JP2820796B2 - 生物療法性細胞被覆微小球状体 - Google Patents
生物療法性細胞被覆微小球状体Info
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、組織移植物の分野、及びより特定には、完
全に及び部分的に厚い皮膚損傷、たとえばやけど及び他
の創傷の処理のためへの皮膚移植物の適用に関する。
全に及び部分的に厚い皮膚損傷、たとえばやけど及び他
の創傷の処理のためへの皮膚移植物の適用に関する。
背景技術 厚み全体及び厚みの一部分の皮膚損傷、たとえばやけ
ど及び他の創傷は、ヘルスケアーシステムに対してかな
りの費用をよぎなくする。たとえば、北アメリカにおけ
る約２百万人の人々が１年当たりやけどに難んでいる。
これらのうち約20万人が入院をよぎなくされ、その15,0
00人がやけど関連原因のために死亡する。それらの患者
を治療するための全体の入院費用は1000ドル／％やけど
部分（1992年、アメリカ）の程度であり、その結果、彼
らの身体の20〜30％をやく平均的なやけど患者は約25,0
00ドルの初期入院ケアー費用を要し、これには追加の治
療費用は含まれず、そして生産性及び所得の実質的損失
を伴う。たとえば、McMillan et al（J Burn Care Reha
b6:444−446;1985）は、手術室での出費が身体のやけど
表面積の％と伴って対数的に上昇することを示した。明
白には、それらの費用を軽減し、そして患者の悩みを減
じる技法の前進のための必要性が存在する。
ど及び他の創傷は、ヘルスケアーシステムに対してかな
りの費用をよぎなくする。たとえば、北アメリカにおけ
る約２百万人の人々が１年当たりやけどに難んでいる。
これらのうち約20万人が入院をよぎなくされ、その15,0
00人がやけど関連原因のために死亡する。それらの患者
を治療するための全体の入院費用は1000ドル／％やけど
部分（1992年、アメリカ）の程度であり、その結果、彼
らの身体の20〜30％をやく平均的なやけど患者は約25,0
00ドルの初期入院ケアー費用を要し、これには追加の治
療費用は含まれず、そして生産性及び所得の実質的損失
を伴う。たとえば、McMillan et al（J Burn Care Reha
b6:444−446;1985）は、手術室での出費が身体のやけど
表面積の％と伴って対数的に上昇することを示した。明
白には、それらの費用を軽減し、そして患者の悩みを減
じる技法の前進のための必要性が存在する。
皮膚は、表皮層下に存在する真皮層から成る。その真
皮層はほとんど線維芽細胞から成り、そして表皮層の厚
さの約５倍である。角化細胞及び免疫細胞、たとえば樹
状突起ランゲルハンス細胞から主に成る損なわれていな
い皮膚の真皮層は通常、水の損失及び微生物の侵入を防
ぎ、その結果、完全に厚い及び部分的に厚い皮膚損傷は
生命の脅威である。不可欠な体液の損失及び細菌の侵入
を防ぐ創傷閉鎖の速度は患者の回復における生命にかか
わる要因である。従って、広範囲の創傷カバーリングが
創傷閉鎖を早めるために開発されて来た。
皮層はほとんど線維芽細胞から成り、そして表皮層の厚
さの約５倍である。角化細胞及び免疫細胞、たとえば樹
状突起ランゲルハンス細胞から主に成る損なわれていな
い皮膚の真皮層は通常、水の損失及び微生物の侵入を防
ぎ、その結果、完全に厚い及び部分的に厚い皮膚損傷は
生命の脅威である。不可欠な体液の損失及び細菌の侵入
を防ぐ創傷閉鎖の速度は患者の回復における生命にかか
わる要因である。従って、広範囲の創傷カバーリングが
創傷閉鎖を早めるために開発されて来た。
やけど及び創傷の存在する処置は、患者の創傷上に移
植するために患者自身の皮膚、又は死体もしくはブタ由
来の組織の使用を包含する。従来の患者由来の皮膚移植
（自己移植片）技法は一般的に、やけど又は他の創傷を
すでに有する患者に対してひじょうに苦痛である。自己
移植片は、身体上の他の部位から取られた皮膚の表皮及
び真皮層の両者の実質的な厚さから構成される。採取さ
れる皮膚の量及び従って新しい創傷の大きさを限定する
試みにおいては、自己移植片は皮膚損傷を通して格子パ
ターンを形成するように処理される。しかしながら、自
己移植片の真皮層における格子パターンは、インビボに
おいて永久瘢痕組織により連続的に満たされる。それら
の瘢痕はしばしば大きく、そしてひじょうに外観を傷つ
け、又はそれらの位置に依存して、機能不全を引き起こ
す。さらに、患者は、身体の他の位置への移植のための
十分に大きな移植片を回収するために、やけどを負って
いない十分な部分を有することができないかも知れな
い。
植するために患者自身の皮膚、又は死体もしくはブタ由
来の組織の使用を包含する。従来の患者由来の皮膚移植
（自己移植片）技法は一般的に、やけど又は他の創傷を
すでに有する患者に対してひじょうに苦痛である。自己
移植片は、身体上の他の部位から取られた皮膚の表皮及
び真皮層の両者の実質的な厚さから構成される。採取さ
れる皮膚の量及び従って新しい創傷の大きさを限定する
試みにおいては、自己移植片は皮膚損傷を通して格子パ
ターンを形成するように処理される。しかしながら、自
己移植片の真皮層における格子パターンは、インビボに
おいて永久瘢痕組織により連続的に満たされる。それら
の瘢痕はしばしば大きく、そしてひじょうに外観を傷つ
け、又はそれらの位置に依存して、機能不全を引き起こ
す。さらに、患者は、身体の他の位置への移植のための
十分に大きな移植片を回収するために、やけどを負って
いない十分な部分を有することができないかも知れな
い。
死体（同種移植片）又はブタ（異種移植片）源に由来
する皮膚移植片は、患者の苦難を減じ、そして創傷治癒
を助けるために使用されて来た。同種移植片の主な欠点
は疾病の伝達の可能性である（たとえばHIV、Ｂ型肝
炎）。さらに、表皮層は著しい抗原性を示し、その結
果、患者に直接的に由来しない移植片、たとえば同種移
植片は移植の２週間以内で通常拒絶される。異種移植片
は、ヒトドナー組織の欠乏の場合での移植片を提供する
が、それは同種移植片よりも一層急速に拒絶され、そし
て乾燥及び腐肉の前、及び創傷への強い付着が手術によ
る除去を要する前、適用後３日目で除去されるべきであ
る。
する皮膚移植片は、患者の苦難を減じ、そして創傷治癒
を助けるために使用されて来た。同種移植片の主な欠点
は疾病の伝達の可能性である（たとえばHIV、Ｂ型肝
炎）。さらに、表皮層は著しい抗原性を示し、その結
果、患者に直接的に由来しない移植片、たとえば同種移
植片は移植の２週間以内で通常拒絶される。異種移植片
は、ヒトドナー組織の欠乏の場合での移植片を提供する
が、それは同種移植片よりも一層急速に拒絶され、そし
て乾燥及び腐肉の前、及び創傷への強い付着が手術によ
る除去を要する前、適用後３日目で除去されるべきであ
る。
すべてのそれらの皮膚移植片、すなわち自己移植片、
同種移植片及び異種移植片は、通常ひじょうに薄く、且
つこわれやすく、その輸送及び取り扱いをひじょうに困
難にする。さらに、移植片は、患者の不快を付与する縫
合をしばしば伴って、創傷部位に結合される。さらに、
重症のやけど又は創傷患者はすでに弱体化されており、
それによって麻酔下での手術工程をさらに一層困難に
し、且つ可能性ある生命の脅威を付与する。
同種移植片及び異種移植片は、通常ひじょうに薄く、且
つこわれやすく、その輸送及び取り扱いをひじょうに困
難にする。さらに、移植片は、患者の不快を付与する縫
合をしばしば伴って、創傷部位に結合される。さらに、
重症のやけど又は創傷患者はすでに弱体化されており、
それによって麻酔下での手術工程をさらに一層困難に
し、且つ可能性ある生命の脅威を付与する。
より最近の研究、たとえばアメリカ特許第4,996,154
号（1991年２月26日に発行された;Millipore Corp,U.S.
A.）及びBeumar,G.J.など（“Biocompatibility and Ch
aracterization of a Palymeric Cell−Seeded Skin Su
bstitute",17th Ann Meeting Soc for Biomaterials;19
91年５月１−５日、Scottsdale,Arizona,U.S.A.,263p）
においては、皮膚細胞が組織移植片を構成するためにメ
ッシュタイプシート上で増殖された。このシートは創傷
部分上で縫合され、そして支持材料が結果的に、身体に
より再吸収される。瘢痕組織進行の程度はこのアプロー
チにより減じられる、予備研究からのいくらかの徴候が
存在する。同様に、メッシュマトリックスパッチは皮膚
移植片よりも安定性である。
号（1991年２月26日に発行された;Millipore Corp,U.S.
A.）及びBeumar,G.J.など（“Biocompatibility and Ch
aracterization of a Palymeric Cell−Seeded Skin Su
bstitute",17th Ann Meeting Soc for Biomaterials;19
91年５月１−５日、Scottsdale,Arizona,U.S.A.,263p）
においては、皮膚細胞が組織移植片を構成するためにメ
ッシュタイプシート上で増殖された。このシートは創傷
部分上で縫合され、そして支持材料が結果的に、身体に
より再吸収される。瘢痕組織進行の程度はこのアプロー
チにより減じられる、予備研究からのいくらかの徴候が
存在する。同様に、メッシュマトリックスパッチは皮膚
移植片よりも安定性である。
しかしながら、再生される皮膚の平らな細胞フィルム
又はシートに関する多くの問題が存在する。メッシュマ
トリックス皮膚パッチは典型的には、約10cmの幅×10cm
の長さ×数細胞層の厚さの寸法で供給される。やけど部
位はしばしば大きく、そしてめったに均等な厚さのもの
ではなく、又は平らな構造のものではないことは、当業
者により理解されるであろう。そのパッチは皮膚におけ
る外形変動を適切に考慮せず、その結果、外観を傷つけ
る問題がほとんどの場合において、多かれ少なかれまだ
存在する。それらは移植片よりも安定性であるが、その
薄いパッチはまだ、こわれやすく、そして多くの場合、
その薄いシートは手術工程のために石油ジュリー含浸ガ
ーゼにより強化される。さらに、小片の皮膚はお互い及
び身体上に縫合され、すでに弱い患者及び弱体化された
患者に対する手術工程の延長をもたらす。
又はシートに関する多くの問題が存在する。メッシュマ
トリックス皮膚パッチは典型的には、約10cmの幅×10cm
の長さ×数細胞層の厚さの寸法で供給される。やけど部
位はしばしば大きく、そしてめったに均等な厚さのもの
ではなく、又は平らな構造のものではないことは、当業
者により理解されるであろう。そのパッチは皮膚におけ
る外形変動を適切に考慮せず、その結果、外観を傷つけ
る問題がほとんどの場合において、多かれ少なかれまだ
存在する。それらは移植片よりも安定性であるが、その
薄いパッチはまだ、こわれやすく、そして多くの場合、
その薄いシートは手術工程のために石油ジュリー含浸ガ
ーゼにより強化される。さらに、小片の皮膚はお互い及
び身体上に縫合され、すでに弱い患者及び弱体化された
患者に対する手術工程の延長をもたらす。
さらに、その適用された皮膚パッチは、細胞に達する
栄養の欠乏のために組織壊死の可能性を導びく、ひじょ
うに不良なガス／塊状物トランスファー特徴を有する。
これは、さらに、パッチのふくれを導びく。ガス及び塊
状物のトランスファーは、ガーゼが手術に続いて除去さ
れた後すぐに、その部位上の石油ジェリーの残留層によ
りさらに悪影響を受ける。その石油ジェリーの残留層
は、それらが細胞上の続く作用のために利用できない層
中への種々の因子、たとえば増殖因子の間仕切を導び
く。
栄養の欠乏のために組織壊死の可能性を導びく、ひじょ
うに不良なガス／塊状物トランスファー特徴を有する。
これは、さらに、パッチのふくれを導びく。ガス及び塊
状物のトランスファーは、ガーゼが手術に続いて除去さ
れた後すぐに、その部位上の石油ジェリーの残留層によ
りさらに悪影響を受ける。その石油ジェリーの残留層
は、それらが細胞上の続く作用のために利用できない層
中への種々の因子、たとえば増殖因子の間仕切を導び
く。
もう１つの欠点は、インビトロでの皮膚由来の細胞の
実際の培養に存在する。典型的には、それらの固定−依
存性細胞は、比較的少量の培養培地にメッシュマトリッ
クスを含む組織培養フラスコにおいて静止状態下で増殖
し、その結果、培地の表面からフラスコの底での細胞へ
の受動的ガストランスファーがもたらされ得る。培地か
らの栄養物の消耗は、細胞にすぐに隣接する微小環境の
形成により結合される主要関心である。そのような微小
