胞凋亡，可抑制纤维血管组织形成，消炎、抗菌、止痛等生物学特性而把保存羊膜应用于结膜重建术中并取得了令人鼓舞的效果，羊膜植于眼表后可作为一种桥梁，促进周边正常结膜上皮细胞在其上移行，最终达到修复结膜病损的目的。

青光眼是眼科一种常见的、复杂的、致盲率很高的疾病，目前，手术是治疗该病的一种重要手段，其中小梁切除术和非穿透小梁切除术是治疗闭角型青光眼和开角型青光眼的两种主要滤过术式。青光眼滤过术的成功与否要看周围外滤通道及手术区有无被增生的纤维组织堵塞，也就是滤过通道及滤过泡有无被瘢痕化。目前，在小梁切除手术中，很多术者用5-氟尿嘧啶或丝裂霉素等抗代谢药物来抗瘢痕的形成，但这会导致角膜毒性反应、结膜伤口渗漏、持续性低眼压、滤过泡苍白等不良作用；非穿透性小梁切除术是近年来发展起来的一种新的抗青光眼手术，术中联合应用sk－gel或胶原等生物胶，可使手术效果更好，但由于这些生物胶来源有限、价格昂贵而令此术式难以普及。羊膜基质中含有抑制tgf－β信号传递和抑制成纤维细胞增殖、分化为纤维细胞的成份，从而减少滤过通道及滤过泡的瘢痕增生；羊膜中含有多种蛋白酶抑制剂如：α1-抗胰蛋白酶、α2-巨球蛋白、α2-纤维蛋白溶解抑制剂等可以阻止己分离或破损组织表面的粘连，有利于滤过通道的通畅和滤过泡的形成、维持，再者，羊膜基质自身为一层胶原结构，可以隔开巩膜瓣和巩膜床创面，阻止创面的纤维组织粘连和增生，同时羊膜还具有清除炎症细胞，减轻炎症反应和降低血管化等特性。国内翼建平，杨静等眼科医生利用羊膜这些特性而把羊膜应用于小梁切除和非穿透小梁切除术中去，取得很好的临床效果。用羊膜代替抗代谢药物，可减少眼部的不良作用，用羊膜代替生物胶，使手术成本下降，令其更易广泛开展。

角膜缘缺损较大患者单纯行羊膜移植术效果不佳，需再联合角膜缘干细胞移植术，才能更好地重建角膜表面结构，眼科临床医生必须认识到这点，否则就有可能令手术以失败告终；保存羊膜移植需要受体眼有一定量的健康球结膜组织，否则羊膜得不到足够的营养和支持，移植片会过早降解而令手术失败，此点，令羊膜在大面积的眼表疾病应用时后果欠佳；羊膜移植重建急性期眼表烧伤的手术时机还有待临床的进一步观察；冻干羊膜哪一面贴于眼表，才能取得更好的疗效，还需临床进一步验证。

但不论怎样，羊膜作为一种新型的生物材料应用于眼科，尤其眼表疾病，取得了神奇的效果，而且它来源广泛，价格低廉，取材和保存简便，手术操作简单而且几乎不发生免疫排斥反应，十分适宜在基层医院开展。需要强调一点是手术应在显微镜下操作，这样既能干净清除病变组织，又能有效减轻手术创伤。羊膜是否还含有其他不为人所知的细胞因子，已经检测出的几种生长因子的确切机制尚未十分明了；新鲜羊膜中的各种活性成份是否会对内眼手术有影响；羊膜移植术进行眼表重建具有的抑制基质细胞增生及抑制新生血管形成的机制有待进一步研究，这些还需要眼科基础研究人员及眼科临床医生的不懈探索。相信，伴随着其他相关学科的发展，在广大眼科工作者的共同努力下，羊膜将会有更多的神奇功能应用于眼科临床。

本发明制备去上皮细胞羊膜的方法，呈现如本发明所述优异技术效果。

附图说明

图1为未消化的羊膜组织伊红苏木精染色镜下图。

图2为消化后的羊膜组织伊红苏木精染色镜下图。

具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。以下提供了本发明实施方式中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

在本文中，提及的PBS缓冲液或者PBS溶液或者PBS等，如未特别说明，均是指pH6.8的磷酸盐缓冲液，其配制方法为：取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml，加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml，用水稀释至1000ml，摇勻，即得。在本文中，提及的冻存液或者组织冻存液，如未另外说明，是指包含2.5％甘油的生理盐水溶液。

