JPH0947503A - 培養皮膚用基材、培養皮膚およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 コラーゲン基材に播種する際に細胞が落下逸
脱することなく培養増殖された表皮細胞および／または
線維芽細胞への充分な栄養分の供給ならびに適用創面か
らの浸出液の排出を円滑に行いうる培養皮膚を提供す
る。 【解決手段】 貫通した切込みが設けられたコラーゲン
基材、該基材と、少なくとも該基材の片面に播種培養さ
れた線維芽細胞および／または表皮細胞からなる培養皮
膚であって、培養細胞適用時に前記切込みを開くように
力を加えることにより適用時に貫通孔を生じせしめうる
培養皮膚およびその製造法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は培養皮膚用基材、培
養皮膚およびその製造法に関する。さらに詳しくは、熱
傷、創傷、褥瘡または皮膚潰瘍などの皮膚疾患などの皮
膚欠損創に用いて、欠損組織を早期に再建させるまたは
治療するための培養皮膚用基材、培養皮膚およびその製
造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来より浅達性II度熱傷など真皮の浅い
部分に達する皮膚欠損創の治療としては創傷被覆材の適
用あるいは軟膏塗布ガーゼなどを適用するのが一般的に
行われてきた治療である。しかしながら、深達性II度熱
傷、III度熱傷あるいはII度以上の褥瘡など真皮の深い
部分に達する広範囲の皮膚欠損を負ったばあい、自己の
表皮細胞増殖による皮膚組織の再建は期待できない。そ
こで、まず壊死組織あるいは不良肉芽組織を除去し、同
種皮膚または創傷被覆材を適用して良好な肉芽組織を再
建したのち、自家分層植皮を行うことにより皮膚を再建
するという治療が行われてきた。しかし、自家分層植皮
を行うばあい、自己の健全な部位から採皮するが、採皮
した部位には傷跡が残るという整容についての問題が生
じる。また患部が極めて広範囲であるばあいには、自家
分層植皮は困難である。

【０００３】この問題を解決するために、わずかな皮膚
片から表皮細胞あるいは線維芽細胞を採取し、培養フラ
スコ中で大量培養する技術が開発され、これらの培養細
胞を用いた種々の培養皮膚が開発されてきている。

【０００４】ハワード・グリーン（Ｈ．Ｇｒｅｅｎ）、
ジェームズ・レインワルド（Ｊ．Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ）
らが開発した培養表皮シートは、切手大の皮膚を採取
し、表皮細胞を培養フラスコ中で大量培養して表皮シー
トをうるものであるが、該シートを培養フラスコから剥
離する際の酵素処理によって最も重要な細胞である基底
細胞が損傷を受けるために自家移植において生着率が低
いという問題点が指摘されている（黒柳能光、生体材料
９巻、１９９１年２月号参照）。

【０００５】また、ユージーン・ベル（Ｅ．Ｂｅｌｌ）
ら（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２１１巻、１０５
２〜１０５４頁、１９８１年３月号参照）は、皮膚から
分離、採取した表皮細胞および線維芽細胞を培養フラス
コ中で大量に培養し、線維芽細胞を組み込んだコラーゲ
ンゲル上に表皮細胞を重層化させた培養皮膚を開発し
た。

【０００６】さらに、スティーブン・ボイス（Ｓ．Ｂｏ
ｙｃｅ）ら（サージェリー（ＳＵＲＧＥＲＹ）、１０３
巻、４２１〜４３１頁、１９８８年４月号参照）は、皮
膚から採取した表皮細胞を培養フラスコ中で大量に培養
したものを、少量のコンドロイチン−６−硫酸を添加し
てえられたコラーゲンスポンジ上に播種し重層化させた
培養皮膚を開発している。

【０００７】また、アテロコラーゲンを基材とする培養
皮膚が、特開昭第６２−２４６３７１号公報および特開
平第４−３３２５６１号公報に記載されている。特開昭
第６２−２４６３７１号公報には、アテロコラーゲンシ
ートを基材とする培養皮膚が記載されているが、シート
に貫通孔がないので、移植床からもたらされる細胞増殖
などに欠かすことのできない栄養分がシートを透過して
シート上の表皮細胞にまで供給され難いために自家移植
において、表皮の生着率が低いという問題があった。

【０００８】また、線維芽細胞のみを組み込んだ培養皮
膚を作製したばあいにおいても、やはり適用創面からも
たらされる栄養分が培養皮膚基材全体へ供給され難いた
めに、線維芽細胞の増殖と代謝が不活発になること、生
理活性物質の放出が円滑になされなくなることなどのた
めに皮膚の再建または良性肉芽組織の形成に支障をきた
すことがある。

