CN116211827B

CN116211827B - 一种特立帕肽固体脂质纳米粒及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN116211827B
Application number: CN202310281722.8A
Authority: CN
Inventors: 袁弘; 陈思敏; 胡富强; 孟廷廷
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2023-03-17
Filing date: 2023-03-17
Publication date: 2024-04-05
Anticipated expiration: 2043-03-17
Also published as: CN116211827A

Abstract

本发明公开了一种特立帕肽固体脂质纳米粒及其制备方法和应用，属于药物制剂领域，所述特立帕肽固体脂质纳米粒包括特立帕肽和包被特立帕肽的脂质材料；由特立帕肽、至少一种第一种脂质材料和至少一种第二种脂质材料通过溶剂扩散法制成；所述第一种脂质材料为脂肪酸、脂肪醇或脂肪酸甘油酯；所述第二种脂质材料为阴离子脂质。本发明利用固体脂质纳米粒包载特立帕肽，保护特立帕肽免受胃肠道环境破坏，增加药物的吸收，实现特立帕肽的口服递送，发挥治疗骨质疏松的作用，相较于传统皮下注射，口服特立帕肽固体脂质纳米粒具有更高的依从性，为广大骨质疏松症患者提供便利。

Description

一种特立帕肽固体脂质纳米粒及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种特立帕肽固体脂质纳米粒及其制备方法和应用。

背景技术

骨质疏松症是一种全身性骨骼疾病，其特点是骨量减少、微结构退化，导致骨脆性和骨折的风险增加。据报道，截止到2020年，全球罹患骨质疏松症的患者超过2亿，平均3秒发生一例骨质疏松性骨折案例。骨质疏松症会降低患者的生活质量，造成多种并发症的发生，增加患者的死亡率和医疗保健的费用，给社会和经济带来巨大的负担。骨质疏松症已经成为世界的主要公共卫生问题之一，其防治亟待解决。

目前治疗骨质疏松症的药物主要为：(1)钙剂和维生素D；(2)骨吸收抑制剂，如雌激素、选择性雌激素受体调节剂、降钙素、双磷酸盐和RANKL抑制剂等；(3)骨形成促进剂，如特立帕肽、阿巴洛肽、骨硬化蛋白抗体和组织蛋白酶抑制剂等。其中特立帕肽是人甲状旁腺激素N端1-34个氨基酸片段，是FDA第一个批准用于治疗骨质疏松的合成代谢药物，特立帕肽可刺激成骨细胞分化、抑制成骨细胞凋亡，从而促进骨形成，改善骨量。目前，特立帕肽需要每天一次在大腿或腹部皮下注射给药，给药时间长达2年，给患者造成不便和痛苦，严重影响患者的身心健康，迫切需要一种更便捷、无创的给药方式。

公开号为CN10611030A的中国专利文献公开了一种特立帕肽鼻腔给药脂质体制剂，由特立帕肽0.01～0.5g、磷脂0.1～1.5g、胆固醇0.015～0.6g、DSPE-PEG2000 0.015～0.2g、脂质体膜调节剂0.012～0.5g、稳定剂0.02～0.3g通过超临界溶液快速膨胀法制成。虽然鼻腔给药的生物利用度更高，但鼻纤毛的清除作用、生理病理状态等对药效会产生很大影响。

公开号为CN114599388A的中国专利文献公开了一种包含特立帕肽的口服药物组合物，该组合物包含由特立帕肽、脱氧胆酸、N^α-脱氧胆酰基-L-赖氨酰甲基酯(脱氧胆酸衍生物)和D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯组成的离子键复合物，该口服药物组合物能够提高肠道粘膜渗透率和生物利用度，但需要多种药物的联用，使用脱氧胆酸和脱氧胆酸衍生物作为吸收促进剂。

固体脂质纳米粒是以天然或合成的高熔点脂质为载体材料制成的纳米粒，药物被包裹或镶嵌在脂质内。固体脂质纳米粒可保护多肽药物免受胃肠道恶劣环境的破坏，尤其是肽酶和蛋白酶的降解。形成固体脂质纳米粒的脂质材料无毒、可生物降解，具有良好的生物相容性，并且固体脂质纳米粒易于大规模生产和灭菌。以固体脂质纳米粒为载体实现特立帕肽的口服给药是一种可选的策略。