实施例1、钝性分离人胎盘羊膜组织

1、羊膜取自剖腹产产妇的胎盘，术前检测孕母血清HbsAg、抗-HCV、HCV-RNA、抗-HDV、抗HEV、抗-HIV-1/2、HIV-1-RNA、CMV-DNA，结果均为阴性方可使用。

2、将含有100U/ml双抗(含青霉素100IU/ml、链霉素100μg/ml)的生理盐水倒入3个200ml灭菌烧杯中待用。

3、将装有胎盘的无菌袋表面喷淋75％酒精消毒，迅速移入超净台中。将胎盘从无菌袋中取出，放置于无菌培养皿上，脐带面向上。用手术剪刀或刀片沿脐带根部与胎盘连接处轻轻剪出一个小口，用止血钳或手钝性分离羊膜层与绒毛层。

4、将剥下的羊膜用镊子夹紧，放入上述3个烧杯中反复冲洗，以洗净表面的血凝块及污渍。处理过的羊膜应是不含血管、淋巴、神经的半透明薄膜。

5、将洗净的羊膜放置于无菌平皿中，双手持镊子小心将羊膜充分展开，使之无卷曲，无重叠及粘附。

6、在超净台灯下仔细观察羊膜表层，如表层折光度高，则说明该层是羊膜基底层，用23mm细胞刮刀轻轻刮去表层黏液。并用含双抗的生理盐水冲洗，重复操作，若表层光滑，则说明该层为羊膜上皮细胞层，在该层做一记号。

7、将紫外灯照射过的硝酸纤维素膜浸入PBS溶液，使其充分湿润，放置于无菌平皿上。双手持镊子夹住羊膜两端放置于硝酸纤维素膜上，上皮细胞层面向上，并使之充分展开，必要时加入冻存液中使其于-80℃冻存。

实施例2、羊膜上皮细胞的消化及处理

1、消化液的配制：用电子天平准确称取0.3g胰蛋白酶粉末、0.04g的EDTA粉末倒入烧杯中，用量筒准确定容100ml的PBS缓冲液，倒入烧杯中，用玻璃棒轻轻搅拌混匀直到溶液中无块状结晶，配制成含0.3％胰蛋白酶+0.04％EDTA的消化液。将烧杯表面喷淋75％酒精消毒，迅速移入超净台。取两只50ml离心管，在管口处放置0.22μm滤器，用50ml注射器吸取消化液，插入到滤嘴处过滤溶液。

2、羊膜清洗：在肾形盘中放入约100ml含双抗的PBS缓冲液，打开离心管口，用镊子小心夹出载有羊膜的硝酸纤维素膜，缓慢的放入PBS缓冲液中清洗三次，以洗净羊膜表面的冻存液(如有)，羊膜恢复乳白色为宜。清洗过程中勿使羊膜从硝酸纤维素膜上脱落。

3、将洗净的羊膜放置在无菌平皿上干燥5min，期间始终保持羊膜上皮细胞面向上。

4、用镊子轻轻夹住硝酸纤维素膜的一端，用手术剪刀将羊膜剪成所需的尺寸，并设对照组。

5、按照羊膜尺寸的大小选择合适的消化容器(如：6孔板、无菌培养皿等)。以6孔板为例，选取两孔作为实验孔及对照孔。在每孔中添加1ml的PBS缓冲液润洗孔壁及孔底，吸去PBS。将实验组羊膜及对照组羊膜平铺于孔底，用镊子轻轻按压羊膜，使之与孔底贴牢。

6、消化：在实验孔中添加约2ml的0.3％胰蛋白酶+0.04％EDTA消化液，并在对照孔中添加等体积的PBS。盖上板盖，延逆时针方向轻轻晃动6孔板。再将6孔板置于37℃的5％CO2培养箱中，消化30min。

7、取一烧杯，在其中倒入约50ml的PBS缓冲液，用镊子将消化后的羊膜从6孔板中取出，放到烧杯中反复冲洗，以洗净表面的消化液。将羊膜标记面向上放置在无菌平皿中，左手持镊子按住羊膜一端，右手持细胞刮刀按同一方向轻轻刮除残留的上皮细胞。转动硝酸纤维素膜，重复上述操作。

8、将刮净的羊膜放入PBS中反复冲洗，洗去残留的上皮细胞。用手术刀片或剪刀取一小块实验组羊膜，同对照组行伊红-苏木精染色，观察消化效果。

实施例3、伊红-苏木精染色

伊红-苏木精染色的方法(例如以下所述的)是本领域公知的，本实施例对本发明方法获得的羊膜进行伊红-苏木精染色，以考察本发明所得羊膜的上皮细胞去除效果。消化组(上文实施例1和实施例2处理所得的羊膜)和对照组(未进行上文实施例1和实施例2处理的、与消化组邻近且具有可比性的羊膜)均按如下相同实验方法进行操作：