【０００９】さらに貫通孔がないことで、培養皮膚を適
用した患部に浸出液が過度に滞留し、この排出が円滑に
なされず感染の温床となるという問題もあった。

【００１０】特開平第４−３３２５６１号公報には、前
記のような問題点を解決するために貫通孔を設けたアテ
ロコラーゲンスポンジが記載されているが、貫通孔を設
けると細胞を播種する際に落下逸脱してしまうので、こ
れを防ぐために細胞播種前にあらかじめアテロコラーゲ
ンゲルなどでスポンジをコーティングすることを必須と
したものであり、こうした方法は、工程が煩雑であるば
かりでなくコストの高い培養皮膚となってしまうという
問題がある。そのため、より安価で簡便な代替品または
手法の開発が望まれていた。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】従来からコラーゲンを
基材として用いた培養皮膚において課題とされていた点
は、 １．皮膚欠損組織への適用後に、培養皮膚基材がバリア
ーとなり、適用創面から培養皮膚全体への栄養供給が円
滑にいかないこと、 ２．皮膚欠損組織への適用後に、培養皮膚適用部に浸出
液が過度に滞留すること ３．前記１および２を防ぐために基材に貫通孔を設けて
おくばあい、細胞播種時に細胞が落下逸脱してしまうこ
と、および ４．前記３を防ぐために基材の貫通孔をコラーゲンゲル
などの生体繊維状高分子材料でコーティングしたばあ
い、コストが高くなってしまうことであった。

【００１２】本発明はかかる１〜４の課題を解消するた
めになされたものであり、熱傷、創傷、褥瘡または皮膚
潰瘍などの皮膚欠損創に用いて、欠損組織を早期に再建
させるための培養皮膚を提供することを目的とする。さ
らに詳しくは、適用創面から培養皮膚全体の細胞への栄
養分供給および適用創面に過度に滞留する浸出液の排出
が円滑に行われうる機能を有し、しかも安価に作製しう
る培養皮膚を提供することを目的とする。

【００１３】

【課題を解決するための手段】前記の目的は、培養皮膚
用コラーゲン基材に貫通した切込みを設けることによ
り、皮膚由来の細胞を該基材上に播種する際の細胞の落
下逸脱の防止を目的とした処理を必要とせず、かつ培養
皮膚適用時に前記切込みを開くように力を加えることに
より貫通孔を生じせしめ、前記基材に播種培養された細
胞への栄養供給、および適用創面に過度に滞留する浸出
液の排出が円滑に行われうる培養皮膚を提供することで
ある。

【００１４】したがって本発明は貫通した切込みが設け
られたコラーゲンスポンジまたはコラーゲンシートから
なる培養皮膚用基材に関する。

【００１５】前記切込みは直線状であり、一方向にそっ
て設けられたものであってよく、また、前記培養皮膚用
基材において２．５ｃｍ×２．５ｃｍの正方形に少なく
とも部分的に設けられ、かつ１ｃｍ×１ｃｍの正方形に
合計で長さ４ｃｍを超える切込みを含まないものであっ
てもよい。

【００１６】また本発明は貫通した切込みが設けられた
コラーゲンスポンジまたはコラーゲンシートからなる培
養皮膚用基材と播種培養された皮膚由来の細胞からなる
培養皮膚に関する。

【００１７】さらに本発明は、貫通した切込みが設けら
れたコラーゲンスポンジまたはコラーゲンシートからな
る培養皮膚用基材と該基材の少なくとも片面に播種培養
された皮膚由来の線維芽細胞からなる培養皮膚であり、
培養皮膚適用時に前記切込みを開くように力を加えるこ
とにより貫通孔を生じせしめうる培養皮膚、貫通した切
込みが設けられたコラーゲンスポンジまたはコラーゲン
シートからなる培養皮膚用基材と該基材の片面に播種培
養された表皮細胞からなる培養皮膚であり、培養皮膚適
用時に前記切込みを開くように力を加えることにより貫
通孔を生じせしめうる培養皮膚、ならびに貫通した切込
みが設けられたコラーゲンスポンジまたはコラーゲンシ
ートからなる培養皮膚用基材と該基材の少なくとも片面
に播種培養された皮膚由来の線維芽細胞および該基材の
片面に播種培養された表皮細胞からなる培養皮膚であ
り、培養皮膚適用時に前記切込みを開くように力を加え
ることにより貫通孔を生じせしめうる培養皮膚に関す
る。

【００１８】前記コラーゲンはアテロコラーゲンであっ
てよく、また前記切込みは均斉に設けられてもよい。

【００１９】前記切込みは、一方向にそって設けられた
直線状であり、切込みが開くように力を加えることによ
り貫通孔を生じせしめうるものであってもよく、また、
前記培養皮膚用基材において２．５ｃｍ×２．５ｃｍの
正方形当りに少なくとも部分的に設けられ、かつ１ｃｍ
×１ｃｍの正方形に合計で長さ４ｃｍを超える切込みを
含まないものであってもよく、また、スリットであって
もよい。より好ましくは、前記切込みは切込み方向に対
し平行にならない方向に、前記切込みが開くように力が
加えられる。

【００２０】さらに本発明は、 ａ）コラーゲンスポンジまたはコラーゲンシートからな
る培養皮膚用基材に貫通した切込みを設ける工程および ｂ）該切込みが閉じた状態で該基材の少なくとも片面に
皮膚由来の線維芽細胞を播種培養する工程からなる培養
皮膚の製造法、および ａ）コラーゲンスポンジまたはコラーゲンシートからな
る培養皮膚用基材に貫通した切込みを設ける工程および ｂ）該切込みが閉じた状態で該基材の片面に表皮細胞を
播種培養する工程からなる培養皮膚の製造法、ならびに ａ）コラーゲンスポンジまたはコラーゲンシートからな
る培養皮膚用基材に貫通した切込みを設ける工程および ｂ）該切込みが閉じた状態で該基材の少なくとも片面に
皮膚由来の線維芽細胞を播種培養し、かつ該基材の片面
に表皮細胞を播種培養する工程からなる培養皮膚の製造
法に関する。

