CN113101415A

CN113101415A - 一种细胞结构完整降解可控的生物羊膜及其制备方法

Info

Publication number: CN113101415A
Application number: CN202110320814.3A
Authority: CN
Inventors: 孙继煌; 张嘉楠
Original assignee: Beijing Jieya Biomedical Research Co ltd
Current assignee: Beijing Jieya Biomedical Research Co ltd
Priority date: 2021-03-25
Filing date: 2021-03-25
Publication date: 2021-07-13

Abstract

本发明涉及一种细胞结构完整降解可控的生物羊膜及其制备方法。本发明所提供的制备方法，包括人工刮除羊膜的绒毛膜，不含绒毛膜的羊膜在过氧化氢及乙醇中浸泡。为了控制羊膜的降解速率，本发明所提供的制备方法中，选择浓度为0.05‑2.5％的戊二醛、甲醛、京尼平或其混合溶液，对羊膜进行交联处理。采用本发明所提供的制备方法，不使用酸、碱、酶、高渗盐等脱细胞试剂，保持了完整的细胞结构；且通过对交联剂使用浓度的控制，控制羊膜的降解速率。在临床应用时，根据不同的病症，选择不同交联程度和降解时间的羊膜产品。

Description

一种细胞结构完整降解可控的生物羊膜及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种保持完整细胞结构且降解可控的生物羊膜及其制备方法。

背景技术

羊膜位于胎儿绒毛膜的表面，为光滑、无血管、无神经、无淋巴的透明薄膜，厚约0.02-0.50mm，由羊膜上皮细胞、基底膜和基质组成。羊膜免疫原性低，具有减轻炎性反应、抑制纤维组织增生等作用，可作为一种理想的组织工程修复材料。羊膜作为一种免疫豁免生物移植物，天然羊膜具有大量不同的胶原、纤维粘连蛋白、层粘连蛋白和蛋白多糖等多种蛋白成份。此外，天然羊膜含有多种营养因子，比如转化生长因子β(TGF-β)、转化生长因子-α(TGF-α)、碱性生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、肝细胞生长因子(HGF)和角化细胞生长因子(KGF)等，可以促进细胞生长、增殖和分化。

羊膜细胞组织主要由来源于外胚层的羊膜上皮和来源于中胚层的羊膜间充质两类细胞组成，羊膜上皮细胞具有三种胚原基层细胞的分化潜能同时，羊膜细胞不表达HLA-A、HLA-B、HLA-C及DR抗原或β2微球蛋白，同时羊膜组织透明且无血管、淋巴和神经组织，其抗原性远低于普通组织，大量研究表明，羊膜具有良好的细胞相容性和组织相容性，具有抗炎、抗粘连等生物学特性，并具有部位特异的组织再生能力，可以促进细胞、增殖和分化。

目前市面上已上市的羊膜产品主要分为两个大的类别，一种是直接进行深低温冷冻的冷藏羊膜，另一种是使用化学手段进行脱细胞处理的脱细胞羊膜。新鲜羊膜和冷藏羊膜确实能最大程度保留各种胶原和活性因子成分，但这类羊膜未经病毒灭活存在病毒传播和免疫原性等安全隐患，并且新鲜羊膜可能附着外层绒毛膜，其结构或者成分可能阻碍羊膜的功效。而目前市面上的脱细胞羊膜常采用酸、碱、高低渗盐溶液、十二烷基硫酸钠或胰蛋白酶等其中的一种或几种的混合溶液脱除细胞和外层绒毛膜，但使用化学溶剂浸泡的方法容易破坏羊膜的胶原和纤维结构，促进细胞增殖和抗炎的一些因子损失大，使其修复和抗炎效果大大降低。

发明内容

本发明的目的是提供一种细胞结构完整且降解速率可控的生物羊膜。本发明第一方面提供一种非脱细胞羊膜的制备方法，包括：使用锐性物质刮除与新鲜羊膜相连的绒毛膜；将羊膜放置于1-10％过氧化氢中，浸泡时间为1-4h；过氧化氢处理后的羊膜放于65-95％乙醇中，浸泡时间为1-4h。

