EA014044B1

EA014044B1 - Наносомальная лекарственная форма препарата пролонгированного действия для лечения гепатита с (варианты)

Info

Publication number: EA014044B1
Application number: EA200801819A
Authority: EA
Inventors: Геворкбек Гайкович БАРСЕГЯН; Евгений Алексеевич ВОРОНЦОВ; Виктор Константинович МАРКОВ; Кирилл Юльевич ШУБСКИЙ
Original assignee: Общество С Ограниченной Ответственностью "Аква-Альянс"
Priority date: 2008-07-09
Filing date: 2008-07-09
Publication date: 2010-08-30
Also published as: EA200801819A1; WO2010005344A1

Abstract

Техническая проблема, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в разработке препарата и его конкретных форм, с использованием которых можно обеспечить эффективное лечение ВГС за счет обеспечения доставки и локализации лекарственных веществ в основном поражаемом ВГС органе-мишени (печени) и внутри клеток печени (в гепатоцитах), в эффективных для терапевтического действия дозах. Препарат содержит комплекс активных компонентов, включающий глутатион и инозин, взятые в отношении 1:1, а также цисплатин в количестве 0,05%, при этом комплекс активных компонентов иммобилизован за счет адсорбции на полимерном носителе в виде наночастиц из полилактидгликолида. Во втором варианте комплекс активных компонентов включает только глутатион и инозин, взятые в указанном соотношении.

Description

Область применения

Изобретение относится к медицине, а конкретно к наносомальной лекарственной форме препарата пролонгированного действия для лечения гепатита С.

Известный уровень

Гепатит С - заболевание печени, вызываемое вирусом гепатита С (ВГС). Кроме того, гепатит может быть вызван и другими вирусами, например цитомегавирусом (ЦМВ) или вирусом герпеса. В мире более 200 миллионов человек являются носителями вируса гепатита С. По данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) приблизительно 2% населения России (около 2 млн. 974 тыс. чел.) заражены этим вирусом. При этом в последующие десятилетия ожидается резкое увеличение количества лиц инфицированных ВГС (Гланц С, Медико-биологическая статистика, М., Практика, 1999, с.459; Балаян М.С., Михайлов М.И., Энциклопедический словарь - вирусные гепатиты, М., Амипресс, 1999, с.304).

Гепатит С может быть острым и хроническим. Острый гепатит С диагностируется очень редко и чаще случайно. Выделяют три сценария - варианта событий, происходящих после острого гепатита С.

У 20% подвергшихся заражению наступает выздоровление в течение 6-12 месяцев с исчезновением маркеров гепатита.

Переход инфекции в так называемое носительство вируса гепатита С, когда симптомы и лабораторные признаки заболевания печени не выявляются, а клинические анализы крови показывают присутствие вируса в крови (феномен персистенции - существование в организме хозяина). Такие случаи (до 20% от общего числа установленного диагноза - гепатит С) могут быть впервые обнаружены при «неспециальном, «случайном обследовании. Частота неблагоприятных исходов при этом варианте течения гепатита С к настоящему времени окончательно не установлена. Известны случаи, когда даже при отсутствии лабораторных признаков поражения печени гепатит С может прогрессировать.

У 60-70% всех людей, переболевших острым гепатитом, происходит развитие хронического гепатита с какими-либо клиническими и лабораторными проявлениями поражения печени. Драматический и часто скрытый переход острого гепатита С в хронический происходит постепенно и не зависит от степени проявлений острой фазы. В течение нескольких лет нарастает повреждение клеток печени, развивается фиброз. Основные функции печени при этом могут долгое время сохраняться. Болезнь прогрессирует медленно, патологические проявления нарастают постепенно, поэтому, как предупреждают гепатологи, с проблемой неблагоприятных исходов гепатита С человечество столкнется через один или несколько десятков лет, когда будет проанализирован опыт наблюдения за большой популяцией людей, болеющих в настоящее время.

Выраженные патологические эффекты гепатита С проявляются у 20% пациентов с хронической формой ВГС и активным течением гепатита, при этом высок риск трансформации гепатита в цирроз печени. А у 5% пациентов с циррозом возможно развитие первичного рака печени. Вероятность развития рака печени выше при одновременном течении двух инфекций - гепатита В и гепатита С. Длительное употребление алкоголя также связано с более высоким риском развития рака печени, что накладывает ограничение на использование алкогольсодержащих лекарственных средств для лечения гепатита.

Большинство вирусов, против которых разработаны действенные вакцины, обладают выраженным цитопатическим эффектом (разрушение клеток). В этом случае выход новых вирусных частиц сопровождается гибелью хозяйской клетки и достаточно высокой концентрацией вирусных частиц в крови, которые представляют практически однородный иммуногенный и антигенный комплекс. Вирус гепатита С способен к длительной персистенции (существованию) в клетках хозяина без выраженного цитопатического эффекта с минимальным уровнем виремии. Это обстоятельство, а также отсутствие репарационных механизмов при репликации вирусной РНК приводит к появлению многочисленных генетических (и антигенных) вариантов вируса - квазивидов. Как правило, от одного и того же хронического больного удается выделить несколько квазивидов; их репертуар меняется в течение заболевания. Таким образом вирус ускользает от иммунного ответа, что осложняет его диагностику, способствуя развитию хронической формы заболевания. Указанные особенности биологии ВГС не позволяют создать традиционную вакцину против гепатита С (Курамшин Д.Х., Сенников С.В., Козлов В.А., Иммунотропные свойства возбудителя вирусного гепатита С, Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2004, мартапрель, с. 110-114; Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д., Иммунология, М., Мир, 2000, с.592; Масалова О.В., Абдулмеджидова А.Г., Моргунов К.В., Грищенко С.В., Шкурко Т.В., Лакина Е.И., Келли Е.И., Львов Д. К., Кущ А.А., Изменение показателей гуморального и клеточного иммунитета у пациентов с хроническим гепатитом С различной тяжести, Вопросы вирусологии, 2003, т. 48, с.15-19; Блохина Н.П., Новые сратегии интерферонотерапии больных хроническим гепатитом С, Вирусные гепатиты - достижения и перспективы, Информационный бюллетень, 1999, №1(2), с.9-12; Павлов Ч.С., Гепатит С: естественное течение и подходы к терапии, Клинические перспективы гастроэнтерологии, гепатологии, 2001, № 3, с.2 - 6; Никитин И.Г., Сторожаков Г.И., Хронический гепатит С: актуальные вопросы диагностики и лечения, Клинические перспективы гастроэнтерологии, гепатологии, 2001, № 3, с. 7-11).

В настоящее время выявляется большая группа больных хроническим гепатитом С, одновременно инфицированная и болеющая другими вирусными заболеваниями, в частности, гепатиты А, В, генитальный герпес, цитомегаловирусная инфекция, ВИЧ/СПИД, а также с другими заболеваниями: цирроз пече

- 1 014044 ни, рак, облучение, токсикоз, вызванный лекарственными препаратами. Для указанной группы прием известных гепатопротекторных препаратов не решает проблемы, поскольку современные гепатопротекторные препараты не обладают достаточно эффективными противовирусными/вирулицидными свойствами (Блохина Н.П. Новые сратегии интерферонотерапии больных хроническим гепатитом С, Вирусные гепатиты -достижения и перспективы, Информационный бюллетень, 1999, №1(2), с.9-12; Павлов Ч.С., Гепатит С: естественное течение и подходы к терапии, Клинические перспективы гастроэнтерологии, гепатологии, 2001, № 3, с.2-6).

В настоящее время в практической медицине известно лишь два препарата, официально зарегистрированных и реально используемых для лечения вирусного гепатита С, это: интерферон альфа (ИФН) или интерферон в комбинации с рибавирином (препарат Виразол) (Блохина Н.П., Новые сратегии интерферонотерапии больных хроническим гепатитом С, Вирусные гепатиты - достижения и перспективы, Информациооный бюллетень, 1999, №1(2), с. 9-12; Петров В.А., Заболотняя Г.А., Индукторы интерферонов в лечении и профилактике вирусных инфекций, Новые лекарства и новости фармакотерапии, 2000, № 8, с.7-12; Вокеи НВ, Оте1сй ΌΒ, НераООк С учик: ситтей иибегйаибшд аиб ртокрейк (от Гйите 1йетар1ек, Мо1., Меб., Тобау, 1999, ν.5, №9, р.393-399).

Интерферон альфа ингибирует репликацию и транскрипцию вирусов и хламидий. Оказывает противовирусное действие, индуцируя в клетках состояние резистентности к вирусным инфекциям и модулируя ответную реакцию иммунной системы, направленную на нейтрализацию вирусов или уничтожение инфицированных ими клеток. Механизм противовирусного действия заключается в создании защитных механизмов в неинфицированных вирусом клетках. Связываясь со специфическими рецепторами на поверхности клетки, интерферон альфа изменяет свойства мембраны клетки, предотвращает адгезию и проникновение вируса внутрь клетки, стимулирует специфические ферменты, воздействует на РНК и ингибирует синтез белков вируса. Эти свойства интерферона альфа позволяют ему эффективно участвовать в процессах элиминации возбудителя, предупреждении заражения и возможных осложнений.

Благодаря иммуномодулирующей активности интерферона альфа, происходит нормализация иммунного статуса. Иммуномодулирующее действие его обусловлено стимулированием активности макрофагов (фагоцитарной активности) и естественных киллерных клеток (ΝΚ-клетки). Интерферон альфа стимулирует процесс презентации антигена макрофагами иммунокомпетентным клеткам. Однако препараты интерферона альфа могут приводить к появлению антител к интерферону, что, как следствие, снижает их лечебный эффект. Интерферон альфа малоэффективен для лечения гепатита С. Так при хроническом гепатите С назначают по 3-6 млн МЕ п/к или в/м 3 раза в неделю, продолжительность лечения 12 недель. Большинство пациентов отвечают на терапию снижением уровня трансаминаз через 12 недель от начала лечения. Однако если в течение 16 недель от начала терапии не наступает снижение содержания трансаминаз (АлАТ), то лечение рекомендуется прекратить.

При лечении Виразолом показана активность рибаврина против вируса гепатита С. Хотя механизм действия полностью не выявлен, предполагается, что накапливающийся по мере фосфорилирования рибавирин трифосфат конкурентно подавляет образование гуанозин трифосфата, тем самым снижая синтез вирусных РНК. Считается также, что механизм синергетического действия рибавирина и интерферона альфа против вируса гепатита С обусловлен усилением фосфорилирования рибавирина интерфероном. Рекомендуется для лечения хронического гепатита С (у первичных больных, ранее не лечившихся интерфероном альфа; при обострении после курса монотерапии интерфероном альфа; у больных, невосприимчивых к монотерапии интерфероном альфа) в комбинации с интерфероном альфа.

Механизм действия интерферонов связан с одновременным противовирусным внутриклеточным эффектом путём активации клеточных генов, в результате чего синтезируются белки, ингибирующие синтез вирусной ДНК (РНК) и системным иммуномодулирующим эффектом, который реализуется путём усиления экспрессии антигенов НЬА на клеточных мембранах и увеличения активности цитотоксических Т-клеток и естественных киллеров (Айтаб А., АКагех Р., Во1е оГ ΝΚ аиб ΝΚΤ се11к ίη 1Пе 1ттииора1йодеиек1к оГ НСУ-шбисеб йераббк, ТЕеикос.Вюй, 2004, ν. 76, р. 743-759, ЕриЬ 2004 1ии 24, Веу1е\\·; ьаке 1.В., Тйе го1е оГ шшшпокирргеккюп ш гесиггеисе оГ йераббк С, Шег Тгаикрк 2003, ν.9, р.863-6, Вет1е\\·; Ве1кет М., Эикйе1ко О., А11еи Т.М., Сйиид В.Т., \7а1кег Β.Ό., К1еиегтаи Р., Н1дй теко1йюи аиа1ук1к оГ се11и1аг 1ттиие гекроикек ш гекокеб аиб регкМет йераббк С νίπικ шГейюи, Оак1тоейего1оду, 2004, ν.127, р. 924-936; Кеск Ζ.Υ., Ор Эе Вееск А., Наб1оск К.О., Х1а 1., Ь1 Т.К., ЭиЬшккои 1., Роиид 8.К., Нераббк С у|гик Е2 йак 1йтее шшшподешс боташк сойа1йид соиГотта1юиа1 ерйорек \\'йй бМшс! рторетбек аиб Ью1ощса1 Гцисбоик, 1.У1то1., 2004, ν.78, р. 9224-9232).

Интерфероны, с одной стороны, стимулируют фагоцитоз, активность естественных киллерных клеток, экспрессию антигенов. С другой стороны, они могут угнетать образование антител, провоцировать развитие анафилактического шока, воспаления, гиперчувствительности замедленного типа. Поэтому большинство авторов сегодня разделяют мнение о том, что лечение вирусных гепатитов уже не может и не должно осуществляться с помощью одной только ИФН-терапии (Клинический опыт применения ИФН альфа-2Ь при гепатите, 1Шр://теб(ги/бос/081015.111т; Дерябин П.Г., Исаева Е.И., Гренкова Е.П. и др., Цитопатогенные варианты вируса гепатита С, Клиническая иммунология, 2001, №.1, р. 28-31). По мнению специалистов назрела необходимость одновременного использования нескольких препаратов,

- 2 014044 способных воздействовать как на различные звенья собственно репликации вируса, так и на иммунную систему в целом, хотя интерфероны продолжают оставаться базисным компонентом лечения.