【００２１】前記コラーゲンはアテロコラーゲンであっ
てよく、また前記切込みは均斉に設けられてもよい。

【００２２】前記切込みは、一方向にそって設けられた
直線状であり、切込みが開くように力を加えることによ
り貫通孔を生じせしめうるものであってもよく、また、
前記培養皮膚用基材において２．５ｃｍ×２．５ｃｍの
正方形当りに少なくとも部分的に設けられ、かつ１ｃｍ
×１ｃｍの正方形に合計で長さ４ｃｍを超える切込みを
含まないものであってもよく、また、スリットであって
もよい。より好ましくは、前記切込みは切込み方向に対
し平行にならない方向に、前記切込みが開くように力が
加えられる。

【００２３】

【発明の実施の形態】本明細書において「閉じた状態」
とは培養皮膚用基材における切込みが開くように力がか
かっていない状態をいう。

【００２４】本発明の培養皮膚用基材には、コラーゲ
ン、ゼラチン、キチン、キトサン、ポリグリコール酸、
コンドロイチン硫酸またはヒアルロン酸などのムコ多糖
類などを用いることができ、前記コラーゲンは、たとえ
ばアテロコラーゲンなどのように生体適合性を有するも
のであることが好ましい。

【００２５】本発明に用いられるコラーゲンスポンジ
は、酸性に調整したコラーゲン溶液をホモジナイザーを
用いてホモジナイズすることにより充分に気泡を含ませ
たものをポリスチレンなどの容器に流し込み、アンモニ
アガス雰囲気中に静置してゲル化させたのち水洗して、
凍結真空乾燥を行い、ついで紫外線照射または架橋剤に
よって分子間架橋を導入することにより作製することが
できる。

【００２６】本発明においてコラーゲン溶液は、ウシ真
皮などからえられたコラーゲンから調製して、ｐＨを好
ましくは２〜４に調整し、濃度を０．２〜３ｗ／ｖ％、
好ましくは０．５〜２ｗ／ｖ％とすることによりえられ
る。ゲル化はアンモニアなどのガス雰囲気下で必要に応
じて数分〜２時間程度行い、こののち、水洗し、凍結真
空乾燥を行う。

【００２７】架橋に用いる紫外線（ＵＶ）の主波長は２
５０〜２７０ｎｍのものが好ましく、紫外線量は５００
〜１２０００ｍＷｓｅｃ／ｃｍ²、好ましくは１０００
〜５０００ｍＷｓｅｃ／ｃｍ²の線量を照射するとよ
い。本発明に用いられる架橋剤の例としてはたとえば、
グルタルアルデヒド、エチレングリコールジグリシジル
エーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、
グリセロールポリグリシジルエーテル、ヘキサメチレン
ジイソシアネートなどがあげられる。また、コラーゲン
スポンジの大きさは患部の大きさにあわせて適宜選択さ
れる。また、コラーゲンスポンジの厚さおよび形状は適
用される患部の状態によって変化するが、厚さ０．２〜
４０ｍｍ、形状は、薄板状、板状、棒状、紡錘状あるい
は両側凸のレンズ状などに成形するとよい。

【００２８】本発明に用いられるコラーゲンシートは、
コラーゲン溶液を前記スポンジ作製と同様の容器に入
れ、乾燥機の中で風乾してシートを形成させたのち、紫
外線照射または架橋剤によって分子間架橋を導入するこ
とにより作製することができる。

【００２９】前記コラーゲンシート作製に用いられるコ
ラーゲン溶液は、ウシ真皮などからえられたコラーゲン
から調製して、ｐＨを好ましくは２〜４に調整し、濃度
が０．２〜３ｗ／ｖ％、好ましくは０．５〜２ｗ／ｖ％
とすることによりえられる。

【００３０】架橋に用いる紫外線（ＵＶ）の主波長は２
５０〜２７０ｎｍのものが好ましく、紫外線量は５００
〜１２０００ｍＷｓｅｃ／ｃｍ²、好ましくは１０００
〜５０００ｍＷｓｅｃ／ｃｍ²の線量を照射するとよ
い。本発明に用いられる架橋剤の例としてはたとえば、
グルタルアルデヒド、エチレングリコールジグリシジル
エーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、
グリセロールポリグリシジルエーテル、ヘキサメチレン
ジイソシアネートなどがあげられる。また、コラーゲン
シートの大きさおよび厚さは患部の状態にあわせて適宜
選択される。

【００３１】本発明の培養皮膚用基材に設けられる貫通
した切込みとは、刃厚が極めて薄く、かつ刃先が鋭利
な、たとえば安全カミソリやメスのような刃物などの切
断手段を用いて線状に貫通しているものをいい、該切断
手段を除去すれば細胞が落下逸脱する間隙はほとんど生
じない。このため、細胞播種の際には設けられた切込み
を通過して細胞が落下逸脱するようなことは極度に少な
くなり、培養皮膚適用時には基材を伸展する力などを加
えることにより切込みを広げて栄養分や適用創面からの
浸出液などが通過しうる貫通孔を形成することができ
る。

