CN112813024A - 利用牙髓间充质干细胞获得人工脊髓的用途及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了利用牙髓间充质干细胞获得人工脊髓的用途及其制备方法，该制备方法由以下步骤组成：步骤1：采集因正畸原因拔除的健康乳牙，用I型胶原酶消化并接种于培养瓶中，洗涤弃掉未贴壁细胞，将贴壁细胞重悬后进行培养获得牙髓间充质干细胞，步骤2：利用α‑MEM培养基对牙髓间充质干细胞培养使其增殖，步骤3：选取第三代牙髓间充质干细胞，当细胞融合率为90％时，利用含有维生素C的α‑MEM培养基对牙髓间充质干细胞培养得到白色膜状结构，并通过体外塑性，最终获得具备三维结构的人工脊髓；本发明获得的人工脊髓可抑制瘢痕形成和炎症以及促进轴突再生；在完全性脊髓损伤大鼠中，Spinor治疗引起了显着的运动改善，感觉恢复和更快的尿反射恢复。

Description

利用牙髓间充质干细胞获得人工脊髓的用途及其制备方法
技术领域
本发明属于人工脊髓的制备方法领域，尤其涉及利用牙髓间充质干细胞获得人工脊髓的用途及其制备方法。
背景技术
脊髓损伤(SCI)是一种复杂的病理生理学级联反应，特别涉及脊髓损伤导致的神经功能缺损，每年全世界的发病率超过千分之一。由于脊柱机械性损伤，全世界每年诊断出超过70万例新的SCI病例。在过去的十年里，外科技术的发展和普及导致SCI死亡人数下降了35％以上。但是，由于成人中枢神经系统神经元的先天再生能力差，手术无法逆转这种永久性残疾。即使存活，SCI幸存者，尤其是严重甚至完全SCI的患者，也要承受极端的身体折磨和对患者及其家庭的沉重精神负担。
为了摆脱这种困境，促进轴突生长和脊髓功能恢复，出现了两种通用策略：1)调节控制轴突再生的外在机制，如去除细胞外抑制分子，补充神经营养因子和嫁接容许基质；2)将干细胞移植到损伤部位以替换丢失或受损的神经元和少突胶质细胞，并操纵微环境以促进轴突再生。在过去的30年里，第一种策略在受损脊髓内的神经再生方面进展有限。至于第二种策略是干细胞移植治疗脊髓损伤，包括替换受损神经元，补充营养元素，抑制囊肿和瘢痕形成以及促进轴突延伸等多种治疗机制。在这种情况下，SCI恢复取得了一些成功，特别是在慢性SCI治疗方面取得了革命性的成功，然而在严重甚至完全的SCI中，损伤轴突的强劲再生和实质性的功能恢复仍然面临重大挑战。
实际上，只有少数移植的干细胞非常幸运地存活下来，并且其中有一小部分在受损的脊髓中分化成神经细胞。近年来，越来越多的证据表明干细胞的治疗效果和生物学活性归因于其细胞外分泌，包括但不限于趋化因子，细胞因子和细胞外微泡。其中，外泌体(exosome)是一类源于核内体的天然膜囊泡(50-150nm)，已被认为是影响治疗效果的最重要因素。干细胞来源的外泌体携带大量蛋白质、脂质和遗传物质，促进再生和抑制炎症。越来越多的证据表明，间充质干细胞(MSC)衍生的外泌体可以逆转多种退行性疾病，包括SCI、自闭症、中风、帕金森氏病、阿尔茨海默病等。然而，外泌体提取过程耗时耗力，因此，没有一种外泌体疗法被批准用于临床应用。
发明内容
本发明的目的是提供利用牙髓间充质干细胞获得人工脊髓的用途及其制备方法，以解决用于治疗脊髓损伤的外泌体提取过程耗时耗力的问题。
本发明采用以下技术方案：利用牙髓间充质干细胞获得人工脊髓的制备方法，由以下步骤组成：
步骤1：采集因正畸原因拔除的健康乳牙，用I型胶原酶消化并接种于培养瓶中，洗涤弃掉未贴壁细胞，将贴壁细胞重悬后进行培养获得牙髓间充质干细胞；
步骤2：利用α-MEM培养基对牙髓间充质干细胞培养使其增殖，
步骤3：选取第三代牙髓间充质干细胞，当细胞融合率为90％时，利用含有维生素C的α-MEM培养基对牙髓间充质干细胞培养得到白色膜状结构，并通过体外塑性，最终获得具备三维结构的人工脊髓。
进一步地，其中，步骤1和步骤2之间需对获得牙髓间充质干细胞进行细胞鉴定，其鉴定方法为：
将牙髓间充质干细胞与PE或FITC偶联的抗人CD73、CD146、CD105、CD11b、CD34或CD45的单克隆抗体孵育，