在本发明所述的一种非脱细胞羊膜制备方法中，物理刮除与羊膜相连的绒毛膜；以过氧化氢和/或乙醇作为羊膜病毒灭活剂。所用病毒灭活剂既可以完全杜绝羊膜病毒传播和免疫原性等安全隐患，又不破坏羊膜完整的细胞及胶原结构，最大限度的保留生长因子。

本发明所述制备方法，采用物理机械法脱除与新鲜羊膜相连的绒毛膜，采用过氧化氢和乙醇作为羊膜病毒灭活剂，得到一种细胞及胶原结构完整的非脱细胞生物羊膜；最大限度的保留了羊膜中的生长因子成分；使得所制备得到的生物羊膜更适用于临床应用。

本发明所述的制备方法没有使用酸、碱、酶、高渗盐等一些强破坏性试剂，用物理方法以及破坏性小的病毒灭活试剂得到了非常完整的细胞结构，实验证实了本发明所提供的制备方法更好的保持了羊膜细胞的完整性。

在本发明所提供的制备方法中，以质量体积百分数计，所述过氧化氢为1-10％的过氧化氢溶液；所述乙醇为65-95％的乙醇溶液。

具体地，在本发明所提供的制备方法中，物理机械法去除绒毛膜及羊膜病毒灭活的处理步骤包括：

使用锐性物质刮除与新鲜羊膜相连的绒毛膜；将羊膜放置于3-6％过氧化氢中，浸泡时间为1-4h；过氧化氢处理后的羊膜放于70-80％乙醇中，浸泡时间为1-4h。

为了控制羊膜的降解速率，本发明所提供的制备方法，还包括，使用交联剂浓度为0.05-2.5％的戊二醛、甲醛、京尼平中的一种或多种进行羊膜交联处理；

优选所述交联剂为0.2％的戊二醛。

发明人在非脱细胞羊膜制备方法的实验探究中发现，羊膜交联程度并不会随着交联剂浓度的提高而提高。发明人进一步发现，交联剂与羊膜交联程度的关系是：在交联剂浓度范围为0.05％、0.1％、0.25％、0.5％时，羊膜的交联程度随交联剂浓度升高而不断上升；在交联剂浓度在0.5％时，羊膜接近完全交联；而在交联剂浓度大于0.5％时，羊膜交联程度无显著变化。基于这样的交联剂使用规律，根据不同的临床应用需求，可以对所用交联剂浓度进行调整，得到一种降解速率可控的生物羊膜。

具体地，在本发明所提供的制备方法中，使用交联剂对羊膜进行交联处理的步骤为：羊膜置于浓度为0.1-0.5％的戊二醛、甲醛和/或京尼平溶液中，置于摇床，摇床转速为50-200r/min，时间为30-120min。

作为本发明的一个具体实施方式，一种细胞结构完整降解可控生物羊膜的制备方法包括以下步骤：

(1)将新鲜的羊膜铺展，使用光滑片状不锈钢刮板逆着羊膜表面绒毛膜生长方向进行人工刮除，得到不含绒毛膜的羊膜；

(2)将经步骤(1)处理后的羊膜在1-10％的过氧化氢中，浸泡1-4h；

(3)将经步骤(2)处理后的羊膜置于纯化水中进行多次清洗，后置于65-95％乙醇中，浸泡浸泡1-4h；

优选的，为了控制羊膜的降解速率，可将羊膜进行交联处理。

(4)将经步骤(3)处理后的羊膜置于纯化水中进行多次清洗，后置于浓度为0.05-2.5％的戊二醛、甲醛、京尼平或其混合溶液中，置于摇床中，摇床转速设置值为50-200r/min，时间设置为30-120min；

(5)将经步骤(3)或步骤(4)处理后的羊膜置于纯化水中，放置于超声清洗机中进行清洗，清洗频率为20-50KHz，清洗2次-8次，每次清洗时间为5-30min，得到细胞结构完整降解可控的生物羊膜；

根据需要，可以将步骤(5)处理后的羊膜置于冻干模具内进行冷冻干燥，分割，得到最终羊膜冻干粉。

分别对现有技术中的非脱细胞羊膜及本发明所制备得到的生物羊膜进行组织学检测，发现本发明得到的生物羊膜细胞结构是完整的。羊膜中的生物活性因子主要存在于羊膜上皮细胞中，一个细胞结构完整的羊膜能更有效地减少炎症反应、降低瘢痕组织形成、促进正常软组织的结构修复和功能恢复来促进软组织损伤的修复。