環境はさらに栄養物を消耗し、そして細胞の増殖に悪影
響を及ぼす高濃度の代謝副生成物を有する傾向がある。
それらの問題を克服するためには、多くの労力を要する
集中的な段階が培地を交換するのに必要とされ、それら
の個々の段階は微生物汚染のための可能性を付与する。
実際の培養に存在する。典型的には、それらの固定−依
存性細胞は、比較的少量の培養培地にメッシュマトリッ
クスを含む組織培養フラスコにおいて静止状態下で増殖
し、その結果、培地の表面からフラスコの底での細胞へ
の受動的ガストランスファーがもたらされ得る。培地か
らの栄養物の消耗は、細胞にすぐに隣接する微小環境の
形成により結合される主要関心である。そのような微小
環境はさらに栄養物を消耗し、そして細胞の増殖に悪影
響を及ぼす高濃度の代謝副生成物を有する傾向がある。
それらの問題を克服するためには、多くの労力を要する
集中的な段階が培地を交換するのに必要とされ、それら
の個々の段階は微生物汚染のための可能性を付与する。
ガス／塊状物トランスファーを高めるための努力にお
いては、再循環ポンプを有するガス透過性バッグから成
る培養システムが、その内部に含まれるメッシュ布上で
の増殖培養物の表面を通して培地を移動せしめるために
開発された（Marrow−Tech Inc.,U.S.A.）。細胞は典型
的には、メッシュ上でランダムにランダムに接種され、
それにより細胞増殖の“多核”を創造する。しかしなが
ら、その表面に堅く固定されないいづれかの細胞はポン
プを通して循環し、そして剪断及び他の破壊的効果を経
験する。このシステムはまだ集中的な労力を要し、且つ
やっかいであり、過剰の取り扱い要求のために高められ
た汚染ん機会を導びく。そのシステムは静的でないのと
同様に、その環境は全体的に均質ではなく、そしてメッ
シュに結合される細胞は半静的培養条件及びメッシュ上
での細胞のランダム接種のために均質増殖相のものでは
ない。単一のパッチを通しての均質性の問題が存在する
のみならず、またしばしば皮膚損傷の激しい部分を通し
てパッチからパッチへの均質性の問題が存在する。さら
に、生存細胞の効果的部分が、細胞の増殖を破壊できる
パッチの端での縫合により有意に減じられる。
いては、再循環ポンプを有するガス透過性バッグから成
る培養システムが、その内部に含まれるメッシュ布上で
の増殖培養物の表面を通して培地を移動せしめるために
開発された（Marrow−Tech Inc.,U.S.A.）。細胞は典型
的には、メッシュ上でランダムにランダムに接種され、
それにより細胞増殖の“多核”を創造する。しかしなが
ら、その表面に堅く固定されないいづれかの細胞はポン
プを通して循環し、そして剪断及び他の破壊的効果を経
験する。このシステムはまだ集中的な労力を要し、且つ
やっかいであり、過剰の取り扱い要求のために高められ
た汚染ん機会を導びく。そのシステムは静的でないのと
同様に、その環境は全体的に均質ではなく、そしてメッ
シュに結合される細胞は半静的培養条件及びメッシュ上
での細胞のランダム接種のために均質増殖相のものでは
ない。単一のパッチを通しての均質性の問題が存在する
のみならず、またしばしば皮膚損傷の激しい部分を通し
てパッチからパッチへの均質性の問題が存在する。さら
に、生存細胞の効果的部分が、細胞の増殖を破壊できる
パッチの端での縫合により有意に減じられる。
従来技術は皮膚損傷の輪郭の変動については何ら考慮
していません。皮膚損傷はそれらの平らな移植片及びパ
ッチを受入れるためにめったに“好ましく”形状化され
ず、新しい皮膚が完全には確立されない非接触部分の可
能性ある発生をもたらす。それらの移植片のすべては縫
合を必要とし、それによって追加の瘢痕の傾向を高め
る。
していません。皮膚損傷はそれらの平らな移植片及びパ
ッチを受入れるためにめったに“好ましく”形状化され
ず、新しい皮膚が完全には確立されない非接触部分の可
能性ある発生をもたらす。それらの移植片のすべては縫
合を必要とし、それによって追加の瘢痕の傾向を高め
る。
さらに、それらの多くの開発は、表皮層を確立する臨
界的な必要性を言及していない。水蒸気は正常な皮膚を
通して約8.5g/m2／時の速度で通過し、そして表皮層が
ない部位からは、約150g/m2／時の速度で通過する。理
想的には、皮膚移植片の透過性は、透過性が高過ぎる場
合の組織の乾燥及び血液凝固、並びに低い透過性による
液体の蓄積及び／移植片の低い付着性を防ぐような正常
な皮膚の透過性に近づくべきである。
界的な必要性を言及していない。水蒸気は正常な皮膚を
通して約8.5g/m2／時の速度で通過し、そして表皮層が
ない部位からは、約150g/m2／時の速度で通過する。理
想的には、皮膚移植片の透過性は、透過性が高過ぎる場
合の組織の乾燥及び血液凝固、並びに低い透過性による
液体の蓄積及び／移植片の低い付着性を防ぐような正常
な皮膚の透過性に近づくべきである。
Demetrious,A.A（“Replacement of liver function
in rats by transplantation of microcarrier−attach
ed hepatocytes"Science233:1190−1192;9月12日、198
6）は、ラットの腹腔への移植のためにコラーゲン皮覆
された架橋デキストランマイクロキャリヤーへの肝細胞
の結合を記載する。そのマイクロキャリヤーは、表面へ
の結合を付与するために使用され、その結果、肝細胞は
生存し、そしてインビボにおいて機能する。そのマイク
ロキャリヤーは移植された後、再吸収又は分解するよう
には意図されていない。
in rats by transplantation of microcarrier−attach
ed hepatocytes"Science233:1190−1192;9月12日、198
6）は、ラットの腹腔への移植のためにコラーゲン皮覆
された架橋デキストランマイクロキャリヤーへの肝細胞
の結合を記載する。そのマイクロキャリヤーは、表面へ
の結合を付与するために使用され、その結果、肝細胞は
生存し、そしてインビボにおいて機能する。そのマイク
ロキャリヤーは移植された後、再吸収又は分解するよう
には意図されていない。
国際出願PCT/US90/02257（Vacanti et al,1990年11月
１日に公開された;WO90/12604）は、ポリマーマトリッ
クス上に多量の細胞の移植について言及している。その
マトリックスは、100〜200μｍの隙間の空間を有する、
繊維性生物適合性分解性又は非分解性シート材料であ
る。Vacantiなどは、小腸の腸間膜への続く移植片のた
めにマトリックスへの肝細胞の結合及び増殖を記載す
る。
１日に公開された;WO90/12604）は、ポリマーマトリッ
クス上に多量の細胞の移植について言及している。その
マトリックスは、100〜200μｍの隙間の空間を有する、
繊維性生物適合性分解性又は非分解性シート材料であ
る。Vacantiなどは、小腸の腸間膜への続く移植片のた
めにマトリックスへの肝細胞の結合及び増殖を記載す
る。
本発明の目的は、完全に及び部分的に厚い皮膚損傷、
たとえばやけど及び他の損傷の処理のための、輪郭の変
動を調節できる生存する皮膚代用物を提供することであ
る。ホッチキスで留める方法、縫合する方法又は他の結
合方法の使用を必要としない、真皮層及び機能的表皮を
有する移植片を提供することが本発明の追加の目的であ
る。
たとえばやけど及び他の損傷の処理のための、輪郭の変
動を調節できる生存する皮膚代用物を提供することであ
る。ホッチキスで留める方法、縫合する方法又は他の結
合方法の使用を必要としない、真皮層及び機能的表皮を
有する移植片を提供することが本発明の追加の目的であ
る。
発明の開示 本発明の一態様によって、生体適合性でかつ生体内で
吸収される材料で製造された複数の微小球状体とその球
状体をコートする皮膚細胞の培養物からなり、その皮膚
細胞でコートされた微小球状体が皮膚損傷部に塗布され
ることを特徴とする、厚み全体および厚みの一部分の皮
膚損傷部の生きている皮膚置換体が提供される。
吸収される材料で製造された複数の微小球状体とその球
状体をコートする皮膚細胞の培養物からなり、その皮膚
細胞でコートされた微小球状体が皮膚損傷部に塗布され
ることを特徴とする、厚み全体および厚みの一部分の皮
膚損傷部の生きている皮膚置換体が提供される。
本発明の他の態様によって、皮膚細胞を培養し、生体
適合性で吸収される複数の微小球状体を加え、該皮膚細
胞を該微小球状体に付着させ、次いで付着させた皮膚細
胞を増殖培地中で集密状態もしくは集密状態に近い状態
まで増殖させ、その後培地のいくらかもしくはすべてを
除去することによって細胞でコートされた微小球状体を
濃縮してスラリーにするステップを特徴とする生きてい
る皮膚置換体の製造方法が提供される。
適合性で吸収される複数の微小球状体を加え、該皮膚細
胞を該微小球状体に付着させ、次いで付着させた皮膚細
胞を増殖培地中で集密状態もしくは集密状態に近い状態
まで増殖させ、その後培地のいくらかもしくはすべてを
除去することによって細胞でコートされた微小球状体を
濃縮してスラリーにするステップを特徴とする生きてい
る皮膚置換体の製造方法が提供される。
本発明のさらに他の態様によって、皮膚の真皮層由来
の細胞を、培地中で、生体適合性で吸収されうる微小球
状体上に増殖させ、培地のいくらかまたは実質的にすべ
てを除去することによって、細胞でコートされた微小球
状体を濃縮してスラリーとし、次いで細胞でコートされ
た微小球状体のスラリーを皮膚の損傷領域に塗布するス
テップを特徴とする厚み全体もしくは厚みの一部分の皮
膚損傷部を治療するための細胞でコートされた微小球状
体の使用方法が提供される。
の細胞を、培地中で、生体適合性で吸収されうる微小球
状体上に増殖させ、培地のいくらかまたは実質的にすべ
てを除去することによって、細胞でコートされた微小球
状体を濃縮してスラリーとし、次いで細胞でコートされ
た微小球状体のスラリーを皮膚の損傷領域に塗布するス
テップを特徴とする厚み全体もしくは厚みの一部分の皮
膚損傷部を治療するための細胞でコートされた微小球状
体の使用方法が提供される。
図面の簡単の説明 本発明の実施態様を示す図面において、 図１は、微小球状体に付着させた真皮線維芽細胞の、
細胞を接種してから１時間後を示す顕微鏡写真である。
細胞を接種してから１時間後を示す顕微鏡写真である。
図２は、図１に示す微小球体に付着させた真皮線維芽
細胞の、細胞を接種してから22時間後を示す顕微鏡写真
である； 図3Aは厚み全体の皮膚損傷部の概略図であり； 図3Bは本発明の生きている皮膚置換体を移植された図
3Aの厚み全体の皮膚損傷部の概略図である； 図４は微小球状体に付着させたケラチノサイトの、細
胞を接種してから24時間後を示す顕微鏡写真である。
細胞の、細胞を接種してから22時間後を示す顕微鏡写真
である； 図3Aは厚み全体の皮膚損傷部の概略図であり； 図3Bは本発明の生きている皮膚置換体を移植された図
3Aの厚み全体の皮膚損傷部の概略図である； 図４は微小球状体に付着させたケラチノサイトの、細
胞を接種してから24時間後を示す顕微鏡写真である。
図５は微小球状体に付着させたケラチノサイトの、細
胞を接種してから24時間後を示す顕微鏡写真である。な
おこの微小球状体は、細胞を接種する前に24時間培養培
地内でインキュベートした： 図６はシトフルオロメータ（cytofluorometer）から
得たデータのヒストグラムである； 図７は付着因子（attachment factor）で処理した微
小球状体に付着させた真皮線維芽細胞の、細胞を接種し
てから１時間後を示す顕微鏡写真である； 図８は図７に示す付着因子で処理した微小球状体に付
着させた真皮線維芽細胞の、細胞を接種してから22時間
後を示す； 図９はガラス面に付着させた真皮線維芽細胞（対照）
の顕微鏡写真である； 図10はPHB−PHV（ポリヒドロキシブチレート−ポリヒ
ドロキシバレレートコポリマー）の平坦面に付着させた
真皮線維芽細胞の顕微鏡写真である；および 図11は付着因子で処理したPHB−PHVの平坦面に付着さ
せた真皮線維芽細胞の顕微鏡写真である。
胞を接種してから24時間後を示す顕微鏡写真である。な
おこの微小球状体は、細胞を接種する前に24時間培養培
地内でインキュベートした： 図６はシトフルオロメータ（cytofluorometer）から
得たデータのヒストグラムである； 図７は付着因子（attachment factor）で処理した微
小球状体に付着させた真皮線維芽細胞の、細胞を接種し
てから１時間後を示す顕微鏡写真である； 図８は図７に示す付着因子で処理した微小球状体に付
着させた真皮線維芽細胞の、細胞を接種してから22時間
後を示す； 図９はガラス面に付着させた真皮線維芽細胞（対照）
