CN114948901B - 一种协同治疗乳腺癌的依西美坦纳米粒、制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种协同治疗乳腺癌的依西美坦纳米粒、制剂及其制备方法。所述依西美坦纳米粒包含依西美坦以及包含聚乙二醇或/和聚乙二醇衍生物的载体材料。本发明采用载药纳米粒技术包封依西美坦制成纳米粒中间体，通过优选载体系统，使得依西美坦纳米粒包封率高，渗漏率低，稳定性高，再分散性好。药效学实验证明，本发明依西美坦纳米粒制剂与市售他莫昔芬或市售依维莫司片联用，治疗乳腺癌的抑瘤率高、抑制大鼠雌二醇(E2)和孕酮(P)的分泌效果好。

Description

一种协同治疗乳腺癌的依西美坦纳米粒、制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种协同治疗乳腺癌的依西美坦纳米粒、制剂及其制备方法。

背景技术

依西美坦化学名称为1,4-二烯-3,17-二酮-6-亚甲基雄烷或6-亚甲基雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮，为白色或类白色结晶性粉末，无臭。在三氯甲烷中易溶，在乙酸乙酯、丙酮、甲醇或乙醇中溶解，在水中几乎不溶。临床上适用于以他莫昔芬治疗后病情进展的绝经后晚期乳腺癌患者。

由于依西美坦的水溶性较差，在人体的用药上遇到了困境。

然而，载药纳米粒是改善难溶性药物的口服吸收的一种方法，载药纳米粒是将药物以溶解、分散、吸附或包裹于适宜的载体或高分子材料中形成的纳米粒，除了有改善难溶性药物的口服吸收这一优势以外，还能够延长该药物的体内循环时间，增强药物跨越血脑屏障的能力，增强药物的靶向性，有利于药物的体内稳定性等。

美国专利US7820788公开了一种含有活性成分和药学可接受的载体的药物组合物，其中活性成分包括依西美坦，药学可接受的载体包括白蛋白。美国专利US7820788进一步明确了组合物中白蛋白和活性成分的比例。

中国专利CN104434808A公开了一种治疗性纳米粒子及其制备方法，治疗性纳米粒子包含活性成分和人血清白蛋白，其中活性成分包括依西美坦，治疗性纳米粒子中人血清白蛋白和活性成分的重量比为0.01:1-1:1。然而很多疾病需要使用白蛋白进行治疗，然而中国很多地区的医院都面临着人血清白蛋白短缺的窘境。在药物制剂中大量使用白蛋白造成对医疗资源的抢夺，不利于公众健康。

因此，为了寻找探究合适的药物载体，将更多的化疗药物递送至耐药肿瘤及其深部，本申请设计构建了多种具有独特性能的纳米载体，制备成依西美坦纳米粒中间体，有助于进一步制剂的制备。

发明内容

克服了现有技术的不足，本发明采用载药纳米粒技术，通过优选载体材料对依西美坦进行吸附与包裹，从而改善依西美坦难溶这一缺陷，且提高药物稳定性，延长药物在体内的循环时间。

具体而言，本发明的技术方案如下：

为了增加药物的吸收，提高药物的生物利用度，延长药物作用的时间，发明人采用载药纳米粒技术制备依西美坦纳米粒中间体，由于纳米粒高度分散，表面积巨大，这有利于增加药物与吸收部位生物膜接触面积，从而明显增加药物的吸收。

因此，发明人选择聚乙二醇及其衍生物这类具有良好的水溶性的高分子聚合物作为载体材料，通过筛选，分子量为3600-8500的聚乙二醇较为合适，尤其是分子量为3600-4400的聚乙二醇(PEG-4000)。

另外发明人发现利用聚乙二醇衍生物，即氨基和/或甲基修饰后的聚乙二醇，一方面能够提高载体材料的水溶性，另一方面，氨基、甲基这类小官能团修饰后，使得聚乙二醇载体附有强有力的“抓手”，同时也给予了药物更多的安置空间，可以增强其载药能力，使药物不易“脱落”，降低纳米粒的渗漏率。

海藻酸钠是从褐藻类的海带或马尾藻中提取碘和甘露醇之后的副产物，其分子由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸连接而成，是一种天然多糖。发明人意外的发现，在上述聚乙二醇聚合物载体材料中加入适量海藻酸钠，可以提高整个载体系统的粘度，从而更有利于依西美坦附着于、被包裹于载体系统中。