本发明第二方面要求保护使用上述制备方法制备得到的生物羊膜。

根据本领域技术人员的理解，本发明还要求保护，上述制备方法或上述制备方法制备得到的生物羊膜，在生产组织修复用生物医药材料中的应用。

本发明的有益效果，至少包括：

(1)本发明对羊膜制备工艺进行了改进，本发明所提供的制备方法，可以保持羊膜完整的细胞及胶原结构；

(2)本发明所提供的制备方法中通过在制备中使用不同交联剂浓度控制生物羊膜的降解时间；

(3)本发明制备得到的生物羊膜，其细胞及胶原结构完整，含有多种生长因子；且生物羊膜的降解时间是可控的，可以更好的用于临床治疗。

附图说明

图1为本发明实施例1中不同交联剂浓度羊膜吸热峰温度统计分析图；图中横坐标的a为0.05％浓度戊二醛溶液处理得到的羊膜、b为0.1％浓度戊二醛溶液处理得到的羊膜、c为0.25％浓度戊二醛溶液处理得到的羊膜、d为0.5％浓度戊二醛溶液处理得到的羊膜、e为1％浓度戊二醛溶液处理得到的羊膜、f为2％浓度戊二醛溶液处理得到的羊膜。

图2为本发明对比例2中以1％氢氧化钠为病毒灭活剂时羊膜组织学检测结果显微图；其中a₁为未进行病毒灭活剂处理前的羊膜组织；b₁为经1％氢氧化钠处理后的羊膜组织。

图3为本发明实验例1中羊膜组织学检测结果显微图；其中a₁为100倍放大倍数下实施例2提供羊膜；a₂为400倍放大倍数下实施例2提供羊膜；b₁为100倍放大倍数下对照品羊膜；b₂为400倍放大倍数下对照品羊膜。

图4为本发明实验例2中非交联羊膜的DSC谱图。

图5为本发明实验例2中经0.1％浓度戊二醛交联的羊膜的DSC谱图。

图6为本发明实验例3中不同交联剂浓度羊膜2h降解率统计分析图，图中横坐标的a为0.05％浓度戊二醛溶液处理得到的羊膜、b为0.1％浓度戊二醛溶液处理得到的羊膜、c为0.25％浓度戊二醛溶液处理得到的羊膜、d为0.5％浓度戊二醛溶液处理得到的羊膜。

图7为本发明实验例4中生物羊膜体外降解时间图，图中横坐标的a为未交联处理的羊膜、b为0.05％戊二醛溶液处理的羊膜、c为0.1％戊二醛溶液处理的羊膜、d为0.25％戊二醛溶液处理的羊膜。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1交联剂为0.05％、0.1％、0.25％、0.5％、1％、2％的戊二醛溶液

本实施例提供交联剂浓度为0.05％、0.1％、0.25％、0.5％、1％、2％时，获得的生物羊膜；具体步骤如下：

(2)将刮除绒毛膜后的羊膜在3％的过氧化氢中，浸泡2h；

(3)将经过氧化氢浸泡处理后的羊膜置于纯化水中进行连续三次清洗，后置于75％乙醇中，浸泡2h；

(4)将经过过氧化氢和乙醇处理后的羊膜置于纯化水中进行连续三次清洗，分别置于浓度为0.05％、0.1％、0.25％、0.5％、1％、2％的交联剂浓度的戊二醛溶液中，置于摇床中，摇床转速设置值为100r/min，时间设置为1h，进行交联处理，同时设定使用纯化水处理羊膜做为非交联的空白对照组进行相同条件处理；

(5)将交联处理后的羊膜置于纯化水中，放置于超声清洗机中进行清洗，清洗频率为40KHz，清洗4次，每次清洗时间为10min；

(6)将经清洗处理后的羊膜置于冻干模具内进行冷冻干燥，分割，得到最终羊膜产品。

使用差示扫描量热法(DSC)对实施例1中经0.05％(组别a)、0.1％(组别b)、0.25％(组别c)、0.5％(组别d)、1％(组别e)、2％(组别f)浓度戊二醛溶液处理的羊膜进行DSC测试，温度范围为0-250℃，升温速率为10℃/min，氮气氛围，每点取3个平行样品，并对吸热峰温度进行统计分析，详见图1。

a、b、c、d组与全部组别相比P值＜0.05，证明差异有统计学意义，d、e、f组组间P值＞0.05，证明其差异无统计学意义。

图1中结果显示，本发明所提供生物羊膜产品在0.05％、0.1％、0.25％、0.5％交联剂浓度范围时，羊膜的交联程度随交联剂浓度升高而不断上升，浓度在0.5％时接近完全交联，浓度大于0.5％时交联程度无显著变化。