1、将消化去上皮细胞后的羊膜组织从硝酸纤维素膜上取下，浸入到含4％的多聚甲醛溶液中浸泡10分钟；

2、蒸馏水漂洗2分钟；再用新鲜的蒸馏水漂洗2分钟；

3、将漂洗后的羊膜组织上皮面向上平铺于6孔板的板底；

4、在羊膜上皮面表面滴加数滴苏木素(即苏木精)染液，使该染液完全覆盖于羊膜组织，染色5-10分钟；

5、用巴氏滴管吸取2ml蒸馏水，洗去羊膜组织表面的苏木素染液，并持续用蒸馏水对羊膜组织进行漂洗10分钟；

6、滴加2ml的95％乙醇，漂洗5秒钟；

7、滴加伊红染色液于羊膜组织，染色2分钟；

8、用70％的乙醇溶液洗涤染液2次；

9、95％乙醇溶液脱水2分钟；

10、换用新鲜的95％乙醇溶液再次脱水2分钟；

11、二甲苯溶液透明5分钟；

12、换用新鲜的二甲苯溶液再次透明5分钟；

13、用中性树胶将羊膜组织封片，显微镜下观察消化效果。

正常未消化的羊膜组织上皮细胞细胞核呈蓝色，细胞浆呈粉红色，如图1所示；消化后的羊膜组织不着色，如图2所示。对于消化组和对照组，在相同放大倍数条件下，计算相同面积的视野中染色细胞(即被染成蓝核-粉红浆色的上皮细胞)的个数，对照组染色细胞数(可记录不少于一千个上皮细胞的视野)记为M0，消化组染色细胞数记为M1，按下式计算消化组的上皮细胞去除率：

上皮细胞去除率(％)＝[(M0-M1)÷M0]×100％

根据本文实施例1～3的方法，对同一胎盘来源的羊膜进行6次处理，计算方法的上皮细胞去除率(％)平均值。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (11)

1.制备去上皮细胞羊膜的方法，该方法包括以下步骤：

(1)羊膜组织的分离：获得新鲜、健康的围产期胎盘组织，将羊膜与胎盘剥离；

(2)羊膜组织的清洗：采用含青霉素100IU/ml、链霉素100µg/ml的生理盐水清洗羊膜数次，洗去其上附着的血渍、血块、脂肪之类的杂质；然后区分羊膜上皮细胞层及下层，用细胞刮刀刮去羊膜表面的粘性物质，将上皮细胞层向上平铺在硝酸纤维素膜上；

(3)羊膜上皮细胞的消化：用消化液消化羊膜上皮细胞30min；所述消化液中包含0.3%胰蛋白酶、0.04%乙二胺四乙酸钙钠、0.25%组氨酸；

(4)羊膜上皮细胞的刮除：将消化后的羊膜组织平铺于硝酸纤维素膜上，使上皮细胞层向上，用细胞刮刀小心的顺向刮除羊膜上的细胞，然后用含抗生素的生理盐水反复冲洗数次；

(5)去上皮细胞羊膜的染色鉴定：利用伊红-苏木精对羊膜进行染色，镜下观察羊膜上皮细胞的消化效果；

(6)羊膜组织的冻存：将消化后的羊膜组织置组织冻存液中，于-80°C冰箱中保存。

2.根据权利要求1的方法，其中所述消化液是照如下操作配制的：称取0.3g胰蛋白酶粉末、0.04g乙二胺四乙酸钙钠、0.25g组氨酸倒入烧杯中，加入100ml的PBS缓冲液，轻轻搅拌混匀直到溶液中无块状结晶，用0.22µm微孔滤膜过滤，得消化液。

3.根据权利要求1的方法，其中羊膜上皮细胞的消化是照如下操作进行的：

在肾形盘中放入100ml含双抗的PBS缓冲液，打开离心管口，用镊子小心夹出载有羊膜的硝酸纤维素膜，缓慢的放入PBS缓冲液中清洗三次，以洗净羊膜表面的存在的冻存液或者其它物质，羊膜恢复乳白色为宜，清洗过程中勿使羊膜从硝酸纤维素膜上脱落；

