CN111573647A - 纳米羟基磷灰石在预防或抑制骨肉瘤转移和复发中的用途 - Google Patents

纳米羟基磷灰石在预防或抑制骨肉瘤转移和复发中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了纳米羟基磷灰石在预防或抑制骨肉瘤转移和复发中的用途。本发明利用体外细胞和动物模型进行研究发现，纳米羟基磷灰石处理可显著抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭；抑制骨肉瘤的肿瘤生长和转移、复发。本发明的上述研究成果为骨肉瘤已经发生转移的患者提供了一种有效的临床治疗候选药物。

Description

纳米羟基磷灰石在预防或抑制骨肉瘤转移和复发中的用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及纳米羟基磷灰石在预防或抑制骨肉瘤转移和复发中的用途。
背景技术
骨肉瘤是最常见的骨原发恶性肿瘤，年发病率约为2～3/100万，发病总数占人类恶性肿瘤的0.2％，占原发骨肿瘤的11.7％。骨肉瘤好发于青少年，大约75％的患者发病年龄在15～25岁，中位发病年龄为20岁，小于6岁或者大于60岁发病相对罕见。本病男性多于女性，比例约为1.4：1，这种差异在20岁前尤为明显。大约80％～90％的骨肉瘤发生在长管状骨，最常见的发病部位是股骨远端和胫骨近端，其次是肱骨近端，这3个部位大约占到所有肢体骨肉瘤的85％。骨肉瘤主要发生部位是干骺端，发生于骺端和骨干的病例相对罕见。多数骨肉瘤患者的首发症状常为疼痛和肿胀，前者发生要早于后者，大约90％的患者在影像学上有软组织肿块，但不是都表现为局部肿胀。肺转移是最常见的转移部位，约有1/2以上患者在其病程的不同时期会发生肺转移，其中10％～15％为同时性肺转移。
骨肿瘤外科、肿瘤内科、放疗科分别代表了肿瘤治疗的3种主要方法，即外科手术、内科化疗和放射治疗。手术是骨肉瘤患者最主要的治疗方法，而化疗是骨肉瘤的重要辅助治疗手段，在骨肉瘤的综合治疗中占有重要的地位。目前骨肉瘤化疗的主要作用是提高保肢率和长期生存率，对于转移的晚期骨肉瘤患者，化疗是最主要的治疗方法。骨肉瘤是一种对放疗不敏感的肿瘤，在大剂量放疗后大多数患者仍有明显的肿瘤残存，局部控制率低，因此不能用单纯放疗来治愈骨肉瘤。放疗的作用主要是辅助性治疗或姑息治疗，对于不能手术切除的病变或拒绝截肢的患者，局部放疗有一定的作用。骨肉瘤肺转移是制约骨肉瘤患者5年生存率的瓶颈之一。对于发生肺转移的患者，肺转移灶应以手术切除为主，联合化疗、放疗可以使患者的生存期延长。
羟基磷灰石，又称羟磷灰石，是钙磷灰石的自然矿物化，广泛存在于动物的骨骼和牙齿中，具有良好的生物活性及生物相容性，并且无毒、无刺激、无致突变性，被广泛应用于生物医用材料领域，如硬组织修复材料、药物载体等。已有研宄显示羟基磷灰石纳米粒子(HAP nanoparticles，HAPN)对肿瘤细胞的生长增殖呈现出一定的抑制作用。但是，目前现有技术中的羟基磷灰石纳米粒子制备方法不一，形态表征不一，性质不一，抗肿瘤效果良莠不齐。现有技术中一般方法生产出的大多数纳米粒子并没有抗肿瘤效果。因此，本领域需要进一步探索羟基磷灰石纳米粒子的抗肿瘤作用，并且优化其制备技术，以开发出新型的、效果优异的羟基磷灰石纳米粒子。
发明内容
本发明目的之一在于提供一种纳米羟基磷灰石。
本发明目的之二在于提供上述纳米羟基磷灰石的制备方法。
本发明目的之三在于提供上述纳米羟基磷灰石的治疗用途。
为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种羟基磷灰石衍生物，所述羟基磷灰石衍生物是纳米羟基磷灰石。
进一步，所述羟基磷灰石衍生物是高压灭菌后的纳米羟基磷灰石。
更进一步，高压灭菌后的纳米羟基磷灰石为棒状，长度为30nm，直径为10nm。
纳米羟基磷灰石的制备方法可采用水热法、沉淀法、超声合成法、溶胶-凝胶法、微乳液法和液固合成法等化学合成法。在发明的具体实施方案中，采用的制备方法是沉淀法。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了前面所述的羟基磷灰石衍生物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)硝酸钙溶液和磷酸钠十二水合物溶液混合搅拌，Ca：P摩尔比为1.67：1；