发明内容

本发明提供了一种特立帕肽固体脂质纳米粒，利用固体脂质纳米粒包载特立帕肽，能够保护特立帕肽免受胃肠道环境破坏，增加药物的吸收，实现特立帕肽的口服递送，发挥治疗骨质疏松的作用。

具体采用的技术方案如下：

一种特立帕肽固体脂质纳米粒，所述特立帕肽固体脂质纳米粒包括特立帕肽和包被特立帕肽的脂质材料；由特立帕肽、至少一种第一种脂质材料和至少一种第二种脂质材料通过溶剂扩散法制成；

所述第一种脂质材料为脂肪酸、脂肪醇或脂肪酸甘油酯，包括但不限于单硬脂酸甘油酯、双硬脂酸甘油酯、山嵛酸甘油酯、十八醇、硬脂酸或油酸等；

所述第二种脂质材料为阴离子脂质，包括但不限于为二棕榈酰磷脂酸(DPPA)、二硬脂酰磷脂酸(DSPA)、二肉豆蔻磷脂酰甘油(DMPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、1,2-棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)或卵磷脂等。

特立帕肽是由34个氨基酸组成的多肽，亲水性极强，而脂质材料具有很强的亲脂性。基于相似相容的原理，单独使用任何一种脂质都无法制备出载特立帕肽的固体脂质纳米粒，也无法实现特立帕肽的口服给药。本发明使用阴离子脂质与特立帕肽复合，增加特立帕肽的亲脂性，便于第一种脂质材料的包载，有助于提高特立帕肽固体脂质纳米粒的包封率和载药量。以第一种脂质材料制备的固体脂质纳米粒具有良好的口服吸收特性，可保护特立帕肽在胃肠道中的稳定性，促进特立帕肽口服吸收。

优选的，特立帕肽、第一种脂质材料和第二种脂质材料的质量比为1:5-18:1-9。特立帕肽与第一种脂质材料的质量比在1:5-18的范围内制备的特立帕肽固体脂质纳米粒的粒径、电位相对适宜，且特立帕肽固体脂质纳米粒的稳定性良好，特立帕肽与第二种脂质材料的质量比在1:1-9的范围内时，能够较好的形成药脂复合物，控制特立帕肽固体脂质纳米粒的包封率在6％以上。

优选的，所述特立帕肽固体脂质纳米粒的直径为60-500nm。

本发明还提供了所述特立帕肽固体脂质纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

(1)将特立帕肽与第二种脂质材料先制成药脂复合物，再将药脂复合物分散至含有第一种脂质材料的有机溶剂中，混合均匀后得有机相；以水为水相；

(2)将有机相注入水相搅拌扩散，得到所述特立帕肽固体脂质纳米粒。

固体脂质纳米粒的主要缺点之一是对亲水性药物的载药能力有限。特立帕肽由34个氨基酸组成，分子量大，亲水性极强，固体脂质纳米粒较难载药。本发明方法将特立帕肽与阴离子脂质复合后增加了特立帕肽的亲脂性，进而制备了载特立帕肽的固体脂质纳米粒。

优选的，所述药脂复合物的制备方法为：将特立帕肽水溶液与第二种脂质材料的有机溶剂溶液混合，除去溶剂制备得到所述药脂复合物。

特立帕肽固体脂质纳米粒以及药脂复合物的制备过程中，所述有机溶剂包括但不限于甲醇、乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷或二甲基亚砜。