の顕微鏡写真である； 図10はPHB−PHV（ポリヒドロキシブチレート−ポリヒ
ドロキシバレレートコポリマー）の平坦面に付着させた
真皮線維芽細胞の顕微鏡写真である；および 図11は付着因子で処理したPHB−PHVの平坦面に付着さ
せた真皮線維芽細胞の顕微鏡写真である。
発明を実施する最良の態様 本発明によれば、細胞を微小球状体に付着させ、その
後その微小球状体は生体内で移植体として使用される。
特に皮膚細胞でコートされた微小球状体のスラリーが、
厚み全体および厚みの一部分の皮膚損傷部の生きている
皮膚置換体として用いられる。この細胞でコートされた
微小球状体のスラリーは、軟膏もしくはパスタ剤とほと
んど同様の方式で皮膚損傷部に直接塗布される。
後その微小球状体は生体内で移植体として使用される。
特に皮膚細胞でコートされた微小球状体のスラリーが、
厚み全体および厚みの一部分の皮膚損傷部の生きている
皮膚置換体として用いられる。この細胞でコートされた
微小球状体のスラリーは、軟膏もしくはパスタ剤とほと
んど同様の方式で皮膚損傷部に直接塗布される。
皮膚細胞は、患者の比較的小さな組織移植片から得る
ことができる。あるいは、真皮線維芽細胞は、移植組織
中で示すアレルゲン性が小さく、死体を含むドナーから
得ることができる。表皮層は顕著な抗原性を示すので、
この層の移植片は通常患者から直接採取する必要があ
る。しかし、ランゲルハンス細胞が表皮層の抗原性に大
きく関与しているということは研究報告に示唆されてい
る（Bagot,M.ら、Clin.Exp.Immunol.,71巻、138頁、198
8年）。それ故に、ケラチノサイトの純粋培養物はドナ
ーから得ることが可能でその拒絶反応は最少かもしくは
ないであろう。
ことができる。あるいは、真皮線維芽細胞は、移植組織
中で示すアレルゲン性が小さく、死体を含むドナーから
得ることができる。表皮層は顕著な抗原性を示すので、
この層の移植片は通常患者から直接採取する必要があ
る。しかし、ランゲルハンス細胞が表皮層の抗原性に大
きく関与しているということは研究報告に示唆されてい
る（Bagot,M.ら、Clin.Exp.Immunol.,71巻、138頁、198
8年）。それ故に、ケラチノサイトの純粋培養物はドナ
ーから得ることが可能でその拒絶反応は最少かもしくは
ないであろう。
本発明によれば、一般に４cm2の小さな組織移植片
は、皮膚採取器（dermatome）もしくは他の適切な外科
用具を用いて患者もしくはドナーから採取される。移植
片は表皮層だけでもよく、または表皮層と真皮層の組合
わせでもよい。その組織は次いで通常の酵素と処理技術
を用いて解離させ、次いで組織培養フラスコ中に接種し
て、線維芽細胞および／またはケラチノサイトの細胞を
増大させる。真皮層と表皮層の細胞はディスパーゼ（di
spase）のような酵素、培地もしくはリン酸緩衝食塩水
ですすぐこと、または他の充分に確立された方法で分離
することができる。死体由来を含むドナー由来の皮膚細
胞の“銀行”が設立されて皮膚の損傷を即座に治療する
ことができることは当該技術分野の当業者にとって分か
っていることである。
は、皮膚採取器（dermatome）もしくは他の適切な外科
用具を用いて患者もしくはドナーから採取される。移植
片は表皮層だけでもよく、または表皮層と真皮層の組合
わせでもよい。その組織は次いで通常の酵素と処理技術
を用いて解離させ、次いで組織培養フラスコ中に接種し
て、線維芽細胞および／またはケラチノサイトの細胞を
増大させる。真皮層と表皮層の細胞はディスパーゼ（di
spase）のような酵素、培地もしくはリン酸緩衝食塩水
ですすぐこと、または他の充分に確立された方法で分離
することができる。死体由来を含むドナー由来の皮膚細
胞の“銀行”が設立されて皮膚の損傷を即座に治療する
ことができることは当該技術分野の当業者にとって分か
っていることである。
微小球状体は、直径が約50〜500μｍの範囲好ましく
は約80〜250μｍの範囲内である。そして微小球状体
は、以下に詳細に考察されるような種々の材料で製造す
ることができる。微小球状体を選択する際に考慮すべき
重要な問題は、その材料は、生体適合性でなければなら
ずかつ毒性副産物を生成することなしに身体に吸収可能
でなければならないことである。一つの適切な材料は、
吸収可能な外科用のステープルおよび縫合材料に従来用
いられているポリヒドロキシブチレート（PHB）であ
る。PHBは生体内で吸収され、最終生成物は二酸化炭素
と水である。他の適切な材料は、薬物送達システム用に
市販されているラクチド−グリコリド（lactide−glyco
lide）ポリマー類（Medisorb Technologies Internatio
nal社，米国）である。これらのポリマー類はそのエス
テル結合がランダムに加水分解されて吸収され、乳酸と
グリコール酸に分解されるが、これらは通常の代謝副産
物である。
は約80〜250μｍの範囲内である。そして微小球状体
は、以下に詳細に考察されるような種々の材料で製造す
ることができる。微小球状体を選択する際に考慮すべき
重要な問題は、その材料は、生体適合性でなければなら
ずかつ毒性副産物を生成することなしに身体に吸収可能
でなければならないことである。一つの適切な材料は、
吸収可能な外科用のステープルおよび縫合材料に従来用
いられているポリヒドロキシブチレート（PHB）であ
る。PHBは生体内で吸収され、最終生成物は二酸化炭素
と水である。他の適切な材料は、薬物送達システム用に
市販されているラクチド−グリコリド（lactide−glyco
lide）ポリマー類（Medisorb Technologies Internatio
nal社，米国）である。これらのポリマー類はそのエス
テル結合がランダムに加水分解されて吸収され、乳酸と
グリコール酸に分解されるが、これらは通常の代謝副産
物である。
本発明の一実施態様では、患者もしくはドナー由来の
組織移植片から分離した真皮線維芽細胞を、充分な数の
細胞が産生されるまで組織培養フラスコで培養する。一
般に、該フラスコは、バイオリアクター中の生細胞密度
が、約または少なくとも104〜105細胞/mlになるのに充
分な数の細胞を有していることが望ましい。1g乾燥重量
当り約５×106個の微小球状体からなる一般的な微小球
状体を３〜5mg/L負荷すると、その細胞密度は約５細胞
／微小球状体に相当する。
組織移植片から分離した真皮線維芽細胞を、充分な数の
細胞が産生されるまで組織培養フラスコで培養する。一
般に、該フラスコは、バイオリアクター中の生細胞密度
が、約または少なくとも104〜105細胞/mlになるのに充
分な数の細胞を有していることが望ましい。1g乾燥重量
当り約５×106個の微小球状体からなる一般的な微小球
状体を３〜5mg/L負荷すると、その細胞密度は約５細胞
／微小球状体に相当する。
充分な数の細胞が産生されたとき、その細胞を例えば
トリプシンを用いて組織培養フラスコの底から分離させ
る。所望の数の細胞を得るには、各種の大きさの組織培
養フラスコで多くの継代を行うことが必要であることは
当該技術分野の当業者には分かっていることである。次
にこれらの細胞を、適切な細胞培地および微小球状体が
１〜15g/Lの密度（最適レベルの密度は２〜5g/L）で入
っているバイオリアクター中に接種する。微小球状体
は、細胞を接種する直前に培地に添加してもよく、また
は微小球状体は細胞を接種する前に所定の時間培地中に
浸漬することによって前処理してもよい。これらの細胞
を、次に静置条件もしくは半静置条件下、予め決められ
た時間例えば３〜６時間で、微小球状体に付着させる。
トリプシンを用いて組織培養フラスコの底から分離させ
る。所望の数の細胞を得るには、各種の大きさの組織培
養フラスコで多くの継代を行うことが必要であることは
当該技術分野の当業者には分かっていることである。次
にこれらの細胞を、適切な細胞培地および微小球状体が
１〜15g/Lの密度（最適レベルの密度は２〜5g/L）で入
っているバイオリアクター中に接種する。微小球状体
は、細胞を接種する直前に培地に添加してもよく、また
は微小球状体は細胞を接種する前に所定の時間培地中に
浸漬することによって前処理してもよい。これらの細胞
を、次に静置条件もしくは半静置条件下、予め決められ
た時間例えば３〜６時間で、微小球状体に付着させる。
この付着ステップは、少容積の培地中で、約３〜６時
間にわたって、30分毎に数分間づつ間欠的に撹拌して実
施することができる。図１は、PHB−PHV（ポリヒドロキ
シブチレート−ポリヒドロキシバレートコポリマー）製
微小球状体に付着させた新生児の包皮由来の真皮線維芽
細胞の、細胞を接種してから１時間後を示す顕微鏡写真
である。真皮線維芽細胞は上記微小球状体に付着し始め
ている。
間にわたって、30分毎に数分間づつ間欠的に撹拌して実
施することができる。図１は、PHB−PHV（ポリヒドロキ
シブチレート−ポリヒドロキシバレートコポリマー）製
微小球状体に付着させた新生児の包皮由来の真皮線維芽
細胞の、細胞を接種してから１時間後を示す顕微鏡写真
である。真皮線維芽細胞は上記微小球状体に付着し始め
ている。
所定の時間さらに細胞を微小球状体に付着させてか
ら、残りの培地を加えて所望の作動容積にし、その後細
胞でコートされた微小球状体を撹拌し続けた。図２は、
図１に示すPHB−PHV微小球状体に付着させた真皮線維芽
細胞の、細胞を接種してから22時間後を示す顕微鏡写真
である。微小球状体に付着した真皮線維芽細胞の大部分
は平坦になっており、長い球状ではない。
ら、残りの培地を加えて所望の作動容積にし、その後細
胞でコートされた微小球状体を撹拌し続けた。図２は、
図１に示すPHB−PHV微小球状体に付着させた真皮線維芽
細胞の、細胞を接種してから22時間後を示す顕微鏡写真
である。微小球状体に付着した真皮線維芽細胞の大部分
は平坦になっており、長い球状ではない。
あるいは、組織移植片から解離させた細胞をバイオリ
アクター中に直接接種することができる。例えば４cm2
の組織移植片は約２〜５×107個の細胞を生成し、この
移植片は1Lの培地中で３〜５細胞／微小球状体の接種密
度を提供するのに充分なものである。
アクター中に直接接種することができる。例えば４cm2
の組織移植片は約２〜５×107個の細胞を生成し、この
移植片は1Lの培地中で３〜５細胞／微小球状体の接種密
度を提供するのに充分なものである。
微小球状体に付着させた真皮線維芽細胞はバイオリア
クター中、懸濁培養で増殖させる。このバイオリアター
としては作動容積が250ml〜数Ｌのものが便利である。1
Lのバイオリアクター中で培養される細胞を有する充分
な皮膚移植片を提供することは可能である。平均表面積
が5000cm2/g乾燥重量の微小球状体に対して、微小球状
体の密度が約３〜5mg/mlの場合、有効表面積は、1Lの作
動容積の容器中約２〜2.5m2になる。これらの細胞はこ
の表面積をカバーし、皮膚の同等な層を生成し、生体内
でさらに移動し増殖する。
クター中、懸濁培養で増殖させる。このバイオリアター
としては作動容積が250ml〜数Ｌのものが便利である。1
Lのバイオリアクター中で培養される細胞を有する充分
な皮膚移植片を提供することは可能である。平均表面積
が5000cm2/g乾燥重量の微小球状体に対して、微小球状
体の密度が約３〜5mg/mlの場合、有効表面積は、1Lの作
動容積の容器中約２〜2.5m2になる。これらの細胞はこ
の表面積をカバーし、皮膚の同等な層を生成し、生体内
でさらに移動し増殖する。
小面積の火傷は、250mlのスピナーフラスコ（Spinner
flask）を具備する小さな容器による培養物で治療でき
る。すべての環境パラメータが注意深く制御され監視さ
れている。例えば1990年５月６日付で発行された米国特
許第4,906,577号（Armstrong,Fleming ＆ Grenzowski）
に記載されているような精巧なバイオリアクターを利用
することができる。あるいは、CO2インキュベータの簡
単な撹拌容器を使用することができる。微小球状体に最
初細胞を接種してから、細胞でコートされた微小球状体
をバイオリアクターから最終的に収穫するまで、容器内
を無菌に維持するプロトコルは当該技術分野で充分確立
されている。
flask）を具備する小さな容器による培養物で治療でき
る。すべての環境パラメータが注意深く制御され監視さ
れている。例えば1990年５月６日付で発行された米国特
許第4,906,577号（Armstrong,Fleming ＆ Grenzowski）
に記載されているような精巧なバイオリアクターを利用
することができる。あるいは、CO2インキュベータの簡
単な撹拌容器を使用することができる。微小球状体に最
初細胞を接種してから、細胞でコートされた微小球状体
