CN109646684B - 环孢菌素h环糊精及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及环孢菌素H与环糊精的包合物，其制备方法，及其用于治疗脑出血后脑水肿的方法和制药用途。

Description

环孢菌素H环糊精及其用途
技术领域
本申请涉及环孢菌素H的环糊精包合物，及其用于治疗脑出血后脑水肿的方法和制药用途。
背景技术
环孢菌素H(CsH)
环孢菌素H(Cyclosporin H)是由11个氨基酸组成的环状十一肽:环[L-丙氨酰-D-丙氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-N-甲基-L-缬氨酰-3-羟基-N,4-二甲基-L-2-氨基-6-辛烯酰-L-2-氨基丁酰-N-甲基甘氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-L-缬氨酰-N-甲基-L-亮氨酰]，分子式为C62H111N11O12，结构如下：
Figure BDA0001971271650000011
CsH是甲酰肽受体1(Formyl Peptide Receptor 1，简称FPR1)的天然拮抗剂。FPR1主要表达于哺乳动物的某些免疫细胞(如组织内的吞噬细胞和血液白细胞等)，其功能是介导细胞对入侵微生物和自身组织损伤释放的N-甲酰甲硫氨酸寡肽的应答。在Wenzel等人利用30nM甲酰肽FMLP(即N-甲酰基甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸)激活人嗜中性粒细胞的实验中，原本FMLP的激活作用诱导了超氧化物(O2 -)的形成，但CsH的加入却可抑制FMLP与FPR1受体结合并由此诱导的O2 -形成，当CsH为40nM时达到半数最大效应，当CsH为1μM时O2 -形成现象消失了(Wenzel等人，J Immunol.1991，147(6):1940-6)。
目前，CsH主要用于科学研究，尚未用于临床治疗疾病，这可能是由于CsH不溶于水，也不易穿越血脑屏障被递送到中枢神经系统。鉴于CsH在肿瘤、抗病毒感染和炎症相关疾病中潜在的临床应用价值，对其分子结构或理化属性进行改造有望形成符合临床需求的新药物。
环糊精及其包合作用
环糊精能广泛与多种两亲性和亲脂性分子形成稳定的非共价包合物(Challa等,AAPS PharmSciTech.2005；6(2):E329–E357)。它们具有亲脂性内腔和亲水外表面，这使得它们有良好的水溶性。已知环糊精有α-,β-,和γ-三种天然形式。
脑出血后脑水肿
脑出血在全球范围内仍然是致死致残率最高的脑卒中类型，每年中国新增脑出血患者约60万人。1年死亡率可达50％，5年死亡率高达70％，且仅有20％的存活患者能在6个月后独立生活。脑出血后脑内形成血肿周围脑水肿(PHE)进一步加重患者的脑损伤和神经功能缺陷(Murthy et al，Stroke.2015Nov；46(11):3088-92.)。目前，尚无特异性药物靶向治疗血肿周围脑水肿。
大分子药物穿越血脑屏障始终是世界性难题。由脑毛细血管独有的紧密连接蛋白形成的血脑屏障(BBB)阻止了大脑对大部分药物和生物大分子的吸收，造成仅分子量小于400Da的小分子药物能够自由扩散到脑组织(William M Pardridge.J Cereb Blood FlowMetab.2012 Nov；32(11):1959–1972.)。分子量超过1000的环孢菌素H显然不能自由通过BBB在脑组织内发挥作用。
发明内容
本申请人首次发现，拮抗FPR1可以改善脑出血后脑水肿，即，FPR1可作为治疗脑出血后血肿周围脑水肿的治疗靶点。本申请人采用环糊精包合CsH，使不溶于水的CsH在水溶液内的浓度达到Wenzel 1991(出处同上)所述半抑制浓度的20万倍。本申请人还意外发现此包合物能促使CsH穿透血脑屏障，在脑组织内达到或超过Wenzel所述半抑制浓度。由于水溶性大大提高，本申请所制得的CSH环糊精包合物适于口服、皮下注射、静脉注射等多样化的给药方式，尤其对于脑出血昏迷、无法进食的病人给药具有重大意义。