使用流式细胞仪对牙髓间充质干细胞进行表面标记的鉴定，
利用成骨诱导培养基对牙髓间充质干细胞进行培养，
对牙髓间充质干细胞进行固定和染色，
利用成脂诱导培养基对牙髓间充质干细胞进行培育，
利用油红O溶液染色检测细胞内脂质积累，对其进行鉴定。
进一步地，其中，所述成骨诱导培养基的配方为：100nmol/L地塞米松、50mg/mL抗坏血酸和1mmol/Lβ-甘油磷酸盐。
进一步地，其中，所述成脂诱导培养基的配方为：0.5mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，0.5mmol/L氢化可的松，60mmol/L吲哚美辛和10μg/mL胰岛素。
进一步地，其中步骤3中的含有维生素C的α-MEM培养基中维生素C的含量为60-240μg/mL。
进一步地，其中步骤3中的含有维生素C的α-MEM培养基中维生素C的含量为120μg/mL。
一种应用于脊髓损伤治疗方法的产品，产品包括来源于牙髓间充质干细胞，而所述治疗方法包括：至少将所述牙髓间充质干细胞制备得到的人工脊髓移植到同种动物的脊髓损伤部位，形成连续脊髓。
牙髓间充质干细胞作为脊髓损伤动物模型治疗产品的用途，牙髓间充质干细胞来源于与动物模型同种的动物，用途包括：至少将所述牙髓间充质干细胞制备得到的人工脊髓移植到动物模型的脊髓损伤部位，形成连续脊髓。
进一步地，用途还包括：人工脊髓用于通过抑制瘢痕形成和炎症以及促进轴突再生形成连续脊髓。
本发明的有益效果是：本发明获得的人工脊髓Spinor作为脊髓填充物和外泌体母体，与MSC相比，Spinor具有与脊髓组织相似的几何结构，释放的外泌体数量增加，外泌体分泌优化，可抑制瘢痕形成和炎症以及促进轴突再生；在完全性脊髓损伤大鼠中，Spinor治疗引起了显着的运动改善，感觉恢复和更快的尿反射恢复，同时保持了高度有利的生物安全性；本发明不仅提供证据表明Spinor是脊髓损伤治疗临床应用的潜在可行治疗范例，而且表明适当的MSC组装在提供新兴的外泌体衍生疗法方面有巨大的希望，从而彻底改变了治疗中枢神经系统损伤的传统方法。
附图说明
图1为本发明Spinor与脊髓组织具有相似的几何构造和地形特征；图1A)Spinor构造示意图；图1B)MTT法分析不同浓度抗坏血酸(AA)作用下MSC的增殖曲线；图1C)Col I和Col III对不同浓度AA的表达谱；图1D)100μg/ml AA孵育后不同培养时间Col I和Col III的表达谱，其中图1C和图1D的所有结果均通过Western blotting检测，并进行三次独立重复试验，β-actin为内参；数据图1B、图1C、图1D以均数±标准差表示；图1E)Spinor的HE染色的代表性图像；图1F)Spinor和脊髓切片的扫描电子显微镜(SEM)；图1G)原子力显微镜(AFM)图像；
图2为本发明中Spinor与MSC来源的外泌体相比，Spinor来源的外泌体在数量和质量上都具有最佳的性能，且促进神经再生的能力更强；图2A)用共聚焦激光扫描显微镜拍摄MSC和Spinor的外泌体图像，外泌体用(GFP)融合CD63标记，细胞骨架和细胞核分别染色为红色(FAK)和蓝色(DAPI)，荧光强度结果显示为表面重塑的3D视图，以角度视图(400×)表示；图2B)MSC和Spinor上清液在48小时内累计释放外泌体数量；图2C)火山图，突出MSC来源的外泌体和Spinor来源的外泌体之间显著改变的蛋白质；图2D)细胞中差异蛋白的功能分布；图2(E-H)基因(蛋白)集富集分析(GSEA)结果，用于细胞组装(图2E)、神经再生(图2F)、星形胶质细胞增殖(图2G)和炎症(图2H)；图2I)经培养基、MSC-Exo或Spinor-Exo处理的脊髓神经元的代表性免疫荧光染色图像，红色为神经元，蓝色为细胞核，比例尺：40μm，分别测量并比较各组分支点(图2J)、神经轴突(图2K)、最大分支水平(图2L)和平均分支长度(图2M)，数据以均数±标准差表示，每组n＝3。p值采用方差分析计算。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；