При введении в организм только незначительная часть указанных лекарственных веществ попадает в орган/клетку - мишень и действует на ВГС, в то время как большая часть циркулирует в крови. В связи с этим возникают серьезные побочные эффекты в виде гриппоподобного синдрома (этот синдром проявляется повышением температуры тела до 38-38,5°С, ознобом, головной болью, болью в мышцах), астенического синдрома (при этом отмечается слабость, быстрая утомляемость, снижение внимания, головокружение, сонливость. Могут возникнуть стрессовое состояние или депрессия), нарушаются свертывание крови, лейкопения. Иногда интерферон может вызывать нарушения сердечного ритма, проводимости сердца, диспепсию, аллергические реакции и другие нарушения функционирования организма. Прием интерферонов усиливает действие алкоголя и психотропных средств. Кроме того, большая часть вводимых лекарственных веществ подвергается биотрансформации, не оказав противовирусного действия.

Лечение препаратами - интерферон альфа и виразол - дорогостоящее, при этом эффективность его недостаточна. Применение этих препаратов сопряжено с различными побочными эффектами. Со стороны нервной системы: головная боль, бессонница, астения, депрессия. Со стороны сердечно-сосудистой системы наблюдается снижение АД, брадикардия, остановка сердца. Со стороны органов кроветворения - гемолитическая анемия, лейкопения, нейтропения, гранулоцитопения, тромбоцитопения. Со стороны дыхательной системы: диспноэ, кашель. Со стороны пищеварительной системы: снижение аппетита, тошнота, гипербилирубинемия. Аллергические реакции: крапивница, ангионевротический отек, бронхоспазм, анафилаксия, кожная сыпь. Наблюдается выпадение волос. У медицинских работников, выполняющих ингаляционное введение препарата, отмечается головная боль, зуд, гиперемия глаз или отечность век. Поэтому эти известные препараты (ИФН и Виразол) применяются строго по назначению врача.

Одним из радикальных путей повышения эффективности лечения гепатита С является разработка комбинированных или композиционных лекарственных препаратов направленного действия как на различные звенья собственно репликации вируса, так и на иммунную систему в целом. При этом длительная локализация лекарственных веществ в основном органе-мишени - печени играет решающую роль в повышении эффективности лечения и снижении побочных эффектов.

Одним из первых препаратов, решающих эту задачу, является препарат, состоящий из динатриевой соли окисленного глутатиона с с18-диаминодихлорплатиной (С88С Р1). Отмечена высокая эффективность лекарственных форм на основе С88С Р1 относительно индукции механизмов апоптоза в вирустрансформированных клетках в случае вирусных гепатитов В и С, что было подтверждено клиническими исследованиями (ВИ, № 2144374, С1, МПК 7 А61К 38/06, 2000).

Терапевтический эффект С88С Р1 и его фармацевтически приемлемых производных, в частности солей, при лечении онкологических, инфекционных (вирусных) заболеваний, в том числе гепатита С, был объяснен как стимуляцией продукции широкой палитры эндогенных цитокинов, так и уникальной способностью активировать апоптотическую гибель исключительно трансформированных клеток. Большинство из терапевтических эффектов С88С Р1 и его фармацевтически приемлемых производных, как в экспериментальных, так и в клинических условиях, связано со свойствами С88С Р1 и его лекарственных форм стимулировать/модулировать эндогенную продукцию цитокинов или воспроизводить их эффекты в отношении того, что касается регуляции (восстановления нормального соотношения) пролиферации и дифференцировки нормальных клеток и в то же время активировать апоптотическую гибель исключительно трансформированных клеток.

Сказанное позволяет сделать вывод о том, что недостатками прототипа являются низкая эффективность, большая токсичность, кратковременное действие, риск инфецирования при многократном применении, нефротоксичность.

Решение проблемы лечения гепатита С требует пролонгированного действия препарата, что в известных формах препарата на основе С88С Р1 не обеспечивается. Компоненты, ответственные за внесение в состав Р1, отличаются высокой токсичностью, поэтому особо важно их дозированное поступление в организм, а в лучшем случае следует добиться лечебного эффекта при отсутствии Р1. Таким образом, при создании конкретных лекарственных форм приходится находить специфические решения, обусловленные природой заболевания, в том числе и гепатита С.

Сущность изобретения

Техническая проблема, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в разработке препарата и его конкретных форм, с использованием которых можно обеспечить эффективное лечение вирусного гепатита С (ВГС) за счет обеспечения доставки и локализации лекарственных веществ в основном поражаемом ВГС органе-мишени (печени) и внутри клеток печени (в гепатоцитах), в эффективных для терапевтического действия дозах.

Эта задача решается наносомальной лекарственной формой препарата пролонгированного действия для лечения гепатита С, содержащей комплекс активных компонентов, включающий глутатион (γглутаминил-цистсинил-глицин) и инозин (1,9-дигидро-9-бета-О-рибофуранозил-6Н-пурин-6-он), взятые в отношении 1:1, а также соль платины (в частном случае это может быть цисплатин или карбоплатин) в

- 3 014044 количестве 0,05%, при этом комплекс активных компонентов иммобилизован за счет адсорбции на биодеградируемом полимерном носителе в виде наночастиц из полилактидгликолида.

Препарат в форме раствора содержит, мас.%:

комплекс активных компонентов - 0.35-0.37 полилактидгликолида - 2,45-2.72 растворитель - остальное.

В наилучшем варианте препарат в форме раствора дополнительно содержит поверхностно-активное вещество в количестве 0,80 мас.%, а в качестве растворителя используется раствор диметилсульфоксида в воде.

Препарат в форме порошка содержит, мас.%:

комплекс активных компонентов - 4 полилактид гликолида - 16 поверхностно-активное вещество - 60 средство криопротекции и рессуспендирования - 20.

Во втором варианте изобретения наносомальная лекарственная форма препарата пролонгированного действия для лечения гепатита С также содержит комплекс активных компонентов, который в этом случае включает только глутатион и инозин, взятые в отношении 1:1. Комплекс активных компонентов в этом варианте, как и в первом случае, иммобилизован за счет адсорбции на биодеградируемом полимерном носителе в виде наночастиц из полилактидгликолида.

В наилучшем варианте осуществления препарат в форме порошка содержит, мас.%: комплекс активных компонентов - 4 полилактидгликолида - 16 поверхностно-активное вещество - 60 средство криопротекции и рессуспендирования 20.

В обоих вариантах изобретения в качестве поверхностно-активного вещества может быть использован поливиниловый спирт или полисорбат 80. В качестве средства криопротекции (предупреждения разрушения и слипания наночастиц при лиофильной сушке) и ресуспендирования (предпреждения агрегации или слипания) используется, например, Ό-маннит.

Иммобилизация активных компонентов биодеградируемыми полимерными наночастицами обеспечивает их оптимальные для лечебного действия распределение и биодоступность, а также пролонгацию высвобождения, которая происходит по мере разрушения частиц в органах, тканях и клетках, куда они проникают благодаря механизму эндоцитоза.

Лечебный эффект реализуется по трем механизмам:

- прямое противовирусное действие лекарственных веществ;

- стимуляция Т-клеточиого и гуморального противоинфекционного иммунитета;

- экспрессия индуктора апоптоза, РА8/АРО-1 антигена (СО95+) на мембранах вирус-инфицированных клеток.

Доставляемого наночастицами количества лекарственных веществ оказывается достаточным как для прямого внеклеточного вирулицидного действия, так и для комплексного воздействия на клеточном уровне. То есть включение лекарственных веществ в биодеградируемые полимерные наночастицы обеспечивает оптимальную биодоступность и адекватное распределение лекарственных веществ в терапевтических количествах. Кроме того, достигается благоприятное воздействие на иммунную систему. Наряду с этим, благодаря изобретению достигается пролонгация циркуляции лекарственных веществ в кровеносном русле (включая капиллярную систему), накопление и продолжительное высвобождение (релиз) лекарственных веществ, что способствует прямому противовирусному действию препарата, обеспечивая высокоэффективное лечение острой и хронической форм гепатита.

На основе разработанной композиции возможен способ лечения путём введения в организм млеко питающих, инфицированных вирусом гепатита С, фармацевтического наносомального препарата пролонгированного действия, содержащего эффективное количество С88С-инозин-Р1, с целью прямого ингибирования АТФ-азно/хеликазной активности N83 вируса гепатита С для прекращения репликативной активности и элиминации вируса гепатита С, следовательно, достижения лечебного эффекта, наряду с обеспечением цитопротекторных эффектов здоровых клеток. Посредством экспрессии индуктора апоптоза, ТА8/АРО-1 антигена (ΟΌ95+) на мембранах вирус-инфицированных клеток, что способствует элиминации вирус-инфицированных клеток, сокращая пул пораженных клеток и тем способствуя оздоровлению. Наряду и одновременно с прямым противовирусным действием С88С - инозин лечебный эффект также достигается путём стимуляции Т-клеточного и гуморального противоинфекционного иммунитета.

Соотношения компонентов - С88С:инозин:Р1²⁺ (1:1:0,001) отобраны экспериментальным путём по комплексу показателей, а именно - эффективность, токсичность, терапевтическая широта, побочные действия.

- 4 014044

Индивидуальные компоненты, входящие в состав композита, зарегистрированы в качестве действующих веществ известных препаратов.

Инозин является действующим веществом препарата рибоксин (ФС 42-2069-97), а динатриевая соль глутатиона-бис-(у-Ь-глутамил)-Ь-цистеинил-бис-глицинат натрия - является действующим веществом препарата глутоксим® (ВФС 42-3194-98), соединения платины - цисплатин и карбоплатин являются зарегистрированными препаратами.

Осуществление изобретения

Осуществление изобретение поясняется на примере технологий получения двух наносомальных лекарственных форм препарата: жидкая - образцы МО-1/1, МО-1/2 (с содержанием комплекса активных компонентов соответственно 0.35 и 0.37 мас.%); порошкообразная - образец МО-7, МО-9. К первому варианту изобретения относятся образцы МО-1/1, МО-1/2 и МО-7. Ко второму варианту изобретения относится образец МО-9.

В соответствии с разработанной нанотехнологией в качестве полимерной матрицы - носителя действующих веществ или полимерной основы получаемых наночастиц использован сополимер молочной и гликолевой кислот марки ЬЛСТЕЬ® Ро1у(ОЕ-1асИке-со-д1усо11ке) (РБ6А аед (50:50) (0.37) потша1) (фирмы ЛЬкогЬаЫе Ро1утет8 1п1етпа1юпа1, США). В соответствии с разработанными технологиями частицы получали либо путём эмульгирования раствора полимера РЬ6А с вспомогательными компонентами, либо путём конденсации в реактивной среде.

С помощью разработанных методик получено пять образцов наносомальной лекарственной формы препарата - два образца в виде порошка, три- в виде коллоидного раствора. С помощью комплекса аналитических и физико-химических методов проведена идентификация размерности получаемых частиц, охарактеризована их дисперсность и доказана пролонгация высвобождения действующих веществ.

В качестве растворителей использовали диметилсульфоксид (ДМСО, > 99.5%) (Ктеке1-ке Наёп, ФРГ), ацетон (осч) (Химмед, РФ), а также дистиллированную воду (аквадистиллятор ДЭ-4 модель 737, РФ). В качестве поверхностно-активных веществ (ПАВ) применяли полисорбат 80 (Т\тееп® 80) (8егуа, США) и поливиниловый спирт (ПВС) то1. \\1. 30000^70000 (81дта, США). В качестве средства криопротекции и рессуспендирования Ό-маннит (> 98%) (81дта, США), субстанции (6886-Р1²⁺-1по5те) (РФ).

Получение жидкого препарата МО-1/1.

3-Компонентная субстанция РГКС состоит из глутатиона (6886), инозина (1по4пе) взятых в отношении 1:1 (1:1 моль/моль) и платины (Р1²⁺) в количестве 0,05%.

В 0.70 мл ацетатного буферного раствора (рН 6.05) растворяли при перемешивании на магнитной мешалке (1КА® ВН-КТ/С, ФРГ) глутатион (6886), инозин (1по8те), взятые в отношении 1:1 (1:1 моль/моль), и добавляли платину (Р1²⁺) общей массой 54.9 мг (раствор А). Также при перемешивании и подогреве растворяли 384.3 мг сополимера молочной и гликолевой кислот (РЬ6А 50/50), 126.3 мг полисорбата 80 в 13.2 мл ДМСО (раствор Б). К раствору Б при интенсивном перемешивании добавляли по каплям раствор А в течение 15 мин. Затем к смеси добавляли 0.60 мл дистиллированной воды. Получался прозрачный желтоватый раствор, который перемешивали ещё 15 мин и переливали в герметичную стеклянную тару.

Состав препарата МО-1/1, мас.%:

РГКС (6886-Р1²⁺Чпоыпе)0.35

РЬ6А 50/502.45

Полисорбат 800.80

Растворители (ДМСО + вода)86.40

Определение размеров частиц и распределение их по размерам осуществляли методом автокорреляционной спектроскопии. Для анализа использовали субмикронный лазерный спектрометр Сои11ет Ν4ΜΌ фирмы СоиНет Е1ес1тошс8, (Франция-США). Алгоритм измерений основан на программе ί'ΌΝΤΙΝ.

Образец жидкого препарата МО-1/1 добавляли к 2.70 мл дистиллированной воды двумя порциями по 0.15 мл и встряхивали рукой. Полученную коллоидную систему переносили в специальную кювету (3 мл). Затем производили измерения. Ультразвуковое воздействие не применяли. Результаты анализа представлены в табл. 1.

Таблица 1

Образец	иштоба!	8ϋΡ	По пикам
Меап , нм	80, нм	Меа п, нм	80, нм	СУ, %	81ге, нм	80, нм	Ато ип1, %
Мо-1/1	101	37	108	61	57	3.1 119	0,5 48	10 90

- 5 014044

Получение жидкого препарата МО-1/2.

3-Компонентная субстанция жидкого препарата МО-1/2 состоит из глутатиона (С88С), инозина (1по81пе), взятых в отношении 1:1 (1:1 моль/моль), и платины (Р1²⁺) в количестве 0,003 моль. Соотношение компонентов С88С: 1по8ше:Р1²⁺ составляет (1:1:0,003). Удельное количество цисплатина увеличено для экспериментальной проверки влияния ионов платины (Р1²⁺) на эффективность и токсичность препарата.