CsH的环糊精包合物(inclusion complex)
环糊精对目标分子的包合形式是灵活的。如果一个目标分子能进入环糊精中空环内，理论上只需一个环糊精分子即可完成包合；一个目标分子太大，进不到单个环糊精的中空环内，需要至少n个环糊精包绕目标物，此时的摩尔比从1:1相应增大到1：n以上。因此，目标分子在环糊精水溶液中的溶解度与环糊精的浓度正相关。
本申请人将CsH与不同浓度的环糊精混合，结果发现，将CsH与环糊精以大约1：30.5的摩尔比混合，就足以使CsH完全溶,表现为CsH环糊精包合物水溶液澄清，而CsH水溶液呈悬浊液。继续增加环糊精的量，CsH的溶解度也相应增加。当CsH与环糊精以1：50的摩尔比混合时，CsH在水中的溶解度可高达8000μM，这相当于Wenzel 1991(出处同上)中半抑制浓度40nM的20万倍。考虑到三次独立制备包含物得到的CsH回收率最低为78％，本申请的包合物中CsH与环糊精摩尔比不少于1:23，优选为1：23～1：39，更优选1：30～1：33。因本申请的包合物所能提供的CsH浓度远超抑制FPR1所需的浓度，故该包合物适合制作各种剂型的CsH药物，例如注射剂，粉剂，胶囊剂，等。
CsH不易穿越血脑屏障(BBB)。有报道称，给与患者环孢菌素类物质，其在人脑脊液中含量不足血液含量千分之一。本申请的动物实验显示，CsH给与小鼠后，在小鼠脑组织中的含量不足血液含量的0.05％(图2D)，与之前报道的病人情况接近。可见，单纯的CsH用药难以抵达脑中枢组织内发挥作用，需要对CsH进行改造。
本申请的CsH环糊精包合物经小鼠尾静脉注射，在注射后4小时小鼠脑组织内的CsH达到了抑制FPR1受体所需半抑制浓度的1.22倍(图2E)，而对照组的CsH仅是该半抑制浓度的0.0375倍，几乎无抑制FPR1活性。因此，该包合物有利于CsH在脑中枢疾病中应用。
由于拮抗剂抑制受体的效率和拮抗剂浓度之间呈S状曲线。在半抑制浓度附近，拮抗剂的抑制效率与拮抗剂的浓度接近线性变化。当拮抗剂浓度过高/过低时，拮抗剂的抑制效率改变不明显。
本申请的环糊精除了包括上述任一种天然形式，还包括改性的环糊精，如修饰了烷基、羟烷基、二烷基和硫烷基醚的环糊精，等等。例如，对羟丙基和硫烷基醚进行化学修饰可增加天然环糊精的水溶性和复合能力(Thompson 1997,Muller et al.,1985,Szente etal.,1999)。在本申请的一个具体实施方案中，环糊精是(2-羟丙基)-β-环糊精(2-Hydroxypropyl)-β-cyclodextrin,简称“HP-β-CD”)。
本申请的环糊精还包括环糊精醚，环糊精酯，桥联环糊精，环糊精交联聚合物，以及与高分子相连环糊精，等等。
治疗脑出血后脑水肿
目前，临床上尚无药物靶向干预FPR1来治疗脑水肿。本申请人发现，脑出血后血肿周围组织和外周免疫细胞的FPR1信号是干预脑水肿治疗新的潜在途径。
本申请对脑出血病人血肿周围组织的全基因组表达谱测序，结果提示：在脑出血后6小时、24小时情况下，血肿周围脑组织接收坏死细胞释放的线粒体甲酰肽的FPR1受体在所有20余种危险信号受体中上调最显著，表达量最高(图3)。
本申请在脑出血小鼠模型上抑制FPR1，脑水肿显著减轻；脑内小胶质细胞的活性和浸润的中性粒细胞、巨噬细胞等显著减少，小鼠的死亡率显著下降(图4和图5)。可见，FPR1信号在脑出血后脑内炎症、血管通透性和脑水肿形成中起到了关键作用。脑出血后血肿周围组织和外周免疫细胞的FPR1信号可作为干预脑水肿治疗新的潜在途径。
CsH作为FPR1的天然特异性抑制剂，如果能克服不溶于水和不能突破BBB的缺陷，被顺利递送至脑组织，就有可能通过干预FPR1信号而起到治疗脑出血的目的。
本申请人发现，环糊精对CsH有非常明显的增溶作用(图1)。所以，用环糊精改造CsH可以克服CsH不溶于水、不利于递送尤其血液递送的缺陷。