将洗净的羊膜放置在无菌平皿上干燥5min，期间始终保持羊膜上皮细胞面向上；

用镊子轻轻夹住硝酸纤维素膜的一端，用手术剪刀将羊膜剪成所需的尺寸，必要时设对照组；

在按照羊膜尺寸的大小选择合适的消化容器内添加PBS缓冲液使容器润洗，吸去PBS，分别将实验组羊膜及对照组羊膜平铺于容器底，用镊子轻轻按压羊膜，使之与孔底贴牢；

在实验容器中添加消化液，并在对照容器中添加等体积的PBS，轻轻晃动使均匀，再将其置于37℃的5% CO2培养箱中，消化30min。

4.根据权利要求1的方法，其中消化过程中使用的容器是6孔板或无菌培养皿。

5.根据权利要求1的方法，其中羊膜上皮细胞的刮除是照如下方式进行的：在烧杯中加入PBS缓冲液，用镊子将消化后的羊膜取出，置烧杯中反复冲洗，以洗净表面的消化液，将羊膜面向上放置在无菌平皿中，用细胞刮刀刮除残留的上皮细胞。

6.一种去上皮细胞羊膜，其是根据如下方法制备得到的：

(1)羊膜组织的分离：获得新鲜、健康的围产期胎盘组织，将羊膜与胎盘剥离；

(2)羊膜组织的清洗：采用含青霉素100IU/ml、链霉素100µg/ml的生理盐水清洗羊膜数次，洗去其上附着的血渍、血块、脂肪之类的杂质；然后区分羊膜上皮细胞层及下层，用细胞刮刀刮去羊膜表面的粘性物质，将上皮细胞层向上平铺在硝酸纤维素膜上；

(3)羊膜上皮细胞的消化：用消化液消化羊膜上皮细胞30min；所述消化液中包含0.3%胰蛋白酶、0.04%乙二胺四乙酸钙钠、0.25%组氨酸；

(4)羊膜上皮细胞的刮除：将消化后的羊膜组织平铺于硝酸纤维素膜上，使上皮细胞层向上，用细胞刮刀小心的顺向刮除羊膜上的细胞，然后用含抗生素的生理盐水反复冲洗数次；

(5)去上皮细胞羊膜的染色鉴定：利用伊红-苏木精对羊膜进行染色，镜下观察羊膜上皮细胞的消化效果；(6)羊膜组织的冻存：将消化后的羊膜组织置组织冻存液中，于-80°C冰箱中保存。

7.根据权利要求6的去上皮细胞羊膜，其中所述羊膜上皮细胞的消化是照如下操作进行的：

在肾形盘中放入100ml含双抗的PBS缓冲液，打开离心管口，用镊子小心夹出载有羊膜的硝酸纤维素膜，缓慢的放入PBS缓冲液中清洗三次，以洗净羊膜表面的存在的冻存液或者其它物质，羊膜恢复乳白色为宜，清洗过程中勿使羊膜从硝酸纤维素膜上脱落；

将洗净的羊膜放置在无菌平皿上干燥5min，期间始终保持羊膜上皮细胞面向上；

用镊子轻轻夹住硝酸纤维素膜的一端，用手术剪刀将羊膜剪成所需的尺寸，必要时设对照组；

在按照羊膜尺寸的大小选择合适的消化容器内添加PBS缓冲液使容器润洗，吸去PBS，分别将实验组羊膜及对照组羊膜平铺于容器底，用镊子轻轻按压羊膜，使之与孔底贴牢；

在实验容器中添加消化液，并在对照容器中添加等体积的PBS，轻轻晃动使均匀，再将其置于37℃的5% CO2培养箱中，消化30min。

8.根据权利要求6的去上皮细胞羊膜，所述消化液是照如下操作配制的：称取0.3g胰蛋白酶粉末、0.04g乙二胺四乙酸钙钠、0.25g组氨酸倒入烧杯中，加入100ml的PBS缓冲液，轻轻搅拌混匀直到溶液中无块状结晶，用0.22µm微孔滤膜过滤，得消化液。

9.根据权利要求6的去上皮细胞羊膜，所述消化过程中使用的容器是6孔板或无菌培养皿。

10.根据权利要求6的去上皮细胞羊膜，所述羊膜上皮细胞的刮除是照如下方式进行的：在烧杯中加入PBS缓冲液，用镊子将消化后的羊膜取出，置烧杯中反复冲洗，以洗净表面的消化液，将羊膜面向上放置在无菌平皿中，用细胞刮刀刮除残留的上皮细胞。

11.根据权利要求6的去上皮细胞羊膜，所述组织冻存液是包含甘油和氯化钠的溶液。

Images