图3为本发明中Spinor比MSC更能促进神经元再生，抑制星形胶质细胞增殖的结果图；图3A)具有代表性的外泌体(GFP融合CD63标记，绿色)生物分布和神经元(NF，红色)在宿主脊髓组织中的荧光显微图；图3B)图3A中外泌体数量的量化；图3C)图3A中神经元数量的量化，其中，图3B)和图3C)数据以均数±标准差表示，每组n＝6，p值采用t检验计算，*p<0.05，***p<0.001；图3D)宿主脊髓组织中具有代表性的外泌体(绿色)和星形胶质细胞(GFAP，红色)荧光显微照片；图3E)图3D中星形胶质细胞数量量化；图3F)图3D中病变区域放大图，数据以均数±标准差表示，每组n＝6，p值采用t检验计算，p<0.05，***p<0.001；
图4为本发明在完全损伤大鼠的运动和感觉功能恢复中，Spinor比MSC更活跃；图4A)PBS(Ctrl)、MSC或Spinor治疗下，健康大鼠和完全SCI大鼠每周BBB评分；图4B)在假手术健康大鼠(黑色)、PBS处理(Ctrl)(红色)、MSC处理(绿色)和Spinor处理(蓝色)的SCI大鼠中测量代表性定量运动诱发电位；图4C)治疗后第8周，各组大鼠代表性爬行照片；图4D)在假手术健康大鼠(黑色)和PBS处理(Ctrl)(红色)、MSC处理(绿色)和Spinor处理(蓝色)的SCI大鼠中测量代表性定量感觉诱发电位。E).治疗0、4、8周后大鼠感觉功能恢复百分比；图4F)膀胱功能反映的是从治疗开始到排尿反射恢复的时间(天)；图4G)治疗后第8周，各组大鼠膀胱代表性照片及HE染色，数据以均数±标准差表示，每组n＝6，p值采用方差分析(ANOVA)计算，*p<0.05，***p<0.001；
图5为本发明中运动和感觉功能恢复的组织学和细胞机制；图5A)将Micro-PET图像与同一时段记录的CT图像融合，并绘制对应于每个椎骨的3D感兴趣区(ROIs)；图5B)为了量化糖酵解，[18F]FDG信号的相对强度被量化并归一化，即每克组织注射的脊椎ROIs剂量占大鼠全身放射性总量的百分比之和(不包括尾巴中的放射性总量)；图5C)Ctrl组(PBS)、MSC组和Spinor组神经丝(NFS，绿色)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP，红色)染色的代表性图像，全景图中的白色虚线表示头部、病变和尾部区域；图5D)神经元和星形胶质细胞的组间定量比较，每组n＝6，数据以每组三次实验的平均值±标准差表示，p值采用方差分析计算，*p<0.05，***p<0.001；
图6为本发明中Spinor皮下移植后的毒性评价；图6A)HE染色结果；图6B)血清炎症因子检测；图6C)血细胞计数；
图7为本发明中Spinor降解及安全性评测；图7A)Spinor可以在体内降解和吸收；图7B)主要脏器HE染色结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明公开了利用牙髓间充质干细胞获得人工脊髓的制备方法，由以下步骤组成：
步骤1：采集因正畸原因拔除的健康乳牙，用I型胶原酶消化并接种于培养瓶中，洗涤弃掉未贴壁细胞，将贴壁细胞重悬后进行培养获得牙髓间充质干细胞。
步骤2：利用α-MEM培养基对牙髓间充质干细胞培养使其增殖。
步骤3：用胰蛋白酶对牙髓间充质干细胞进行消化，选取第三代牙髓间充质干细胞，当细胞融合率为90％时，利用含有维生素C的α-MEM培养基对牙髓间充质干细胞培养得到白色膜状结构，并通过体外塑性，最终获得具备三维结构的白色人工脊髓膜状结构，本发明中简称具备三维结构的白色人工脊髓膜状结构为Spinor。其中，含有维生素C的α-MEM培养基中维生素C的含量为60-240μg/mL，优选地为120μg/mL。
其中，步骤1和步骤2之间需对获得牙髓间充质干细胞进行细胞鉴定，其鉴定方法为：
将牙髓间充质干细胞与PE或FITC偶联的抗人CD73、CD146、CD105、CD11b、CD34或CD45的单克隆抗体孵育，