至于药物穿越BBB，一般认为，只有分子量小于400Da的亲脂性药物才能穿过BBB，而大分子量或亲水性分子则不能。对于亲水性的CsH环糊精包合物或亲脂性分子量为大于1000Da的CsH来讲，理论上都无法直接穿越BBB。环糊精内亲脂外亲水且分子量大于400Da，需要在外面再套一层能与细胞膜发生融合的亲脂层，才可能顺利穿过BBB，到达脑内。例如，US20130337051就用环糊精包合非水溶性的化合物，并进一步将包合物包裹到脂质体，通过脂质体与细胞膜发生融合来实现脑内递送。本申请却意外发现，具有亲水外层的环糊精与CsH复合后，无需脂质体包裹，也能突破BBB(图2)。
故本申请的CsH环糊精包合物非常适合在脑出血后急性期给药，能在脑内病灶区达到有效工作浓度，抑制脑出血后组织坏死细胞释放的线粒体甲酰肽的过度免疫应答导致的早期血脑屏障损伤和脑水肿加重。
附图说明
图1示CsH在不同浓度的HP-β-CD水溶液中的溶解度，以室温下的分光光度值计，参照CsH标准品(sigma公司)。
图2示CsH环糊精包合物的体内生物稳定性和血脑屏障突破能力。A.采用多反应检测(Multi Reaction Monitor)质谱对CsH的标准品、小鼠血清样本和脑组织样本进行离子碎片分析，显示CsH以环糊精包合物的形式给药时在血液和脑组织内的结构稳定，没有被降解。B和C.质谱定量分析显示，在小鼠尾静脉注射后1小时、4小时和24小时之时，实验组CsH血清强度略高于对照组，无显著性差异。D和E.质谱定量分析提示，在尾静脉注射后1小时和4小时之时，实验组CsH脑内强度明显高于对照组，存在显著差异。特别是在4小时时，实验组CsH达到了Wenzel所述半抑制浓度的1.22倍，而对照组的CsH仅是该半抑制浓度的0.0375倍，几乎无抑制FPR1活性。
图3示危险信号受体在脑出血患者血肿周围脑水肿组织内的表达。脑出血急性期需手术清除基底节大血肿(大于15ml)的患者，在开颅吸取病灶区血肿手术时保留100mg血肿周围脑组织，用于全基因组表达谱分析。对照样本为NIH的SRA数据库正常基底节脑组织的测序样本，测序均采用ILLUMINA系统和仪器。与对照组正常脑组织相比，脑出血血肿周围脑水肿组织内的部分危险信号受体在脑出血发作(表现为：患者突然出现头痛、昏厥、神经功能障碍和具有脑出血核磁影像特征)后6小时或24小时出现显著性上调，其中，FPR1的上调最为显著。正常对照组4例，脑出血6小时组5例，脑出血24小时组6例。均值±标准误,*P<0.05，**P<0.01。
图4示CsH环糊精减轻脑出血后脑水肿、神经功能缺陷和死亡率。在造模后24小时，评估患侧和对侧大脑水分含量(脑组织干重、湿重比率)，小鼠神经功能缺陷(mNNS评分)和死亡率统计。A.CsH环糊精组与对照组大脑患侧(ipsilateral)、大脑对侧(contralateral)和小脑组织(cerebellum)内水含量比较。B.CsH环糊精组与对照组神经功能缺陷比较。C.CsH环糊精组与对照组死亡率比较。每组6只小鼠,均值±标准误，*P<0.05。
图5示CsH环糊精在脑出血给药后24小时显著减少脑内浸润的中性粒细胞、巨噬细胞。A.脑组织单细胞样本内中性粒细胞(neutrophil)、巨噬细胞(macrophage)、T细胞、B细胞和小胶质细胞(microglia)的流式细胞仪分群分析。B.CsH环糊精组与环糊精对照组，在脑出血后24小时脑内中性粒细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞和小胶质细胞数量的统计分析。每组6只小鼠，均值±标准误,**P<0.01。
实施例
实施例1：制备CsH环糊精包合物
1.1CsH在HP-β-CD环糊精水溶液中的溶解度
将1mgCsH分别加入6个容积为1.5ml带盖塑料管内，每管分别加入1ml浓度分别为1mM，10mM，30mM，50mM，70mM，90mM HP-β-CD水溶液。将所有6个管盖密封，放入装入200ml水的1L容积的玻璃瓶。将瓶子放在磁力搅拌器上加入转子进行搅拌，磁力搅拌器温度设置为50摄氏度，搅拌速度设置为1200rpm，连续搅拌48小时，使CsH在各HP-β-CD水溶液内达到饱和。将管子取出，冷却至室温，0.22μM滤器过滤后，吸出过滤液用吸光光度计按蛋白检测各样品吸光度值。与CsH的标准品吸光度值比较，获得CsH在1mM到90mMHP-β-CD水溶液的溶解度曲线(图1)。