(2)洗涤沉淀物以去除多余的硝酸钠；
(3)让沉淀物沉降并除去过量上清液以获得HAP凝胶；
(4)在高压灭菌器中，对HAP沉淀进行高压灭菌。
进一步，步骤(1)中，硝酸钙溶液和磷酸钠十二水合物溶液混合搅拌后，室温放置24小时。
进一步，步骤(4)的具体条件是：121℃下对HAP沉淀进行高压灭菌15分钟。
根据本发明的又一个方面，本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物的有效成分是前面所述的羟基磷灰石衍生物。
进一步，所述药物组合物中前面所述的羟基磷灰石衍生物的有效量如0.000001-50wt％；较佳的0.00001-20wt％；更佳的，0.0001-10wt％。
本发明的药物组合物可直接用于抑制肿瘤。此外，还可同时与其它治疗剂(如化疗剂)或辅剂联合使用。
进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
通常，可将所述的羟基磷灰石衍生物配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。如所述的水性载体介质为生理盐水。
术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量的所述的羟基磷灰石衍生物以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：生理盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量通常是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。
本发明所述的羟基磷灰石衍生物的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的羟基磷灰石衍生物的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当所述的羟基磷灰石衍生物每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-40mg/kg动物体重，如20mg/kg动物体重，10mg/kg动物体重，5mg/kg动物体重，3mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
本发明还提供了一种用于抑制肿瘤的药盒，包括：容器，该容器内含有有效量的本发明所述的羟基磷灰石衍生物，以及药学上可接受的载体。
所述的药盒是便于本领域技术人员特别是临床医生应用的。作为本发明的优选方式，所述的药盒中还包括使用说明书，以指导本领域人员采取适合的方法给药。
根据本发明的又一个方面，本发明还提供了前面所述的羟基磷灰石衍生物在制备抑制骨肉瘤细胞增殖的药物中的应用。
根据本发明的又一个方面，本发明还提供了前面所述的羟基磷灰石衍生物在制备抑制骨肉瘤细胞迁移的药物中的应用。
根据本发明的又一个方面，本发明还提供了前面所述的羟基磷灰石衍生物在制备抑制骨肉瘤细胞侵袭的药物中的应用。
根据本发明的又一个方面，本发明还提供了前面所述的羟基磷灰石衍生物在制备抑制骨肉瘤转移的药物中的应用。
根据本发明的又一个方面，本发明还提供了前面所述的羟基磷灰石衍生物在制备治疗骨肉瘤的药物中的应用。
根据本发明的又一个方面，本发明还提供了前面所述的羟基磷灰石衍生物在制备预防或抑制骨肉瘤复发的药物中的应用。
根据本发明的又一个方面，本发明还提供了一种抑制骨肉瘤细胞增殖的方法，所述方法包括施用前面所述的羟基磷灰石衍生物。
根据本发明的又一个方面，本发明还提供了一种抑制骨肉瘤细胞迁移或侵袭的方法，所述方法包括施用前面所述的羟基磷灰石衍生物。
根据本发明的又一个方面，本发明还提供了一种抑制骨肉瘤转移的方法，所述方法包括施用前面所述的羟基磷灰石衍生物。
根据本发明的又一个方面，本发明还提供了一种治疗骨肉瘤的方法，所述方法包括施用前面所述的羟基磷灰石衍生物。