本发明还提供了所述特立帕肽固体脂质纳米粒在制备治疗骨质疏松症的药物中的应用。

优选的，所述特立帕肽固体脂质纳米粒经口递送。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明利用固体脂质纳米粒包载特立帕肽，保护特立帕肽免受胃肠道环境破坏，增加药物的吸收，实现特立帕肽的口服递送，发挥治疗骨质疏松的作用；该特立帕肽固体脂质纳米粒能够显著改善骨质疏松小鼠的骨量，几乎实现与特立帕肽皮下注射一致的药效；特立帕肽固体脂质纳米粒为特立帕肽提供了一种非注射给药方式，相较于传统皮下注射，口服特立帕肽固体脂质纳米粒具有更高的依从性，为广大骨质疏松症患者提供便利。

(2)本发明方法为固体脂质纳米粒载亲水性药物提供了一种新思路，较薄膜-超声法、乳化挥发-低温固化法、微乳法等常见固体脂质纳米粒制备方法较为便捷，易于实施。

(3)特立帕肽的结构在纳米粒制备过程中保持稳定，固体脂质纳米粒的高粘附性和肠道渗透性可促进特立帕肽的口服吸收、提高生物利用度，解决特立帕肽口服无效的问题。

附图说明

图1为特立帕肽固体脂质纳米粒的体外释放曲线图，其中A为处方3得到的特立帕肽固体脂质纳米粒，B为处方4得到的特立帕肽固体脂质纳米粒。

图2为特立帕肽固体脂质纳米粒和特立帕肽的圆二色光谱图。

图3为不同浓度特立帕肽和特立帕肽固体脂质纳米粒诱导大鼠原代成骨细胞分化7d后细胞中的碱性磷酸酶(ALP)活性。

图4为不同浓度特立帕肽和特立帕肽固体脂质纳米粒诱导大鼠原代成骨细胞分化矿化14d后细胞中结节图。

图5为不同浓度特立帕肽和特立帕肽固体脂质纳米粒诱导大鼠原代成骨细胞分化矿化14d后细胞中钙化结节的定量测定结果。

图6为小鼠股骨远端冠状面和矢状面的2D和3D的micro-CT图像。

图7中的A-E分别为小鼠股骨远端ROI的骨密度、骨小梁分离度、骨小梁厚度、骨体积百分比、骨表面积骨体积比值的micro-CT分析，ROI：骨髓腔中央距离骨垢线0.8mm处直径为0.8mm高为0.8mm的圆柱体。

图8为小鼠股骨碱性磷酸酶(ALP)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色图。

图中，*表示5％水平上差异显著，**表示1％水平上差异显著，***表示0.1％水平上差异显著，ns表示差异不显著。

具体实施方式

下面结合实施例与附图，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的操作方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1特立帕肽固体脂质纳米粒的制备与处方组成

精密称取处方量的特立帕肽溶于5mL去离子水，制备特立帕肽溶液。精密称取处方量的阴离子脂质(第二种脂质材料)，溶于2.5mL处方中的有机溶剂，制备阴离子脂质的有机溶剂溶液；剧烈混合特立帕肽溶液与阴离子脂质的有机溶剂溶液，除去溶剂制成药脂复合物。精密称取第一种脂质，溶于5mL处方中的有机溶剂，制备第一种脂质的有机溶液；药脂复合物溶于第一种脂质的有机溶液，加热溶解，搅拌下将有机相注入25mL去离子水(水相)中，即得特立帕肽固体脂质纳米粒分散液。

表1特立帕肽固体脂质纳米粒的处方组成

实施例2特立帕肽固体脂质纳米粒的理化性质

(1)特立帕肽固体脂质纳米粒的粒径、电位、载药量和包封率测定

按实施例1中各处方所制备的固体脂质纳米粒，去离子水稀释纳米粒至适宜浓度，采用动态光散射法测定纳米粒的粒径，电泳光散射法测定纳米粒的电位。

采用高效液相色谱法测定实施例1中按各处方制备的固体脂质纳米粒中特立帕肽的含量。特立帕肽的色谱条件如下，色谱柱：C18柱；流动相：流动相A(10％乙腈+90％0.2M硫酸钠):流动相B(50％乙腈+50％0.2M硫酸钠)＝63:37(v/v)；流速：1mL/min；柱温40℃；进样体积20μL；检测波长：214nm。