进一步的，发明人还发现在载体系统中加入少量硬脂酸，能够起到“稳固”的作用，使整个载体系统更加“牢固”、“紧密”，但是值得注意的是，硬脂酸在溶液中呈弱酸性，在酸性条件下，—COO－容易转变成—COOH，电离度降低，会使得海藻酸钠的亲水性降低，分子链收缩，从而难以使体系中的海藻酸钠发挥其作用。

于是发明人经过大量实验，发现在制备过程中加入缓冲溶液，提高溶液的pH值，在pH值增加时，—COOH基团会不断地解离，从而使得海藻酸钠的亲水性增加，分子链伸展，使海藻酸钠在该体系中最大的发挥作用。

经过优选，上述缓冲溶液为pH＝8.6的甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液。

需要说明的是，上述载体系统中各个成分的比例、以及载药系统各成分与药物依西美坦的比例均通过大量实验验证，以重量份比计算，依西美坦：聚乙二醇及其衍生物：海藻酸钠：硬脂酸＝1:1-10:1-3:0.5-2，优选为，以重量份比，所述依西美坦：聚乙二醇及其衍生物：海藻酸钠：硬脂酸＝1:4:1:0.5。

进一步的，所述依西美坦纳米粒的制备方法包括以下步骤：

(1)将载体材料溶解于乙醇中，室温下搅拌，缓慢滴入甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液，搅拌，离心，用甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液洗涤，得到载体聚合物；

(2)将依西美坦与步骤(1)所得载体聚合物溶于适量乙醇中，透析，过0.22μm滤膜，得到依西美坦纳米粒。

进一步的，本发明所述依西美坦纳米粒可作为中间体，与药学上可接受的辅料制备成制剂，所述制剂包括片剂、胶囊剂、注射剂等。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明采用载药纳米粒技术，将依西美坦包载与聚合物载体材料中制成微粒直径约100nm的纳米粒中间体，进一步制备成有关物质含量低、稳定性高的制剂。

(2)本发明优选载体材料、优化缓冲溶液，筛选得到适合包载依西美坦的载体系统，使得依西美坦纳米粒包封率高，渗漏率低，稳定性高，再分散性好，有利于进一步制备成制剂。

(3)通过药效学实验证明，本发明依西美坦纳米粒制剂与市售他莫昔芬或市售依维莫司片联用，治疗乳腺癌的抑瘤率高、抑制大鼠雌二醇(E2)和孕酮(P)的分泌效果好，优于市售依西美坦片与市售他莫昔芬或市售依维莫司片联用。

附图说明

图1实施例2各组依西美坦纳米粒包封率

图2实施例3依西美坦纳米粒再分散性

图3实施例1依西美坦纳米粒再分散性

图4实施例1依西美坦纳米粒形态

图5实施例5各组依西美坦纳米粒包封率

图6实施例6依西美坦片与市售依西美坦片的稳定性长期试验

图7实施例6依西美坦片与市售依西美坦片的稳定性加速试验

图8各组大鼠瘤体重量

图9各组大鼠抑瘤率

图10各组大鼠血清中雌二醇(E2)表达水平

图11各组大鼠血清中孕酮(P)表达水平

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明做进一步的说明，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例，实施例仅用于解释本发明。本领域技术人员应该理解的是，凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

实施例1依西美坦纳米粒

制备方法：

(1)将配方量的载体材料溶解于乙醇中，室温下搅拌，缓慢滴入8ml的甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液(pH＝8.6)，搅拌，离心，用甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液洗涤，得到载体聚合物；

(2)将依西美坦与步骤(1)所得载体聚合物溶于适量乙醇中，搅拌，透析，过0.22μm滤膜，得到依西美坦纳米粒,测得载药量为67.6％±0.37。

实施例2依西美坦纳米粒中载体材料的探究

制备方法：

同实施例1。

采用单因素实验，探究载体材料对依西美坦纳米粒的质量影响，通过包封率、渗漏率、来评价依西美坦纳米粒的质量。

表1实施例2各组依西美坦纳米粒的渗漏率(％)

实施例3依西美坦纳米粒

制备方法：

(1)将配方量的载体材料溶解于乙醇中，室温下搅拌，离心，洗涤，得到载体聚合物；

(2)将依西美坦与步骤(1)所得载体聚合物溶于适量乙醇中，搅拌，透析，过0.22μm滤膜，得到依西美坦纳米粒。

实施例4依西美坦纳米粒再分散性探究

在依西美坦纳米粒再分散性的探究过程中，发明人发现在制备过程中加入缓冲溶液，提高溶液的pH值，能够防止海藻酸钠的亲水性从而影响载体系统黏度，图2-3分别实施例1和实施例3依西美坦纳米粒的浊度变化，再分散性可以用纳米粒介质的浊度变化表示，浊度与介质中纳米粒的量呈线性关系，说明能再分散，直线回归方程的相关系数越接近1，表示再分散性越好。由此证明，加入适量甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液(pH＝8.6)能够提高依西美坦纳米粒的再分散性，使得海藻酸钠在整个载药体系中发挥最大作用。