使用流式细胞仪对牙髓间充质干细胞进行表面标记的鉴定，
利用成骨诱导培养基对牙髓间充质干细胞进行培养，
对牙髓间充质干细胞进行固定和染色，
利用成脂诱导培养基对牙髓间充质干细胞进行培育，
利用油红O溶液染色检测细胞内脂质积累，对其进行鉴定。
其中，成骨诱导培养基的配方为：100nmol/L地塞米松、50mg/mL抗坏血酸和1mmol/Lβ-甘油磷酸盐；
成脂诱导培养基的配方为：0.5mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，0.5mmol/L氢化可的松，60mmol/L吲哚美辛和10μg/mL胰岛素。
本发明还公开了一种应用于脊髓损伤治疗方法的产品，产品包括来源于牙髓间充质干细胞，而所述治疗方法包括：至少将所述牙髓间充质干细胞制备得到的人工脊髓移植到同种动物的脊髓损伤部位，形成连续脊髓。
本发明还公开了牙髓间充质干细胞作为脊髓损伤动物模型治疗产品的用途，牙髓间充质干细胞来源于与动物模型同种的动物，用途包括：至少将所述牙髓间充质干细胞制备得到的人工脊髓移植到动物模型的脊髓损伤部位，形成连续脊髓，用途还包括：人工脊髓用于通过抑制瘢痕形成和炎症以及促进轴突再生形成连续脊髓。
实施例1
1.细胞培养
对人牙髓干细胞(DPSCs)进行分离和培养。采集因正畸原因拔除的健康乳牙(某口腔医院)作为牙齿样本。用I型胶原酶(3mg/mL；Sigma，USA)在37℃下消化1小时。将单细胞悬液以1×105个细胞/cm2的密度接种于一个75cm2的培养瓶中。24h后，洗涤弃掉未贴壁细胞。贴壁细胞重悬后培养于含有10％胎牛血清(Hyclone,Logan,Utah,USA)、2mmol/L谷氨酰胺(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)、100U/mL青霉素(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)和100mg/mL链霉素(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)的α-MEM(Gibco，USA)培养基2周。
2.细胞鉴定
为了鉴定牙髓间充质干细胞的细胞表面标记物，将3×105个细胞与PE或FITC偶联的抗人CD73、CD146、CD105、CD11b、CD34和CD45(eBioscience,CA)的单克隆抗体在4℃下孵育30分钟。然后，使用美国Beckman Coulter公司的CytoFLEX流式细胞仪对细胞进行分类。
牙髓间充质干细胞于成骨诱导培养基(100nmol/L地塞米松、50mg/mL抗坏血酸和1mmol/Lβ-甘油磷酸盐)(Sigma)中培养28天。然后，用60％异丙醇固定，1％茜素红(Sigma)染色。
牙髓间充质干细胞于成脂诱导培养基(0.5mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，0.5mmol/L氢化可的松，60mmol/L吲哚美辛和10μg/mL胰岛素；sigma)中培育21天。油红O溶液染色检测细胞内脂质积累。
3.Spinor构建
为了优化构建spinor的诱导培养基，将牙髓间充质干细胞培养在添加不同剂量维生素C(Sigma，0，15，30，60，120，240μg/mL)的α-MEM培养基中。四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞增殖。根据MTT结果，牙髓间充质干细胞用含120μg/mL维生素C的α-MEM培养液培养0、1、3、5、7天，Western Blot结果表明，120μg/mL维生素C能够显著促进细胞外基质I型以及III型胶原的分泌，为后期spinor的构建及塑性奠定了基础。传统细胞膜片技术(cellsheet technology,CST)，CST主要应用温度反应培养皿收获细胞，收获的细胞为单层细胞。本方法与传统方法相比，不需要特殊的温度反应培养皿，且收获的细胞为多层叠加，细胞外基质的分泌量也远高于传统细胞膜片。