实施例2交联剂为0.1％的戊二醛溶液

本实施例提供交联剂为0.1％的戊二醛溶液时制备得到的生物羊膜，具体步骤如下：

(1)将新鲜的羊膜铺展，使用光滑片状不锈钢刮板逆着羊膜表面绒毛膜生长方向进行人工刮除，得到无绒毛膜的羊膜；

(2)将刮除绒毛膜后的羊膜在3％的过氧化氢中，浸泡2h；

(4)将经过过氧化氢和乙醇处理后的羊膜置于纯化水中进行连续三次清洗，后置于浓度为0.1％的戊二醛溶液中，置于摇床中，摇床转速设置值为100r/min，时间设置为1h，进行交联处理；

实施例3交联剂为0.2％的京尼平溶液

本实施例采用与实施例2相同的制备方法，区别在于，所使用交联剂为0.2％的京尼平溶液，摇床转速设置值为50r/min，时间设置为30min，进行交联处理；具体步骤如下：

(2)将刮除绒毛膜后的羊膜在3％的过氧化氢中，浸泡2h；

(4)将经过过氧化氢和乙醇处理后的羊膜置于纯化水中进行连续三次清洗，后置于浓度为0.2％的京尼平溶液中，置于摇床中，摇床转速设置值为50r/min，时间设置为30min，进行交联处理；

(6)将经清洗处理后的羊膜置于冻干模具内进行真空干燥，分割，得到最终羊膜产品。

对比例1不进行交联的生物羊膜

(2)将刮除绒毛膜后的羊膜在3％的过氧化氢中，浸泡2h；

(4)将经过过氧化氢和乙醇处理后的羊膜置于纯化水中，放置于超声清洗机中进行清洗，清洗频率为40KHz，清洗4次，每次清洗时间为10min；

(5)将经清洗处理后的羊膜置于冻干模具内进行冷冻干燥，分割，得到最终羊膜产品。

对比例2以1％氢氧化钠为病毒灭活剂

本对比例提供与实施例2相同的生物羊膜制备方法，区别仅在于，本对比例中所用病毒灭活剂为1％氢氧化钠，所得到的生物羊膜的组织学检测见图2。

从图2中可以看出未进行病毒灭活剂处理前，羊膜组织细胞结构完整；经1％氢氧化钠处理后，细胞失去原有完整结构，变为破碎的细胞及细胞碎片。

实验例1细胞结构完整性组织学检测

将实施例2制备的羊膜和已上市的通过化学方法处理的非脱细胞羊膜产品分别进行组织学检测，具体检测方法：使用苏木精-伊红染色法(HE染色)，染色后在光学显微镜下观察脱细胞效果，细胞呈现清晰层次分明的蓝黑色，纤维组织呈粉红色。

组织学检测结果详见图3。从图3中可以看出，实施例2提供的羊膜细胞结构完整，细胞外观呈圆形或椭圆型，基本无破坏。而对照羊膜的细胞结构呈不规则形状，细胞结构破坏变为细胞碎片。

实验例2

使用差示扫描量热法(DSC)对实施例2(0.1％的戊二醛溶液)和对比例1(无交联剂处理)制备的羊膜分别进行测试，温度范围为0-250℃，升温速率为10℃/min，氮气氛围。非交联羊膜的DSC谱图，吸热峰温度为38.38℃，见图4，经0.1％浓度戊二醛交联的羊膜的DSC谱图，吸热峰温度为46.33℃，见图5。