从溶解曲线可以看出，要使CsH完全溶于水，需要CsH与HP-β-CD环糊精的摩尔比为不小于1:30.5。单位体积内的HP-β-CD环糊精浓度与CsH的溶解度呈正比关系。
1.2液体制剂
溶液1：固体CsH溶于乙醇中，终浓度6.15mg/ml。
溶液2：HP-β-CD溶于去离子水，终浓度73mg/ml。
在50℃，实验组将溶液1按体积比1:4缓慢加入溶液2，并进行磁力搅拌30分钟溶液变澄清，得CsH环糊精包合物，对照组将溶液1与水混合只得到浑浊液。对澄清溶液用0.22μm滤网过滤，分光光度计测出溶液的吸光度值，与CsH标准品吸光度对比，获得样品内的CsH浓度和总量，经计算CsH环糊精包合物中CsH回收率为约80％。
1.3固态制剂
将实施例1.2所得包合物液体避光干燥，即获得固体包合物。该固体包合物可进一步用于制作粉针、静脉输液、胶囊等剂型。
1.4氯化钠溶液
取实施例1.3的固态包合物，加入医用氯化钠溶液内，磁力搅拌混匀30分钟，调pH至6.8-7.2。灭菌，密封。
1.5制剂分析
取成年雄性C57小鼠18只分为对照组和实验组，实验组9只尾静脉注射CsH的HP-β-CD包合物(CsH与HP-β-CD环糊精摩尔比为1:40条件下制得)，对照组9只注射等量的CsH生理盐水液。每只小鼠注射的纯CsH剂量为5mg/kg体重/天。
在注射后1小时、4小时和24小时分别收集小鼠血液和脑组织样本。每个时间点实验组和对照组各3只。将注射后的1小时、4小时和24小时之时的脑内CsH浓度与Wenzel 1991(出处同上)所述的半抑制浓度进行比对，)以此表示CsH在脑组织内的生物活性。
血清CsH质谱测定。准确称100ul血液样本在100ul甲醇里溶解后，最终取5ul甲醇上清液质谱上样。在注射后1小时，4小时和24小时，两组小鼠血液内CsH无显著差别，都远高于Wenzel 1991(出处同上)所述半抑制浓度，说明CsH在血清内的生物活性都达到饱和(图2B)。
脑组织CsH质谱测定。准确称5mg脑组织样本在300ul甲醇里溶解后，最终取5ul甲醇上清液上样。在注射后1小时和4小时，实验组CsH生物活性量显著高于对照组。特别在注射后4小时，实验组脑组织CsH与Wenzel1991(出处同上)所述的40nM的比值为1.22，对照组脑组织CsH与40nM比值为0.0375。可见，实验组脑组织内CsH对FPR1受体具有显著的抑制活性，对照组脑组织内CsH含量太低，几乎对FPR1起不到抑制作用(图2D)。
此外，结果还提示CsH环糊精其他新特性：1)与单纯CsH给药相比，CsH环糊精给药使得CsH在脑组织内活性的达峰时间从1小时提升到4小时，提升了4倍，CsH环糊精在体内的利用率提高；2)在单次尾静脉注射后的24小时内脑内CsH相对活性，CsH环糊精组始终高于单纯CsH组。
实施例2：脑出血小鼠动物模型中的应用
2.1建模
腹腔注射氯胺酮(100mg/kg)麻醉小鼠。随后，将小鼠固定于立体定位仪，在颅骨右侧(中线旁开2.3mm，前囟向前0.5mm)钻出直径为1mm的孔。使用注射泵(Kd ScientificInc.,Holliston,MA)在小鼠右侧纹状体，颅骨下3.7mm的深度，从内眦静脉中取出30ul的非肝素化的自体血注入脑实质的纹状体部位。以1ul/分钟的速率在孔下方3mm的深度注射前5ul，以产生凝块，之后将针移动到3.7mm的深度并暂停5min。剩余的25ul同样以1ul/分钟的速度注射。手术过程中，小鼠体温维持在37℃±0.5℃。用骨蜡封闭颅骨上的孔，手术后缝合关闭切口。为了避免脱水，在手术后立即通过皮下注射给每只小鼠注射0.5ml生理盐水(0.9％NaCl)，然后放入能获取到食物和水的笼子里。诱导ICH(脑出血)导致的可再生性病变主要局限于纹状体。
2.2给药