をバイオリアクターから最終的に収穫するまで、容器内
を無菌に維持するプロトコルは当該技術分野で充分確立
されている。
先に考察したメッシュマトリックスパッチ法で実施さ
れているような静置もしくは静置に近い培養法とは異な
り、バイオリアクター内で細胞を浮遊状態で成長させる
と装置の生産性が一層大きくなる。このことは、微小担
体（microcarrier）に付着させた細胞が浮遊培養で成長
することが証明された。なおこの担体は直径が100〜200
μｍで表面積が約5000cm2/gの小ビーズであり一般に架
橋デキストランで製造されている。ある種の細胞系が、
細胞を増殖しおよび／または産物を生成する装置の生産
性を、組織培養フラスコ中で静置培養する際に達成でき
る該生産性を越えるよう改善するため微小担体上で増殖
されている（van Wezel,A.L.“Growth of Cell−Strain
s and Primary Cells in Microcarriers in Homogeneou
s Culture",Nature,216巻、64−65頁、1967年10月７
日）。
れているような静置もしくは静置に近い培養法とは異な
り、バイオリアクター内で細胞を浮遊状態で成長させる
と装置の生産性が一層大きくなる。このことは、微小担
体（microcarrier）に付着させた細胞が浮遊培養で成長
することが証明された。なおこの担体は直径が100〜200
μｍで表面積が約5000cm2/gの小ビーズであり一般に架
橋デキストランで製造されている。ある種の細胞系が、
細胞を増殖しおよび／または産物を生成する装置の生産
性を、組織培養フラスコ中で静置培養する際に達成でき
る該生産性を越えるよう改善するため微小担体上で増殖
されている（van Wezel,A.L.“Growth of Cell−Strain
s and Primary Cells in Microcarriers in Homogeneou
s Culture",Nature,216巻、64−65頁、1967年10月７
日）。
組織培養容器内で支持体のメッシュシート上で皮膚移
植片を産生する静置培養物は、有効表面／容積比（S/
V）が、25g/Lの濃度で浮遊させた微小球状体は約150cm
-1であるのに比べて約２〜５cm-1である。さらに浮遊培
養法はあまり労働集約的でなくかつ培養物が均一なの
で、ガスの移入、栄養素の枯渇および栄養素の蓄積の問
題は該培養法を制限するほどではない。例えばメッシュ
マトリックスを使って２m2の新しい組織を製造するに
は、１フラスコ当り一般的に利用可能な表面積80cm2に
基づいて、約250個の組織培養フラスコが必要になる。
植片を産生する静置培養物は、有効表面／容積比（S/
V）が、25g/Lの濃度で浮遊させた微小球状体は約150cm
-1であるのに比べて約２〜５cm-1である。さらに浮遊培
養法はあまり労働集約的でなくかつ培養物が均一なの
で、ガスの移入、栄養素の枯渇および栄養素の蓄積の問
題は該培養法を制限するほどではない。例えばメッシュ
マトリックスを使って２m2の新しい組織を製造するに
は、１フラスコ当り一般的に利用可能な表面積80cm2に
基づいて、約250個の組織培養フラスコが必要になる。
好ましくは、真皮線維芽細胞は、集密状態または集密
状態に近い状態に到達するまでバイオリアクター内で増
殖され、その時点で該細胞が微小球状体を実質的にコー
トする。集密状態は一般に約７日間で達成される。しか
し、細胞集団がいぜんとして高度に移動し増殖する状態
にあるときは、集密状態になる前の集密状態に近い状態
の時点で、細胞でコートされた微小球状体を治療に使用
することができる。これらの細胞は次に、過剰の培地を
除去して濃縮され、次にその場で適切な緩衝液もしくは
溶液で洗浄されて、微小球状体／細胞のスラリーが形成
される。トリプシンのような薬剤を使って、細胞を微小
担体から取り外す微小担体培養法かを通常実施するのと
異なり、本発明では、真皮線維芽細胞は微小球状体から
取り外さない。そして本発明の微小球状体／細胞のスラ
リーは、軟膏もしくはパスタ剤を塗布するのとほとんど
同じ方式で創傷に直接塗布される。微小球状体は均一に
浮遊しているため、各微小球状体には類似した数の細胞
が付着し、その結果、次に皮膚損傷部に塗布するのに用
いる均一な集団が得られる。その上、広い面積の症例で
も、皮膚損傷部の領域を横切る細胞の増殖相は等質であ
る。
状態に近い状態に到達するまでバイオリアクター内で増
殖され、その時点で該細胞が微小球状体を実質的にコー
トする。集密状態は一般に約７日間で達成される。しか
し、細胞集団がいぜんとして高度に移動し増殖する状態
にあるときは、集密状態になる前の集密状態に近い状態
の時点で、細胞でコートされた微小球状体を治療に使用
することができる。これらの細胞は次に、過剰の培地を
除去して濃縮され、次にその場で適切な緩衝液もしくは
溶液で洗浄されて、微小球状体／細胞のスラリーが形成
される。トリプシンのような薬剤を使って、細胞を微小
担体から取り外す微小担体培養法かを通常実施するのと
異なり、本発明では、真皮線維芽細胞は微小球状体から
取り外さない。そして本発明の微小球状体／細胞のスラ
リーは、軟膏もしくはパスタ剤を塗布するのとほとんど
同じ方式で創傷に直接塗布される。微小球状体は均一に
浮遊しているため、各微小球状体には類似した数の細胞
が付着し、その結果、次に皮膚損傷部に塗布するのに用
いる均一な集団が得られる。その上、広い面積の症例で
も、皮膚損傷部の領域を横切る細胞の増殖相は等質であ
る。
さきに考察したメッシュマトリックスパッチ法と異な
り、本発明では細胞の操作の必要回数が減少する。この
ことによって、細胞自体が損傷する可能性が小さくな
り、かつ創傷の感染症をもたらす汚染の機会が最少にな
る。
り、本発明では細胞の操作の必要回数が減少する。この
ことによって、細胞自体が損傷する可能性が小さくな
り、かつ創傷の感染症をもたらす汚染の機会が最少にな
る。
本発明の方法にしたがって創傷に塗布される細胞は創
傷の全表面に容易に供給することができる。このこと
は、メッシュマトリックスで増殖させた細胞および患者
由来の皮膚移植片でさえも皮膚が充分に定着できない多
くの非接触領域がある場合が多いから非常に重要な利点
である。スラリーのコンシステンシーによって、創傷に
存在している場合がある輪郭の変異を修正することがで
きる。このことは従来の技術の平坦な移植片を越える大
きな利点である。なんとなれば第一に創傷は、深さが均
一で底面がなめらかで平坦な場合はまれであり、第二に
創傷はかなりの面積にわたって広がっていることがある
からである。例えば腕の全長にわたってその内側に広が
っている火傷を治療する場合、その全長にそって多くの
自然曲線があることは当該技術分野の当業者にとってよ
く分かっていることである。本発明は、最も深い創傷で
も充満させて、創傷を有効に治癒させかつ損傷部位によ
り自然な三次元の組織を再生させることができる。
傷の全表面に容易に供給することができる。このこと
は、メッシュマトリックスで増殖させた細胞および患者
由来の皮膚移植片でさえも皮膚が充分に定着できない多
くの非接触領域がある場合が多いから非常に重要な利点
である。スラリーのコンシステンシーによって、創傷に
存在している場合がある輪郭の変異を修正することがで
きる。このことは従来の技術の平坦な移植片を越える大
きな利点である。なんとなれば第一に創傷は、深さが均
一で底面がなめらかで平坦な場合はまれであり、第二に
創傷はかなりの面積にわたって広がっていることがある
からである。例えば腕の全長にわたってその内側に広が
っている火傷を治療する場合、その全長にそって多くの
自然曲線があることは当該技術分野の当業者にとってよ
く分かっていることである。本発明は、最も深い創傷で
も充満させて、創傷を有効に治癒させかつ損傷部位によ
り自然な三次元の組織を再生させることができる。
凹凸がある厚み全体の皮膚損傷の一例10を図3Aに示
す。この皮膚損傷10は表皮11と真皮12を貫通してその下
側に位置する筋肉13まで広がっている。平坦な皮膚移植
片は、この種の損傷に対して適切な皮膚移植片を提供し
ないことは当該技術分野の当業者にとってよく分かって
いることである。図3Bは、本発明の生きている皮膚置換
体20を移植した同じ皮膚損傷10の概略図である。この生
きている皮膚置換体20は真皮線維芽細胞21とケラチノサ
イト22の移植体を提供している。例えばそのほかの輪郭
の変異を修正するため、真皮線維芽細胞の第一層の上に
真皮線維芽細胞の次の層を創傷に対して塗布することが
できる。またドナー由来の真皮線維芽細胞／微小球状体
スラリーを創傷に塗布し続いて患者由来の真皮線維芽細
胞／微小球状体スラリーを塗布することもできる。
す。この皮膚損傷10は表皮11と真皮12を貫通してその下
側に位置する筋肉13まで広がっている。平坦な皮膚移植
片は、この種の損傷に対して適切な皮膚移植片を提供し
ないことは当該技術分野の当業者にとってよく分かって
いることである。図3Bは、本発明の生きている皮膚置換
体20を移植した同じ皮膚損傷10の概略図である。この生
きている皮膚置換体20は真皮線維芽細胞21とケラチノサ
イト22の移植体を提供している。例えばそのほかの輪郭
の変異を修正するため、真皮線維芽細胞の第一層の上に
真皮線維芽細胞の次の層を創傷に対して塗布することが
できる。またドナー由来の真皮線維芽細胞／微小球状体
スラリーを創傷に塗布し続いて患者由来の真皮線維芽細
胞／微小球状体スラリーを塗布することもできる。
微小球状体上に集密状態もしくは集密状態に近い状態
にある細胞を使用すると、皮膚損傷部に高濃度の細胞が
得られるだけでなく細胞の有効性も増大する。動物の細
胞は、微小球状体上の集密状態もしくは集密状態に近い
細胞集団に見られる様なミクロコスム（microcosm）内
にある場合、一層良好に機能する傾向がある。また特に
互いに密接に接触している細胞によって、増殖因子およ
び拡散因子が一層充分に産生されるが、これは自己分泌
と傍分泌の相互作用、低い拡散制限などを含む細胞間の
調節があるからである。
にある細胞を使用すると、皮膚損傷部に高濃度の細胞が
得られるだけでなく細胞の有効性も増大する。動物の細
胞は、微小球状体上の集密状態もしくは集密状態に近い
細胞集団に見られる様なミクロコスム（microcosm）内
にある場合、一層良好に機能する傾向がある。また特に
互いに密接に接触している細胞によって、増殖因子およ
び拡散因子が一層充分に産生されるが、これは自己分泌
と傍分泌の相互作用、低い拡散制限などを含む細胞間の
調節があるからである。
真皮層を塗布すると、構造タンパク質のコラーゲンお
よび他の増殖因子と付着因子を迅速に産生させることが
できる。真皮線維芽細胞を早期に塗布すると、傷痕がで
きる主原因である皮膚の収縮および過大な体液の損失を
最少にするかもしくは防止することができる。真皮線維
芽細胞は、分化して、特に皮膚の損傷が縦方向の切り傷
の場合、創傷中に軸方向に並んで創傷を有効に結合させ
る。線維芽細胞でコートされた微小球状体を早く塗布す
ると創傷が一層良好に治癒し、患者の苦痛が少なくな
る。
よび他の増殖因子と付着因子を迅速に産生させることが
できる。真皮線維芽細胞を早期に塗布すると、傷痕がで
きる主原因である皮膚の収縮および過大な体液の損失を
最少にするかもしくは防止することができる。真皮線維
芽細胞は、分化して、特に皮膚の損傷が縦方向の切り傷
の場合、創傷中に軸方向に並んで創傷を有効に結合させ
る。線維芽細胞でコートされた微小球状体を早く塗布す
ると創傷が一層良好に治癒し、患者の苦痛が少なくな
る。
本発明のスラリーを創傷に塗布したならば、気体通過
性の創傷ドレッシングを用いて創傷部位を覆ってもよ
い。次に微小球状体／細胞スラリーの真皮線維芽細胞
は、微小球状体から外れて周囲の組織中に移動して増殖
して、皮膚損傷部の代わりに連続面を生成する。時間が
経過し細胞が増殖するにつれて、微小球状体は生体内で
吸収され始める。
性の創傷ドレッシングを用いて創傷部位を覆ってもよ
い。次に微小球状体／細胞スラリーの真皮線維芽細胞
は、微小球状体から外れて周囲の組織中に移動して増殖
して、皮膚損傷部の代わりに連続面を生成する。時間が
経過し細胞が増殖するにつれて、微小球状体は生体内で
吸収され始める。
皮膚移植には、表皮層の再生も含めることが好まし
い。真皮線維芽細胞が生体内で定着しつつある間に、患
者の表皮層由来の細胞は組織培養フラスコ中で培養する
ことができる。充分な数の細胞が生成したとき、例えば
トリプシンを用いて組織培養フラスコの底部から細胞を
取り出す。次にその細胞を、適切な細胞培地と微小球状
体が入っているバイオリアクター中に接種する。さきに
考察したように、他の任意の方法としては、患者由来の