取适量特立帕肽固体脂质纳米粒，加入乙腈和水的混合溶剂溶解稀释，按上述特立帕肽的色谱条件测定特立帕肽的量M，分别根据公式(Ⅰ)、公式(Ⅱ)计算特立帕肽固体脂质纳米粒的包封率和载药量，公式如下：

式中，M为特立帕肽的质量，M_总投药量为处方中特立帕肽的投药量，M_{阴离子脂质}为处方中第二种脂质材料(阴离子脂质)的投药量，M_脂质材料为处方中第一种脂质材料的投药量。

经测定与计算，按实施例1中各处方制备的特立帕肽固体脂质纳米粒的粒径、电位、载药量和包封率结果如表2所示。

表2按实施例1中各处方制备的特立帕肽固体脂质纳米粒的理化性质

(2)特立帕肽固体脂质纳米粒的体外释放

以含有1.5％甘氨酸和0.5％吐温-80的20mL磷酸盐缓冲液为释放介质，加入适量按处方3、处方4制备的特立帕肽固体脂质纳米粒溶液，100rpm、37℃恒温震荡下，经时取样。采用高效液相色谱法测定样品中特立帕肽的含量。

按处方3、处方4制备的特立帕肽固体脂质纳米粒体外释放情况分别如图1中的A和B所示，特立帕肽固体脂质纳米粒在前1h均可观察到突释现象，1h后特立帕肽开始缓慢释放，在4-8h时释放完全，特立帕肽固体脂质纳米粒1h后释放增量分别为10.3％(处方3)，15.13％(处方4)。(3)特立帕肽固体脂质纳米粒中特立帕肽的稳定性

取按处方4制备的特立帕肽固体脂质纳米粒(TPTD-SLN)和同浓度的特立帕肽(TPTD)，分别分散、溶解在去离子水中，采用圆二色光谱仪在195-260nm波长范围进行圆二色测量，以验证特立帕肽固体脂质纳米粒中特立帕肽结构的稳定性。

圆二色信号结果如图2所示，特立帕肽固体脂质纳米粒中特立帕肽和游离特立帕肽的圆二色光谱形状相似，表现出典型的α-螺旋结构，表明特立帕肽固体脂质纳米粒中特立帕肽的结构在纳米粒制备过程中保持稳定。

实施例3

(1)特立帕肽固体脂质纳米粒对大鼠原代成骨细胞碱性磷酸酶活性影响

取生长状态良好的大鼠原代成骨细胞，以5×10⁴/孔的密度接种于6孔板中，在37℃孵箱中培养过夜，待细胞贴壁。吸弃原培养基，更换含β-磷酸甘油和L-抗坏血酸的α-MEM成骨诱导培养基，分别加入按处方4制备的特立帕肽固体脂质纳米粒(TPTD-SLN)和游离特立帕肽(TPTD)，控制特立帕肽浓度为10nmol/L和100nmol/L，间歇刺激培养，即给药4h后，换成成骨诱导培养基培养44h。以成骨诱导培养基为对照，每组设置3个复孔，37℃孵箱培养。培养7d后吸弃培养基，PBS洗涤，胰酶消化后加入培养基吹散细胞，收集细胞悬液，1000rpm，离心6min，收集细胞沉淀，加入1％ TritonX-100裂解细胞，15000rpm，离心10min，收集上清，按BCA试剂盒测定蛋白浓度，按碱性磷酸酶试剂盒测定ALP活性，比较各组成骨细胞内碱性磷酸酶活性。

实验结果如图3所示，与未给药的对照组相比，TPTD组和TPTD-SLN组均可显著提升大鼠原代成骨细胞中碱性磷酸酶(ALP)活性，且ALP活性随药物浓度的增加而增加，这表明TPTD在固体脂质纳米粒的制备过程中可保持良好的生物活性。当药物浓度相同时，TPTD-SLN诱导的大鼠原代成骨细胞ALP活性较游离TPTD弱，可能的原因是实验中采用间歇刺激给药4h，而TPTD-SLN在4h内TPTD没有完全释放。