【００３２】前記切込みを設けるために用いられる刃物
は刃先が薄ければ薄いほど良く、厚いものでも０．２ｍ
ｍを超えず、好ましくは０．１ｍｍ以内であるとよい。
前記切込みの数はとくに限定されないが、２〜２０ｍ
ｍ、好ましくは５〜１０ｍｍの長さの切込みを切込みに
対して縦方向に２〜３０ｍｍ、好ましくは５〜１５ｍｍ
間隔で、横方向に３〜２０ｍｍ、好ましくは５〜１５ｍ
ｍ間隔で隣り合う列どうしの切込みが互い違いになり１
列おきに各切込みが隣り合うように設けるのが好ましい
（図２（ｂ）参照）が、隣り合う列どうしの切込みが隣
り合うように並んでいてもよい（図２（ａ）および
（ｃ）参照）。また、切り込みは前記培養皮膚用基材に
均斉に設けられているのが好ましいが、同一基材上で搾
設する切込みの長さおよび密度は異なっていても良い。

【００３３】切込みの形状は、直線状であるのみなら
ず、半弧形、波形、カギ形、放射状直線形、同心円形、
同心の楕円形、カップ形または無定形であってもよい
が、一定方向の力を加えたときに、開きやすい形が好ま
しい。全ての切込みが同一の形状であっても異なってい
てもよく、配列も平行のみならず、ランダムであっても
よい。これらの例示として図１〜９にその形状を示す
が、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００３４】本発明の培養皮膚用基材には、その少なく
とも片面において哺乳動物皮膚由来の表皮細胞および／
または線維芽細胞が播種され培養増殖される。前記表皮
細胞とは、基底細胞を含む角質化細胞および表皮細胞層
に通常存在するそのほかの細胞を意味するが、このうち
培養増殖させるのは角質化細胞である。前記線維芽細胞
とは、真皮中の主要な細胞であり、コラーゲンをはじめ
とする結合組織成分を産生し、これらの成分と結合して
結合組織を形成している細胞をいう。

【００３５】本発明の培養皮膚は、播種される細胞に応
じて以下の３種類を作製することが可能である： 本発明のコラーゲン基材の少なくとも片面に皮膚由来
の線維芽細胞のみを播種培養した培養皮膚（複合培養真
皮）、 本発明のコラーゲン基材の片面に表皮細胞を播種培養
した培養皮膚（複合培養表皮）および 本発明のコラーゲン基材の少なくとも片面で皮膚由来
の線維芽細胞を播種培養して、該基材の片面に表皮細胞
を播種培養した培養皮膚（複合培養皮膚）。このばあ
い、先に線維芽細胞を播種培養する工程を行う方が、表
皮細胞の脱落を防ぐことができるのでより好ましい。

【００３６】前記の３種類の培養皮膚は、患部の面積、
深さおよび患者の症状などによって適宜使い分けること
でより効果が発揮される。また、これらの培養皮膚を自
家、他家で適宜使い分けることもできる。

【００３７】前記表皮細胞は以下の手順で調製される。
清潔な環境下で採取された皮膚（表皮および真皮の一
部、または皮膚全層）を消毒し、抗生物質を含有する生
理食塩水またはハンクス（Ｈａｎｋ′ｓ）液などの緩衝
液に浸漬する。この皮膚をディスパーゼ濃度を１０００
Ｕ／ｍＬに調製したダルベッコ変法イーグル最少必須培
地（ＤＭＥＭ）（以下、「ディスパーゼ溶液」という）
に浸漬したのち表皮と真皮に分離する。えられた表皮を
トリプシン濃度０．２５ｗ／ｖ％、エチレンジアミン四
酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）濃度を０．５ｍＭに調製し
たハンクス液（以下、「トリプシン溶液」という）中、
３７℃で約１５分間浸漬したのち１０ｖ／ｖ％ウシ胎児
血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ（以下、この培地を「Ｄ
ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ」という）などの培地中に移し、
振とうすることにより細胞を分散させ、約４００×ｇ、
５分間、遠心分離して採取させることによってうること
ができる。えられた表皮細胞は、たとえばグリーン（Ｇ
ｒｅｅｎ）培地、ＮＣＴＣ１６８培地、ＭＣＤＢ１５３
培地、とくに好ましくはグリーン培地を加えて表皮細胞
懸濁液とする。

【００３８】前記グリーン培地とはＤＭＥＭとハム（Ｈ
ａｍ′ｓ）Ｆ−１２を３：１に混合し、ヒドロコルチゾ
ン（０．４μｇ／ｍＬ）、インスリン（５μｇ／ｍ
Ｌ）、トランスフェリン（５μｇ／ｍＬ）、トリヨード
チロニン（０．００１３μｇ／ｍＬ）、コレラトキシン
（０．０１μｇ／ｍＬ）、アデニン（２４．３μｇ／ｍ
Ｌ）、表皮細胞増殖因子（０．０１μｇ／ｍＬ）と抗生
物質を添加し、１０ｖ／ｖ％ＦＣＳを含んでなる表皮細
胞増殖培地である（セル（Ｃｅｌｌ）、４０巻、６７７
〜６８３頁、１９８５年３月号参照）。

【００３９】前記表皮細胞を高効率で増殖させるには、
たとえばマイトマインシン処理や放射線照射などによっ
て増殖能を消失させたマウス由来の線維芽細胞である３
Ｔ３細胞などを支持細胞として接着させた培養フラスコ
中で培養を行うことが好ましい。