根据本发明的又一个方面，本发明还提供了一种预防或抑制骨肉瘤复发的方法，所述方法包括施用前面所述的羟基磷灰石衍生物。
羟基磷灰石是一种弱碱性磷酸钙盐，包括人工合成的羟基磷灰石或动物的自然的羟基磷灰石，为针状、或棒状，或球状、或圆饼状、或其他不规则形状。所述的磷酸钙盐，还包括磷灰石、磷酸钙基骨水泥。所述的羟基磷灰石是通过水相合成或高温固相合成的方法获得的，包括水热法、水解法、共沉淀法、溶胶-凝胶法、气溶胶法、酸碱反应法、喷雾干燥法、在微乳中合成、在脂质体内水相中合成、以及通过在湿空气中高温分解含钙化合物的方法中的任意一种，或者是通过对动物体内自然骨进行高温煅烧获得的，获得的羟基磷灰石为针状、或棒状，或球状。
本文所用的术语“治疗”、“进行治疗”等是指获得所需的药理学效果和/或生理学效果。所述效果可以是预防性的，即完全或部分预防疾病或其症状，并且/或者可以是治疗性的，即完全或部分治愈疾病和/或疾病所导致的不良影响。本文使用的“治疗”涵盖对受试者尤其是人的疾病的任何治疗，包括:(a)预防所述疾病在受试者中发生，所述受试者可能易患所述疾病但尚未被诊断出患有所述疾病；(b)抑制所述疾病，即阻止其发展；和(c)缓解所述疾病，例如引起所述疾病的消退，例如以完全或部分地消除所述疾病的症状。
本发明的有益效果：
本发明人经过深入的研宄，揭示了一种纳米羟基磷灰石，其具有极其优异的抑制骨肉瘤转移和增殖活性，并能预防或抑制骨肉瘤复发。
附图说明
图1显示nano-HAP的TEM图像，其中A：非高压灭菌；B：高压灭菌；
图2显示nano-HAP的X射线衍射(XRD)图；
图3显示nano-HAP尺寸统计图；
图4显示nano-HAP吸收图，其中，A：对照；B：50μg/ml；C：100μg/ml；D：200μg/ml；E：400μg/ml；F：800μg/ml；
图5显示nano-HAP降解图，其中A：细胞外；B：细胞内；
图6显示CCK-8实验结果图；
图7显示菌落形成实验结果图，其中A：染色图；B：统计图；
图8显示荧光素双乙酸盐(FDA)染色结果图；
图9显示伤口愈合实验结果图，其中A：染色图；B：统计图；
图10显示细胞迁移实验结果图，其中A：染色图；B：统计图；
图11显示细胞侵袭实验结果图，其中A：染色图；B：统计图；
图12显示小鼠肿瘤生长曲线图；
图13显示小鼠肿瘤实物图；
图14显示小鼠肿瘤体积统计图；
图15显示小鼠肿瘤重量统计图；
图16显示肿瘤组织学分析结果图；
图17显示肺、肝、肾组织学分析结果图；
图18显示血液检测结果图，其中A：白细胞，103/mm；B：红细胞，106/mm；C：血红蛋白浓度，g/L；D：血细胞比容；E：平均红细胞容积，fL；F：平均血红蛋白含量，pg；G：平均血红蛋白含量，g/L；H：血小板，103/mm；I：红细胞分布宽度，％；J：血小板血细胞比容；K：平均血小板体积，fL；L：血小板体积分布宽度，％。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1纳米羟基磷灰石(Nano-HAP)的制备与表征
1、制备
使用化学沉淀方法合成Nano-HAP。简言之，硝酸钙[Ca(NO3)2·4H2O]和磷酸钠十二水合物(Na3PO4·12H2O)分别溶解在去离子水中，Ca：P摩尔比为1.67：1。搅拌后，将HAP在室温下放置24h确保反应完成。之后用去离子水彻底洗涤沉淀物以去除多余的硝酸钠。然后让沉淀物沉降并除去过量上清液以获得HAP凝胶。在高压灭菌器中，121℃下对HAP沉淀进行高压灭菌15分钟。将HAP沉淀物储存在4℃。所用化学品均为分析纯(购自国药集团化学试剂有限公司，中国北京)。
2、Nano-HAP形态检测
2.1步骤
在加速电压为200keV条件下使用TEM检测Nano-HAP形态(Tecnai G2，FEI，HK)。使用能量色散X射线衍射仪(ESCALAB 250，Bruker Co.)分析nano-HAP的晶体结构。
2.2结果
TEM图像显示，非高压灭菌的nano-HAP形态为针状(图1A)和高压灭菌后的nano-HAP为棒状(图1B)。非高压灭菌的nano-HAP长度为50nm，直径为5nm，而高压灭菌后的nano-HAP长度为30nm，直径为10nm。X射线衍射(XRD)分析证实预期的HAP峰存在于非高压灭菌的nano-HAP样品和高压灭菌后的nano-HAP样品(ICDD 00-037-1497；图2)。本发明选择了高压灭菌后的棒状nano-HAP用于以下研究。