在此需要说明的是，缓冲溶液的选择也是发明人经过单因素实验优选出来的最佳缓冲溶液与pH，发明人选用了磷酸盐缓冲液、枸橼酸盐缓冲液等，发现甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液效果较好，并优选了缓冲液的pH，发现pH＝8.6、8.8偏弱碱性的缓冲液效果较好，优选为pH＝8.6。

实施例5探究载体材料的比例对依西美坦纳米粒质量的影响

制备方法如同实施例1。

采用单因素实验，探究载体材料的比例对依西美坦纳米粒的质量影响，通过包封率、渗漏率来评价依西美坦纳米粒的质量。

表2实施例5各组依西美坦纳米粒的渗漏率(％)

实施例6依西美坦片剂(1000片)

实施例1制备的依西美坦纳米粒 37g

微晶纤维素 240g

低取代羟丙纤维素 10g

制备方法：

按配方将实施例1制备的的依西美坦纳米粒、微晶纤维素、低取代羟丙纤维素过筛、混合均匀，压片。

实施例7依西美坦胶囊剂(1000粒)

制备方法：

以适量的水作为湿润剂，将处方量的实施例1依西美坦纳米粒、微晶纤维素、低取代羟丙纤维素、硬脂酸镁分别粉碎、过筛后倒入湿法混合制粒机中，搅拌，得湿颗粒，装入胶囊，即得。

实施例8探究本发明依西美坦制剂与市售依西美坦制剂的稳定性

加速试验：按市售包装，温度40±2℃，相对湿度75％±5％条件下放置6个月，在试验期间的第1个月、2个月、3个月、6个月末分别取样，测有关物质含量。

长期试验：按市售包装，温度25±2℃，相对湿度60％±10％条件下放置，在试验期间的第0个月、3个月、6个月、9个月、12个月、24个月、36个月分别取样，检测有关物质含量。

有关物质含量检测方法：

取本品适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml中约含0.5mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，用流动相稀释制成每1ml中约含2.5μg的溶液，作为对照溶液。照含量测定项下的色谱条件，取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的25％。再精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2.5倍。供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积(0.5％)，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的2倍(1.0％)。

图6、图7分别是本发明实施例6依西美坦片与市售依西美坦片的稳定性长期试验、加速试验的结果，显示本发明依西美坦片的制剂稳定性高于市售依西美坦片。

药效学实验

发明人开展相关药效学试验研究以证明本发明依西美坦制剂协同治疗乳腺癌的功效。需要说明的是，以下实验研究均是在急性毒性试验、长期毒性试验证明药物安全性基础之上开展，实验研究中的给药剂量均在安全剂量范围之内。

此外，下述药效学实验仅以部分动物模型为例验证本发明的功效，在此，仅展示本发明依西美坦制剂联合化疗药物依维莫司治疗乳腺癌的药效学实验结果，西药说明的是，本发明依西美坦制剂也可以联合他莫昔芬等其他化疗药物进行联合用药，以此治疗乳腺癌。

1.材料

1.1实验动物

雌性SD大鼠，SPF级，6-8周龄，180-220g，实验动物许可证号：SYXK(鲁)20180008，由鲁南制药集团股份有限公司提供，实验前在标准条件下适应性喂养1周。

1.2细胞株

人乳腺癌MDA-MB-435细胞株。

1.3实验药品

实施例6依西美坦片、市售依西美坦片、市售依维莫司片、市售他莫昔芬片

2.实验动物造模

双侧卵巢切除模型：取上述大鼠60只，腹腔注射麻醉后，将裸鼠俯卧于手术台上，固定四肢，碘伏消毒，于脊柱旁开约0.5cm、距肋弓下缘约0.5cm处切开皮肤及肌肉，剪开腹膜进入腹腔，可见乳白色组织。轻轻将乳白色组织提出腹腔，即可见被包裹的“桑葚样”卵巢，分离后钳夹、结扎，剪去卵巢，检查是否渗血，分层缝合后碘伏消毒，同法取出另一侧卵巢。术后每天肌注青霉素生理盐水以抗炎，络合碘消毒切口以防止感染，连续三天，裸鼠自由进食和摄水，每天更换垫料，饲养28天，双侧卵巢切除模型制备完成。另取10只大鼠仅做开关腹腔缝合，术后做同样的消炎，饲养，为空白组。