为了体外构建Spinor，第三代牙髓间充质干细胞用胰蛋白酶消化(Sigma-Aldrich)，将1×106个细胞接种到5cm培养皿(Corning)中，在培养基中培养24h。当细胞融合率约90％时，将培养基换为含有120μg/mL维生素C的培养基，每2天换液一次。培养5天后，可观察到一定厚度的白色膜。然后，膜开始卷曲，进一步形成包含脊髓样三维结构的Spinor。
在步骤1中，将这些MSC用含10％胎牛血清的培养基进行培养，经过3代传代后，其数量增加约100倍(图1A)。然后，在步骤2中，将抗坏血酸(AA)加入培养基中，该抗坏血酸已被证明可以通过胶原纤维促进细胞间黏附，以刺激MSC自组装成薄膜形状的弹性结构(图1A)。值得注意的是，为了优化该MSC衍生薄膜(MSCF)的形成，使用不同浓度的AA，可以发现浓度100μg/ml的AA对膜的构建(图1B)和胶原蛋白分泌(图1C)影响最强，100μg/ml的AA孵育5天后胶原蛋白积聚最多(图1D)。接下来，在步骤3中，将其从培养皿上剥离下来，MSCF可以方便地卷曲成一根棒，这就是最终的产品--Spinor(图1A)。正如预期的那样，Spinor具有连通良好的孔内部结构，这些结构可支持神经干细胞的附着，增殖，分化和迁移，从而指导和促进轴突的再生(图1E)。
4.扫描电子显微镜(SEM)分析
Spinor脊髓组织和Spinor的表面和横切面用2.5％戊二醛固定，PBS冲洗3次，进行梯度酒精脱水，用六甲基二硅胺(Sigma，USA)孵育。然后将样品烘干，涂上钯金，在5.0kV电压下，用S-4800(Hitachi,Japan)扫描电子显微镜观察。扫描电子显微镜(SEM)图像(图1F)显示这种缝隙状的内部结构类似于脊髓的内部解剖结构。
5.原子力显微镜(AFM)分析
脊髓组织和spinor的横切面被连接到一个新鲜的支架上μ。2min后用去离子水(2×1ml)冲洗2次，风干。AFM图像由多模8原子力显微镜(Brucker,Billerica,MA)采集。在高度通道和地形图像采集数据，并用纳米分析软件处理使用。图1G中的原子力显微镜(AFM)测量显示，Spinor的纵截面具有与脊髓相似的表面形貌。总的来说，这些结果完全支持Spinor的脊髓样结构特征。
6.免疫印迹分析
牙髓间充质干细胞和spinor的细胞总蛋白或外泌体总蛋白经PIPA裂解缓冲液处理(Beyotime Co.,Shanghai,China)。全细胞蛋白提取后BCA定量，经10％聚丙烯酰胺凝胶分离,转移到PVDF膜上(Millipore,Billerica,MA,USA)，5％BSA封闭,孵育一抗如下：Col I(1:1000,Abcam,ab6308),ColⅢ(1:1000,Abcam,ab78078),CD63(1:2000,Abcam,ab134045),GFAP(1:2000,Millipore,04-1062),S100(1:1000,Abcam,ab52642),Neurofilament(NF)(1:1000,Cell Signaling,2836),Nestin(1:1000,Abcam,ab105389),MAP2(1:2000,Millipore,AB5622)和MBP(1:1000,Abcam,ab24567)。GAPDH(1:4000,Abcam,ab8245)作为内参。孵育二抗，与二抗偶联的过氧化物酶通过电化学发光(Tanon4200imaging system,China)显示信号强度。
7.免疫荧光染色分析