【００４０】具体的には、この３Ｔ３細胞を培養したの
ち、培地を除去してハンクス液ですすぎ、これを除去す
る。ついでマイトマイシンＣ ４μｇ／ｍＬ含有ＤＭＥ
Ｍ溶液を細胞全体が充分漬かるように（７５ｃｍ²培養
フラスコでは、２〜４ｍＬ程度が好ましい）加え３７℃
にて２時間程度静置したのち緩衝液で洗浄し、マイトマ
イシンＣを除去する。こうして、３Ｔ３細胞は生きたま
まで増殖能のみが消失せしめられる。えられた増殖能を
有さない３Ｔ３細胞を採取して、前記グリーン培地に懸
濁し、１×１０³〜５×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²、好ま
しくは５×１０³〜３×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²の密度
になるように調製したのち培養フラスコへ播種して接着
させる。この培養フラスコに前記表皮細胞を３Ｔ３細胞
を播種したのちに５×１０³〜５×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｃ
ｍ²、好ましくは１×１０⁴〜２×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｃ
ｍ²の細胞密度にて播種して、５％ＣＯ₂インキュベータ
ー中、３７℃にて培養する。

【００４１】３Ｔ３細胞はこの培養継続中に表皮細胞が
コロニーを形成する過程において培養フラスコ底面より
脱離して培地中に浮き上がり、培地を交換する際に除去
されるので、最終的にえられる表皮細胞にはほとんど含
まれない。

【００４２】培養増殖した表皮細胞は、ディスパーゼ溶
液を加え３７℃にて約２時間静置することにより剥し、
さらにトリプシン溶液により分散させ遠心分離して、表
皮細胞を採取し、グリーン培地を添加して細胞懸濁液を
える。表皮細胞は、必要に応じて継代培養して多量の表
皮細胞をえておく。具体的には、前記支持細胞を必要数
量作製し前記したように培養増殖した表皮細胞を採取し
て、支持細胞に播種培養する。この際、表皮細胞が角質
化しないよう注意して継代培養する。えられた前記表皮
細胞を、たとえば切込みを設けた約６×９．５ｃｍ、厚
さ１ｍｍのコラーゲンスポンジ基材上に、５×１０⁴〜
２×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²の細胞密度に調製して播種
する。

【００４３】細胞播種前にＦＣＳを基材全体に添加し、
３７℃にて約２０時間静置し、こののち、余分なＦＣＳ
を除去しておくことにより、前記細胞の接着が良好とな
る。表皮細胞が基材に接着したのち、グリーン培地を加
えて５％ＣＯ₂インキュベーター中３７℃にて３日ごと
に培地を交換しながら７〜２１日間培養する。このよう
にして複合培養表皮がえられる。

【００４４】前記線維芽細胞は、採取された皮膚を前記
と同様に表皮と真皮に分離したのち、えられた真皮をハ
サミ、ホモジナイザーなどを用いて砕き、コラゲナーゼ
をＤＭＥＭに溶解し０．５ｗ／ｖ％の濃度に調製した溶
液（以下、「コラゲナーゼ溶液」という）に加えて、約
３時間、約３７℃にて静置したのち振とうして結合組織
を溶解させ、約４００×ｇ〜約１，０００×ｇ、好まし
くは約６００×ｇ〜約８００×ｇで遠心分離して採取す
る。えられた線維芽細胞は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳな
どを培地として５％ＣＯ₂インキュベーター中３７℃に
てサブコンフルエントとなるまで培養し、必要に応じて
多くの線維芽細胞をうるように継代培養する。

【００４５】えられた線維芽細胞をたとえば切込みを搾
設した約６×９．５ｃｍ、厚さ１ｍｍのコラーゲンスポ
ンジ基材に播種するばあい、播種前にまず、前記した複
合培養表皮作製におけると同様に基材にＦＣＳを含ませ
ておく。培養した線維芽細胞をトリプシン溶液を用いて
培養フラスコからはがし、遠心分離により採取して、Ｄ
ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳを添加して懸濁液を調製する。こ
の線維芽細胞懸濁液を５×１０³〜５×１０⁵ｃｅｌｌｓ
／ｃｍ²、好ましくは５×１０⁴〜２×１０⁵ｃｅｌｌｓ
／ｃｍ²の細胞密度にてコラーゲン基材に播種する。細
胞が基材に接着したのち、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳを加
え、５％ＣＯ₂インキュベーター中３７℃にて３日ごと
に培地を交換しながら１〜１４日間培養を行う。このよ
うにして複合培養真皮をうることができる。複合培養真
皮は基材の少なくとも片面に線維芽細胞を培養増殖させ
てえられる。

【００４６】表皮細胞および真皮細胞の両方を併せて有
する複合培養皮膚は、以下のように作製される。前記し
た複合培養真皮の作製工程にて線維芽細胞を播種し、細
胞を良好に基材に接着させたのち該基材を裏返し、前記
複合培養表皮の作製における工程を行い複合培養皮膚を
うる。