接种MDA-MB-435细胞：取对数生长期的MDA-MB-435细胞用胰蛋白酶消化后，PBS清洗2次，加入细胞培养液中，用移液枪吹打均匀，0.4％台盼蓝染色，记录活细胞数(>95％)细胞计数板计数，调节活细胞浓度为1×10⁷/ml，裸鼠右侧腋下碘伏消毒，无菌条件下施行每只裸鼠右侧腋下接种0.2ml，注射后留针30秒，以防细胞悬液渗出。共接种3只，待肿瘤长至0.8cm³时，无菌条件下手术取出肿瘤组织，分别移植于60只裸鼠腋下，具体操作:将取出的肿瘤组织立即放入培养液中，剪切成1mm'左右的小块备用。10％水合氯醛(4ml/kg)腹腔注射麻醉裸鼠，碘伏消毒腋下皮肤，切开皮肤将肿瘤小块种于皮下，缝合后碘伏消毒，术后肌注青霉素抗感染，于SPF级动物室内正常饲养，每日观察裸鼠状态及腋下肿瘤形成情况，移植后第4-5天即可见肿瘤生长，饲养15天后，共有57只大鼠造模成功，将造模成功大鼠分为模型组、对照组、本发明联合组、市售联合组，每组10只，剩余大鼠备用。

3.分组与剂量

空白组：生理盐水(0.5ml/只)

模型组：生理盐水(0.5ml/只)

本发明联合组A：市售依维莫司片(0.45mg/kg)+实施例6依西美坦片(25mg/kg)

依维莫司市售联合组：市售依维莫司片(0.45mg/kg)+市售依西美坦片(25mg/kg)

本发明联合组B：市售他莫昔芬片(1.8mg/kg)+实施例6依西美坦片(25mg/kg)

他莫昔芬市售联合组：市售他莫昔芬片(1.8mg/kg)+实施例6依西美坦片(25mg/kg)

上述各组每日给药1次，连续给药28天。

4.统计学处理

采用SPSS 22.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用

表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间采用独立样本T检验方式分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

5.检测项目与实验结果

5.1瘤体重量和抑瘤率

连续给药28天后，采用断颈法处死各组大鼠后，剖开皮肤，剥离出腋下完整的肿瘤组织后，称重并记录瘤体重量，肿瘤组织备用，按下列公式计算抑瘤率：

抑瘤率(％)＝(模型组瘤体重—实验组瘤体重)/模型组瘤体重×100％。

5.2大鼠血清中雌二醇(E2)和孕酮(P)的表达水平

ELISA法检测大鼠血清中雌二醇(E2)和孕酮(P)的的含量。采用典型竞争法酶联免疫吸附试验，酶标仪在450nm测定OD值。通过比较待测样本与标准品的吸光度，准确测得样本中的E2、P含量。

结果显示，本发明依西美坦纳米粒制剂与市售他莫昔芬或市售依维莫司片联用，治疗乳腺癌的抑瘤率高、抑制大鼠体内雌二醇(E2)和孕酮(P)的表达效果好，优于市售依西美坦片与市售他莫昔芬或市售依维莫司片联用。

Claims (5)

1.一种协同治疗乳腺癌的依西美坦纳米粒，其特征在于，所述依西美坦纳米粒由以下成

分组成：（1）依西美坦，（2）由聚乙二醇衍生物、海藻酸钠、硬脂酸组成的载体材料；其中，所述聚乙二醇衍生物为氨基聚乙二醇和/或甲基聚乙二醇，以重量份比，所述依西美坦：聚乙二醇衍生物：海藻酸钠：硬脂酸=1:（1-10）:（1-3）:（0.5-2）。

2.根据权利要求1所述的依西美坦纳米粒，其特征在于，以重量份比，所述依西美坦：聚乙二醇衍生物：海藻酸钠：硬脂酸=1:4:1:0.5。

3.一种如权利要求1-2任意一项所述依西美坦纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将载体材料溶解于与水互溶的有机溶剂中，室温下搅拌，缓慢滴入甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液，搅拌，离心，用甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液洗涤，得到载体聚合物；

(2)将依西美坦与步骤（1）所得载体聚合物溶于适量有机溶剂中，透析，过0.22μm滤膜，得到依西美坦纳米粒。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为乙醇，所述甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液的pH=8.6。

5.一种药物制剂，其特征在于，所述的药物制剂由权利要求1-2任一项所述的依西美坦纳米粒与药学上可接受的辅料制备而成。

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