В 0.80 мл ацетатного буферного раствора (рН 6.05) растворяли при перемешивании на магнитной мешалке (ПСА® РН-КТ/С. ФРГ) глутатион (С88С), инозин Дпокше), взятых в отношении 1:1 (1:1 моль/моль), и добавляли цисплатин (Р1²⁺) общей массой 61.0 мг (раствор А). Также при перемешивании и подогреве растворяли 408.7 мг сополимера молочной и гликолевой кислот (РЬСА 50/50), 140.3 мг в 14.7 мл ДМСО (раствор Б). К раствору Б при интенсивном перемешивании добавляли по каплям раствор А в течение 15 мин. Затем к смеси добавляли 0.70 мл дистиллированной воды. Получался прозрачный раствор, который перемешивали ещё 15 мин и переливали в герметичную стеклянную тару.

Состав препарата МО-1/2, мае, %:

РГКС (ОБЗО-РрМповше)0.37

РША 50/502.72

Растворители (ДМСО + вода)87.20

Определение размеров частиц препарата МО-1/2 осуществляли аналогично описанным выше случаям. Результаты представлены в табл. 2, из которых следует, что основная фракция частиц (71%) имеет размеры (109±17) нм.

Таблица 2

Образец	иштоба!	8ОР	По пикам
Меа п, нм	80, нм	Меап, нм	80, нм	СУ, %	81ге, нм	80, нм	Атой Ш, %
МО-1/2	77	39	101	75	59	2,3 109	0,5 17	17 71

Получение лиофилизованного препарата МО-7.

При перемешивании на магнитной мешалке и слабом подогреве растворяли 168 мг РЬСА 50/50 в 21 мл ацетона (раствор А). Раствор полимера добавляли через медицинский шприц с иглой 0.6x25 мм в течение 25-30 мин к раствору 630 мг поливинилового спирта (ПВС) в 105 мл дистиллированной воды (раствор Б) при комнатной температуре и интенсивном перемешивании на магнитной мешалке. Полученную смесь перемешивали ещё 15 мин. Затем включали подогрев (до 50-60°С) и продолжали перемешивание в течение 2 ч для удаления ацетона. После охлаждения водной смеси до комнатной температуры добавляли в неё 42 мг препарата РГКС® (С88С-РГ'-1по5ше) и перемешивали 18 ч. Затем добавляли 70 мг Ό-маннита и растворяли его при перемешивании в течение 10-15 мин. Смесь фильтровали через крупнопористый стеклянный фильтр (размер пор 100-160 мкм) и собирали в круглодонную колбу (ёмк. 1 л). Колбу вакууммировали до 30-50 мБар для удаления остатков ацетона. Содержимое колбы замораживали, вращая её в жидком азоте, и подвергали лиофилизации в течение 20-22 ч при 0.03-0.1 мБар (лиофильная сушилка АЬРНА II, США). Получали около 1.1 г белого лиофилизованного порошка, который после деэлектризации перегружали шпателем в пузырьки. Выход 0.92 г (88%).

Состав препарата МО-7 (в расчёте на абсолютно сухую смесь), мас.%:

РГКС (С88С.-РГ-1по5те)4

РГС.А 50/50 16

ПВС60

Ώ-Маннит20

Определение размеров частиц и распределение их по размерам осуществляли методом, описанным для препарата МО-1/1.

К образцу лиофилизованного препарата МО-7 в количестве 30 мг, помещённому в пенициллиновый пузырёк, добавляли 2.97 мл дистиллированной воды и растворяли с помощью шпателя и встряхивания вручную. Полученную коллоидную смесь переносили в специальную кювету (3 мл). После чего производили измерения. Ультразвуковое воздействие не применяли. Результаты анализа представлены в табл. 3. Из табл. 3 следует, что частицы с размерами (146±17) нм представляют собой основную фракцию в количестве 83%.

- 6 014044

Таблица 3

Образец	Иштода!	8ϋΡ	По пикам
Меа п, нм	80, нм	Меа п, нм	8ϋ, нм	СУ, %	8ϊζο, нм	80, нм	Ато ип!, %
МО-7	137	47	121	65	53	ЗД 146	0,5 17	17 83

Получение порошкообразного лиофилизованного препарата МО-9.

Для изготовления образца МО-9 использован препарат РГКС состава О88О-1по5ше (1:1 моль/моль). Хроматограмма препарата РГКС представлена на фиг. 1.

При перемешивании на магнитной мешалке и слабом подогреве растворяли 112 мг РЬОЛ 50/50 в 14 мл ацетона (раствор А). Полученый раствор полимера добавляли через медицинский шприц с иглой 0.6х25 мм к раствору 420 мг поливинилового спирта (ПВС) в 70 мл дистиллированной воды (раствор Б) течение 15-20 мин при комнатной температуре и интенсивном перемешивании на магнитной мешалке. Полученную смесь перемешивали ещё 15 мин. Затем включали подогрев (до 50-60°С) и продолжали перемешивание в течение 2 ч для удаления ацетона. После охлаждения водной смеси до комнатной температуры добавляли в неё 28 мг препарата О88О-1по5ше (1:1 моль/моль) и перемешивали 18 ч. Затем добавляли 140 мг Ό-маннита и растворяли его при перемешивании в течение 10-15 мин. Смесь фильтровали через крупнопористый стеклянный фильтр (размер пор 100-160 мкм) и собирали в круглодонную колбу (ёмк. 0.5 л). Колбу вакуумировали до 30-50 мБар для удаления остатков ацетона. Содержимое колбы замораживали, вращая её в жидком азоте, и подвергали лиофилизации в течение 20-22 ч при 0.03-0.1 мБар. Получали около 0.70 г белого лиофилизованного порошка, который после деэлектризации перегружали шпателем в пузырьки. Выход 0.54 г (77%).

Состав препарата МО-9 (в расчёте на абсолютно сухую смесь), мас.%:

0880—Ью81п..................4

РЬОА 50/5016

ПВС60 £>-Маннит20.

Определение размеров частиц и распределение их по размерам осуществляли методом, описанным для препарата МО-7 при тех же условиях. Результаты анализа представлены в табл. 4, из приведенных в которой данных следует, что основная фракция частиц (84%) имеет размеры (119± 48) нм.

Таблица 4

Образец	ПттосЫ	8ϋΡ	По пикам
Меап , нм	80, нм	Меап, нм	80, нм	СУ, %	8ΐζβ НМ	8ϋ, нм	Ато ιιηΐ, %
МО-9	132	36	111	62	56	3,0 131	0,5 28	16 84

Размеры полученных частиц определяли также методом фотонной корреляционной спектроскопии (ФКС) с помощью наносайзера (субмикронный лазерный спектрометр СоиИет Ν4ΜΌ фирмы СоиИет Е1ес1тошс8, (Франция-США)). Алгоритм измерений основан на программе СООТШ.

Для подготовки порошкообразного образца содержимое флакона (лиофилизированные порошки образцов МО-7, МО-9), доводят до объема 2 мл бидистиллированной водой и аккуратно встряхивают в течение 2-4 мин.

Эффект ресуспендирования определялся визуально по отсутствию агломератов или осадка. Нормально восстановленный образец представляет из себя опалисцирующий коллоидный раствор без видимых агломератов или включений.

Часть восстановленного образца (50 цл) помещали в колбу наносайзера, содержавшую 3 мл бидистиллированной воды. Колбу непрерывно встряхивали и помещали в наносайзер. Измерения производят ся немедленно.

Для подготовки жидкого образца (МО-1/1 или МО-1/2) добавляли к 2.70 мл бидистиллированной воды двумя порциями по 0.15 мл и встряхивали рукой. Полученную коллоидную систему переносили в специальную кювету (3 мл). Затем производили измерения. Ультразвуковое воздействие не применяли.

Рабочие параметры наносайзера:

- угол рассеивания - 900

- температура - 250

- плотность - 0,01

- индекс рефрактивности -1.333

- 7 014044

Результаты измерений размеров и распределение частиц по фракциям исследованных образцов сведены в табл. 5.

Полученные характеристики наработанных образцов показывают, что по зарегистрированным значениям размеров частиц и существующим критериям оценки размерности частиц созданные образцы классифицируются как наночастицы, причем средние размеры частиц близки к 100 нм (101-121 нм).

Таблица 5

Шифры образцов	Унимодальный анализ	Распределение частиц по размерам	Рас разме с	пределение ров частиц по гракциям
Значение ' размера, нм ;	Стандартное отклонение, нм	Среднее значение, нм	Стандартное отклонение, нм	Коэффициен т вариации, %	Размер, нм	Стандартное отклонение, 1 нм =	\| Количество в ¹образце, %
МО-1/1	101	37	108	61	57	3.1	0,5	10
					119	48	90
МО-1/2	77	39	101	75	59	2,3	0,5	17
					109	17	71
МО-7	137	47	121	65	53	3,0	0,5	17
					146	17	83
МО-9	132	36	111	62	56	3,0	0,5	16
					131	28	84

По дисперсности наработанные образцы классифицируются как полидисперсные. Анализ распределения размеров частиц по фракциям показывает бимодальную картину распределения по фракциям у всех образцов. При этом минимальный зарегистрированный размер частиц составил 2,3 нм у образца МО-1/2, а максимальный 146 нм у образца МО-7. Из анализа распределения размеров частиц по фракциям следует, что у образца МО-1/1 наночастицы размером 119 нм составляют 90%, а мода - среднее значение по всему массиву наночастиц, составила 108 нм. У образца МО-7 наночастицы размером 146 нм составили 83%, а мода составила 121 нм. У образца МО-9 наночастицы размером 131 нм составляют 84%, мода составила 111 нм.

Таким образом, полученные образцы МО-1/1, МО-1/2, МО-7, МО-9 в соответствии с принятой классификацией являются наносомальными субстанциями (далее по тексту наносомальная форма препарата РГКС - НРГКС).

Устойчивость полученных образцов препарата Н-РГКС к хранению оценивали по воспроизводимости физико-химических характеристик и изменению внешнего вида образцов.

Испытания провели по стандартной схеме - методом ускоренного старения на образцах МО-1/1, МО-1/2, МО-7, МО-9 после 92 дней хранения при постоянной температуре 40°С, без доступа света. Для сравнительной характеристики контрольные образцы хранились при температуре 20°С без доступа света. Испытанные на старение образцы получили дополнительную маркировку (с): МО-1/1(с), МО-1/2(с), МО7(с), МО-9(с).

Определение размеров частиц состаренных образцов и распределение их по размерам осуществляли на наносайзере методом автокорреляционной спектроскопии. Для анализа использовали субмикронный лазерный спектрометр СоиИег Ν4ΜΌ фирмы СоиИег Е1ес1гошс8, (Франция-США).

Образцы МО-1/1 и МО-1/2 до старения представляли собой прозрачную бесцветную жидкость (жидкая лекарственная форма для инъекций или употребления внутрь). После выдержки образцы приобрели лёгкую желтоватую окраску, оставаясь прозрачным. Установленные значения размеров частиц образцов МО-1/1 (с), МО-1/2 (с), в водной среде представлены в табл. 6 и 7.

Таблица 6

Образец	ипппоба!	8ΌΡ	По пикам
Меап, нм	8ϋ, нм	Меап, нм	80, нм	ον, %	81ге, нм	80, нм	Атой ηΐ, %
МО-1/1(с)	103	35	по	63	59	3.5 121	0,5 51	13 87

Таблица 7

Образец	ипппойа!	8ϋΡ	По никам
Меап, нм	80, нм	Меап, нм	80, нм	ον, %	8ίζβ, нм	8Ό, нм	Атоип 1,%
МО-1/2(с)	101	37	111	63	59	3.5 121	0,5 51	13 87

- 8 014044

Из данных в табл. 6 следует, что основная фракция наночастиц (87%) имеет размеры (121±51) нм. Поскольку по данным исходных испытаний образцов МО-1/1 и МО-1/2 основная фракция частиц (90%) имеет средний размер (119±48) нм, то можно заключить, что старение не вызвало существенных изменений размеров частиц. Распределение частиц по фракциям осталось бимодальным. Следовательно, жидкая лекарственная форма в пределах точности измерений сохраняет дисперсный состав наночастиц.

Образец МО-1/2 до старения представлял собой порошок белого или слегка кремового цвета (порошкообразная лекарственная форма для употребления внутрь). После выдержки образец мало изменил окраску, оставаясь прозрачным.

Из табл. 7 следует, что основная фракция наночастиц (87%) образца МО-1/2 (с) имеет размеры (121±51) нм, что практически совпадает с данными исходных испытаний образца МО-1/2. Таким образом можно заключить, что старение не вызвало существенных изменений размеров частиц МО-1/2 (с). Распределение частиц по фракциям осталось бимодальным. Следовательно, жидкая лекарственная форма в пределах точности измерений сохраняет дисперсный состав наночастиц.

Образец МО-7 до старения представлял собой порошок белого или лёгкого кремового цвета (порошкообразная лекарственная форма для употребления внутрь). После выдержки образец практически не изменил окраску, оставаясь светло-кремовым. Установленные значения размеров частиц образца МО-7 (с) в водной среде представлены в табл. 8.

Таблица 8

Образец	ипйпойа!	ЗОР	По пикам
Меап, нм	80, нм	Меап, нм	80, нм	ον, %	8ίζβ, нм	80, нм	Атой ηί, %
МО-7 (с)	140	50	127	69	55	3,0 149	0,5 23	15 85

Из табл. 8 следует, что наночастицы порошкообразного образца МО-7 с размерами (149± 23) нм составляют основную фракцию образца и представлены в количестве 85% от общего массива. Распределение частиц по фракциям сохранилось бимодальным. Небольшое (на 2% относительно исходного значения) увеличение среднего размера частиц основной фракции после процедуры ускоренного старения находится в пределах ошибки измерения.