3、细胞培养环境下nano-HAP的大小测定
分析不同浓度的高压灭菌后的nano-HAP大小。高压灭菌后，将nano-HAP添加到细胞培养基中以模拟细胞培养环境。然后对培养基中的nano-HAP进行超声处理并涡旋防止大量结块。图3显示，nano-HAP的大小与浓度有关，且尺寸从约138nm转变为750nm。
4、Nano-HAP吸收
4.1细胞培养
在添加了10％胎牛血清(Hyclone)和1％青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基(Thermo Scientific)中培养OS-732细胞，并放置在不含CO2的37℃湿润环境下孵育。
4.2Nano-HAP的细胞吸收和细胞内定位
将OS-732细胞以每孔3×105个细胞的密度接种在六孔板(Corning)中，接种24小时后，将nano-HAP添加到培养基中培养24小时，细胞用胰蛋白酶消化，在4℃下用2.5％戊二醛(pH 7.4，溶于PBS)固定2小时，然后在同一缓冲液中用四氧化锇固定1％。乙醇脱水后，将固定细胞渗透并包埋在环氧树脂中。超薄部分用4％乙酸铀酰和柠檬酸铅复染，利用JEM-1400Plus型透射电子显微镜进行检测。
4.3结果
结果如图4所示，所有浓度(0、50、100、200、400和800μg/ml)的nano-HAP被OS-732摄取。nano-HAP的吸收并不遵循明确的浓度依赖性方式，nano-HAPs的细胞内分布处于变化之中。大多数纳米颗粒位于大或小的膜结合液泡内部。在某些细胞中存在含有更紧密堆积的nano-HAP的液泡。在吸收实验中，还观察到nano-HAP会发生降解。有趣的是，细胞内和细胞外nano-HAP逐渐降解，棒状颗粒变少，随着时间的推移边界模糊类似于细砂(图5)。
实施例2纳米羟基磷灰石(Nano-HAP)对细胞功能的影响
1、Nano-HAP对骨肉瘤细胞增殖的影响
1.1CCK-8细胞活力检测
利用细胞计数试剂盒8(CCK-8)分析评估OS-732细胞活力(Dojindo MolecularTechnologies，Inc.)，具体操作参见制造商提供的使用说明书。OS-732细胞以每孔1×103个细胞的密度接种在96孔板(Corning)中，配制浓度分别为0、50、100、200、400和800μg/ml的Nano-HAP，在细胞接种24小时后添加到培养基中。培养1、4和7天后，使用CCK-8分析细胞活力分析，简要步骤如下：将10μl CCK-8溶液添加到含有100μl培养基的孔中，然后将96孔板在37℃下孵育2小时。使用Multiskan光谱微孔板分光光度计(Thermo ScientificMultiscan GO)检测450nm(参考波长为620nm)下的吸光度。
1.2荧光素双乙酸盐(FDA)染色
以1×103个细胞/每孔的密度将OS-732细胞接种在6孔板中，接种后加入Nano-HAP。培养24小时后，细胞用FDA(Sigma-Aldrich，USA)染色，并在荧光显微镜上观察。
1.3菌落形成试验
将细胞接种到六孔板(0.5×103/孔)中，接种24小时后将浓度分别为0、50、100、200、400和800μg/ml的nano-HAP添加到培养基中。铺板十二天后，将细胞用4％多聚甲醛(在PBS中)固定，并用0.1％结晶紫(Biotime Biotechnology)染色。
1.4结果
CCK-8实验结果如图6所示，当细胞与nano-HAPs共培养1天时，细胞活力差异没有明显变化。但是，400和800μg/ml的nano-HAP温育4天以上时，OS-732细胞活力显著降低。暴露于浓度为800μg/ml的nano-HAP 7天后，OS-732细胞达到了最大生长抑制状态。因此，nano-HAP以剂量和时间依赖性方式降低了OS-732细胞活力。
菌落形成试验结果显示，nano-HAPs处理12天后，确定200、400和800μg/ml的nano-HAP以剂量依赖性方式显着抑制OS-732集落形成(图7)。
荧光素双乙酸盐(FDA)染色结果显示，nano-HAP孵育以剂量依赖性方式可以减少OS-732细胞数量(图8)。