組織移植片由来の表皮細胞を用いて微小球状体に直接接
種する方法がある。これらの細胞は、真皮線維芽細胞に
ついて先に述べたのと同じ方式で、バイオリアクター中
で、微小球状体に付着させ、浮遊状態で培養することが
できる。通常の皮膚細菌叢からおよび他の起源からの創
傷部位の汚染が起こる可能性があるため、細胞増殖の初
期相で広スペクトルの抗生物質を使用する必要があるこ
とは当該技術分野の当業者にはよく分かっていることで
ある。
い。真皮線維芽細胞が生体内で定着しつつある間に、患
者の表皮層由来の細胞は組織培養フラスコ中で培養する
ことができる。充分な数の細胞が生成したとき、例えば
トリプシンを用いて組織培養フラスコの底部から細胞を
取り出す。次にその細胞を、適切な細胞培地と微小球状
体が入っているバイオリアクター中に接種する。さきに
考察したように、他の任意の方法としては、患者由来の
組織移植片由来の表皮細胞を用いて微小球状体に直接接
種する方法がある。これらの細胞は、真皮線維芽細胞に
ついて先に述べたのと同じ方式で、バイオリアクター中
で、微小球状体に付着させ、浮遊状態で培養することが
できる。通常の皮膚細菌叢からおよび他の起源からの創
傷部位の汚染が起こる可能性があるため、細胞増殖の初
期相で広スペクトルの抗生物質を使用する必要があるこ
とは当該技術分野の当業者にはよく分かっていることで
ある。
図４は、PHB−PHVの微小球状体に付着させた新生児包
皮由来のケラチノサイトの、細胞を接種してから24時間
後の顕微鏡写真である。微小球状体に付着させたケラチ
ノサイトは大部分が平坦になっておりもはや球形ではな
い。
皮由来のケラチノサイトの、細胞を接種してから24時間
後の顕微鏡写真である。微小球状体に付着させたケラチ
ノサイトは大部分が平坦になっておりもはや球形ではな
い。
先に述べたように、微小球状体は、細胞を接種する直
前に培地に添加してもよく、または細胞を接種する前に
所定の時間培地中に浸漬することによって前処理しても
よい。図５はPHB−PHV微小球状体に付着させた新生児包
皮由来のケラチノサイトの、細胞を接種してから24時間
後の顕微鏡写真である。この場合の微小球状体は、細胞
を接種する前に24時間培地中でインキュベートした。微
小球状体に付着したケラチノサイトは大部分が平坦にな
っている。
前に培地に添加してもよく、または細胞を接種する前に
所定の時間培地中に浸漬することによって前処理しても
よい。図５はPHB−PHV微小球状体に付着させた新生児包
皮由来のケラチノサイトの、細胞を接種してから24時間
後の顕微鏡写真である。この場合の微小球状体は、細胞
を接種する前に24時間培地中でインキュベートした。微
小球状体に付着したケラチノサイトは大部分が平坦にな
っている。
ケラチノサイトを含む表皮細胞が微小球状体上で集密
状態もしくは集密状態に近い状態に到達したとき、培地
のいくらかもしくはすべてを除いて、細胞でコートされ
た微小球状体のスラリーにする。創傷ドレッシングを用
いている場合はこれを創傷部位から外し、次いで上記ス
ラリーを、定着したかまた定着中の真皮線維芽細胞層の
上に塗布し、外側皮膚層を再生させて無傷の皮膚の保護
層を定着させる。
状態もしくは集密状態に近い状態に到達したとき、培地
のいくらかもしくはすべてを除いて、細胞でコートされ
た微小球状体のスラリーにする。創傷ドレッシングを用
いている場合はこれを創傷部位から外し、次いで上記ス
ラリーを、定着したかまた定着中の真皮線維芽細胞層の
上に塗布し、外側皮膚層を再生させて無傷の皮膚の保護
層を定着させる。
表皮細胞のスラリーを創傷に塗布したならば、気体透
過性の創傷ドレッシングを使用して皮膚損傷部を覆って
もよい。次いで表皮細胞は、微小球状体から移行して増
殖して周囲の組織中に入り、皮膚損傷部の代わりに連続
表面を形成する。細胞が増殖するにつれて、微小球状体
の生体内吸収が始まる。
過性の創傷ドレッシングを使用して皮膚損傷部を覆って
もよい。次いで表皮細胞は、微小球状体から移行して増
殖して周囲の組織中に入り、皮膚損傷部の代わりに連続
表面を形成する。細胞が増殖するにつれて、微小球状体
の生体内吸収が始まる。
所定の比率の表皮細胞を、カルシウムおよび／または
cAMPのような所定の薬剤では生体内もしくは生体外で処
理して、表皮角質層すなわち死んで高度に角化した細胞
の最も外側の層の生成を促進してもよい。この表皮角質
層は、身体から失われる水の量を調節し、かつ微生物が
創傷部位に進入するのを防止するのに役立っている。こ
の層の分化の促進が制御されることによって、修復され
た創傷部位は損傷していない無傷の皮膚のように機能す
る。
cAMPのような所定の薬剤では生体内もしくは生体外で処
理して、表皮角質層すなわち死んで高度に角化した細胞
の最も外側の層の生成を促進してもよい。この表皮角質
層は、身体から失われる水の量を調節し、かつ微生物が
創傷部位に進入するのを防止するのに役立っている。こ
の層の分化の促進が制御されることによって、修復され
た創傷部位は損傷していない無傷の皮膚のように機能す
る。
本発明の他の実施態様では、真皮層と表皮層の両者由
来の細胞が一つの組織培養フラスコ中で共生培養（cocu
lture）される。この実施態様では自己分泌と傍分泌の
機能発達を強化することができる。先に考察したのと同
じ方法を用いて、細胞を組織培養フラスコから取り出し
て細胞培養培地と微小球状体が入っているバイオリアク
ター内に接種する。これらの細胞は、バイオリアクター
中で、静置もしくは半静置条件下で微小球状体に付着さ
せ次いで浮遊状態で共生培養を行う。個々の微小球状体
には真皮層と表皮層の両者由来の細胞が付着している。
得られた微小球状体／細胞のスラリーは軟膏もしくはパ
スタ剤を塗布するのとほとんど同じ方式で創傷に直接塗
布して、真皮層と表皮層を同時に再生させる。分化中の
ケラチノサイトが生体内で生成すると、創傷部位の最も
外側に移動して表皮角質層を自然に形成するに至る。真
皮と表皮の要素が正常に再形成することによって創傷が
有効に治癒するまで、気体透過性創傷ドレッシングを用
いて皮膚損傷部位を覆ってもよい。
来の細胞が一つの組織培養フラスコ中で共生培養（cocu
lture）される。この実施態様では自己分泌と傍分泌の
機能発達を強化することができる。先に考察したのと同
じ方法を用いて、細胞を組織培養フラスコから取り出し
て細胞培養培地と微小球状体が入っているバイオリアク
ター内に接種する。これらの細胞は、バイオリアクター
中で、静置もしくは半静置条件下で微小球状体に付着さ
せ次いで浮遊状態で共生培養を行う。個々の微小球状体
には真皮層と表皮層の両者由来の細胞が付着している。
得られた微小球状体／細胞のスラリーは軟膏もしくはパ
スタ剤を塗布するのとほとんど同じ方式で創傷に直接塗
布して、真皮層と表皮層を同時に再生させる。分化中の
ケラチノサイトが生体内で生成すると、創傷部位の最も
外側に移動して表皮角質層を自然に形成するに至る。真
皮と表皮の要素が正常に再形成することによって創傷が
有効に治癒するまで、気体透過性創傷ドレッシングを用
いて皮膚損傷部位を覆ってもよい。
本発明の他の実施態様では、真皮線維芽細胞および表
皮層由来の細胞が別個の組織培養フラスコで独立して培
養される。その真皮線維芽細胞をその組織培養フラスコ
から、例えばトリプシンを使用して取り出して、適切な
細胞培地と微小球状体が入っている容器に接種する。次
いでこの真皮線維芽細胞は、静置もしくは半静置の条件
下で微小球状体に付着させる。
皮層由来の細胞が別個の組織培養フラスコで独立して培
養される。その真皮線維芽細胞をその組織培養フラスコ
から、例えばトリプシンを使用して取り出して、適切な
細胞培地と微小球状体が入っている容器に接種する。次
いでこの真皮線維芽細胞は、静置もしくは半静置の条件
下で微小球状体に付着させる。
同様に、ケラチノサイトを含む表皮細胞を例えばトリ
プシンを用いてその組織培養フラスコから取り出して、
適切な細胞培地と微小球状体が入っている別の容器内に
接種する。次にその表皮細胞を静置もしくは半静置の条
件下で微小球状体に付着させる。
プシンを用いてその組織培養フラスコから取り出して、
適切な細胞培地と微小球状体が入っている別の容器内に
接種する。次にその表皮細胞を静置もしくは半静置の条
件下で微小球状体に付着させる。
真皮線維芽細胞でコートされた微小球状体と表皮細胞
でコートされた微小球状体を単一のバイオリアクター中
に入れて共生培養を行う。得られた、細胞でコートされ
た微小球状体のスラリーを創傷部に塗布して、真皮層と
表皮層を同時に再生させる。次いで気体透過性の創傷ド
レッシングを用いて創傷を覆ってもよい。
でコートされた微小球状体を単一のバイオリアクター中
に入れて共生培養を行う。得られた、細胞でコートされ
た微小球状体のスラリーを創傷部に塗布して、真皮層と
表皮層を同時に再生させる。次いで気体透過性の創傷ド
レッシングを用いて創傷を覆ってもよい。
さらに他の実施態様では、真皮線維芽細胞をバイオリ
アクター中で微小球状体に付着させ、増殖させる。所定
の時間経過後、表皮層由来の細胞をそのバイオリアクタ
ー中に接種して、真皮線維芽細胞ですでにある程度コー
トされた微小球状体に付着させる。このようにしてケラ
チノサイトは、該線維芽細胞の傍分泌作用から利益をう
ることができる。
アクター中で微小球状体に付着させ、増殖させる。所定
の時間経過後、表皮層由来の細胞をそのバイオリアクタ
ー中に接種して、真皮線維芽細胞ですでにある程度コー
トされた微小球状体に付着させる。このようにしてケラ
チノサイトは、該線維芽細胞の傍分泌作用から利益をう
ることができる。
また本発明を利用して、皮膚に自然の色素沈着を起こ
させて紫外線に対する保護を行うのに用いるメラノサイ
トの生体内移植体を得ることもできる。
させて紫外線に対する保護を行うのに用いるメラノサイ
トの生体内移植体を得ることもできる。
美容形成の用途、例えば創傷、アクネなどによる重篤
な傷痕の修復を行う場合、表皮層および任意に、小比率
の下側真皮層を皮膚採取器または他の適切な外科用具を
用いて外科的に除去する。次いで細胞でコートされた微
小球状体のスラリーを、上記の前処理を行った領域に一
つ以上の層で直接塗布して輪郭の変異を修正する。
な傷痕の修復を行う場合、表皮層および任意に、小比率
の下側真皮層を皮膚採取器または他の適切な外科用具を
用いて外科的に除去する。次いで細胞でコートされた微
小球状体のスラリーを、上記の前処理を行った領域に一
つ以上の層で直接塗布して輪郭の変異を修正する。
本発明に用いる微小球状体は、生体適合性で、かつ天
然の生体内酵素の作用によって、毒性副産物を生成する
ことなく、身体に容易に吸収されうる各種の材料で製造
することができる。
然の生体内酵素の作用によって、毒性副産物を生成する
ことなく、身体に容易に吸収されうる各種の材料で製造
することができる。
微小球状体用に適切な材料としては天然もしくは合成
の生体吸収性材料があり、例えばポリヒドロキシブチレ
ート（PHB）、PHB−ポリヒドロキシバレレート（PHB−P
HV）コポリマー類、ポリエステル結合を有するPHB、ラ
クチド−グリコリドポリマー類、脂質類、リン脂質類、
ポリラクトン類、ポリエステル類、ポリラクチド類、ポ
リグリコリド類、ポリ無水物類、コラーゲン、ゼラチン
および治癒中の組織に対する副作用がない（すなわち最
初に提供されたときまたは吸収の最終生成物によって細
胞に対して毒性でない）他の吸収性材料がある。これら
の材料は、純品の形態で用いるか、または材料の混合物
として用いて物理化学的特性を強化するかもしくはその
分解速度を制御することができる。
の生体吸収性材料があり、例えばポリヒドロキシブチレ
ート（PHB）、PHB−ポリヒドロキシバレレート（PHB−P
HV）コポリマー類、ポリエステル結合を有するPHB、ラ
クチド−グリコリドポリマー類、脂質類、リン脂質類、
ポリラクトン類、ポリエステル類、ポリラクチド類、ポ
リグリコリド類、ポリ無水物類、コラーゲン、ゼラチン
および治癒中の組織に対する副作用がない（すなわち最
初に提供されたときまたは吸収の最終生成物によって細
胞に対して毒性でない）他の吸収性材料がある。これら
の材料は、純品の形態で用いるか、または材料の混合物
として用いて物理化学的特性を強化するかもしくはその
分解速度を制御することができる。
微小球状体は、培養培地中での混合と浮遊を容易にす
るためにその密度は1.01〜1.04g/mlが好ましい。微小球
状体は、比較的なめらかであってもよく、またはいくら
か表面が変化していてもよく、微小気孔率（microporos
ity）が30〜80％で多孔度（porosity）が30〜80μｍで
ある。本発明の微小球状体は、表面積が、従来技術の平