Образец МО-9 до старения представлял собой порошок белого цвета (порошкообразная лекарственная форма для употребления внутрь). После выдержки образец практически не изменил окраску.

Установленные значения размеров частиц образца МО-9 (с) в водной среде представлены в табл. 9. Таблица 9

Образец	иттосЫ	8ϋΡ	По пикам
Меап, нм	80, нм	Меап, нм	80, нм	ον, %	δίζβ нм	80, нм	Атой т, %
МО-9 (с)	131	39	из	59	57	3,5 133	0,5 37	15 85

Анализ данных показывает, что основную фракцию порошкообразного образца МО-9(с) составляют наночастицы с размерами (149±23) нм, которые представлены в количестве 84% от общего массива частиц. Распределение частиц по фракциям сохранилось бимодальным. Небольшое (на 2% относительно исходного значения) увеличение среднего размера частиц основной фракции после процедуры ускоренного старения находится в пределах ошибки измерения.

Проведённое исследование показало, что образцы препарата МО-1/1, МО-1/2, МО-7, МО-9 сохраняют характеристики дисперсности после 92 дней хранения, в темноте, при постоянной температуре 40°С, что указывает на стабильность полученных образцов.

Доказательства пролонгированного высвобождения

Доказательство пролонгированного высвобождения действующих веществ осуществляли путём сравнительного изучения временной зависимости изменения содержания действующих веществ - окисленного глутатиона и инозина из исходного препарата и созданных образцов МО-1/1, МО-1/2, МО-7, МО-9 в модельных экспериментах ίη νίίτο и фармакокинетических исследованиях ίη νίνο в опытах на крысах линии ХУМаг. Использовалась однокамерная модель организма. В соответствии с этой моделью растворы изучаемых образцов раздельно помещали в диализный мешок, который погружали в камеру (ёмкость), заполненную дистиллированной водой. В данной постановке определяется зависимость выхода из диализного мешка высвобождающихся веществ от времени. С этой цель через определённые промежутки времени берутся пробы, в которых определяется концентрация изучаемых веществ.

Исследование высвобождения (релиз действующих веществ - глутатиона и инозина) субстанции РГКС и полученных образцов препарата из растворов в модельных экспериментах осуществляли в условиях равновесного диализа при комнатной температуре и последовательном отборе проб в течение 3-х суток.

Для характеристики пролонгированного высвобождения действующих веществ из исходного препарата и полученных образцов проведено сравнительное исследование компонентов препарата методом высоко эффективной жидкостной хроматографии (ВЖХ, хроматограф Со1Д §у81ет, Весктап, США) и

- 9 014044 спектрофотометрическим методом анализа - спектрофотометр НйасЫ 557 (Япония) и ИНтокрес 2000 (Рйатташа. Швеция).

В исследованиях анализировали субстанцию РГКС. глутатион. инозин (81дта). полученные образцы Н-РГКС.

В качестве диализных мешков использовали ленту Ωίαίνδίδ 1иЫпд. 1ιί§1ι ге1еп1юп. 8|/е: 23ттх15тт (8щта-А1йпс11). Предел исключения 12 кДа. Предварительно отрезки диализной ленты (10 см) кипятили в ~0.001 М растворе этилендиаминтетрауксусной кислоты в течение 1 ч. Использовали дистиллированную воду. полученную с помощью аквадистиллятора ДЭ-4 модель 737 (РФ).

Сосудами для проведения диализа служили мерные цилиндры ёмкостью 250 мл с крышками. Перемешивание диализной жидкости в ламинарном режиме осуществляли при помощи магнитных мешальников в тефлоновой оболочке и магнитной мешалки КН-КТ/8 (ΙΚΑ®. Германия). Измерение оптических плотностей растворов проводили на спектрофотометрах НйасЫ 557 (Япония) и ИНтокрес 2000 (Рйаттас1а. Швеция). Для взвешивания использовали аналитические весы ΥΙΒΡΑ (тах/й 220/0.0001 г) (Япония). Для отбора проб применяли пипетки и пластиковые наконечники (ΒΙΟΗΙΤ) (Финляндия).

В подготовленные диализные мешки (ёмкостью 5-6 мл) с помощью пипетки помещали образцы субстанции РГКС (200 мг). порошкообразного препарата пролонгированного действия МО-7 (200 мг). Мешки. загерметизированные с помощью зажимов. помещали в сосуды для диализа с 250 мл дистиллированной воды. закрепляли нитью. закрывали крышкой и включали перемешивание.

Периодически проводили отбор проб из диализатов (по 3 мл) в стеклянные пробирки (ёмкость 10 мл). Отобранные пробы объёмом 3 мл анализировали спектрофотометрически при длине волны 252 нм. Концентрацию определяли с помощью градуировочного графика. К ранее отобранным пробам добавляли по 1 мл 2% раствора нингидрина в воде. Пробирки нагревали на кипящей водяной бане в течение 30 мин. Пробы приобретали характерное сине-фиолетовое окрашивание (пурпур Руэмана). Определение концентрации глутатиона окисленного (0880) проводили спекрофотометрически при длине волны 570 нм с использованием градуировочного графика.

На фиг. 1 представлена хроматограмма образца препарата РГКС. Выделяются 2 пика основных составляющих препарата: окисленного глутатиона (0880) и инозина (Ιηοκίη).

Условия: колонка - Рйепотепех Ьипа С18 (5 мкм. 250x4.6 мм); подвижная фаза: ацетонитрил0.03% ТФУ. 2:98; скорость потока: 1.0 мл/мин; элюирование: изократическое; аналитическая длина волны: 220 нм; температура: 20°С; объём вводимой пробы: 10 мкл; хроматографическая система: Адйеп! 1100.

На фиг. 2 проиллюстрирована динамика высвобождения глутатиона и инозина из препарата РГКС при 252 нм (по инозину) и при 570 нм (по глутатиону окисленному). полученных методом равновесного диализа в модельном эксперименте.

Изучение зависимости концентрации действующих веществ (окисленного глутатиона и инозина) высвобождающихся из исходного препарата РГКС от времени показало. что в условиях модельного эксперимента интенсивный выход изучаемых веществ происходит на протяжении первых 4-х часов. К 5-му часу с момента начала процесса концентрация действующих веществ достигает пикового значения: окисленного глутатиона на уровне 0.55 мкг/мл. а инозина на уровне 0.27 мкг/мл. Дальнейшие наблюдения на протяжении длительного периода (16 ч с момента начала процесса) показали. что в системе установилось состояние динамического равновесия. при котором концентрации веществ вне и внутри камеры выровнялись. На этой стадии процесса количество выходящих из камеры через полупроницаемую мембрану во внешнюю среду веществ и количество проникающих в камеру веществ (как глутатиона. так и инозина) одинаково и это соотношение во времени не меняется.

Сравнительное изучение зависимости концентрации инозина высвобождающегося из исходного препарата РГКС и созданных образцов МО-1/1. МО-1/2. МО-7. МО-9 в эквивалентных начальных условиях эксперимента (температура в системе. исходные концентрации действующих веществ в камере) показало достоверное различие в скорости высвобождения и выхода действующих веществ из РГКС и полученных образцов.

На фиг. 3 проиллюстрирована динамика высвобождения инозина из препарата РГКС и образцов МО-1/1. МО-7. МО-9 при 252 нм (по инозину); получено методом равновесного диализа.

Результаты экспериментов показывают (фиг. 3). что в тождественных условиях высвобождение инозина из образцов МО-1/1. МО-7. МО-9 происходит существенно и достоверно медленнее. чем из образца РГКС. В случае релиза действующих веществ из образца РГКС выход на максимальный уровень высвобождения и достижение равновесного состояния происходит в течение первых 5-10 ч. в то время как в релизе веществ из образцов МО-1/1. МО-7. МО-9 достижение равновесного состояния не наблюдается на протяжении 50 ч с момента начала процесса. Релиз образца МО-1/2 практически не отличается от рилиза образца МО-1/1. Полученные результаты позволяют заключить. что в модельном эксперименте при сопоставимых концентрациях действующих веществ в исходных пробах выявлено большое (более чем в 5 раз. с высокой вероятностью Р<0.05) замедление (удлинение- пролонгация) времени высвобождения инозина из образцов полученного препарата МО-1/1. МО-1/2. МО-7. МО-9 относительно препарата РГКС.

- 10 014044

Исследования на животных

Одним из действующих веществ является окисленный глутатион - важнейший агент антиоксидантного глутатионового цикла клетки. В то же время, в опытах ίη νίίτο показано, что инозин, входящий в состав препарата, в значительной мере остается в органической фазе. Поэтому информативно определение именно окисленного глутатиона. Данные о константах протонной диссоциации ионогенных групп для глутатиона - рК=8.66 (ΝΗ₃), 3.53 и 2.12 (СООН) - позволяют заключить, что при физиологическом значении рН вещество существует в виде дианиона и является чрезвычайно гидрофильным соединением, что определяет целесообразность использовать для анализа ВЖХ. Наличие в молекуле глутатиона ΟΟΝΗ- и СООН-групп, а также дисульфидной связи позволяет использовать при хроматографическом анализе спектрофотометрическое детектирование. В связи с изложенным, для определения действующих веществ препаратов в плазме крови крыс использован модифицированный подход, предложенный в литературе для анализа в биожидкостях бициклических гепта- и октапептидов. Вследствие гидрофильного характера препарата предлагаемая процедура пробоподготовки представляет собой не извлечение окисленного глутатиона из биологической матрицы, а напротив - удаление из нее посторонних компонентов. Таким образом, основными стадиями анализа являются осаждение белков, удаление из образца неполярных и среднеполярных соединений и последующий хроматографический анализ со спектрофотометрическим детектированием.

Использовались хроматограф Οοΐά ЗуЫет (Весктап, США), включающий двойной насос (мод. 126), спектрофотометрический детектор с диодной матрицей (мод. 168), компьютер 486ΌΧ4, аппарат для встряхивания (СЫгапа, Чехия), хроматографическая колонка НурегьП ΟΌ8, 250x4.6 мм, 5 мкм (8щтаЛ1бпс11. США), эффективностью 15000 т.т. Ацетонитрил для жидкостной хроматографии марки осч (8фта-Л1бпс11). Трифторуксусная кислота (Россия), дважды перегнанная. Метиленхлорид (для спектроскопии, Мегск).

Эксперименты выполнялись на белых половозрелых крысах-самцах \Ук1аг стандартной массы 200220 г. Вещества вводили в хвостовую вену. У животных при декапитации собирали кровь и получали плазму крови. Затем 1 мл полученной плазмы крови помещали в пробирку с притертой пробкой вместимостью 5 мл и добавляли 2 мл ацетонитрила, содержащего 15 мкл трифторуксусной кислоты. Пробирку закрепляли в аппарате для встряхивания таким образом, чтобы движение каретки осуществлялось вдоль главной оси пробирки. Экстрагировали в течение 10 мин, затем содержимое пробирки центрифугировали и декантировали супернатант в другую пробирку с притертой пробкой вместимостью 10 мл. Добавляли 6 мл метиленхлорида, вновь экстрагировали в течение 10 мин и центрифугировали. В хроматограф вводили 50 мкл полученного супернатанта.

Для улучшения селективности разделения инозина и окисленного глутатиона использовали режим хроматографирования, представляющий комбинацию изократического и линейного градиентного элюирования. Спектрофотометрическое детектирование проводили при рабочей длине волны 205 нм. Компьютерную обработку экспериментальных данных производили с помощью калибровочного графика, предварительно проверенного по стандартным образцам на трех уровнях концентраций.

Образец РГКС - 1 мл препарата содержит 10 мг окисленного глутатиона. При инъекции 0.2 мл раствора препарата РГКС, доза составляет 10 мг/кг в пересчете на окисленный глутатион. Для согласования концентраций и инъецируемых крысам объёмов жидкости с образцами препарата Н-РГКС вводилась коррегирующая поправка.

Образцы крови забирали через 1, 2, 5, 10, 20, 40 и 60 мин, при исследовании препарата РГКС, кроме того через 1,5, 3, 24, 48 и 72 ч, при исследовании образцов препарата Н-РГКС- жидкой формы МО-1/1 и порошкообразной формы МО-7. В отобранных образцах крови отделяли плазму и проводили определение концентрации окисленного глутатиона. На каждую точку брали не менее 6 животных.

Для характеристики полученных экспериментальных зависимостей концентрации препаратов РГКС и Н-РГКС в плазме крови от времени использовались непараметрические методы оценивания, не требующие аппроксимации экспериментальных кривых по какой-либо фармакокинетической модели.

На основании полученных экспериментальных данных строились кривые зависимости концентрации окисленного глутатиона от времени. В табл. 10 приведены данные о концентрации окисленного глутатиона в плазме крови крыс \Ук1аг после в/в введения препарата МО-1/1.

Таблица 10

Время, мин	Концентрация глутатиона в образцах, мкг/мл	М± т
0	1,1	1,6	0,7	0,2	1,5	0,9	0,75 ± 0,33
1	190,8	47,7	71,0	87,0	197,1	15,2	103,13 ±29,21
2	173,0	75,7	49,7	140,1	47,3	57,5	90,54 ± 24,71
5	34,7	18,5	23,7	25,9	31,7	43,3	29,63 ± 5,71
10	5,0	7,1	8,9	7,7	10,3	9,7	8,11 ±0,91
20	4,7	5,4	5,6	1,7	4,5	3,3	4,20 ± 0,53
40	0,5	2,1	0,4	1,7	0,9	0,7	1,05± 0,50
60	0,4	0,5	0,1	1,0	0,7	1,0	0,61 ±0,20

- 11 014044

На фиг. 4 проиллюстрирована фармакокинетика препарата РГКС. Зависимость концентрации окисленного глутатиона в плазме крови крыс от времени.