自体血注射完成建模后，立即给与一组小鼠以实施例1.2的CsH环糊精包含物液体制剂(是将CsH与HP-β-CD环糊精按摩尔比1:40制得的包含物，相当于纯CsH用量为5mg/kg小鼠体重每天)，对照组注射等量环糊精。此后每组小鼠每12小时腹腔注射给药1次(因首次尾静脉给药后12小时内脑内CsH量已达到最大值，腹腔注射易操作固故后继给药改为腹腔注射)，直到实验结束。
2.3给药后脑水肿的测量
在脑出血后第1天麻醉无痛脱颈处死小鼠，将脑放入脑切割模具中。立即将脑分为三部分：左半球、右半球和小脑。进行称重，获得各部分组织的湿重。随后将组织置于100℃烘箱中烘干24h，获得干重。脑含水量用如下公式计算：(湿重—干重)/湿重*100％。
接受CsH处理的小鼠，在给药后24小时，患侧脑组织的水含量与环糊精对照组相比显著下降(图4)
2.4给药后神经功能损伤的测量
在给药24小时后，至少由两名对小鼠手术分组和给药情况未知的人员对小鼠进行改良的神经系统严重程度评分(mNSS)和转角试验，以此评估神经功能受损情况。
mNSS通过一个15-18分的量表为神经功能评分，包括复合的运动，感觉，反射和平衡测试。当小鼠不能执行某个测试时，给1分。最后，给出一个整体评分来确定每个小鼠的功能缺损。
转角试验用于评估感觉运动和姿势的不对称性，试验小鼠被放进一个30度的夹角，并且被要求向左或向右转以退出角落。该测试重复并且记录10次，且每两次试验之间至少间隔30秒，究计算右转占总转数的百分比。
接受CsH处理的小鼠，在给药后24小时，神经功能缺陷减轻并且死亡率下降(图4)。
2.5给药后脑内免疫细胞的检测
采用流式细胞计数法来分析给药后24小时当时的脑内免疫细胞和小胶质细胞。用冰的PBS灌注小鼠后，取出脑组织剪碎。用10mM Hepes/NaOH缓冲液配制1mg/ml的胶原酶(Sigma,St.Louis,MO)在37℃消化脑组织1小时。1500rpm离心5min后，收集细胞沉淀，用70％percoll(Sigma,St.Louis,MO)重悬后，上层倒入30％percoll。室温下，2000rpm离心30min，使免疫细胞和小胶质细胞聚集到30％和70％Percoll的交界处。吸取30/70％Percoll的界面之间的单层细胞带可获得单个核细胞和小胶质细胞。单细胞悬液用抗原特异性抗体或同型对照抗体染色。所有的抗体均购于BD Bioscience,Inc(San Jose,CA)或eBioscience,Inc(San Diego,CA)，细胞染色的步骤遵照抗体说明书。所用抗体如下：CD3(145-2C11),NK1.1(PK136),CD45(30-F11),CD11b(M1/70),F4/80(6F12),Ly6G(1A8),CD19(1D3)。采用FACSAria流式细胞仪(BD Biosciences,San Jose,CA)获取流式细胞计数数据，采用Flow Jo软件7.6.1版(Informer Technologies,Walnut,CA)分析数据。
接受CsH处理的小鼠，在给药后24小时，脑内浸润的中性粒细胞和巨噬细胞的数据显著下降(图5)，从而缓解脑内过度的炎症反应，减轻脑水肿和神经功能缺陷的程度。

Claims (7)

1.环孢菌素H的环糊精包合物在制备治疗FPR1关联疾病的药物中的用途，其中环孢菌素H与环糊精的摩尔比不小于1:23，所述FPR1关联疾病是脑出血后脑水肿，并且，所述环糊精包合物不进行脂质体包裹。
2.根据权利要求1所述的用途，其中环孢菌素H与环糊精的摩尔比介于1:30～1:33之间。
3.根据权利要求1所述的用途，其中的环糊精为β-环糊精。
4.根据权利要求1所述的用途，其中的环糊精选自羟丙基-β-环糊精或磺丁基醚-β-环糊精。
5.根据权利要求1所述的用途，其为液体剂型。
6.根据权利要求1所述的用途，其中，所述包合物的制备方法，是按照环孢菌素H与环糊精的摩尔比在1:25～1:60之间来制备所述包合物。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述摩尔比介于1:40～1:50之间。
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