坦法のメッシュマトリックスが一般に200〜700cm2/gの
範囲内にあるのに比べて比較的大きく例えば約5000cm2/
g乾燥重量である。その上に、メッシュマトリックスに
適当な強度を与えるには多量の材料が必要である。した
がって、メッシュマトリックスの場合、同じ表面積を移
植体に与えるにはかなり多量の材料が必要であり、同様
により多くの材料を生体内で吸収しなければならない。
るためにその密度は1.01〜1.04g/mlが好ましい。微小球
状体は、比較的なめらかであってもよく、またはいくら
か表面が変化していてもよく、微小気孔率（microporos
ity）が30〜80％で多孔度（porosity）が30〜80μｍで
ある。本発明の微小球状体は、表面積が、従来技術の平
坦法のメッシュマトリックスが一般に200〜700cm2/gの
範囲内にあるのに比べて比較的大きく例えば約5000cm2/
g乾燥重量である。その上に、メッシュマトリックスに
適当な強度を与えるには多量の材料が必要である。した
がって、メッシュマトリックスの場合、同じ表面積を移
植体に与えるにはかなり多量の材料が必要であり、同様
により多くの材料を生体内で吸収しなければならない。
例えば円板形、円筒形および卵形の他の構造体も、微
小球状体の代わりに、本発明の生きている皮膚置換体に
用いることができることは、当該技術分野の当業者には
よく分かっていることである。
小球状体の代わりに、本発明の生きている皮膚置換体に
用いることができることは、当該技術分野の当業者には
よく分かっていることである。
また本発明の微小球状体は、一つの材料で作ったコア
および他の材料で作った外層もしくはコーティングで製
造して、微小球状体の吸収性、ならびに電荷密度他の化
学薬剤もしくは化合物の付着性および細胞の付着と展着
の増大を含む機能を改善することができる。例えばリン
脂質のコーティングは、リン酸のヘッド官能基を有する
極性面を生成することができる。またリン脂質のアシル
基は、微小球状体に一層疏水性の表面を与える。次に、
各種の化学薬剤もしくは生体分子を上記リン脂質のこれ
らの部分に付着させることができる。その上、リン脂質
類とスフィンゴシン類を含めてある種の表皮角質層の脂
質を微小球状体にコートして抗菌活性を付与することが
できる。スフィンゴシン類は、μｇのレベルで、微生物
の増殖を阻害するのに特に優れている（“Antimicrobia
l activity of sphingosines",J.Invest.Dermatol.,98
巻、269〜273頁、1992年）。
および他の材料で作った外層もしくはコーティングで製
造して、微小球状体の吸収性、ならびに電荷密度他の化
学薬剤もしくは化合物の付着性および細胞の付着と展着
の増大を含む機能を改善することができる。例えばリン
脂質のコーティングは、リン酸のヘッド官能基を有する
極性面を生成することができる。またリン脂質のアシル
基は、微小球状体に一層疏水性の表面を与える。次に、
各種の化学薬剤もしくは生体分子を上記リン脂質のこれ
らの部分に付着させることができる。その上、リン脂質
類とスフィンゴシン類を含めてある種の表皮角質層の脂
質を微小球状体にコートして抗菌活性を付与することが
できる。スフィンゴシン類は、μｇのレベルで、微生物
の増殖を阻害するのに特に優れている（“Antimicrobia
l activity of sphingosines",J.Invest.Dermatol.,98
巻、269〜273頁、1992年）。
図６は、細胞生存能を測定するシトフルオロメータで
得られたデータのヒストグラムである。細胞生存能は生
存細胞に対し特異的な蛍光色素および死んだ細胞に対し
特異的な蛍光色素で測定する。これらの測定間は“任意
蛍光単位”で表し、生存細胞を示す斜めにハッチングを
したバーと、死んだ細胞を示す白抜きのバーのヒストグ
ラムでプロットした。データの解釈は、リン酸緩衝溶液
と対照それぞれに対するデータセット１と２によって修
正する。
得られたデータのヒストグラムである。細胞生存能は生
存細胞に対し特異的な蛍光色素および死んだ細胞に対し
特異的な蛍光色素で測定する。これらの測定間は“任意
蛍光単位”で表し、生存細胞を示す斜めにハッチングを
したバーと、死んだ細胞を示す白抜きのバーのヒストグ
ラムでプロットした。データの解釈は、リン酸緩衝溶液
と対照それぞれに対するデータセット１と２によって修
正する。
同じ細胞接種物由来のケラチノサイトを、PHBおよび
リン脂質でコートされたPHBに接種し、各々24時間イン
キュベートした。付着した細胞の細胞生存能は、上記の
蛍光色素を適正な試料に導入することによって測定し
た。細胞を付着させていない試料も蛍光色素で処理し、
特異的な吸収性材料に対してさらに修正した。細胞なし
の試料はデータセット3,5,7および９に示し、これらの
データはデータセット4,6,8および10それぞれに対する
修正係数である。
リン脂質でコートされたPHBに接種し、各々24時間イン
キュベートした。付着した細胞の細胞生存能は、上記の
蛍光色素を適正な試料に導入することによって測定し
た。細胞を付着させていない試料も蛍光色素で処理し、
特異的な吸収性材料に対してさらに修正した。細胞なし
の試料はデータセット3,5,7および９に示し、これらの
データはデータセット4,6,8および10それぞれに対する
修正係数である。
データセット４と８はPHBに付着したケラチノサイト
の生存能を示し、一方データセット６と10はリン脂質で
コートされたPHBを示す。データセット3,4,5および６の
吸収性材料は細胞を接種する前にオートクレーブにか
け、一方データセット7,8,9および10の吸収性材料は非
加熱エチレンオキシド法（non−thermal ethylene oxid
e process）で滅菌した。これらのデータは、これらの
細胞がこれらの吸収性材料上で生存能が高いことを示し
ている。その上、前滅菌法（水蒸気またはエチレンオキ
シド）はこれら細胞集団の付着効率もしくは生存能に影
響しない。
の生存能を示し、一方データセット６と10はリン脂質で
コートされたPHBを示す。データセット3,4,5および６の
吸収性材料は細胞を接種する前にオートクレーブにか
け、一方データセット7,8,9および10の吸収性材料は非
加熱エチレンオキシド法（non−thermal ethylene oxid
e process）で滅菌した。これらのデータは、これらの
細胞がこれらの吸収性材料上で生存能が高いことを示し
ている。その上、前滅菌法（水蒸気またはエチレンオキ
シド）はこれら細胞集団の付着効率もしくは生存能に影
響しない。
他の実施態様では、微小球状体は、多糖と吸収性材料
を組み合わせて、吸収性材料がコアによってランダムに
分布される。多糖（例えばデキストランもしくはデンプ
ン）は、皮膚細胞で微小球状体をコートする段階の前に
浸食させるかまたは化学的にもしくは酵素によって消化
させて、オープン構造を残させて、生体内に入ったとき
吸収性材料の加水分解を増大させる。この種の微小球状
体は、栄養素または代謝副産物の拡散限度が低下しその
ため細胞の増殖がさらに容易になる。その上、微小球状
体中もしくは微小球状体上に組み入れられる各種の増殖
因子などの因子はより迅速に放出されるので治癒過程中
適正な時点にこれらの因子に対する“接近”が可能にな
る。
を組み合わせて、吸収性材料がコアによってランダムに
分布される。多糖（例えばデキストランもしくはデンプ
ン）は、皮膚細胞で微小球状体をコートする段階の前に
浸食させるかまたは化学的にもしくは酵素によって消化
させて、オープン構造を残させて、生体内に入ったとき
吸収性材料の加水分解を増大させる。この種の微小球状
体は、栄養素または代謝副産物の拡散限度が低下しその
ため細胞の増殖がさらに容易になる。その上、微小球状
体中もしくは微小球状体上に組み入れられる各種の増殖
因子などの因子はより迅速に放出されるので治癒過程中
適正な時点にこれらの因子に対する“接近”が可能にな
る。
あるいは微小球状体は、細胞が生体外および生体内で
増殖する間に吸収されるように無傷の多糖の成分ととも
に用いることができる。
増殖する間に吸収されるように無傷の多糖の成分ととも
に用いることができる。
本発明の好ましい実施態様では、微小球状体は細胞集
団が膨脹するのと同等の速度で吸収される。このように
して、微小球状体が吸収されるにつれて、部分的に吸収
された微小球状体によって残された小空隙中に細胞が入
って増殖し、傷痕と輪郭の変異が最小になる。
団が膨脹するのと同等の速度で吸収される。このように
して、微小球状体が吸収されるにつれて、部分的に吸収
された微小球状体によって残された小空隙中に細胞が入
って増殖し、傷痕と輪郭の変異が最小になる。
材料および／または因子もしくはコーティングを選択
する一つの方法は、真皮層に対する一つの組合わせと表
皮層に対するもう一つの組合わせを選択する方法であ
る。表皮層の微小球状体は、真皮層に用いる下側の材料
よりはるかに速く吸収されることが好ましい。このこと
によって、ケラチノサイトは、より自然な方式で下側の
真皮層上を移動し展着することができる。コーティング
は異なる種類の細胞に対して異なっているが１種のコー
ティングが適していることもありうる。
する一つの方法は、真皮層に対する一つの組合わせと表
皮層に対するもう一つの組合わせを選択する方法であ
る。表皮層の微小球状体は、真皮層に用いる下側の材料
よりはるかに速く吸収されることが好ましい。このこと
によって、ケラチノサイトは、より自然な方式で下側の
真皮層上を移動し展着することができる。コーティング
は異なる種類の細胞に対して異なっているが１種のコー
ティングが適していることもありうる。
微小球状体は、その中にもしくはその上に添加剤を組
込むことにより、例えば固定化、被包形成、共有結合に
よりまたは単なる吸着によって微小球状体に他の特徴を
付与することができる。これらの添加剤は、細胞の増殖
を促進し、移植後の生体内の局部環境を改善しおよび／
またはある種の薬剤の放出を制御するのに用いられる。
このような添加剤は、移植体の実質的にすべての微小球
状体またはそのごく一部分に組込むことができる。
込むことにより、例えば固定化、被包形成、共有結合に
よりまたは単なる吸着によって微小球状体に他の特徴を
付与することができる。これらの添加剤は、細胞の増殖
を促進し、移植後の生体内の局部環境を改善しおよび／
またはある種の薬剤の放出を制御するのに用いられる。
このような添加剤は、移植体の実質的にすべての微小球
状体またはそのごく一部分に組込むことができる。
例えば、抗菌剤の放出を制御することは特に重要であ
る。というのはこれらの化合物は大部分が現在臨床で使
用されている治療レベルでは真皮線維芽細胞とケラチノ
サイトの両方に対して細胞毒性があり、そのため創傷の
治癒に対して大きなマイナスの作用があるからである。
抗菌剤の放出の優れた制御は微小球状体を抗菌剤で予め
処理することによって達成され、その結果、創傷の治癒
に対する不利なことは少なくなるが滅菌状態は維持され
る。
る。というのはこれらの化合物は大部分が現在臨床で使
用されている治療レベルでは真皮線維芽細胞とケラチノ
サイトの両方に対して細胞毒性があり、そのため創傷の
治癒に対して大きなマイナスの作用があるからである。
抗菌剤の放出の優れた制御は微小球状体を抗菌剤で予め
処理することによって達成され、その結果、創傷の治癒
に対する不利なことは少なくなるが滅菌状態は維持され
る。
あるいは微小球状体の表面を、その表面に細胞が付着
するのを促進するために、例えばアルギニン−グリシン
−アスパラギン酸のトリペプチド（RGD）またはポリ−
Ｌ−リシンのような付着因子で前処理してもよい。図７
は、RGD付着因子で処理したPHB−PHV微小球状体に付着
させた新生児包皮由来の真皮線維芽細胞の、細胞を接種
してから１時間後を示す顕微鏡写真である。図８は、図
７に示すRGD付着因子で処理したPHB−PHV微小球状体に
付着させた真皮線維芽細胞の、細胞を接種してから22時
間後を示す顕微鏡写真である。微小球状体に付着した細
胞の大部分は平坦になっておりもはや球形ではない。
するのを促進するために、例えばアルギニン−グリシン
−アスパラギン酸のトリペプチド（RGD）またはポリ−
Ｌ−リシンのような付着因子で前処理してもよい。図７
は、RGD付着因子で処理したPHB−PHV微小球状体に付着
させた新生児包皮由来の真皮線維芽細胞の、細胞を接種
してから１時間後を示す顕微鏡写真である。図８は、図
７に示すRGD付着因子で処理したPHB−PHV微小球状体に
付着させた真皮線維芽細胞の、細胞を接種してから22時
間後を示す顕微鏡写真である。微小球状体に付着した細
胞の大部分は平坦になっておりもはや球形ではない。