Анализ зависимости концентрации глутатиона в плазме крови крыс от времени показывает, что максимальная концентрация вещества (103,13±29,21 мкг\мл) обнаруживается в плазме крови в первые минуты после в\в ведения к 5-й минуте концентрация вещества снижается почти в 4 раза относительно максимума (29,63±5,71 мкг\мл), к 40-й минуте концентрация вещества снижается почти в 100 раз относительно максимума (1,05±0,50мкг\мл), а к 60-й минуте нивелируется почти до нуля. Кинетика препарата РГКС имеет двухфазный характер. Вероятно в начале, пока его концентрация значительно выше естественного уровня, он уходит в ткани и элиминирует, как обычный ксенобиотик. В дальнейшем, когда его концентрация опускается до определенного уровня, контроль над его концентрацией, скорее всего, берут на себя механизмы регуляции организма и собственно кинетическая фаза на этом заканчивается. Фаза выведения РГКС, в смысле окончательного выведения препарата из организма, в данной постановке опыта не рассматривается.

В табл. 11 приведены данные о концентрации глутатиона в плазме крови крыс ΑίδΙαΓ после в/в введения образца МО-1/1.

Таблица 11

Время, мин	Концентрация глутатиона в образцах, мкг/мл	М ± ш,мкг/мл
0	0,1	0,9	0,3	1,0	од	0,7	0,52 ±0,31
1	4,7	5,4	5,6	1,7	4,5	3,3	4,20 ± 0,53
5	11,5	27,4	15,9	10,7	7,1	13,2	14,5± 9,33
15	13,0	12,7	18,7	14,1	17,3	16,5	15,38 ±4,71
30	14,7	18,3	19,7	23,9	21,9	19,3	19,63 ± 5,71
60	25,0	17,1	28,9	17,7	23,3	20,7	22,11 ± 5,91
90	34,7	25,4	35,6	27,7	34,1	41,8	33,23 ±7,13
180	27,5	30,1	31,8	34,7	36,8	25,4	31,05± 5,15
Время,час
24	44,8	35,3	45,5	37,7	50,7	44,7	43,11 ±7,20
48	41,5	55,8	37,3	41,9	50,7	53,3	46,74 ± 6,43
72	39,8	31,4	35,1	47,7	34,1	41,3	38,23 ±7,13

Анализ зависимости концентрации окисленного глутатиона в плазме крови крыс после в/в введения раствора порошкообразной формы препарата Н-РГКС - образца МО-7 показывает, что в первые 3 ч от момента введения максимальная концентрация вещества (33,23±7,13мкг\мл) обнаруживается в плазме крови через 90 мин после в\в ведения МО-1/1. В последующем концентрация вещества увеличивается достигая пикового значения на вторые сутки. Значение более 38 мг\кг сохраняется на протяжении 72 ч, что указывает на длительную пролонгацию высвобождения окисленного глутатиона в крови крыс.

На фиг. 5 проиллюстрированы данные о фармакокинетике образца МО-7. Зависимость концентрации окисленного глутатиона, высвобождающегося в плазму крови крыс из пролонгформы МО-7, от времени.

На фиг. 6 проиллюстрирована фармакокинетика препарата РГКС и пролонгформы МО-7. Зависимость концентрации окисленного глутатиона в плазме крови крыс от времени. В табл. 12 представлены данные о концентрация глутатиона в плазме крови крыс Αίδΐατ после в/в введения образца МО-7.

Таблица 12

Время, мин	Концентрация глутатиона в образцах, мкг/мл	М ± га, мкг/мл
0	0,8	0,4	0,7	0,2	0,9	0,9	0,65 ±0,21
1	7,7	8,4	5,6	7,7	9,5	5,3	7,20 ±1,33
5	15,7	16,9	27,1	17,5	21,4	18,5	19,52± 3,01
30	21,8	19,3	28,9	18,7	23,5	21,7	22,12 ±5,91
60	20,7	19,8	22,5	20,3	20,7	19,9	20,49± 1,11
180	20,3	22,1	21,5	24,7	19,8	21,9	21,72±3,15
Время, час
24	17,1	30,3	19,8	21,9	27,3	19,9	22,71 ± 7,33
48	20,5	17,7	21,5	15,7	24,5	20,2	20,02 ± 4,43
72	24,5	20,7	19,8	21,9	17,3	23,7	17,71 ± 5,21

Анализ зависимости концентрации окисленного глутатиона в плазме крови крыс после в/в введения жидкой формы препарата Н-РГКС образца МО-7 показывает, что максимальная концентрация вещества (20,49± 1,11 мкг\мл) обнаруживается в плазме крови через 60 мин после в\в ведения МО-7. С небольшими отклонениями от этого значения (от 22,71±7,33 до 17,71±5,21 мкг\мл) концентрация вещества сохраняется на протяжении 72 ч, что указывает на длительную пролонгацию высвобождения окисленного глутатиона в крови крыс.

- 12 014044

Результаты исследования фармакокинетики препаратов РГКС и разработанных образцов показывают, что у крыс концентрация препарата РГКС в плазме крови после введения быстро, за 40-60 мин, снижается до уровня, близкого к фоновому, в то время как концентрация разработанных препаратов в плазме крови крыс длительное время - не менее 3-х суток после введения- остается на относительно высоком уровне.

Относительно быстрое распределение РГКС у крыс указывают на то,что препарат распределяется в основном в водной фазе (плазма крови). Это хорошо согласуется с данными о его высокой гидрофильности. Однако, несмотря на то, что распределение окисленного глутатиона происходит сравнительно быстро и введенный внутривенно вызывает пиковую концентрацию в 100 мкг/мл в крови, которая к 40 минуте нивелируется, разработанные препараты сохраняют способность высвобождать окисленный глутатион не менее 3-х суток.

Таким образом, зависимости концентрации высвобождающихся действующих веществ от времени, полученных в модельных экспериментах по релизу препарата РГКС и образцов разработанных препаратов МО-1/1, МО-1/2, МО-7, МО-9 показали пролонгацию (в 5 раз) времени высвобождения инозина из образцов препарата Н-РГКС.

Фармакокинетика изменений концентрации глутатиона в плазме крови крыс от времени препарата РГКС и образцов МО-1/1, МО-7, МО-9 показали существенную пролонгацию времени циркуляции действующих веществ в крови. Эти обстоятельства позволяют заключить, что разработанные образцы препарата являются наносомальными субстанциями прологированного действия.

Определение специфической эффективности разработанных препаратов.

Исследование специфической эффективности и безопасности образцов разработанного препарата провели в 2-х сериях экспериментов: во-первых, изучалось прямое противовирусное действие от гепатита С и цитотоксическое действие на культуре клеток СПЭВ; во-вторых, изучалось гепатопротективное действие препаратов на крысах со сформированной моделью токсического гепатита. Кроме того, проведено испытание острого токсического действия образцов препарата Н-РГКС.

В серии опытов исследовали противовирусную активность образцов полученных препаратов (разных лекарственных форм и разных составов): образец МО-1/1 жидкая форма, образец МО-1/2 жидкая форма, МО-7 порошок, образец МО-9 порошок в отношении вирусной инфекции, вызванной цитопатогенным вариантом ВГС в культурах клеток.

С целью изучения противовирусной активности препаратов в экспериментах использовали цитопатогенный штамм вируса гепатита С, выделенный из крови хронически инфицированной больной, в сыворотке крови которой были обнаружены антитела к ВГС и РНК ВГС. Вируссодержащий материал представлял собой культуральную жидкость, собранную из зараженных вирусом культур клеток СПЭВ на высоте развития цитопатических проявлений.

Исследования противовирусной активности препаратов проводили в культурах клеток СПЭВ, выращенных в виде однодневного монослоя в 48-луночных панелях (Дерябин П.Г., Львов Д.К., Высокопродуктивный вариант вируса гепатита С: выделение, идентификация и характеристика, Докл. Российской академии наук, 1998, т. 358, Νο. 5, р. 685-687; Адпе11о V., АЬе1 С., Е1£апб Μ., Κηί§ηΐ С.В., Ζΐιηπβ ΟΧ. НераШ18 С νίπΐδ апб о1Нег Р1ау1ушбае У1ги5е5 еп!ег се11§ νίη 1ο\ν бепкбу 11рорго1еш гесерЮг. Ргос. Ν;·ι11. Асаб.8с1., И8А, 1999, ν. 96, р. 12766-12771).

Образцы препаратов МО-7 и МО-9 поступили в виде сухого вещества, растворимого в среде, которые использовали после растворения в питательной среде сразу для обработки клеток и через 7 дней после хранения раствора при комнатной температуре.

Образцы препаратов МО-1/1 и МО-1/2 были предоставлены в виде жидкого раствора. Все препараты использовали для обработки ВГС инфицированных культур клеток в разведениях от 1:2 до 1:20.

Цитотоксические свойства препаратов МО-1/1, МО-1/21 МО-7, МО-9 изучали после воздействия различных концентраций каждого препарата на незараженные культуры клеток СПЭВ. Результаты учитывали через 5-6 дней после внесения препаратов - время, когда необработанные культуры клеток СПЭВ не теряли своих морфологических свойств и сохраняли жизнеспособность.

Вирулицидную активность образцов препаратов МО-1/1, МО-1/2, МО-7, МО-9 определяли путем экспозиции нетоксических доз препарата с вируссодержащим материалом в соотношении 1:1 в течение 10 и 30 мин, после чего в пробах определяли остаточную инфекционную активность ВГС методом титрования остаточной инфекционной активности в культурах клеток СПЭВ.

Для изучения противовирусных свойств образцов препаратов МО-1/1, МО-1/2, МО-7, МО-9 культуры клеток СПЭВ обрабатывали различными разведениями препарата за 24 ч до заражения клеток вируса в дозе 0,1 ТЦД50, сразу после адсорбции вируса и через 24 ч после инфекции вирусом. Через 48 ч после инфекции пробы культуральной среды отбирали и определяли инфекционный титр вируса ВГС, используя классический метод Рида и Менча для определения инфекционного титра вируса. Зараженные культуры клеток оставляли в термостате до 7 дня, после чего учитывали жизнеспособность ВГС инфицированных клеток под воздействием препарата РГКС.

Результаты исследований свидетельствуют о том, что все образцы препаратов, кроме МО-1/2, в используемых разведениях не обладают цитотоксическими свойствами для СПЭВ. Препарат МО-1/2 в раз

- 13 014044 ведении 1:2 вызывал 100%-ю гибель клеток СПЭВ, обработка клеток этим препаратом в разведении 1:4 приводила к 35%-й гибели клеток. Поэтому в дальнейших исследованиях препарат МО-1/2 перед использованием разводили в 8 раз и более.

Образцы препаратов МО-1/1, МО-7, МО-9 не обладают цитотоксическими свойствами для культур клеток СПЭВ. Исключение составляет препарат МО-1/2, начальная нетоксическая доза которого для культур клеток соответствовала его разведению 1:8.

Установлено также, что образцы препаратов МО-1/1 и МО-1/2 обладают высокой вирулицидной способностью, подавляют инфекционные свойства вируса после экспозиции их с препаратом в течение 10 и 30 мин соответственно.

Показано, что образцы препаратов МО-7 и МО-9 в порошкообразном виде не обладают вирулицидной активностью в отношении инфекционных свойства вируса гепатита С.

Препараты не обладают способностью защищать инфицированные ВГС клетки СПЭВ от литического действия вируса на протяжении 6 дней (срок наблюдения).

Показана активация противовирусных свойств у образцов препаратов МО-7 и МО-9 после 7-го дня от приготовления раствора из порошкообразной субстанции, которая выражалась в защите клеток от литического действия вируса, в снижении инфекционной активности ВГС, продуцируемого клетками.

Образцы препаратов МО-7 и МО-9 сохранили способность подавлять инфекционную активность ВГС в случае обработки инфицированных клеток после заражения вирусом, в большей степени, чем при профилактическом применении препарата.

Таким образом, по исследованиям противовирусной активности и цитотоксическому действию образцов разработанного препарата экспериментально установлено, что все полученные образцы препарата обладают противовирусным действием. Однако в разной степени выраженности и с разным латентным периодом. Так, образцы препаратов МО-1/1 и МО-1/2 обладают высокой вирулицидной способностью, подавляют инфекционные свойства вируса сразу после экспозиции их с препаратом в течение 10 и 30 мин, в то время как активация противовирусных свойств у образцов препаратов МО-7 и МО-9 произошла только после 7-го дня от приготовления раствора из порошкообразной субстанции. Вместе с тем этот результат можно считать ожидаемым у образцов с более медленным выходом всего набора действующих веществ. Представляется важным, что вирулицидной активностью обладает образец МО-9, в составе которого нет платины. Должна приниматься во внимание высокая начальная цитотоксичность образца МО1/2, не токсическая доза которого для культур клеток соответствовала его разведению 1:8.

Изучение специфической гепаторотективной активности наносомальных препаратов пролонгированного действия МО-1/1, МО-7 в сравнении с препаратом Эссенциале-Н осуществили в экспериментах на модели токсического гепатита спровоцированного введением внутрь четыреххлористого углерода.

Исследование проводилось на 120 линейных крысах ^ίδΐατ, самцах массой в начале опыта 190-210г. Патологию печени вызывали четырехкратным пероральным введением, через атравматический зонд, четыреххлористого углерода (СС1₄) в 50% растворе на оливковом масле в дозе 1 мл/кг. Через 10 дней после последнего введения СС1₄, проводился 10-ти дневный курс лечения изучаемыми препаратами в дозах (в пересчёте на действующее вещество) 15 мг/кг, 10 мг/кг, 5,0 мг/кг путём в /в введения в хвостовую вену. Подопытные животные были разделены на 10 равноценных групп по 10 животных; 6 групп с моделью токсического гепатита, 2 группы - контроль.