大鼠用1％戊巴比妥钠麻醉，全身灌注4％福尔马林(PFA)固定脊髓。取围绕病变部位约2.5cm的脊髓组织。将组织置于包埋剂(OCT、Leica)中，切成20μm切片。原代神经元染色时，用4％PFA固定细胞，然后用PBS洗涤3次。免疫荧光测定中,柠檬酸钠缓冲液用于抗原热修复(10mmol/L柠檬酸钠,0.05％Tween 20,pH值6.0)，组织和细胞用含10％正常血清及1％牛血清白蛋白(BSA)的TBST(pH值7.6)在室温下封闭2小时；一抗4℃孵育过夜，抗体如下：FAK(1:100,Invitrogen,ZF002),β3-tubulin(1:100,Abcam，ab78078),GFAP(1:100,Millipore,04-1062),NF(1:100,Cell Signaling,2836),MAP2(1:200,Millipore,ab5622),MBP(1:300,Abcam,ab24567),Nestin(1:100,Abcam，ab105389),S100(1:100,Abcam，ab52642)CGRP(1:200，Cell Signaling,14959),iNos(1:100,Abcam,ab15323),CD3(1:50,Santa Cruz Biotechnology,sc-20047),CD11b(1:100,Abcam,ab1211)和CD206(1:200,Abcam,ab125028)，随后与二抗孵育。在激光扫描共聚焦显微镜(Olympus FluoViem FV1000,Tokyo,Japan)下检测阳性细胞。使用Image-Pro Plus软件进行定量组织形态学分析。
8.外泌体分离和收集
牙髓间充质干细胞和spinor用无外泌体的培养基培养，收集培养上清。上清16000g离心30分钟，用ST 40R离心机(ThermoFisher Scientific,USA)去除细胞和碎片。随后，用0.22μm滤器过滤，130000g离心70分钟制成外泌体颗粒。用无菌PBS重悬外泌体颗粒，再于130000g离心70分钟。所有离心均在4℃操作。为了检测外泌体的特异性表面标记，用CD63抗体进行蛋白免疫印迹。通过扫描电镜和纳米颗粒跟踪分析(NTA)(NanoSightNS300系统)检测外泌体的大小分布和浓度。
9.外泌体释放分析
为了研究外泌体的释放行为，制备牙髓间充质干细胞和spinor，并在无外泌体的培养基中培养，收集培养上清。当细胞融合率达90％时，换成一种新的无外泌体的培养基。48h后，收集上清离心得外泌体颗粒，然后用等体积的新鲜PBS重悬。收集的样品通过BCA测试分析，以检测上清液中游离外泌体的数量。累积释放量通过GraphPadprism 8.0计算并绘制。
10.外泌体TMT分析
利用BioNovoGene(苏州，中国)在线二维纳米LC/MS/MS分析spinor和牙髓间充质干细胞中的外泌体。通过不同倍数和表达差异，筛选出干细胞源外泌体和spinor源外泌体表达差异的蛋白，然后进行基因集富集分析。
众所周知，干细胞来源的外泌体对MSCs的治疗效果起着至关重要的作用，这对Spinor来源的外泌体的数量和质量进行研究。为此，将绿色荧光蛋白(GFP)融合CD63(外泌体标记)稳定转染MSC，通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)追踪外泌体，并通过荧光酶标仪进行定量。如图2A所示，通过CLSM拍摄MSC或Spinor分泌的外泌体图像，其中细胞骨架(FAK)和细胞核(DAPI)分别染成红色和蓝色。在Spinor中可以找到更多绿色的外泌体(图2A)，CD63的定量分析进一步证实了这一点(图2B)。接下来，通过质谱分析蛋白质组，研究了Spinor衍生的外泌体和MSC衍生的外泌体中的包涵蛋白。如图2C所示，在两个外泌体中可找到643种蛋白质，当将Spinor衍生的外泌体与MSC衍生的外泌体进行比较时，其中77个是有差异的(校正后的p值<0.05，倍数Log2的变化>1.3或<-1.3)。在这些差异蛋白中，有17种(22.0％)蛋白参与炎症过程，其中30种(39.0％)蛋白具有促进神经再生的功能，其中15种(19.5％)蛋白与瘢痕抑制相对应，其余15种蛋白质(19.5％)与细胞组装直接相关(图2D)。此外，基因集富集分析(GSEA)以一致且可重现的方式暴露了细胞组装相关蛋白差异信号的富集(图2E)，再次诱导了MSC组装和Spinor中的连接。此外，与MSC来源的外泌体相比，Spinor来源的外泌体中神经调节通路上调，提示了Spinor的脊髓修复能力增强(图2F)。此外，MSC组装中最高下调的通路包括与星形胶质细胞增殖(图2G)和炎症(图2H)有关的蛋白，抑制这两种蛋白均有利于脊髓损伤后的神经再生。在这个问题中，衍生自Spinor的外泌体比MSC衍生的外泌体更为活跃，并有效地促进神经的再生和分化(图2I)，这可以从分支点(图2J)和神经突点(图2K)的增加以及额外的最大长度(图2L)和平均分支(图2M)得到证明。总的来说，这些结果无论是在在数量还是质量上都充分证明了优化的源自Spinor的外泌体可作为修复受损脊髓的潜在工具。