図９はガラスの表面（対照）に付着させ次いで26時間
インキュベートした新生児の包皮由来の真皮線維芽細胞
の顕微鏡写真である。図10はPHB−PHVの平坦面に付着さ
せて次に26時間インキュベートした新生児包皮由来の真
皮線維芽細胞の顕微鏡写真である。図11はRGDで処理し
たPHB−PHVの平坦面に付着させ次いで26時間インキュベ
ートした新生児包皮由来の真皮線維芽細胞の顕微鏡写真
である。図9,10および11中の生存細胞はナチュラルレッ
ド（Natural Red）で染色されている。この染料は生存
細胞によって活発に吸収され、使用されている生体吸収
性材料上に細胞が多量生存していることを、図10と11に
示している。
インキュベートした新生児の包皮由来の真皮線維芽細胞
の顕微鏡写真である。図10はPHB−PHVの平坦面に付着さ
せて次に26時間インキュベートした新生児包皮由来の真
皮線維芽細胞の顕微鏡写真である。図11はRGDで処理し
たPHB−PHVの平坦面に付着させ次いで26時間インキュベ
ートした新生児包皮由来の真皮線維芽細胞の顕微鏡写真
である。図9,10および11中の生存細胞はナチュラルレッ
ド（Natural Red）で染色されている。この染料は生存
細胞によって活発に吸収され、使用されている生体吸収
性材料上に細胞が多量生存していることを、図10と11に
示している。
微小球状体に組込むことができる他の因子としては次
のような増殖因子がある。例えば表皮増殖因子（EG
F）、トランスフォーミング増殖因子−α（TGF−α）、
トランスフォーミング増殖因子−β（TGF−β）、ケラ
チノサイト増殖因子（KGF）、塩基性線維芽細胞増殖因
子（bFGF）およびインシュリン様増殖因子−Ｉ（IGF−
Ｉ）がある。これらの因子の制御された送達は微小球状
体を用いて創傷の治癒を一層よく制御することによって
達成できる。というのは、分裂促進因子（増殖因子）ま
たは血管新生促進因子（創傷のリキャピラライゼーショ
ン（recapillarization）を含む〕の送達が速すぎる
と、創傷部位に傷痕ができることがあるからである。ま
た増殖因子は、例えば永久的な共有結合によって、微小
球状体の表面に固定化して細胞を固定化された増殖因子
に接触させることができる。
のような増殖因子がある。例えば表皮増殖因子（EG
F）、トランスフォーミング増殖因子−α（TGF−α）、
トランスフォーミング増殖因子−β（TGF−β）、ケラ
チノサイト増殖因子（KGF）、塩基性線維芽細胞増殖因
子（bFGF）およびインシュリン様増殖因子−Ｉ（IGF−
Ｉ）がある。これらの因子の制御された送達は微小球状
体を用いて創傷の治癒を一層よく制御することによって
達成できる。というのは、分裂促進因子（増殖因子）ま
たは血管新生促進因子（創傷のリキャピラライゼーショ
ン（recapillarization）を含む〕の送達が速すぎる
と、創傷部位に傷痕ができることがあるからである。ま
た増殖因子は、例えば永久的な共有結合によって、微小
球状体の表面に固定化して細胞を固定化された増殖因子
に接触させることができる。
モノクローナル抗体を、微小球状体に組込んでTGF−
βの生体内の局所のレベルを制御して、例えば創傷治癒
の過程の特定の時点でこの因子の多するぎ供給を回避す
ることができる。TGF−βは、過剰量を利用できる場
合、線維芽細胞およびマクロファージの細胞によってコ
ラーゲンが不釣合いに過剰産生されることがある。
βの生体内の局所のレベルを制御して、例えば創傷治癒
の過程の特定の時点でこの因子の多するぎ供給を回避す
ることができる。TGF−βは、過剰量を利用できる場
合、線維芽細胞およびマクロファージの細胞によってコ
ラーゲンが不釣合いに過剰産生されることがある。
微小球状体の吸収は、リパーゼ、デポリメラーゼおよ
びデヒドロゲナーゼのような酵素を微小球状体に組込む
ことによって促進することができる。これらの酵素は、
生体内の他の内在性酵素、または構造結合を攻撃して生
体吸収性物質を解重合させることができる、身体が生成
する遊離ラジカル（例えばマクロファージ細胞）による
吸収を促進する。
びデヒドロゲナーゼのような酵素を微小球状体に組込む
ことによって促進することができる。これらの酵素は、
生体内の他の内在性酵素、または構造結合を攻撃して生
体吸収性物質を解重合させることができる、身体が生成
する遊離ラジカル（例えばマクロファージ細胞）による
吸収を促進する。
微小球状体に結合しているかまたは組込まれているい
くつかの物質は患者から直接得られるものでもよい。例
えば血小板由来の増殖因子（PDGF）（創傷の治癒を促進
することが知られている）は患者の血液の血小板由来の
ものであり、微小球状体内もしくは該球状体上に複合さ
せることができる。必要な血液の試料は比較的少量で例
えば100〜200mlである。
くつかの物質は患者から直接得られるものでもよい。例
えば血小板由来の増殖因子（PDGF）（創傷の治癒を促進
することが知られている）は患者の血液の血小板由来の
ものであり、微小球状体内もしくは該球状体上に複合さ
せることができる。必要な血液の試料は比較的少量で例
えば100〜200mlである。
他の添加物としては、肥厚性瘢痕を軽減するポリアミ
ン類；生物静力学的特性、殺菌特性もしくは抗拒絶反応
性を付与する物質；ならびに活性および／または安定性
を増大するプロテイノイド類が挙げられる。
ン類；生物静力学的特性、殺菌特性もしくは抗拒絶反応
性を付与する物質；ならびに活性および／または安定性
を増大するプロテイノイド類が挙げられる。
さらに、増殖因子、移動因子、血管形成誘導因子など
の因子を、細胞でコートしないで追加して供給する微小
球状体内もしくはその球状体上に組込んでもよい。この
目的のために、極小微小球状体を用いることができる。
なんとなれば、この球状体は多量を必要とせず吸収すべ
き物質の量が減少するからである。これらの極小微小球
状体（直径が10〜50ミクロンの範囲内である）は、細胞
でコートされた大きい微小球状体とともに創傷部位中に
拡散させるかまたは適切なときに独立して添加する。周
囲の組織は、細胞の移動、栄養素の送達、移動および増
殖のための環境を改善するために、上記の細胞なしの微
小球状体の表面にコートされた走化性因子、血管新生促
進因子およびマイトジェン因子で前処理してもよい。本
発明には次のような別の利点がある。すなわち、これら
の因子の多くは溶解状態では比較的安定性が低いが、細
胞でコートされた微小球状体で創傷を治療する直前に新
たに調製できる。これらの特別の微小球状体は、細胞の
移動、血管形成および／または増殖を促進する環境を確
立するために、細胞が送達されるときもしくはそれより
早期に内部に拡散させ増殖させてもよい。このようにし
て、創傷部位において組織の再生と移動を促進する、計
画された環境を確立することができる。その結果、下側
に位置する毛細血管のネットワークが増大して、塗布さ
れた細胞に対して栄養素を“正常”に送達することがで
きる。
の因子を、細胞でコートしないで追加して供給する微小
球状体内もしくはその球状体上に組込んでもよい。この
目的のために、極小微小球状体を用いることができる。
なんとなれば、この球状体は多量を必要とせず吸収すべ
き物質の量が減少するからである。これらの極小微小球
状体（直径が10〜50ミクロンの範囲内である）は、細胞
でコートされた大きい微小球状体とともに創傷部位中に
拡散させるかまたは適切なときに独立して添加する。周
囲の組織は、細胞の移動、栄養素の送達、移動および増
殖のための環境を改善するために、上記の細胞なしの微
小球状体の表面にコートされた走化性因子、血管新生促
進因子およびマイトジェン因子で前処理してもよい。本
発明には次のような別の利点がある。すなわち、これら
の因子の多くは溶解状態では比較的安定性が低いが、細
胞でコートされた微小球状体で創傷を治療する直前に新
たに調製できる。これらの特別の微小球状体は、細胞の
移動、血管形成および／または増殖を促進する環境を確
立するために、細胞が送達されるときもしくはそれより
早期に内部に拡散させ増殖させてもよい。このようにし
て、創傷部位において組織の再生と移動を促進する、計
画された環境を確立することができる。その結果、下側
に位置する毛細血管のネットワークが増大して、塗布さ
れた細胞に対して栄養素を“正常”に送達することがで
きる。
過去数年間に、動物由来の血清を含有していない培地
の配合に、重要な進歩があった。このことは、ヒトの臨
床上の用途を目指す技術にとって特に重要である。血清
は、一般にウシが起源であるが、全く不明確なものであ
るばかりでなく、最終製品に汚染物を導入して結果が変
動する原因になることがある。明確な血清なしの培地が
真皮線維芽細胞とケラチノサイトの培養に適している。
多数の血清なしの培地が市販されているが例えばClonet
ics Corporation社のKGMとFGMおよびGIBCO社のKGMがあ
る。
の配合に、重要な進歩があった。このことは、ヒトの臨
床上の用途を目指す技術にとって特に重要である。血清
は、一般にウシが起源であるが、全く不明確なものであ
るばかりでなく、最終製品に汚染物を導入して結果が変
動する原因になることがある。明確な血清なしの培地が
真皮線維芽細胞とケラチノサイトの培養に適している。
多数の血清なしの培地が市販されているが例えばClonet
ics Corporation社のKGMとFGMおよびGIBCO社のKGMがあ
る。
ケラチノサイトと真皮線維芽細胞を共生培養する場
合、ケラチノサイトは、迅速な増殖速度を助長しかつ最
終分化を防止するため培地中のカルシウムのレベルは低
いことが必要である。高レベルのカルシウム（＞0.1m
M）のもとでは、ケラチノサイトは増殖が遅く、最終分
化を行い細胞消滅に至る傾向がある〔プログラム細胞死
（programmed cell death）〕。真皮線維芽細胞は、通
常１〜3mMの範囲内のカルシウムレベルの培地で培養さ
れ、このレベルで正常に増殖し機能することができる。
したがって、一つの実施態様では、真皮線維芽細胞を最
初に0.1mMより高い濃度のカルシウムを含有する培地で
培養する。所定の時間経過した後、その細胞を、その場
で、リン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄して増殖培地を除
去する。次いで、ケラチノサイトおよびカルシウム濃度
を下げた別の培地を、培養された真皮線維芽細胞が入っ
ている組織培養フラスコに添加する。さらに培養する
と、最終的に、線維芽細胞の増殖は低下するがケラチノ
サイトは良好に増殖できるという結果になる。このこと
は、ケラチノサイトの層が、該線維芽細胞の存在下で、
線維芽細胞が増殖しすぎてケラチノサイトをおしのける
ことなく増殖できるので理想的な状態である。該線維芽
細胞は増殖しないが、ケラチノサイトが真皮の表面で最
適に増殖して器質化するのに必要な因子を依然として産
生することができる。線維芽細胞が産生する因子であっ
てケラチノサイトが最適に増殖／器質化することができ
るようにする因子としてはフィブロネクチンとTGF−β
がある。
合、ケラチノサイトは、迅速な増殖速度を助長しかつ最
終分化を防止するため培地中のカルシウムのレベルは低
いことが必要である。高レベルのカルシウム（＞0.1m
M）のもとでは、ケラチノサイトは増殖が遅く、最終分
化を行い細胞消滅に至る傾向がある〔プログラム細胞死
（programmed cell death）〕。真皮線維芽細胞は、通
常１〜3mMの範囲内のカルシウムレベルの培地で培養さ
れ、このレベルで正常に増殖し機能することができる。
したがって、一つの実施態様では、真皮線維芽細胞を最
初に0.1mMより高い濃度のカルシウムを含有する培地で
培養する。所定の時間経過した後、その細胞を、その場
で、リン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄して増殖培地を除
去する。次いで、ケラチノサイトおよびカルシウム濃度
を下げた別の培地を、培養された真皮線維芽細胞が入っ
ている組織培養フラスコに添加する。さらに培養する
と、最終的に、線維芽細胞の増殖は低下するがケラチノ
サイトは良好に増殖できるという結果になる。このこと
は、ケラチノサイトの層が、該線維芽細胞の存在下で、
線維芽細胞が増殖しすぎてケラチノサイトをおしのける
ことなく増殖できるので理想的な状態である。該線維芽
細胞は増殖しないが、ケラチノサイトが真皮の表面で最
適に増殖して器質化するのに必要な因子を依然として産
生することができる。線維芽細胞が産生する因子であっ
てケラチノサイトが最適に増殖／器質化することができ
るようにする因子としてはフィブロネクチンとTGF−β
がある。
本発明によって、実際の細胞処置を行う創傷もしくは