группа - положительный контроль - сформированная модель гепатита, лечение не проводилось;

группа - опытная сформированная модель гепатита, лечение проводилось препаратом сравнения Эссенциале-Н в/в в дозе 15 мг/кг;

группа - опытная - сформированная модель гепатита, лечение проводилось исследуемым препаратом МО-1/1 в/в в дозе 15 мг/кг;

группа - сформированная модель гепатита, лечение проводилось исследуемым препаратом МО1/1 в/в в дозе 10 мг/кг;

группа - сформированная модель гепатита, лечение проводилось исследуемым препаратом МО1/1 в/в в дозе 5,0 мг/кг;

группа - опытная - сформированная модель гепатита, лечение проводилось исследуемым препаратом МО-7 в/в в дозе 15 мг/кг;

группа - сформированная модель гепатита, лечение проводилось исследуемым препаратом МО-7 в/в в дозе 10 мг/кг;

группа - сформированная модель гепатита, лечение проводилось исследуемым препаратом МО-7 в/в в дозе 5,0 мг/кг;

контроль - вместо токсина получали эквивалентное количество 50% р-ра оливкового масла в воде, лечение проводилось физиологическим раствором, в/в в эквивалентном объеме;

группа - интактные животные.

По окончанию курса лечения животные подверглись эвтаназии, некропсии и гистологическому анализу.

Полученные результаты исследований - динамика веса крыс, данные некропсии (макроскопическое исследование внутренних органов), оценка массовых коэффициентов для печени экспериментальных

- 14 014044 (леченных) крыс, данные гистологических исследований указывают на то, что препараты МО-1/1, МО-7 проявили низкую токсичность, вместе с тем они оказались эффективными при лечении токсического гепатита. В табл. 13 приведены данные о динамике изменения веса экспериментальных крыс. В табл. 14 представлен массовый коэффициент печени крыс (М ± т, мг/100 г).

Ислледования 1 группы (токсический гепатит) показали следующее.

Органы грудной полости: Локализация сохранена. Патологических изменений в строении не выявлено. Легкие светло-розовые, чистые, без уплотнений и новообразований. Сердце без патологий, умеренного кровенаполнения.

Таблица13

№№ Групп	Наименование группы	Средняя начальная масса (1)	Средняя масса перед лечением (2)	Дм1 (2)- (1)	Средняя масса после лечения (3)	Дм2 (3) - (1)
1	Положительный контроль (п= 10)	204,2	221,5	17,3	227,8	14,3
2	«Эссенциале-Н» в/в 15 мг/кг; (п=10)	207,6	228,5	21,9	217,9	10,3
3	МО-1/1,в/в 15 мг/кг; (п10)	202,5	225,5	25,0	230,7	28,2
4	МО-1/1,в/в 10 мг/кг; (п=10)	200,2	226,4	26,2	230,5	30,25
5	МО-1/1,в/в 5 мг/кг; (п=10)	197,7	225,1	27,4	234,5	36,8
6	МО-7,в/в 15 мг/кг; (п=10)	205,3	228,4	22,1	232,5	27,2
7	МО-7,в/в 10 мг/кг; (п=10)	199,4	224,4	25,0	219,7	20,3
8	МО-7,в/в 5 мг/кг; (п=10)	201,5	226,7	25,2	222,0	21,5
9	Контроль оливковое масло(п=10)	200,2	226,4	26,2	219,5	19,3
10	Контроль интактные (п=10)	201,3	226,4	25,1	231,5	30,25

Таблица 14

№ групп	Группы и дозы	Относительная масса мг/100г
1	Положительный контроль	4923,5 + 516,4*
2	«Эссенциале-Н» в/в 15 мг/кг	3951,8 + 301,8
3	МО-1/1,в/в 15 мг/кг; (п=10)	3780,9+155,9
4	МО-1/1,в/в 10 мг/кг; (п=10)	3570,1 + 135,7
5	МО-1/1,в/в 5 мг/кг; (п=10)	3691,7+ 149,5
6	МО-7,в/в 15 мг/кг; (п=10)	3881,8+ 167,9
7	МО-7,в/в 10 мг/кг; (п-10)	3670,4 + 145,7
8	МО-7,в/в 5 мг/кг; (п=10)	3792,5 + 159,3
9	Контроль, оливковое масло	4410,3 +422,2
10	Контроль, интактные животные	3495,1 + 154,4

Органы брюшной и тазовой полостей: локализация сохранена, гиперемий нет. Скудное или умеренное отложение жировой клетчатки. Почки плотной однородной консистенции, красно-коричневые без очагов некроза на поверхности и разрезе. Хорошо различимы корковый и мозговой слой. Поверхность гладкая. Патологических изменений на макроскопическом уровне нет. Селезенка плотной однородной консистенции, красно-коричневого насыщенного цвета. Размер сохранен. Поверхность гладкая, края ровные. Патологических изменений на макроскопическом уровне нет. Печень несколько увеличена, коричнево-серого цвета. Края ровные, поверхность гладкая. Консистенция однородная, упругая или слегка дряблая, легко рвется. На разрезе незначительное выбухание. На лезвии скальпеля остается жирный налет. Капсула без повреждений.

Ислледования 2 группы (Эссенциале-Н).

Органы брюшной и тазовой полостей: локализация сохранена, отечностей, гиперемий нет. Скудное или умеренное отложение жировой клетчатки. Почки плотной однородной консистенции, краснокоричневые без очагов некроза на поверхности и разрезе. Хорошо различимы корковый и мозговой слой. Поверхность гладкая. Патологических изменений на макроскопическом уровне нет. Селезенка плотной

- 15 014044 однородной консистенции, красно-коричневого насыщенного цвета. Размер сохранен. Поверхность гладкая, края ровные. Патологических изменений на макроскопическом уровне нет. Печень несколько увеличена, красно-коричневого в фиолетовый цвета, консистенция плотная, однородная. Поверхность гладкая, края ровные. На разрезе без выбуханий.

Ислледования 3 группы, разработанный препарат (группы 3-8), образцы МО-1/1, МО-7.

При наружном осмотре животных указанных групп установлено: упитанность удовлетворительная, шерсть гладкая. Слизистые влажные, бледно-розовые, без повреждений и геморрагий. Из естественных отверстий нет каких-либо выделений, характеризующих патологические процессы.

Данные макроскопических исследований внутренних органов испытуемых животных не имели существенных различий, в связи с чем были объединены в общую группу животных, которых лечили препаратами МО-1/1, МО-7.

Органы грудной полости: локализация органов сохранена. Патологических изменений в строении не выявлено. Легкие светло-розовые, чистые, без уплотнений и новообразований. Сердце без патологий, умеренного кровенаполнения.

Органы брюшной и тазовой полостей: локализация сохранена, отечностей, гиперемий нет. Скудное или умеренное отложение жировой клетчатки. Почки плотной однородной консистенции, краснокоричневые без очагов некроза на поверхности и разрезе. Хорошо различимы корковый и мозговой слой. Поверхность гладкая.

Патологических изменений на макроскопическом уровне нет. Селезенка плотной однородной консистенции, красно-коричневого насыщенного цвета. Размер сохранен. Поверхность гладкая, края ровные. Патологических изменений на макроскопическом уровне нет. Печень несколько увеличена, краснокоричневого в фиолетовый цвета, консистенция плотная, однородная. Поверхность гладкая, края ровные. На разрезе без выбуханий.

Ислледования 4 группы (контроль).

Органы брюшной и тазовой полостей: Локализация сохранена, отечностей, гиперемий нет. Скудное или умеренное отложение жировой клетчатки. Почки плотной однородной консистенции, краснокоричневые без очагов некроза на поверхности и разрезе. Хорошо различимы корковый и мозговой слой. Поверхность гладкая. Патологических изменений на макроскопическом уровне нет. Селезенка плотной однородной консистенции, красно-коричневого насыщенного цвета. Размер сохранен. Поверхность гладкая, края ровные. Патологических изменений на макроскопическом уровне нет. Печень краснокоричневого цвета. Размер сохранен. Консистенция плотная, однородная. Края ровные, гладкие. Поверхность гладкая. На разрезе без выбуханий.

Ислледования 5 группы (интактные).

Органы брюшной и тазовой полостей: локализация сохранена, отечностей, гиперемий нет. Скудное или умеренное отложение жировой клетчатки. Почки плотной однородной консистенции, краснокоричневые без очагов некроза на поверхности и разрезе. Хорошо различимы корковый и мозговой слой.

Поверхность гладкая. Патологических изменений на макроскопическом уровне нет. Селезенка плотной однородной консистенции, красно-коричневого насыщенного цвета. Размер сохранен. Поверхность гладкая, края ровные. Патологических изменений на макроскопическом уровне нет. Печень красно-коричневого цвета. Размер сохранен. Консистенция плотная, однородная. Края ровные, гладкие. Поверхность гладкая. На разрезе без выбуханий.

Результаты микроскопического исследования гистологических срезов печени показали следующее.

I Группа (токсический гепатит, фиг. 7 - фотография среза печени крысы). При микроскопии срезов наблюдается не четкое, смазанное дольчатое строение. Печеночные балки просматриваются только в 1/3 дольки возле венулы. Сосуды умеренного кровенаполнения. Ткань инфильтрирована макрофагами и лимфоцитами. Гепатоциты без четких границ, цитоплазма бледная, низкозернистая, содержание гликогена снижено. Жировая и вакуольная вплоть до баллонной дистрофия. Перипортальные области характеризуются участками некрозов и апоптоза.

II Группа (лечение лечение токсического гепатита Эссенциале-Н, фиг. 8 - фотография среза печени крысы). Дольчатое строение умеренно смазано. Сосуды кровенаполнены, ткань не инфильтрирована. Печеночные балки прослеживаются четко. Размеры гепатоцитов сохранены, границы не четкие. Хорошо видны ядра с ядрышками. Цитоплазма зернистая, умеренно гиперхромная.

III Группа (группы №№3-8, лечение МО-1/1, МО-7, фиг. 9 - фотография среза печени крысы). Дольчатое строение четко выражено. Сосуды кровенаполнены, ткань не инфильтрирована. Строение печеночных балок прослеживается четко. Размеры гепатоцитов не изменены, границы несколько размыты. Хорошо видны ядра с ядрышками, смещены к синусоидальному полюсу. Цитоплазма зернистая, гипер

- 16 014044 хромная в перипортальной зоне. Микроскопическое строение свидетельствует о регенераторной активности клеток.

IV Группа (контроль, оливковое масло, фиг. 10 - фотография среза печени крысы). При микроскопии выявлена сохраненная структура печеночных долек и ацинусов. Строение балок не нарушено. Сосуды умеренного кровенаполнения, инфильтраций нет. Гепатоциты сохранены, размер в пределах нормы, очертания клеток несколько размыты. Четко видно круглое ядро с ядрышками в центре клетки. Цитоплазма зернистая, богата гликогеном. Диаметр синусоидов 19-21 мкм.

V Группа (интактные, фиг. 11 - фотография среза печени крысы). Структура печеночных долек и ацинусов сохранена. Печеночные балки сохранены. Сосуды умеренного кровенаполнения, инфильтраций нет. Гепатоциты не увеличены. Диаметр синусоидов 19-21 мкм. Очертания клеток несколько размыты. Четко видно круглое ядро с ядрышками в центре клетки. Цитоплазма зернистая, богата гликогеном. Тинкториальные свойства сохранены.

Полученные результаты исследования гепатопротективного действия разработанного препарата НРГКС и препарата сравнения Эссенциале-Н при 10-дневном внутривенном введении крысам νίδΐατ со сформированной моделью токсического гепатита спровоцированного введением внутрь четыреххлористого углерода позволяют заключить что, разработанный препарат, испытанный в качестве гепатопротектора при развившемся модельном токсическом гепатите у крыс, привел к восстановлению структуры печени и вызвал отчетливо выраженные регенеративные процессы в печени. Сравнительные данные, полученные в условиях эксперимента, показали, что терапевтический эффект образцов препарата относительно действия препарата сравнения Эссенциале-Н оказался явно более выраженным.

Испытание токсичности

Испытание токсичности разработанного препарата провели в соответствии с требованиями по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Для определения показателей острой токсичности растворов препарата (образцы МО-1/1, МО-1/2, МО-7, МО-1/1(с), МО7(с)) испытание провели на белых мышах линии Ва1Ь/с и белых крысах \Уй1аг обоего пола. Препараты вводили животным двумя путями- внутрижелудочно (в/ж), внутривенно (в/в) в возрастающих дозах по Литчфилду-Уилкоксону. Для достижения больших доз препарата при введении внутрь лекарственную форму вводили животным повторно с интервалами 20-30 мин в течение 2-3 ч. В/в введение осуществляли в боковую вену хвоста. В/ж введение осуществляли с помощью специального атравматического зонда. В каждой исследуемой группе было по 7-10 животных обоего пола на каждую дозу. Период наблюдений за состоянием животных составлял 14 дней с момента введения препарата, вещества сравнения и животными контрольных групп.

Испытание острого токсического действия препарата (образцы МО-1/1, МО-1/2? МО-7, МО-1/1(с), МО-7(с), МО-9) на мышах при в/в введении провели в 4-х дозах: 600мг/кг, 800мг/кг, 1000мг/кг, 1200 мг/кг. Были отобраны группы мышей из расчета по две однополые группы (10 самок/10 самцов) на каждую дозу; две контрольные группы были составлены из самцов и самок по семь особей. Препарат сравнения Н-эссенциале, производства А. Наттерманн энд Сие, Гмбхв водили в\в в дозах: 550, 600, 650, 700 мг/кг. Использовали по семь самцов и самок мышей на каждую из испытанных доз.