11.轴突生长及摄取分析
分离培养脊髓神经元。简单地说，8周龄Sprague-Dawley大鼠(200-250g)的脊髓取材于HABG溶液，其中包含60mL冬眠液、1.2mL B27、0.176mL Gln(终期0.5mM)(或0.15ml谷氨酰胺)。然后用HABG清洗脊髓组织，切成0.5毫米的碎片，转移到一个含有木瓜蛋白酶(Worthington,cat.no.3119)的小盘子中30℃孵育30分钟。小心地将细胞悬液用于准备好的OptiPrep密度梯度分离液(Sigma,cat.no.D1556)，然后在22℃下800g离心15分钟。收集2、3部分,22℃，200g，离心2min，丢弃含有碎片的上清液，立即将细胞重悬于5ml HABG中，细胞悬液200g,22℃，离心2分钟，丢弃上清，用0.5mM谷氨酰胺和10mg/ml庆大霉素将细胞重新悬浮在Neurobasal-A/B27中。将细胞置于预先涂有聚赖氨酸的15mm盖玻片上，置于24孔板上，细胞数为5×104个/孔，培养3天。对于轴突生长试验，将培养基替换为源自对照组、MSC组或spinor组的含有外泌体的新鲜培养基，再培养72小时。外泌体摄取实验中，PKH26标记的外泌体添加到培养液中，细胞和外泌体共孵育6小时。共孵育后，上述细胞用4％多聚甲醛固定,用于免疫荧光染色分析。利用Image-Pro Plus软件对分支点、神经突起数量、最大分支水平和平均分支长度进行量化。
12.脊髓损伤模型及术后护理
根据机构指南，本实施例设计了所有动物实验，并得到了批准。8周龄雌性Sprague-Dawley大鼠(200-250g)采用1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。在深麻醉下，剃掉大鼠背部T9-T10棘突附近的毛发。分离肌肉后，行椎板切除术，显露T9-T10节段背侧表面。用眼科剪完全横切T9-T10节段，病灶间隙3.0±0.4mm。精确止血后，将MSCs与基质胶(LifeSciences,354234)和spinor混合植入spinor脊髓间隙，确保与病变吻合。注入PBS溶液作为对照组。行椎板切除术但不横断脊髓的动物作为假手术组，本研究命名为健康组。最后缝合肌肉和皮肤。
本发明评估的组为健康组、脊髓损伤大鼠模型+PBS组(对照)、脊髓损伤大鼠模型+MSC组、脊髓损伤大鼠模型+spinor组(每组6只)。术后7天内给予青霉素预防感染。在术后护理方面，动物每天接受两次手动膀胱排尿直到恢复自主排尿。
为了系统、全面地探索Spinor的生物功能，在大鼠上做2mm横切口，在T9-T10处切断脊髓背索和背角来建立完整的SCI模型。成模后，将Spinor或MSC填充到病灶腔内。两周后，通过免疫荧光染色对神经元(NF)和星形胶质细胞(GFAP)进行染色，评估Spinor或MSC植入之间的组织学差异。与CD63-GFP标记的外泌体发出的绿色荧光叠加，在病灶，延髓和尾端均出现神经元的红色荧光信号(图3A)。图3B和3C的定量分析结果显示，经Spinor处理的大鼠中，外泌体和神经细胞数量明显高于经MSC处理的大鼠。同时，与MSC处理的大鼠的GFAP标记的星形胶质细胞相比，Spinor植入后星形胶质细胞的数量明显减少(图3D-3F)。因此，这些结果提供了体内证据，证明Spinor比MSC具有更强的促进神经元再生和抑制星形胶质细胞增殖的活性。这些结果与蛋白质组分析非常吻合，蛋白质组分析认为源自Spinor的外泌体包含更多的抗炎蛋白和较少的促炎蛋白(图2H)。