火傷の治療施設を地理的に集中できる可能性がある。厚
み全体および厚みの一部分の皮膚損傷に真皮線維芽細胞
を利用することは、移植物が示すアレルゲン性が非常に
低い、死体由来を含むドナー由来の真皮線維芽細胞の地
方の“銀行”を維持することによって促進することがで
きる。
火傷の治療施設を地理的に集中できる可能性がある。厚
み全体および厚みの一部分の皮膚損傷に真皮線維芽細胞
を利用することは、移植物が示すアレルゲン性が非常に
低い、死体由来を含むドナー由来の真皮線維芽細胞の地
方の“銀行”を維持することによって促進することがで
きる。
患者由来の組織移植片は、患者が真皮線維芽細胞／微
小球状体のスラリーですでに治療されつつある間に、ケ
ラチノサイトの培養を行うための中央細胞処理施設に、
移植用の臓器を輸送するのに使われている媒体〔例えば
ViaSpan（登録商標）UW Solution（Dupont社）または他
の維持培地〕と類似の適正な輸送媒体に入れて輸送する
ことができる。一般に４cm2の組織移植片は容易に輸送
することが可能で、かつ必要なときに１〜３週間以内で
数平方米もの同等の組織の面積を治療するよう拡張する
ことができる。治療に用いるのに充分な細胞の増殖は、
すでに述べた従来の方法より著しく速くかつ効率的であ
る。
小球状体のスラリーですでに治療されつつある間に、ケ
ラチノサイトの培養を行うための中央細胞処理施設に、
移植用の臓器を輸送するのに使われている媒体〔例えば
ViaSpan（登録商標）UW Solution（Dupont社）または他
の維持培地〕と類似の適正な輸送媒体に入れて輸送する
ことができる。一般に４cm2の組織移植片は容易に輸送
することが可能で、かつ必要なときに１〜３週間以内で
数平方米もの同等の組織の面積を治療するよう拡張する
ことができる。治療に用いるのに充分な細胞の増殖は、
すでに述べた従来の方法より著しく速くかつ効率的であ
る。
適切な大きさの細胞集団が得られたならば、細胞でコ
ートされた微小球状体は収穫し、濃縮し次いで遠隔地の
治療センターに送るため維持培地中に入れる。107細胞/
mlのオーダーの多数の細胞を微小球状体にコートして、
比較的小容積で輸送できる。このことは、同等量の細胞
に対してより多数の容器を必要とする平坦法を超える利
点である。さらに、メッシュマトリックスの輸送はその
組織調製品がもろいために阻害されている。本発明の微
小球状体／細胞スラリーは比較的破壊されにくいので、
それほど理想的でない条件下で満足すべき輸送を行うこ
とができる。
ートされた微小球状体は収穫し、濃縮し次いで遠隔地の
治療センターに送るため維持培地中に入れる。107細胞/
mlのオーダーの多数の細胞を微小球状体にコートして、
比較的小容積で輸送できる。このことは、同等量の細胞
に対してより多数の容器を必要とする平坦法を超える利
点である。さらに、メッシュマトリックスの輸送はその
組織調製品がもろいために阻害されている。本発明の微
小球状体／細胞スラリーは比較的破壊されにくいので、
それほど理想的でない条件下で満足すべき輸送を行うこ
とができる。
細胞でコートされた微小球状体は、心臓のような移植
臓器を輸送するのに用いられているのと類似の媒体に入
れて輸送できる。さらにこの媒体は酸素運搬を促進する
ペルフルオロカーボンを含有するよう適応させることが
できる。本発明の微小球状体／細胞スラリーは皮膚損傷
に塗布する前にそれ以上の処理をほとんどもしくは全く
必要としない。接線流もしくは交差流の膜もしくは中空
繊維の膜のような公知の方法も輸送に用いることがで
き、この方法によって、細胞／微小球状体が存在する環
境を操作しながら細胞／微小球状体を維持できる。
臓器を輸送するのに用いられているのと類似の媒体に入
れて輸送できる。さらにこの媒体は酸素運搬を促進する
ペルフルオロカーボンを含有するよう適応させることが
できる。本発明の微小球状体／細胞スラリーは皮膚損傷
に塗布する前にそれ以上の処理をほとんどもしくは全く
必要としない。接線流もしくは交差流の膜もしくは中空
繊維の膜のような公知の方法も輸送に用いることがで
き、この方法によって、細胞／微小球状体が存在する環
境を操作しながら細胞／微小球状体を維持できる。
先に考察したメッシュマトリックス移植体は、それを
輸送できるようにするため一般に凍結保存される。しか
し、凍結保存の媒体はジメチルスルホキシド（DMSO）を
含有しこのDMSOは滅菌環境と多数の操作を含む手のこん
だ方法を必要とし、移植する前にDMSOを除くために受け
入れ末端に細胞培養実験室を必要とすることは当該技術
分野の当業者にとっては分かっていることである。この
種の施設は、治療が必要なときまたは場所に、現場で利
用できるとは限らない。
輸送できるようにするため一般に凍結保存される。しか
し、凍結保存の媒体はジメチルスルホキシド（DMSO）を
含有しこのDMSOは滅菌環境と多数の操作を含む手のこん
だ方法を必要とし、移植する前にDMSOを除くために受け
入れ末端に細胞培養実験室を必要とすることは当該技術
分野の当業者にとっては分かっていることである。この
種の施設は、治療が必要なときまたは場所に、現場で利
用できるとは限らない。
産業上の利用性 本発明によれば、火傷などの創傷のごとき厚み全体お
よび厚みの一部分の皮膚損傷を迅速かつ有効に治療する
ことができる。本発明は、従来の方法と異なり、患者に
適用する場合にステープリング（stapling）、縫合また
は他の付着法を必要とせず、また身体の輪郭または弯曲
に付随する問題で制約されることもない。さらに、微小
球状体／細胞スラリーの塗布は、理想的なおよびそれほ
ど理想的でない条件下で実施することができる。
よび厚みの一部分の皮膚損傷を迅速かつ有効に治療する
ことができる。本発明は、従来の方法と異なり、患者に
適用する場合にステープリング（stapling）、縫合また
は他の付着法を必要とせず、また身体の輪郭または弯曲
に付随する問題で制約されることもない。さらに、微小
球状体／細胞スラリーの塗布は、理想的なおよびそれほ
ど理想的でない条件下で実施することができる。
また本発明の生きている皮膚置換体は、医薬、化粧品
および家庭用品の化合物の危険性と安全性を評価する検
定法の“皮膚のモデル”として使用できる。これは、動
物実験を回避する要求があるので成長分野である。
および家庭用品の化合物の危険性と安全性を評価する検
定法の“皮膚のモデル”として使用できる。これは、動
物実験を回避する要求があるので成長分野である。
また本発明は、皮膚の欠陥を修正する美容分野にも用
途がある。
途がある。
フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) A61K 35/36 A61L 15/01 A61K 9/50
Claims (19)
- 【請求項１】損傷の形状に適合し、損傷の厚みの全体に
わたる及び損傷の厚みの一部にわたる皮膚損傷のための
生きている皮膚置換組成物であり、上記組成物が、生物
学的に許容される液体担体、生体適合性、かつ、インビ
ボにおいて吸収性である材料を含み、30〜80％の微小気
孔率（macroporosity）を有する微小球、並びに上記微
小球をコーティングしている増殖性皮膚細胞であって、
ケラチノサイト（keratinocytes）、真皮繊維芽細胞（d
ermal fibroblasts）、メラノサイト（melanocytes）及
びそれらの組合せ物から成る群から選ばれた増殖性皮膚
細胞のスラリーを含んで成り、ここで、上記スラリーが
損傷に適用されるとき、その増殖性皮膚細胞が、上記微
小球から上記損傷に移動する、ことを特徴とする、前記
皮膚置換組成物。 - 【請求項２】前記皮膚細胞が、真皮繊維芽細胞であるこ
とを特徴とする、請求項１に記載の生きている皮膚置換
組成物。 - 【請求項３】前記皮膚細胞が、ケラチノサイト又はメラ
ノサイトであることを特徴とする、請求項１に記載の生
きている皮膚置換組成物。 - 【請求項４】前記皮膚細胞が、真皮繊維芽細胞、ケラチ
ノサイトとメラノサイトの組合せ物である、請求項１に
記載の生きている皮膚置換組成物。 - 【請求項５】前記皮膚細胞が、皮膚損傷をもつ患者から
得られることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１
項に記載の生きている皮膚置換組成物。 - 【請求項６】前記皮膚細胞が、皮膚損傷をもつ患者以外
のドナーから得られることを特徴とする、請求項１〜４
のいずれか１項に記載の生きている皮膚置換組成物。 - 【請求項７】前記微小球が、ポリヒドロキシブチレート
（PHB）、PHB−ポリヒドロキシバレレート（PHB−PHV）
コポリマー、ラクチド−グリコリド・ポリマー、脂質、
ポリラクトン、ポリエステル、ポリラクチド、ポリグリ
コリド、ポリ無水物、コラーゲン、及びゼラチンから成
る群から選ばれた少なくとも１の材料から形成されるこ
とを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の
生きている皮膚置換組成物。 - 【請求項８】前記微小球が、１の材料のコア及びその他
の材料のコーティングから形成されることを特徴とす
る、請求項１〜４のいずれか１項に記載の生きている皮
膚置換組成物。 - 【請求項９】前記微小球が、リン脂質又はスフィンゴシ
ンによりコートされていることを特徴とする、請求項８
に記載の生きている皮膚置換組成物。 - 【請求項１０】前記微小球が、ポリヒドロキシブチレー
ト及び多糖類から形成されていることを特徴とする、請
求項１〜９のいずれか１項に記載の生きている皮膚置換
組成物。 - 【請求項１１】細胞による前記微小球のコーティングに
先立って、前記多糖類が、部分的又は全体的に、物理
的、化学的又は酵素的に、除去されていることを特徴と
する、請求項10に記載の生きている皮膚置換組成物。 - 【請求項１２】リパーゼ、デポリメラーゼ、デヒドロゲ
ナーゼ、患者由来又はそれ以外の血小板由来成長因子、
表皮成長因子、トランスフォーミング成長因子−アルフ
ァ、トランスフォーミング成長因子−ベータ、インスリ
ン−様成長因子、ケラチノサイト成長因子、塩基性繊維
芽細胞成長因子、アルギニン−グリシン−アスパラギン
酸トリペプチド、ポリ−Ｌ−リジン及びコラーゲンの如
きポリペプチド、抗菌剤、ポリアミン、免疫抑制剤の如
き医薬、炭水化物、脂質、並びに顔料から成る群から選
ばれた添加物をさらに包含することを特徴とする、請求
項１〜11のいずれか１項に記載の生きている皮膚置換組
成物。 - 【請求項１３】前記添加物が、皮膚細胞で前記微小球を
コーティングするに先立って、その微小球の中に又は上
に取り込まれていることを特徴とする、請求項12に記載
の生きている皮膚置換組成物。 - 【請求項１４】前記添加物が、前記皮膚損傷への適用に
先立って、前記スラリーに添加された追加の微小球の中
に又は上に取り込まれていることを特徴とする、請求項
12に記載の生きている皮膚置換組成物。 - 【請求項１５】前記微小球の平均直径が、50〜500μｍ
の範囲内にあることを特徴とする、請求項１〜14のいず
れか１項に記載の生きている皮膚置換組成物。 - 【請求項１６】前記追加の微小球の平均直径が、10〜50
0μｍの範囲内にあることを特徴とする、請求項14に記
載の生きている皮膚置換組成物。 - 【請求項１７】ケラチノサイト、真皮繊維芽細胞、メラ
ノサイト及びそれらの組合せ物から成る群から選ばれた
皮膚細胞を培養し、30〜80％の微小気孔率をもつ２以上
の生物適合性の吸収性微小球を提供し、上記皮膚細胞に
上記微小球を付着させ、そして上記の付着された細胞を
増殖培地中で集密又は集密付近まで増殖させて、増殖性
の皮膚細胞でコートされた微小球を得て、そしてその
後、上記の細胞−コートされた微小球を生物学的に許容
される液体担体中でスラリーになるまで濃縮する、工程
を含み、かつ、上記の細胞−コートされた微小球が皮膚
損傷に適用されるとき、その増殖性細胞が、上記微小球
から上記損傷に移動することを特徴とする、請求項１〜
16のいずれか１項に記載の生きている皮膚置換組成物の
製造方法。 - 【請求項１８】真皮繊維芽細胞とケラチノサイトの組合
せ物が使用され、そして細胞を増殖させる工程が、0.1m
Mより高い濃度でカルシウムを含有する第１培地中で真
皮繊維芽細胞を増殖させ、そしてその後、上記細胞をバ
ッファー溶液で洗浄して上記第１培地を除去し、そして
0.1mM未満の濃度でカルシウムを含有する第２培地中で
ケラチノサイトを増幅させる、ことを含むことを特徴と
する、請求項17に記載の製造方法。 - 【請求項１９】前記増殖培地が無血清である、請求項18
に記載の製造方法。
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