В табл. 15 приведены результаты оценки выживаемости белых мышей линии Ва1Ь/с после однократного внутривенного введения препаратов Н-РГКС. В табл. 16 приведены данные о выживаемости белых мышей линии Ва1Ь/с после однократного внутрижелудочного введения препаратов.

Однократное в/в введение мышам растворов жидкой формы препарата - образцы МО-1/1, МО-1/1(с) - в целом сопровождалось сходными изменениями и проявилось в одинаковом уровне токсичности. При этом вводились жидкие формы препарата МО-1/1, МО-1/1(с), МО-1/2, МО-1/2(с), различаюшиеся количественным содержанием комплекса активных компонентов (соответственно 0,35 мас.% для МО-1/1, МО-1/1(с), и 0,37 мас.% для МО-1/2, МО-1/2(с) (табл. 15)).

В дозе 600 мг/кг, в/в образцов препарата МО-1/1, МО-1/1 (с) на протяжении всего периода наблюдений не сопровождалось летальностью вне зависимости от пола животных. В первые 4 ч после инъекции отмечались вялость, некоторое торможение общей активности, снижение потребления корма, повышение потребления воды. В последующем общее состояние и поведение экспериментальных животных не отличались от контрольной группы. Половых различий в течении интоксикации не отмечалось. В дозе 600 мг/кг, в/в образцов препарата МО-1/2, МО-1/2(с) пал один самец на 4 сутки.

При в/в введении препаратов в дозах 800 мг/кг и выше образцов препарата МО-1/1, МО-1/1(с) у животных наблюдались заторможенность, оглушение, урежение дыхания и ЧСС. На дозе 800 мг/кг на после введения образца МО-1/1 на 4 сутки после введения образца МО-1/1 пал 1 самец, на 3 сутки после введения образца МО-1/1 (с) пал 1 самец. Среди самок на дозе 800 мг/кг после введения образца МО-1/1 и после введения образца МО-1/1 (с) пали по 2 мыши - одно животное на 3-4 сутки. После введения образцов препарата Н-РГКС (образцы МО-1/1, МО-1/1 (с)) в дозе 1000 мг/кг среди самцов пало по 3 мыши из 10 испытуемых, среди самок пало по 5 мышей из 10 испытуемых. После введения образцов препарата НРГКС (образцы МО-1/1, МО-1/1(с)) в дозе 1200 мг/кг у животных отмечались заторможенность, вялость, нарастающие явления угнетения дыхания, боковое положение, сопор и смерть в течение первых суток после введения образцов МО-1 и МО-1(с): среди самцов по 5 из 10, а среди самок по 6 из 10. Судорог не

- 17 014044 наблюдалось.

При введении в/в тех же доз образцов препарата препарата Н-РГКС (образцы МО-1/2, МО-1/2(с)) опыт показал следующее. Для МО-1/2 при дозе 800 мг/кг на 2 и 3 сутки пало по одному самцу, при дозе 1000мг/кг на 2, 3 сутки пали соответственно по 2 самца, на 4 сутки один самец, при дозе 1200 мг/кг на 1 сутки пал один самец, на 2 сутки - два самца, на 3 сутки - четыре самца, на 5 сутки - один самец. Для доз 800мг/кг, 1000мг/кг образца МО-1/2 (с) результаты совпадали с полученными для образца МО-1/2, для дозы 1200 мг/кг образца МО-1/2 (с) отличались тем, что на 1 сутки падежа животных не было отмечено, на 2 сутки пало три самца.

Число павших животных среди самок при в/в введении препарата Н-РГКС (образцы МО-1/2, МО1/2(с)) превысило число павших самцов для доз 800 мг/кг, 1000 мг/кг и 1200 мг/кг соответственно на одно животное для каждой дозы.

Таблица 15

Н-РГКС (образец МО-1/1), Самцы
Доза, мг/кг	600	800	1000	1200	Расчетные показатели токсичности (мг/кг)
Эффект: пало/всего	0/10	1/10	3/10	6/10	ЛД16=873,78; ЛД84=1396,34 ЛД50=1135,06
Н-РГКС (образец МО-1/1(с), Самцы
Эффект: пало/всего \| 0/10 \| 1/10 ~[ 3/10 \| 6/10 \| ЛД50=1135,06
Н-РГКС (образец МО-1/1), Самки
Эффект: пало/всего	0/10	2/10	5/10	7/10	ЛД16=792,41; ЛД84=1375,31 ЛД50=1083,03
Н-РГКС (образец МО-1/1(с), Самки
Эффект: пало/всего	0/10	2/10	5/10	7/10	ЛД16-792.41; ЛД84=1375,31 ЛД50=1083,03
Н-РГКС (образец МО-1/2), Самцы
Эффект: пало/всего	1/10	2/10	5/10	8/10	ЛД16=873,78; ЛД84-1396,34 ЛД50=1135,06
Н-РГКС (образец МО-1/2(с), Самцы
Эффект: пало/всего \| 1/10 \| 2/10 ί 5/10 \| 8/10 [ ЛД50—1135,06
Н-РГКС (образец МО-1/2), Самки
Эффект: пало/всего	1/10	3/10	6/10	9/10 ЛД16=792,41; ЛД84-] 375,31 \| ЛД50=1083,03
Н-РГКС (образец МО-1/2(с), Самки
Эффект: пало/всего	1/10	3/10	6/10	9/10	ЛД16=792,41; ЛД84=1375,31 ЛД50=1083,03
Н-РГКС (образец МО-7, Самцы
Доза, мг/кг	900	1200	1500	1800	Расчетные показатели токсичности (мг/кг)
Эффект: пало/всего	0/7	1/7	3/7	4/7	ЛД16-1177,56; ЛД84-2162.22 ЛД50=1669,89
Н-РГКС (образец МО-7(с), Самцы
Эффект: пало/всего	0/7	1/7	3/7	4/7	ЛД 16=1 177,56; ЛД84=2162,22 ЛД50=1669,89
Препарата сравнения «Н-эссенциале» производства А. Натгерманн энд Сие, Гмбх
Доза, мг/кг	550	600	650	700	Расчетные показатели токсичности (мг/кг)
Самцы
Эффект, пало/всего“ \| 0/7 Гг/7 [4/7 \| ΊΠ \| ЛД50-629(579-661 )
Самки
Эффект, пало/всего \| 0/7 \| 3/7 \| 5/7 \| 7/7 \| ЛД50 = 612 (486-644)
Мыши-однократное контрольное в/в введение физраствора
Доза, мл/мышь	0,5	Расчетные показатели токсичности (мг/кг)
Самцы и самки
Эффект, пало/всего \| 0/7 \| Нет павших
Н-РГКС (образец М\мд-1), Самцы
Доза, мг/кг	100	300	500	700	Расчетные показатели токсичности (мг/кг)
Эффект: пало/всего	0/10	2/10	4/10	7/10	ЛД16=263,29; ЛД84=850,12 ЛД5О=556,71
Н-РГКС (образец М\мд-1), Самки
Эффект: пало/всего \| 0/10	2/10 5/10	7/10	ЛД16=234,16; ЛД84=824,94 ЛД50=529,55

Существенных различий после введения образцов препарата Н-РГКС МО-1/1, МО-1/2 и МО-1/1 (с), МО-1/2(с), в течении интоксикации не отмечалось. В целом гибель животных происходила в первые 3-4 суток. Токсичность среди самок оказалась несколько выше, чем среди самцов. В последующие дни вы- 18 014044 жившие животные полностью восстанавливались и по внешнему виду: состоянию волосяного и кожного покрова, окраске слизистых оболочек, двигательной активности, тонусу мыщц, реакциям на тактильные, звуковые, световые раздражители, скоординированности движений и адекватности поведения, потреблению корма и воды, количеству и консистентции фекальных масс, частоте мочеиспусканий и цвету мочи не отличались от животных контрольных групп. Расчетные показатели средней токсической дозы после введения образцов МО-1/1 и МО-1/1(с) составили: для самцов - ЛД50 = 1135,06 мг/кг, для самок - ЛД50 = 1083,03 мг/кг, для образцов МО-1/1 и МО-1/1 (с) - для самцов - ЛД50 = 1142,08 мг/кг, для самок ЛД50 = 1094,07 мг/кг.

Таблица 16

Н-РГКС (образец МО-1/1), Самцы
Доза, мг/мьппь	200	300	400	500	Расчетные показатели токсичности (г/кг)
Эффект: пало/всего	0/7	0/7	0/7	0/7	нет павших , ЛД50>25 г\кг
Н-РГКС (образец МО-1/1 (с), Самцы
Эффект: пало/всего	0/7	0/7	0/7	0/7	нет павших, ЛД50>25 г\кг
Н-РГКС (об	разец МО-1/2), Самцы
Эффект: пало/всего	0/7	0/7	0/7	0/7	нет павших, ЛД50>25 г\кг
Н-РГКС (образец МО-1/2(с), Самцы
Эффект: пало/всего	0/7	0/7	0/7	0/7	нет павших , ЛД50>25 г\кг
Н-РГКС (образец МО-7), Самцы
Эффект: пало/всего	0/7	0/7	0/7	0/7	\| нет павших , ЛД50>25 г\кг
Н-РГКС (об	разец МО-7(с), Самцы
Эффект: пало/всего	0/7	0/7	0/7	0/7	\| нет павших , ЛД50>25 г\кг
Н-РГКС (образец МО-9), Самцы
Эффект: пало/всего	0/7	0/7	0/7	0/7	\| нет павших , ЛД50>25 г\кг

Расчетные показатели средней токсической дозы после введения порошкообразных образцов МО-7 и МО-7(с) не различались и составили - ЛД5₀=1669,89 мг/кг. Следовательно, старение образца МО-7 не привело к изменению его токсического действия.

То есть токсичность порошкообразных образцов МО-7 и МО-7(с) оказалась меньшей, чем токсичность жидких образцов МО-1/2 и МО-1/2(с) и МО-1/1 и МО-1/1(с).

Смертность после однократного в/в введения препарата сравнения Н-эссенциале производства А. Наттерманн энд Сие, Гмбх наблюдалась при дозе 550мг/кг: пали 2 самца из 7 и 3 самки из 7.

После однократного в/в введения препарата сравнения в дозе 700 мг/кг: пали 7 самцов из 7 и 7 самок из 7 в течение первых 2-х суток с момента введения.

Испытание токсичности при в/в введения жидкого образца МО-1/2 показало, что данный образец обладает существенно большей (~2 раза) токсичностью, чем образцы МО-1/1, МО-1/1(с). Смертность после однократного в/в введения жидкого образца МО-1/2 наблюдалась при дозе: 300 мг/кг - пали 2 самца из 10 и соответственно 2 самки, а при дозе 500 мг/кг - пали 3 самца из 10 и соответственно 4 самки из 10, при дозе 700 мг/кг - пали по 7 из 10 в группе самцов и самок.

Среди мышей контрольных групп (в/в введение изотонического физиологического раствора) смертности не отмечено за весь период наблюдений.

Таким образом, при однократном в/в введении мышам образцов препарата МО-1/1 и МО-1/1(с) установлено, что оба образца имеют равную острую токсичность; для образцов МО-1/2 и МО-1/2(с), испытанных в тех же условиях, токсичность выше. При испытании образцов МО-7 и МО-7(с) в тех же условиях, что и в опытах с образцами препарата МО-1, установлено, что оба образца имеют равную острую токсичность. Выявленная острая токсичность образцов существенно ниже, чем у препарата сравнения Н-эссенциале, и старение образцов препарата Н-РГКС не сказалось на его токсичности.

Испытание токсичности при в/в введения жидкого образца МО-1/2 показало, что образец обладает достоверно большей (>2 раза) токсичностью, чем образцы МО-1/1, МО-1/1(с) и образцы МО-7 и МО7(с).

Сравнительная характеристика средней токсической дозы при в/в введении препаратов мышам линии Ва1Ь/с показывает, что значение ЛД5₀ достоверно выше, чем у препарата сравнения. Следовательно острая токсичность у разработанных образцов меньше, чем у Н-эссенциале.

Испытания острой токсичности при внутрижелудочном введении образцов МО-1/1 и МО-1/1(с) препарата мышам не позволили в силу физиологических ограничений (применялось 4-кратное введение по 0,8 мл растворов препарата) достичь токсических эффектов, что позволило оценить её величину как превосходящую максимальную из введённых доз: ЛД50>25 г/кг (табл. 16).

Испытание острой токсичности на белых крысах Αίδΐατ обоего пола была определена после однократного внутривенного введения раствор препарата Н-РГКС (образцы МО-1/1, МО-7) в возрастающих дозах по Литчфилду-Уилкоксону - в дозах 0,50-0,75 г/кг; 1,0; 1,25; 1,50 г/кг, а также после внутрижелу- 19 014044 дочного (в/ж) введения в дозах 8-20 г/кг.

Для достижения больших доз препарата при введении лекарственную форму вводили животным повторно с интервалами 20-30 мин в течение 2-3 ч. В/в введение осуществляли в боковую вену хвоста. В/ж введение осуществляли с помощью специального атравматического зонда. В каждой исследуемой группе было испытано по 7 крыс обоего пола на каждую дозу.

В табл. 17 приведены данные о выживаемости крыс линии ХУй1аг после однократного в/в введения препарата Н-РГКС образец МО-1/1. В табл. 18 приведены данные о выживаемости крыс линии У18(аг после однократного в/в введения препарата Н-РГКС - порошкообразный образец МО-7.

Однократное в/в введение крысам препарата образца МО-1/1 в дозе 500 мг/кг на протяжении всего периода наблюдений не сопровождалось летальностью вне зависимости от пола животных. Однократное в/в введение крысам препарата Н-РГКС образец МО-1/1 в дозе 550-700 мг/кг приводило к гибели животных (табл. 17). В первые часы после инъекции отмечались вялость, снижение потребления корма, повышение потребления воды. На дозе 550 мг/кг на 5 сутки после введения препарата пал 1 самец и 1 самка, на 7 сутки ещё 1 самка. В последующем общее состояние и поведение выживших экспериментальных животных не отличались от контрольной группы. Половых различий в течение интоксикации не отмечалось, но смертность у самок оказалась несколько выше, чем у самцов.