(2)特立帕肽固体脂质纳米粒诱导大鼠原代成骨细胞分化矿化

取生长状态良好的大鼠原代成骨细胞，以5×10⁴/孔的密度接种于6孔板中，在37℃孵箱中培养过夜，待细胞贴壁。吸弃原培养基，更换含β-磷酸甘油和L-抗坏血酸的α-MEM成骨诱导培养基，分别加入按处方4制备的特立帕肽固体脂质纳米粒(TPTD-SLN)和游离特立帕肽(TPTD)，控制特立帕肽浓度为10nmol/L和100nmol/L，间歇刺激培养，即给药4h后，换成成骨诱导培养基培养44h。以成骨诱导培养基为对照，每组设置3个复孔，于37℃孵箱培养。细胞培养14d后，吸弃培养基，PBS洗涤，70％(v/v)乙醇固定1h，吸弃乙醇，PBS洗涤，每孔加入1mL茜素红S水溶液(1.5％，w/v，pH调至4.0-4.2)，染色15min，吸弃茜素红S溶液，PBS洗涤多次，光学显微镜下观察细胞中的钙化结节。每孔中加入1mL氯化十六烷基吡啶鎓(10％，w/v)，室温下放置30min，溶解沉积的茜素红S，用酶标仪，于波长570nm处测定吸光值，定性定量分析各组成骨细胞内钙沉积情况。

诱导14d大鼠原代成骨细胞的矿化结节如图4所示。未给药的对照组大鼠原代成骨细胞周围可见少量由抗坏血酸和β-磷酸甘油诱导的橙红色的钙化结节。TPTD组和TPTD-SLN组在大鼠原代成骨细胞周围均可观察到大量矿化结节。进一步采用氯化十六烷基吡啶鎓溶解茜素红S与钙形成的络合物，以定量的方式分析大鼠原代成骨细胞中钙化结节沉积情况。实验结果如图5所示，与未给药组相比，TPTD和TPTD-SLN均可显著提升大鼠原代成骨细胞钙化结节的量，且钙化结节量随药物浓度的增加而增加，这表明TPTD在固体脂质纳米粒的制备过程中可保持良好的生物活性。当药物浓度相同时，TPTD-SLN诱导大鼠原代成骨细胞分化矿化能力较TPTD弱，可能的原因是实验中采用间歇刺激给药4h，而TPTD-SLN在4h内TPTD没有完全释放，无法充分发挥TPTD诱导成骨细胞分化矿化，促进骨形成的药效。

实施例4

(1)小鼠骨质疏松模型的建立与动物实验给药分组

本实验采取手术摘除小鼠双侧卵巢(ovariectomy，OVX)构建雌性Balb/c小鼠骨质疏松症模型。使用1％的戊巴比妥钠，按20mg/kg的剂量腹腔注射麻醉小鼠，俯卧位固定小鼠四肢，切口区域碘酒消毒。背部肾区附近纵行切开一小口，剪开背部肌肉，沿肠系膜寻找卵巢，其外观呈现粉红色小颗粒状，大约3-4mm。结扎输卵管和相关血管后摘除卵巢，仔细缝合肌肉与皮肤，对侧重复上述操作。假手术(Sham)组仅暴露卵巢，缝合肌肉与皮肤，其余不做任何处理。

去势小鼠饲养4周后，随机分成5组，每组5只，加上假手术组，总共6组，分组及给药方案如下：假手术组(Sham)，给予等剂量的生理盐水；去势阴性对照组(OVX)，给予等剂量的生理盐水；口服空白固体脂质纳米粒组(SLN-Blank)，按空白固体脂质纳米粒40mg/kg/d灌胃给药；口服特立帕肽溶液组(TPTD-Oral)，考虑到口服吸收过程中胃肠道的化学、生物屏障，特立帕肽固体脂质纳米粒的载药量和释放效果等，按药物720μg/kg/d灌胃给药；口服按处方4制备的特立帕肽固体脂质纳米粒组(TPTD-SLN)，按纳米粒中药物720μg/kg/d灌胃给药；皮下注射特立帕肽组(TPTD-SC)，为保证药效良好，按药物20μg/kg/d皮下注射给药；连续给药8周。