【００４７】このようにしてえらえた培養皮膚は、創面
に適用される前に、ＤＭＥＭを用いて洗浄し、ＦＣＳを
除いた同様の培地に置き換えておくことが好ましい。

【００４８】貫通孔を設けられていない基材を用いた培
養皮膚では、培養皮膚全体に栄養成分が供給され難く培
養細胞の増殖、代謝を阻害することがあった、またその
適用創面に浸出液などが過度に滞留し、感染の温床とな
ることがあるのに対し、本発明の基材を用いた培養皮膚
においては、前記のように創面への適用前に搾設した切
込みを開くように力を加えて貫通孔を設けることによっ
て培養皮膚全体に栄養成分が供給され易くなり、培養細
胞の増殖、代謝を円滑にすると共に適用創面における浸
出液の排出が良好に行われる。

【００４９】また複合培養表皮または複合培養皮膚を自
家移植するばあいには生着率を高める効果がある。

【００５０】前記細胞を基材に良好に接着させるため
に、細胞接着因子としてフィブロネクチンやラミニンな
どを本発明の基材に被覆しておくとさらに良好な培養皮
膚がえられる。

【００５１】

【実施例】以下に本発明を実施例をあげてさらに詳細に
説明するが、本発明はもとよりこれら実施例に限定され
るものではない。

【００５２】実施例１ 切込みを設けたアテロコラーゲンスポンジの作製 １ｗ／ｖ％となるよう調製したアテロコラーゲン
（（株）高研製）の水溶液（塩酸でｐＨ４に調整）をホ
モジナイザー（（株）日本精機製作所製）を用いて１分
間撹拌することにより気泡を入れ、プラスチックケース
（１０×１８ｃｍ、高さ２．８ｃｍ）に５０ｍｌを注加
し、アンモニアガス雰囲気下にてゲル化させた。これを
流水中にて充分洗浄したのち凍結真空乾燥を行って厚さ
約１ｍｍのアテロコラーゲンスポンジをえた。ついで、
このスポンジの片面にＵＶを１．５ｍＷ／ｃｍ²、表面
裏面各３０分間照射した。

【００５３】えられたアテロコラーゲンスポンジに、ス
テンレス製メス（フェザー安全剃刀（株）製）を用いて
長さ５ｍｍの切込みを長辺に平行に５ｍｍ間隔かつ短辺
において５ｍｍ間隔に、隣り合う列同志の切込みは互い
違いになり１列おきに各切込みが隣り合うように貫通さ
せ、エチレンオキサイドガス滅菌を行い、切込み入りの
培養皮膚用アテロコラーゲンスポンジをえた（図１
（ａ））。

【００５４】実施例２ 切込みを設けた複合培養皮膚の作製 清潔な環境下で採取されたヒトの皮膚片（約２×２ｃ
ｍ、厚さ約０．５ｍｍ）をイソジン溶液（明治製菓
（株）製）に浸漬し、ハンクス液で洗い流したのちスト
レプトマイシン（１０００μｇ／ｍＬ）、ペニシリン
（１０００Ｕ／ｍＬ）およびアンホテリシンＢ（２．５
μｇ／ｍＬ）を混合したハンクス液に室温、３０分間浸
漬して殺菌した。

【００５５】つぎに、ディスパーゼ溶液（ディスパーゼ
は合同酒精（株）製、ＤＭＥＭはライフテックテクノロ
ジーズ社製）１０ｍｌに４℃にて約２０時間浸漬し、ピ
ンセットを用いて表皮と真皮に分離した。こうしてえら
れた表皮をトリプシン溶液（トリプシンは和光純薬工業
（株）製、ＥＤＴＡは（株）同仁化学製）１０ｍｌに１
５分間、３７℃にて処理したのちＤＭＥＭ＋１０％ＦＣ
Ｓ中に移し、振とうすることにより細胞を培地中に分散
させ、約４００×ｇ、５分間の遠心分離にて沈殿させる
ことによって集め、本明細書に記載した組成よりなるグ
リーン培地に懸濁した。

【００５６】表皮細胞を高効率で増殖させるために、以
下の支持細胞を用いた。マウス由来線維芽細胞である３
Ｔ３細胞をＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳの入った培養フラス
コ中で、サブコンフルエントとなるまで５％ＣＯ₂イン
キュベーター中３７℃にて培養した。そののち、培地を
除去してハンクス液ですすぎ、ＤＭＥＭを加えてここに
マイトマイシンＣの最終濃度が０．０００４％になるよ
うにマイトマイシンＣ（和光純薬工業（株）製）含有生
理的食塩水溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ）を添加した。つい
でこの培養フラスコを３７℃で２時間静置したのち、ハ
ンクス液で洗浄してマイトマイシンＣを除き、増殖能が
消失した３Ｔ３細胞を採取し、さらにグリーン培地に懸
濁し、計数後２×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²の密度となる
よう調製して新たな培養フラスコに播種した。

【００５７】このようにして調製した３Ｔ３細胞が接着
した培養フラスコに前記表皮細胞を播種し、３７℃にて
５％のＣＯ₂インキュベーター中で培養増殖させた。

【００５８】一方、分離した真皮部分をハサミでペース
ト状になるまで砕いてコラゲナーゼ溶液（コラゲナーゼ
は和光純薬工業（株）製、ＤＭＥＭはライフテックテク
ノロジーズ社製）１０ｍｌで約６時間、３７℃にて処理
して結合組織を除去したのち、約７００×ｇ、５分間の
遠心分離にて沈殿させることによって線維芽細胞をえ
た。えられた線維芽細胞はＤＭＥＭ（ライフテックテク
ノロジーズ社製）＋１０％ＦＣＳを培地として用いて５
％ＣＯ₂インキュベーター中３７℃にて培養フラスコ中
で３日ごとに培地を交換しながら継代培養し、増殖させ
た。トリプシン溶液でこの培養フラスコから線維芽細胞
を剥がし、遠心分離して採取し、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣ
Ｓ中で細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を５×１
０⁴ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²の細胞密度にて実施例１で作製し
た切込み入りアテロコラーゲンスポンジに播種し、ＤＭ
ＥＭ＋１０％ＦＣＳ中で２日間培養した。