综上所述，这些发现表明，nano-HAPs可以以时间和剂量依赖性的方式抑制OS-732细胞生长。
2、Nano-HAP对骨肉瘤细胞迁移和侵袭的影响
2.1伤口愈合测定
将细胞接种到六孔板(5×105/孔)中，使其生长至汇合。接种24小时后，用移液器吸头在孔中心化线剥落细胞。用PBS冲洗细胞后加入RPMI 1640培养基孵育，培养基中加或不加nano-HAP(浓度分别为50、100、200、400和800μg/ml)。0和24小时后在显微镜下获取图像，测量细胞迁移到划痕区的距离。如下公式计算细胞迁移率：迁移率(％)＝(原划痕宽度–现划痕宽度)/原划痕宽度×100％。实验重复3次取其平均值。
2.2细胞迁移和侵袭分析
细胞迁移测定：将3×104个细胞接种在含有添加或不添加nano-HAP(50、100、200、400和800μg/ml)的无血清RPMI 1640的transwell(Millipore，MCFP24H48)的上室中，Transwell下室包含添加10％FBS的RPMI 1640。孵育24小时后，将transwell室使用结晶紫染色。
细胞侵袭测定：transwell上室预先涂上Matrigel(BD，356324)，并在37℃下孵育2小时，以使基质胶层聚合。所有其他步骤与细胞迁移测定相同。成功迁移/侵入transwell下表面的细胞被固定，结晶紫染色后在光学显微镜下计数。
2.3结果
伤口愈合实验分析表明，nano-HAP处理后OS-732细胞可显著降低OS-732细胞的水平迁移(图9)。800μg/ml的nano-HAP剂量对细胞迁移的抑制作用最强。
细胞迁移实验结果显示，HAP处理可显著抑制OS-732细胞的垂直迁移(图10)。当nano-HAP浓度达到800μg/ml，只有少数细胞可以通过transwell孔板的膜。
细胞侵袭实验显示，所有浓度的nano-HAPs处理均可影响OS-732细胞的侵袭(图11)。
这些体外实验表明，nano-HAP处理可以以剂量依赖性方式显着抑制OS-732细胞的迁移和侵袭。
实施例3纳米羟基磷灰石(Nano-HAP)对动物模型的影响
1、动物模型
使用雌性BALB/c裸鼠(4-6周龄)进行体内肿瘤发生实验。动物实验获得了北京积水潭医院动物伦理委员会的批准，整个研究过程遵守国家实验动物护理和使用指南。将18只小鼠随机分为三组(每组6只小鼠)。第1组和第3组，将50万个OS-732细胞重悬于0.2ml带有Matrigel的无血清RPMI 1640，植入每只小鼠的腋窝。细胞植入后十二天，肿瘤体积约为100mm3。第1组老鼠瘤内注射20μl生理盐水，第3组老鼠每3天瘤内注射一次20μl nano-HAP(400μg/ml)。对于第2组，50万个OS-732细胞重悬于0.2ml含nano-HAP(400μg/ml)的无血清RPMI 1640中，与基质胶混合植入每只小鼠的腋窝。每3天监测一次肿瘤生长，测量宽度(W)和长度(L)，肿瘤体积使用公式：体积＝(W2×L)/2计算。第23天，小鼠眼眶后取血进行常规血液检查。之后将所有小鼠处死并收获肿瘤，肺，肝和肾。肿瘤拍照并称重，计算出肿瘤平均重量(*P<0.05)。
2、H&E染色，von Kossa染色和免疫组织化学
肿瘤和器官组织用10％中性福尔马林固定，石蜡包埋，切片厚度为5-10μm，在载玻片上进行组织学检查。使用苏木精和曙红(H&E)染色观察肿瘤生长状况和器官组织病变。
根据制造商(Solarbio)的操作说明利用von Kossa染色法分析体内纳米材料。
通过免疫组织化学分析MMP9水平。简言之，通过在10mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中加热切片10分钟实现抗原修复。根据产品说明书使用抗MMP9(1：100)一抗。然后切片进行化学发光染色，并用苏木精复染。利用全切片扫描仪(NanoZoomer-SQ，C13140-01)使染色后切片成像。
3、结果
3.1nano-HAP对肿瘤生长的影响