以吸热峰温度来表征羊膜交联程度，图4、图5结果表明，本发明所提供的羊膜制备方法中戊二醛溶液可用作羊膜交联剂。

实验例3羊膜体外酶降解速率

使用实施例1在0.05％(组别a)、0.1％(组别b)、0.25％(组别c)、0.5％(组别d)浓度范围戊二醛溶液交联处理得到的羊膜和对比例1中非交联羊膜进行体外酶降解实验，分别称取羊膜0.02g，放入浓度为12.5u/ml(0.01g/100ml)体积为50ml的Ⅰ型胶原酶中，温度为37℃，摇床震荡100r/min，降解2h，降解完成后分别提取5ml反应液，3000r/min离心取上清液，取5次。

分别在波长为230nm的紫外吸光光度计中测试吸光度，进而计算羊膜在2h内的降解率，并对所得降解率进行统计分析，结果见图6。图6的结果说明，羊膜的降解率时间随交联剂浓度的升高而不断降低，可以通过调节羊膜的交联程度达到降解可控的效果。

实验例4生物羊膜体外降解时间

使用实施例1中在0.05％(组别b)、0.1％(组别c)、0.25％(组别d)、0.5％(组别f)交联剂浓度范围处理得到的羊膜和对比例1中非交联羊膜(组别a)进行体外酶降解实验，分别称取羊膜0.02g，放入浓度为12.5u/ml(0.01g/100ml)体积为50ml的Ⅰ型胶原酶中，温度为37℃，摇床震荡100r/min，观察羊膜的降解时间，每个交联浓度组别进行三次平行实验，结果见图7。

图7表明非交联羊膜的降解时间在12-15天；交联剂浓度为0.05％时，羊膜的降解时间在18-22天；交联剂浓度为0.1％时，羊膜降解时间在25-29天；交联剂浓度为0.25％时，羊膜降解时间在35-41天；交联剂浓度为0.5％时，羊膜降解时间为62-65天。

依据上述实验结果，本发明所提供的生物羊膜产品可适用于急性和慢性组织损伤的修复。因本发明所提供的生物羊膜表面光滑、透明、有弹性，组织相容性好、免疫排斥性低，可作为一种良好的生物隔离材料。

本发明所提供的生物羊膜作为一种良好的生物隔离材料，一方面可以将创面与周围组织隔离，阻止周围纤维组织侵入，抑制外源性愈合；另一方面又有一定的通透性，允许一些小分子营养物质通过，为创面提供营养，促进内源性愈合，减少瘢痕组织过度增生。通过对生物羊膜降解时间的综合调控，可适用于肌腱、骨、神经、眼科、溃疡、表皮创伤等诸多领域。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种非脱细胞生物羊膜的制备方法，其特征在于，包括：

使用锐性物质刮除与新鲜羊膜相连的绒毛膜；将不含绒毛膜的羊膜放置于1-10％过氧化氢中，浸泡时间为1-4h；过氧化氢处理后的羊膜放于65-95％乙醇中，浸泡时间为1-4h。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，以质量体积百分数计，所述过氧化氢为3-6％的过氧化氢溶液。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，以质量体积百分数计，所述乙醇为80-90％的乙醇溶液。

4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，还包括，进行羊膜交联时，所使用交联剂浓度为0.05-2.5％；

优选所述交联剂为0.2％的戊二醛。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述交联剂为戊二醛、甲醛、京尼平中的一种或多种。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，羊膜置于浓度为0.1-0.5％的戊二醛、甲醛和/或京尼平溶液中，置于摇床，摇床转速为50-200r/min，时间为30-120min。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将不含绒毛膜的羊膜在1-10％的过氧化氢中，浸泡1-4h；

(2)将过氧化氢处理后的羊膜置于纯化水中进行多次清洗后，置于65-95％乙醇中，浸泡1-4h；

(3)将乙醇处理后的羊膜置于纯化水中进行多次清洗后，置于浓度为0.05-2.5％的戊二醛、甲醛或京尼平或其混合溶液中，置于摇床中，摇床转速设置为50-200r/min，时间设置为30-120min；

(4)将经步骤(1)-(2)或步骤(1)-(3)处理后的羊膜置于纯化水中，放置于超声清洗机中进行清洗，清洗频率为20-50KHz，清洗2次-8次，每次清洗时间为5-30min。

8.一种生物羊膜，其特征在于，使用权利要求1-7任一项所述制备方法制备得到。

9.权利要求1-7任一项所述制备方法或权利要求8所述生物羊膜在生产组织修复用生物医药材料中的应用。

10.一种生物医药材料，其特征在于，包含权利要求8所述的生物羊膜。