【００５９】この際、線維芽細胞を播種する前に、当該
アテロコラーゲンスポンジにＦＣＳを満遍なく滴下して
含浸させ３７℃、５％ＣＯ₂インキュベーターに静置
し、２０時間後、余分なＦＣＳを除去した。

【００６０】こののち、前記線維芽細胞を播種培養した
アテロコラーゲンスポンジの入った容器中の培地を除去
し、該アテロコラーゲンスポンジを裏返した。そののち
前記で培養増殖させた表皮細胞を２×１０⁵ｃｅｌｌｓ
／ｃｍ²の密度で播種し、クリーンベンチの中で６時間
静置したのち、グリーン培地２０ｍｌを加えて５％ＣＯ
₂インキュベーター内で３７℃にて１４日間培養し、複
合培養皮膚をえた。

【００６１】試験例 複合培養皮膚の適用 ヌードマウスの背部に約２．５×２ｃｍの全層欠損を作
製した。

【００６２】実施例２でえられた複合培養皮膚を作製し
た欠損形状に合わせて切り、切込みに平行な両辺に力を
加えて貫通孔を生じさせたのち適用した。適用部位上を
ゲンタマイシン含有創傷被覆材で被覆し、この周囲を被
覆材と共に縫合した上にガーゼをのせて弾性包帯で固定
した。

【００６３】適用３週間後、肉眼的には浸出液の滞留は
認められず、ほぼ全体的に表皮化して乾燥していた。組
織は、表皮の重層化が認められ順調な皮膚の再建の状態
を示した。

【００６４】比較例 切込みが設けられていない複合培養皮膚の作製 切込みを設けずに実施例１および２と同様にして作製し
た複合培養皮膚を試験例におけると同様にヌードマウス
に適用して３週間後に肉眼的および形態学的観察を行っ
た。その結果、適用部の一部に浸出液の滞留が認めら
れ、適用部で真皮層の再建は観察されたが、表皮細胞の
生着は認められなかった。

【００６５】

【発明の効果】本発明によれば、コラーゲン基材に細胞
を播種する際に生ずる細胞の落下逸脱の防止を目的とし
た前処理を要せず、培養皮膚を創面に適用する前に培養
皮膚に設けられた切込みを開くように力を加えることに
よって貫通孔を生ぜしめ、播種培養された表皮細胞およ
び／または線維芽細胞への充分な栄養分の供給ならびに
適用部に滞留する浸出液の排出が円滑に行われうる培養
皮膚を安価に提供することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の培養皮膚用基材または培養皮膚（切込
みが直線）の適用前（ａ）および適用時（ｂ）の切込み
の状態を示す概略図である。図１（ａ）の矢印は力を加
える方向を示す。

【図２】本発明の培養皮膚用基材の切込みの設ける位置
を示す概略図である。（ａ）では長さ２ｍｍの切込みが
縦の間隔は２ｍｍおき、横の間隔は５ｍｍおきで設けら
れ、（ｂ）では長さ２ｍｍの切込みが縦の間隔は２ｍｍ
おき、横の間隔は５ｍｍおきで設けられ、列が隣りどう
しの切込みは互い違いに設けられており、および（ｃ）
では、長さ２ｍｍの切込みが縦の間隔は２ｍｍおき、横
の間隔は１ｃｍおきに設けられている。

【図３】本発明の培養皮膚用基材または培養皮膚（切込
みがナミ形）の適用前（ａ）および適用時（ｂ）の切込
みの状態を示す概略図である。図３（ａ）の矢印は力を
加える方向を示す。

【図４】本発明の培養皮膚用基材または培養皮膚（切込
みがカギ形）の適用前（ａ）および適用時（ｂ）の切込
みの状態を示す概略図である。図４（ａ）の矢印は力を
加える方向を示す。

【図５】本発明の培養皮膚用基材または培養皮膚（切込
みがカップ形）の適用前（ａ）および適用時（ｂ）の切
込みの状態を示す概略図である。図５（ａ）の矢印は力
を加える方向を示す。

【図６】本発明の培養皮膚用基材または培養皮膚（切込
みが放射状直線形）の適用前（ａ）および適用時（ｂ）
の切込みの状態を示す概略図である。図６（ａ）の矢印
は力を加える方向を示す。

【図７】本発明の培養皮膚用基材または培養皮膚（切込
みが同心円形）の適用前（ａ）および適用時（ｂ）の切
込みの状態を示す概略図である。図７（ａ）の矢印は力
を加える方向を示す。

【図８】本発明の培養皮膚用基材または培養皮膚（切込
みが同心の楕円形）の適用前（ａ）および適用時（ｂ）
の切込みの状態を示す概略図である。図８（ａ）の矢印
は力を加える方向を示す。