对于第1组和第3组，将OS-732细胞与基质胶混合植入小鼠体内，之后每3天小鼠瘤内注射生理盐水(第1组)或400μg/mlnano-HAP(第3组)一次。对于第2组，将OS-732细胞重悬于nano-HAP(400μg/ml)，植入小鼠体内。23天后，所有小鼠均存活至实验终点，除肿瘤生长外无明显差异。如图12-13所示，第1组和第3组中所有小鼠的肿瘤生长，而第2组中只有5只小鼠肿瘤生长。在实验过程中，与第1组相比，第2组和第3组小鼠的肿瘤生长明显减弱。在实验最后，第1、2和3组的平均肿瘤大小分别为2243.38mm3、551.216mm3和分别为1289.76mm3(图14)。第2组和第3组的肿瘤重量分别比第1组小1倍和0.6倍(图15)。有趣的是，共注射nano-HAP和OS-732细胞对肿瘤生长抑制作用比小鼠在肿瘤形成后接受了nano-HAP处理的第3组观察到的更大(图14)。这一发现表明，nano-HAP处理除了抑制现有肿瘤的生长之外还可以抑制肿瘤复发。
3.2组织学分析
H&E染色结果显示，第1组和第3组的大细胞核肿瘤细胞在血管丰富的环境中生长良好(黄色箭头)，相反，第2组的肿瘤细胞核较小且血管形成较差(图16)。
IHC分析显示源自第2组的肿瘤细胞与第1组和3组的相比，金属基质蛋白酶9(MMP-9)减少(图16)。
Von Kossa染色结果显示，两组肿瘤中均存在nano-HAP残留(图16)。
为了确定实验期间肿瘤是否发生转移，在实验结束时收集了小鼠肺，肝和肾组织。分析3个实验组的肺，肝和肾组织的组织形态学未发现肿瘤转移至肺，肝和肾组织(图17)。
另外，对异种移植小鼠进行常规血液检查(图18)。血液分析结果显示，除了第2组和第3组的白细胞数量(WBC)减少之外，大多数指标在3组之间的差异很小，表明nano-HAP处理未诱导炎症，并表现出良好的血液相容性。
综上所述，结果表明nano-HAP处理可以有效抑制OS肿瘤生长和体内发展，且研究表明nano-HAP处理也能减少肿瘤的复发可能性。

Claims (10)

1.一种羟基磷灰石衍生物，其特征在于，所述羟基磷灰石衍生物是纳米羟基磷灰石。
2.根据权利要求1所述的羟基磷灰石衍生物，其特征在于，所述羟基磷灰石衍生物是高压灭菌后的纳米羟基磷灰石。
3.根据权利要求2所述的羟基磷灰石衍生物，其特征在于，高压灭菌后的纳米羟基磷灰石为棒状，长度为30nm，直径为10nm。
4.权利要求1-3中任一项所述的羟基磷灰石衍生物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)硝酸钙溶液和磷酸钠十二水合物溶液混合搅拌，Ca：P摩尔比为1.67：1；
(2)洗涤沉淀物以去除多余的硝酸钠；
(3)让沉淀物沉降并除去过量上清液以获得HAP凝胶；
(4)在高压灭菌器中，对HAP沉淀进行高压灭菌。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，硝酸钙溶液和磷酸钠十二水合物溶液混合搅拌后，室温放置24小时。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)的具体条件是：121℃下对HAP沉淀进行高压灭菌15分钟。
7.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的有效成分是权利要求1-3中任一项所述的羟基磷灰石衍生物。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
9.一种用于抑制肿瘤的药盒，包括：容器，该容器内含有有效量的权利要求1-3中任一项所述的羟基磷灰石衍生物，以及药学上可接受的载体。
10.一种应用，所述应用包括以下任一项所述的应用：
(1)权利要求1-3中任一项所述的羟基磷灰石衍生物在制备抑制骨肉瘤细胞增殖的药物中的应用；
(2)权利要求1-3中任一项所述的羟基磷灰石衍生物在制备抑制骨肉瘤细胞迁移的药物中的应用；
(3)权利要求1-3中任一项所述的羟基磷灰石衍生物在制备抑制骨肉瘤细胞侵袭的药物中的应用；
(4)权利要求1-3中任一项所述的羟基磷灰石衍生物在制备抑制骨肉瘤转移的药物中的应用；
(5)权利要求1-3中任一项所述的羟基磷灰石衍生物在制备治疗骨肉瘤的药物中的应用；
(6)权利要求1-3中任一项所述的羟基磷灰石衍生物在制备预防或抑制骨肉瘤复发的药物中的应用。
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