(2)口服特立帕肽固体脂质纳米粒骨组织的micro-CT分析

给药结束后，脱颈处死小鼠，取出小鼠左右两侧股骨，剔除股骨上粘附的肌肉组织，置于4％多聚甲醛中固定。固定24h后，采用小动物活体断层扫描成像系统的微型计算断层扫描技术(micro-CT)对小鼠股骨远端进行扫描成像，并通过系统自带软件重建3D图像。通过软件分析股骨远端感兴趣区域(ROI)的相对骨密度(BMD)、骨小梁分离度(Tb.Sp)、骨小梁厚度(b.Th)、骨体积分数(BV/TV)、骨表面积骨体积比值(BS/BV)。通过2D和3D图像和ROI相关指标数据定性定量考察口服特立帕肽固体脂质纳米粒治疗骨质疏松症的作用。本实验选择的ROI为骨髓腔中央距离骨垢线0.8mm处直径为0.8mm高为0.8mm的圆柱体。

小鼠股骨远端2D和3D的micro-CT图如图6所示，结合冠状面和矢状面的2D、3D图，可观察到Sham组，股骨远端具有非常丰富的骨小梁结构。与Sham组相比，OVX组、口服空白固体脂质纳米粒组和口服TPTD组可观察到无骨小梁分布的空腔，骨量明显减少。口服TPTD组的骨量与OVX组相似，表明TPTD口服无效。与OVX组相比，口服特立帕肽固体脂质纳米粒组和皮下注射TPTD组可观察到更丰富的骨小梁结构，骨量丢失较少。此外，皮下注射TPTD组骨小梁丰富程度接近Sham组，口服特立帕肽固体脂质纳米粒组的骨小梁结构稍少于皮下注射TPTD组。

进一步采用micro-CT自带软件对ROI相关参数(BMD、BV/TV、BS/BV、Tb.Sp、Tb.Th)进行定量分析，实验结果如图7中的A-E所示。BMD和BV/TV是评价骨质疏松症的指标，骨质疏松时BMD和BV/TV减小。Sham组的相对BMD为1624.4g/cm³，OVX组的相对BMD为976.9g/cm³，口服空白固体脂质纳米粒组的相对BMD为907.6g/cm³，口服TPTD组的相对BMD为838.3g/cm³，口服特立帕肽固体脂质纳米粒组的相对BMD为1391.8g/cm³，皮下注射TPTD组的相对BMD为1431.0g/cm³。与Sham组相比，OVX组相对BMD下降了39.9％，表明本实验中骨质疏松模型的成功建立。口服TPTD组的相对BMD与OVX组接近，较Sham组下降了48.4％，定量层面说明TPTD口服无效。与OVX组相比，口服特立帕肽固体脂质纳米粒组和皮下注射TPTD组的相对BMD分别提高42.5％和46.5％，骨量分别为Sham组的85.7％和88.1％。骨体积分数BV/TV为骨组织体积与组织体积的比值，可直接反映骨量变化情况，BV/TV的变化趋势与BMD的变化趋势一致。与Sham组相比，OVX组、口服空白固体脂质纳米粒组和口服TPTD组的BV/TV下降显著，分别下降39.9％、40.0％和40.7％，口服特立帕肽固体脂质纳米粒组和皮下注射TPTD组的BV/TV较OVX组显著提升，分别提升47.1％和71.1％，分别为Sham组的88.4％和102.8％。

骨小梁分离度Tb.Sp和骨小梁厚度Tb.Th是评价骨小梁空间形态结构的主要指标，发生骨质疏松时骨小梁分离度增加，骨小梁厚度减少。与Sham组相比，OVX组、口服空白固体脂质纳米粒组和口服TPTD组的Tb.Sp增加，Tb.Th减小显著。与OVX组相比，口服特立帕肽固体脂质纳米粒组和皮下注射TPTD组的Tb.Sp显著减小，Tb.Th显著增加。