【図９】本発明の培養皮膚用基材または培養皮膚（切込
みが無定形）の適用前（ａ）および適用時（ｂ）の切込
みの状態を示す概略図である。図９（ａ）の矢印は力を
加える方向を示す。

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 貫通した切込みが設けられたコラーゲン
   スポンジまたはコラーゲンシートからなる培養皮膚用基
   材。
2. 【請求項２】 コラーゲンがアテロコラーゲンである請
   求項１記載の培養皮膚用基材。
3. 【請求項３】 貫通した切込みが均斉に設けられた請求
   項１または２記載の培養皮膚用基材。
4. 【請求項４】 貫通した切込みが直線状であり、一方向
   にそって設けられた請求項１、２または３記載の培養皮
   膚用基材。
5. 【請求項５】 貫通した切込みが培養皮膚用基材におい
   て２．５ｃｍ×２．５ｃｍの正方形に少なくとも部分的
   に設けられ、かつ１ｃｍ×１ｃｍの正方形に合計で長さ
   ４ｃｍを超える切込みを含まない請求項１、２、３また
   は４記載の培養皮膚用基材。
6. 【請求項６】 貫通した切込みが設けられたコラーゲン
   スポンジまたはコラーゲンシートからなる培養皮膚用基
   材と播種培養された皮膚由来の細胞からなる培養皮膚。
7. 【請求項７】 貫通した切込みが設けられたコラーゲン
   スポンジまたはコラーゲンシートからなる培養皮膚用基
   材と該基材の少なくとも片面に播種培養された皮膚由来
   の線維芽細胞からなる培養皮膚であり、培養皮膚適用時
   に前記切込みを開くように力を加えることにより貫通孔
   を生じせしめうる培養皮膚。
8. 【請求項８】 貫通した切込みが設けられたコラーゲン
   スポンジまたはコラーゲンシートからなる培養皮膚用基
   材と該基材の片面に播種培養された表皮細胞からなる培
   養皮膚であり、培養皮膚適用時に前記切込みを開くよう
   に力を加えることにより貫通孔を生じせしめうる培養皮
   膚。
9. 【請求項９】 貫通した切込みが設けられたコラーゲン
   スポンジまたはコラーゲンシートからなる培養皮膚用基
   材と該基材の少なくとも片面に播種培養された皮膚由来
   の線維芽細胞および該基材の片面に播種培養された表皮
   細胞からなる培養皮膚であり、培養皮膚適用時に前記切
   込みを開くように力を加えることにより貫通孔を生じせ
   しめうる培養皮膚。
10. 【請求項１０】 コラーゲンがアテロコラーゲンである
    請求項６、７、８または９記載の培養皮膚。
11. 【請求項１１】 貫通した切込みが均斉に設けられた請
    求項６、７、８、９または１０記載の培養皮膚。
12. 【請求項１２】 貫通した切込みが一方向にそって設け
    られた直線状であり、切込みが開くように力を加えるこ
    とにより貫通孔を生じせしめうる、請求項６、７、８、
    ９、１０または１１記載の培養皮膚。
13. 【請求項１３】 貫通した切込みが培養皮膚用基材にお
    いて２．５ｃｍ×２．５ｃｍの正方形に少なくとも部分
    的に設けられ、かつ１ｃｍ×１ｃｍの正方形に合計で長
    さ４ｃｍを超える切込みを含まない請求項６、７、８、
    ９、１０、１１または１２記載の培養皮膚。
14. 【請求項１４】 ａ）コラーゲンスポンジまたはコラー
    ゲンシートからなる培養皮膚用基材に貫通した切込みを
    設ける工程および ｂ）該切込みが閉じた状態で該基材の少なくとも片面に
    皮膚由来の線維芽細胞を播種培養する工程からなる培養
    皮膚の製造法。
15. 【請求項１５】 ａ）コラーゲンスポンジまたはコラー
    ゲンシートからなる培養皮膚用基材に貫通した切込みを
    設ける工程および ｂ）該切込みが閉じた状態で該基材の片面に表皮細胞を
    播種培養する工程からなる培養皮膚の製造法。
16. 【請求項１６】 ａ）コラーゲンスポンジまたはコラー
    ゲンシートからなる培養皮膚用基材に貫通した切込みを
    設ける工程および ｂ）該切込みが閉じた状態で該基材の少なくとも片面に
    皮膚由来の線維芽細胞を播種培養し、かつ該基材の片面
    に表皮細胞を播種培養する工程からなる培養皮膚の製造
    法。
17. 【請求項１７】 コラーゲンがアテロコラーゲンである
    請求項１４、１５または１６記載の製造法。
18. 【請求項１８】 貫通した切込みが均斉に設けられる請
    求項１４、１５、１６または１７記載の製造法。
19. 【請求項１９】 貫通した切込みが一方向にそって設け
    られた直線状であり、切込みが開くように力を加えるこ
    とにより貫通孔を生じせしめうる、請求項１４、１５、
    １６、１７または１８記載の製造法。
20. 【請求項２０】 貫通した切込みが培養皮膚用基材にお
    いて２．５ｃｍ×２．５ｃｍの正方形に少なくとも部分
    的に設けられ、かつ１ｃｍ×１ｃｍの正方形に合計で長
    さ４ｃｍを超える切込みを含まない請求項１４、１５、
    １６、１７、１８または１９記載の製造法。