Таблица17

крысы-однократное в/в введение образец МО-1/1
Доза, мг/кг	500	550	600	650	700	Расчетные показатели токсичности (г/кг)
самцы
Эффект, пало/всего	0X7	1/7	3/7	4/7	6/7	ЛД16=549,77; ЛД5О=625,ОЗ; ЛД84=700,29
самки
Доза, мг/кг	500	550	600	650	700	Расчетные показатели токсичности (г/кг)
Эффект, пало/всего	0X7	2/7	4/7	6/7	7/7	ЛД16=525,02; ЛД50=586,47; ЛД84=647,66

При в/в введении препарата в дозах 600 мг/кг и выше у животных наблюдались заторможенность, оглушение, урежение дыхания и ЧСС. На дозе 600 мг/кг на 3 сутки после введения препарата пало 3 самца и 4 самки. У животных отмечались заторможенность, вялость, нарастающие явления угнетения дыхания, боковое положение, сопор и смерть. Судорог не наблюдалось. При дозах 700 мг/кг смерть наступала в течение 5-7 ч при явлениях остановки сердца и паралича. Существенных половых различий в течение интоксикации не отмечалось. Среди животных контрольных групп смертности не было за весь период наблюдений.

Таблица 18

крысы-однократное в/в введение образец МО-7
Доза, мг/кг	750	1000	1250	1500	2000	Расчетные показатели токсичности (г/кг)
самцы
Эффект, пало/всего	0X7	0X7	1/7	3/7	5/7	ЛД16=1058,96 ЛД50=1531,36 ЛД84=2003,76
самки
Доза, мг/кг	750	1000	1250	1500	2000	Расчетные показатели токсичности (г/кг)
Эффект, пало/всего	0X7	0X7	1/7	3/7	6/7	ЛД16=981,30 ЛД50=1391,57 ЛД84= 1801,85
контроль - крысы-однократное в/в введение физраствора
Доза, мл/крыса	1,0	Расчетные показатели токсичности (мг/крыса)
самцы
Эффект, пало/всего 10X7 \| нет павших
самки
Эффект, пало/всего 10X7 \| нет павших

Однократное в/в введение крысам раствора порошкообразного препарата, образец МО-7 в дозе до 1000 мг/кг включительно на протяжении всего периода наблюдений не сопровождалось летальностью вне зависимости от пола животных. Однократное в/в введение крысам препарата Н-РГКС образец МО-7 в дозе 1250 мг/кг приводило к гибели животных (табл. 18). В первые часы после инъекции отмечались вялость, снижение потребления корма, повышение потребления воды. На дозе 1550 мг/кг на 5 сутки после введения препарата пал 1 самец и 1 самка. В последующем общее состояние и поведение выживших крыс не отличались от показателей контрольной группы. Половых различий в течение интоксикации не отмечалось. При в/в введении препарата в дозах 2000 мг/кг у животных наблюдались заторможенность, оглушение, урежение дыхания и ЧСС. Судорог не наблюдалось. Смерть наступала в течение нескольких

- 20 014044 часов при явлениях остановки сердца и паралича. Существенных половых различий в течение интоксикации не отмечалось. Среди животных контрольных групп смертности не было за весь период наблюдений.

Внутрижелудочное введение: после однократного внутрижелудочного (в/ж) введения крысам растворов препарата Н-РГКС - образец МО-1/1 в возрастающих дозах 7,0, 8,0, 9,0, 12,0, 14, 16,0 г/кг летальные исходы наблюдались только при дозах больше 8,0 г/кг. В табл. 19 приведены данные о выживаемости крыс линии ^У18(аг после однократного в/ж введения образца МО-1/1.

Таблица 19

крысы-однократное в/ж введение, образец МО-1/1
Доза, г/кг	8,0	9,0	12,0	14,0	16,0	Расчетные показатели токсичности (г/кг)
самцы
Эффект, Пало/всего	0\7	1\7	2/7	3/7	5/7	ЛД16=9,79; ЛД50=14,16; ЛД84-18,53
самки
Доза, г/кг	7,0	8,0	9,0	12,0	14,0	Расчетные показатели токсичности (г/кг)
Эффект, пало/всего	0\7	1\7	2/7	3/7	4/7	ЛД16=7,21; ЛД50=13,51; ЛД84=19,83
контроль - крысы-однократное в/ж введение физраствора
Доза, мл/крыса	3,0	Расчетные показатели токсичности (мг/крыса)
самцы
Эффект, пало/всего 10\7 \| нет павших
самки
Эффект, пало/всего 10\7 \| нет павших

Гибель животных при в/ж введении смертельных доз препарата (9,0 г/кг и более) наблюдалась в течение 1-5 суток от момента введения при явлениях одышки, гиперкинезов, заторможенности, вялости, оглушения, без судорог в агональной стадии и паралича. Шерсть была взъерошенной, наблюдался акроцианоз. Вскрытие погибших при в/ж введении крыс выявило, помимо венозного полнокровия внутренних органов, признаки дилятации желудка и паралитического расширения кишечника, что вероятно связано с большим объемом введенного препарата.

В первые часы после инъекции отмечались вялость, снижение потребления корма, повышение потребления воды. На дозе 9,0 г/кг на 5-е сутки после введения препарата пал 1 самец и 1 самка. В последующем общее состояние и поведение выживших животных не отличалось от контрольных. При в/ж введении крысам растворов препарата МО-1/1 в дозах 12,0, 14, 16,0 г/кг летальные исходы наступали соответственно на 3-й, на 2-е сутки от момента введения. Картина течения интоксикации была сходна с описанной.

Существенных половых различий в течении интоксикации не отмечалось. Среди животных контрольных групп смертности не было за весь период наблюдений. Значение средней токсической дозы для самцов ЛД₅₀=14,16 г\кг оказалось выше значения средней токсической дозы для самок ЛД₅₀=13,51 г/кг.

После однократного внутрижелудочного (в/ж) введения крысам растворов препарата, порошкообразный образец МО-7 в возрастающих дозах 9,0 г/кг, 10,0 г/кг, 12,0 г/кг, 14 г/кг, 16,0 г/кг, 18,0 г/кг летальные исходы наблюдались только при дозах больше 10,0 г/кг. В табл. 20 приведены данные о выживаемости крыс линии ХУМаг после однократного в/ж введения порошкообразного препарата МО-7.

Гибель животных при в/ж введении смертельных доз препарата (12,0 г/кг, 14 г/кг, 16,0 г/кг, 18,0 г/кг) наблюдалась в течение первых 7-ми - 2-х суток от момента введения при явлениях одышки, заторможенности, вялости, оглушения, без судорог и паралича в агональной стадии.

Вскрытие погибших при в/ж введении образца МО-7 крыс выявило, венозное полнокровия внутренних органов, признаки дилятации желудка и паралитического расширения кишечника, что могло быть связано с большим объемом введенного препарата.

- 21 014044

Таблица 20

крысы-однократное в/ж , образец МО-7
Доза, г/кг	10,0	12,0	14,0	16,0	18,0	Расчетные показатели токсичности (г/кг)
			самцы
Эффект, пало/всего	0/7	1/7	2/7 ...	3/7	5/7	ЛД 16=12,43 ЛД50=16,19 ЛД84=19,96
			самки
Доза, г/кг	10,0	12,0	14,0	16,0	18,0	Расчетные показатели токсичности (г/кг)
Эффект, пало/всего	0/7	1/7	3/7	4/7	6/7	ЛД16=11,99 ЛД50=15,00 ЛД84=18,ОЗ
контроль	- крысы-однократное в/ж введение	шзраствора
Доза, мл/крыса	3,0					Расчетные показатели токсичности (мг/крыса)
			самцы
Эффект, пало/всего	0/7					нет павших
			самки
Эффект, пало/всего	0/7					нет павших

Существенных половых различий в течение интоксикации не отмечалось. У выживших после интоксикации животных происходило восстановление - общее состояние и поведение выживших экспериментальных животных не отличались от контрольной группы. Среди животных контрольных групп смертности не было за весь период наблюдений.

Значение средней токсической дозы при в/ж введении образца МО-7 для самцов ЛД50=16,69 г\кг оказалось выше значения средней токсической дозы для самок ЛД50=15,00 г/кг.

Таким образом, в ходе токсикологического изучения образцов (образцы МО-1/1, МО-7, МО-1/1(с), МО-7(с), МО-9) разработанного препарата, проведённых на мышах, было установлено, что величины ЛД₅₀ при в/в введении образцов мышам колеблются от 1083,05 до 1669,88 мг/кг. При в/ж введении токсическая доза не была достигнута, значение расчетной средней смертельной дозы было принято по максимальной из введенных внутрь доз ЛД₅₀ >25 г/кг.

При в/в введении образца М\мд-1 установлено, что у мышей-самцов величина ЛД5₀ = 556,71 мг/кг, а у самок ЛД, = 529,55 мг/кг, т.е. токсичность при в\в введении оказалась наибольшей из испытанных образцов.

При определения показателей острой токсичности на белых крысах ^181аг раствор препарата, образцы МО-1/1, МО-7 установлено, что величины ЛД50 при в/в введении крысам разного пола колеблются от 586,47 мг/кг до 1531,36 мг/кг, а при в/ж введении от 13,51 г/кг до 16,69 г/кг.

Полученные результаты позволяют классифицировать образцы МО-1/1, МО-7, МО-1/1(с), МО-7(с), МО-9 препарата как мало токсичные. Состояние животных, переживших острую интоксикацию, свидетельствует о хорошей переносимости и безвредности препарата в дозах, превышающих эффективные, использованные для лечения токсического гепатита (5 мг\кг, 10 мг\кг, 15 мг\кг) более, чем в сто раз. Следовательно, результаты токсикометрии, данные некропсии и наблюдений за экспериментальными животными в течение всего периода изучения гепатопротекторной активности препарата позволяют заключить о безопасности применения препарата и возможности после дополнительных исследований классифицировать образцы препарата как практически не токсичные (по Нобде, 81ет).

Прогнозируемая безопасность препарата (БП), которую принято характеризовать как отношение среднетоксических доз (ЛД₅₀) к среднеэффективной (ЕД5Д, для образцов препарата пролонгированного действия Н-РГКС будет гарантировано больше 100. Т.е. прогнозируемое значение безопасности препарата БП=ЛД₅₀/ЕД₅₀>100, что указывает на достаточную для перспективного препарата терапевтическую широту. Вместе с тем, необходимо отметить, что значение среднеэфективной гепатопротекторной дозы препарата, с учётом пролонгированности действия, может оказаться существенно меньше 5 г\кг, что указывает на возможность большей терапевтической широты, чем приведённая оценочная.

Таким образом, проведённые исследования свидетельствуют об отсутствии противопоказаний по данным острой токсичности и безопасности для дальнейших доклинических испытаний разработанного препарата в обоих вариантах изобретения.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Наносомальная лекарственная форма препарата пролонгированного действия для лечения гепатита С, содержащая комплекс активных компонентов, включающий глутатион, инозин и соль платины, отличающаяся тем, что глутатион, инозин взяты в отношении 1:1, а соль платины в количестве 0,05%,

- 22 014044 при этом комплекс активных компонентов иммобилизован за счет адсорбции и соосаждения на биодеградируемом полимерном носителе в виде наночастиц из полилактидгликолида РЬСА 50:50 с размерами наночастиц 92-163 нм.
2. Лекарственная форма по п.1, отличающаяся тем, что она содержит, мас.%:

комплекс активных компонентов — 0.35-0.37 полилактидгликолида РЬОА 50:50- 2.45-2.72 растворитель - остальное.
3. Лекарственная форма по п.2, отличающаяся тем, что она содержит поверхностно-активное вещество в количестве 0,80 мас.%.
4. Лекарственная форма по п.2, отличающаяся тем, что в качестве растворителя она содержит раствор диметилсульфоксида в воде.
5. Лекарственная форма по п.1, отличающаяся тем, что она содержит, мас.%:

комплекс активных компонентов - 4 полилактидгликолида РЬСтА 50:50- 16 поверхностно-активное вещество - 60 средство криопротекции и рессуспендирования- 20.
6. Лекарственная форма по п.5, отличающаяся тем, что комплекс активных компонентов иммобилизован на биодеградируемом полимерном носителе в виде наночастиц из полилактидгликолида РЬСА 50:50 с размерами 129-163 нм.
7. Лекарственная форма по п.6, отличающаяся тем, что в качестве средства криопротекции и рессуспендирования использован Ό-Маннит.
8. Лекарственная форма по п.3 или 5, отличающаяся тем, что в качестве поверхностно-активного вещества использован поливиниловый спирт или полисорбат 80.
9. Наносомальная лекарственная форма препарата пролонгированного действия для лечения гепатита С, содержащая комплекс активных компонентов, включающий глутатион и инозин, отличающаяся тем, что глутатион и инозин взяты в отношении 1:1, при этом комплекс активных компонентов иммобилизован за счет адсорбции и соосаждения на биодеградируемом полимерном носителе в виде наночастиц из полилактидгликолида РЬСА 50:50 с размерами частиц 103-159 нм.
10. Лекарственная форма по п.9, отличающаяся тем, что она содержит, мас.%:

комплекс активных компонентов - 4 полилактидгликолида РЬОА 50:50 - 16 поверхностно-активное вещество - 60 средство криопротекции и рессуспендирования - 20.
11. Лекарственная форма по п.9, отличающаяся тем, что в качестве средства криопротекции и рессуспендирования использован Ό-Маннит.
12. Лекарственная форма по п.9, отличающаяся тем, что в качестве поверхностно-активного вещества использован поливиниловый спирт или полисорбат 80.