定量分析结果显示口服特立帕肽固体脂质纳米粒组和皮下注射TPTD组ROI的BMD、BS/BV、Tb.Sp和Tb.Th无显著性差异。上述定性、定量结果表明口服特立帕肽固体脂质纳米粒可实现特立帕肽的口服递送，显著提升骨质疏松小鼠的骨量，药效几乎与皮下注射特立帕肽一致。

(3)口服特立帕肽固体脂质纳米粒骨组织的ALP和TRAP染色

给药结束后，脱颈处死小鼠，取出小鼠股骨，剔除股骨上粘附的肌肉组织，置于4％多聚甲醛中固定24h，EDTA脱钙后，石蜡包埋，沿股骨冠状面切片(厚4-5μm)，分别做ALP染色和TRAP染色，光学显微镜下观察骨组织中成骨细胞和破骨细胞的活性，以考察皮下注射特立帕肽和口服特立帕肽固体脂质纳米粒对骨组织的合成代谢作用。

实验结果如图8所示，在ALP染色图中ALP被染成灰棕色，且多个成骨细胞聚集在一起形成骨基质，为后续骨矿化做准备。图片中的灰棕色的ALP数量越多、颜色越深，表明成骨细胞的数量越多、活性越好。在TRAP染色图中TRAP被染成浅红色，浅红色的TRAP数量越多、颜色越深，表明破骨细胞的数量越多、活性越好。与Sham组相比，OVX组、SLN-Blank组和TPTD-Oral组中红色的TRAP较多，灰棕色的ALP则较少，表明破骨细胞活性比成骨细胞强，骨组织处于骨量丢失状态。与Sham组相比，TPTD-SLN组和TPTD-SC组可见大量灰棕色的ALP，浅红色的TRAP则较少，表明成骨细胞活性比破骨细胞强，骨组织处于骨形成状态，这是因为特立帕肽可通过刺激成骨细胞分化、抑制破骨细胞活性的方式促进骨形成。此外，图8中可观察到TPTD-SLN组和TPTD-SC组有着相似的ALP活性和TRAP活性。上述实验结果表明，口服特立帕肽固体脂质纳米粒可通过提高成骨细胞的活性、促进骨形成，同时也表明了固体脂质纳米粒可成功实现特立帕肽的口服递送，并发挥药效。

以上所述实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种特立帕肽固体脂质纳米粒，其特征在于，所述特立帕肽固体脂质纳米粒包括特立帕肽和包被特立帕肽的脂质材料；由特立帕肽、至少一种第一种脂质材料和至少一种第二种脂质材料通过溶剂扩散法制成；

所述第一种脂质材料为脂肪酸、脂肪醇或脂肪酸甘油酯；

所述第二种脂质材料为阴离子脂质；所述阴离子脂质为二棕榈酰磷脂酸、二硬脂酰磷脂酸、二肉豆蔻磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、1,2-棕榈酰磷脂酰甘油或卵磷脂；

所述的特立帕肽固体脂质纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述特立帕肽固体脂质纳米粒，其特征在于，所述第一种脂质材料包括单硬脂酸甘油酯、双硬脂酸甘油酯、山嵛酸甘油酯、十八醇、硬脂酸或油酸。

3.根据权利要求1所述特立帕肽固体脂质纳米粒，其特征在于，特立帕肽、第一种脂质材料和第二种脂质材料的质量比为1:5-18:1-9。

4.根据权利要求1-3任一所述特立帕肽固体脂质纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述特立帕肽固体脂质纳米粒的制备方法，其特征在于，所述药脂复合物的制备方法为：将特立帕肽水溶液与第二种脂质材料的有机溶剂溶液混合，除去溶剂制备得到所述药脂复合物。

6.根据权利要求4所述特立帕肽固体脂质纳米粒的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂包括甲醇、乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷或二甲基亚砜。

7.根据权利要求1-3任一所述特立帕肽固体脂质纳米粒在制备治疗骨质疏松症的药物中的应用。

8.根据权利要求7所述特立帕肽固体脂质纳米粒在制备治疗骨质疏松症的药物中的应用，其特征在于，所述特立帕肽固体脂质纳米粒经口递送。