13.运动功能检测
采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)运动评定量表法对大鼠的行为结果进行盲法评定和评分。术后每2-3天测量一次作为基线评分，之后每周测量一次，共8周。此外，还为每只实验鼠录制了视频。在视频记录的帮助下，每只动物的移动状态都被仔细地检查。结果通过SPSS 22.0和GraphPad prism 8.0进行分析。
为了评估Spinor的神经再生潜能，将18只完全SCI的大鼠分为三组：1)PBS治疗组(对照)、2)Spinor治疗组、3)MSC治疗组，以及6只接受了模拟手术的健康大鼠，其中包括脊髓切开和缝合的大鼠被用作阳性对照。由于临床上不可能在SCI之后立即进行治疗，因此所有治疗均在伤后3小时左右开始，以模拟临床病例中的实际治疗方法。治疗后，在8周的恢复期内，对所有大鼠进行每周Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)运动评分量表(图4A)。从第三周开始，Spinor组大鼠的运动功能显著恢复(图4A)。8周时，Spinor组大鼠的平均血脑屏障运动评分为10±2，与对照组和MSC组大鼠的平均血脑屏障运动评分为2±1(p<0.001，图4A)相比，差异有显着性(P<0.001，图4A)。同时，通过测量大鼠从运动皮层到坐骨神经的电位差，可以发现Spinor组和健康组的高振幅运动诱发电位(MEP)与对照组和MSC治疗组测量的基线噪声信号形成鲜明对比(图4B)。结果，在治疗8周后，Spinor治疗引起了显著的运动功能恢复，而对照组和MSC治疗组的大鼠都不能用后腿爬行，甚至不能用后腿直立行走(图4B)。
14.感觉恢复分析
采用von Frey纤维丝测痛仪评估感觉恢复情况。将具有刺激力梯度(6,8,10,15,26,60,100,180,300g)的纤维丝(Bioseb，法国)刺激脚爪，以引起伤害性反应(脚爪从刺激中快速撤退)。健康大鼠撤回脚爪的截止阈值被设定为感觉恢复的指标。撤回阈值定义为三次试验中至少有两次的最小力诱导阳性反应，两次试验之间至少30秒。
运动能力的恢复总是伴随着感觉的恢复(图4C)。为了验证这一结论，在大鼠左后爪的电刺激下，在参照后爪的最大刺激强度下记录体感诱发电位(SEP)。如预期的那样，在健康和Spinor治疗的大鼠中观察到由三个连续峰值(两个负偏转和一个正偏转)组成的SEP信号的特征性表现，而在MSC治疗组或对照组中则测量到低振幅或不完整信号(图4D)。为了进一步研究感觉恢复情况，采用Von Frey纤维丝试验，在60-300g范围内对后肢施加刺激力，以确定足退缩阈值。如图4E所示，对照组大鼠在第0、4、8周对300克纤维丝刺激针没有反应，表明其感觉功能完全缺失。重要的是，与只使用MSC的大鼠相比，使用Spinor的组中有2/3的大鼠在第8周获得了感觉恢复(图4E)。此外，排尿反射的恢复进一步支持上述结果。具体来说，Spinor组大鼠仅在6.8±1.6天内恢复了排尿反射，而MSC组和对照组的小鼠相对长时间没有排尿反射(图4F)，且Spinor组的大鼠正常大小的膀胱(图4G)再次支持了上述结果。综上所述，这些结果提供了大量证据表明，Spinor治疗比MSC治疗在感觉功能恢复方面更有效。
为了探讨运动和感觉恢复的组织学机制，采用正电子发射断层扫描(PET)和计算机断层扫描(CT)联合双模式成像技术对对照组、Spinor组和MSC组大鼠脊髓损伤处进行了观察。在PET显像中，使用葡萄糖类似物2-[18F]氟-2-脱氧-D-葡萄糖([18F]FDG)来测量脊髓病变中葡萄糖的提取情况。值得注意的是，[18F]FDG可以被摄取到葡萄糖代谢旺盛的细胞中，但不能被分解和利用，从而积累在这些细胞内通过[18F]FDG PET和CT显像的合并(如图5A)，[18F]FDG在脊髓损伤大鼠的病变中可以发现明显的信号，而其它各组几乎没有任何PET信号。此外，[18F]FDG在脊髓病变中积聚的量化数据再次支持这一结果，其中[18F]FDG在脊髓病变中的相对强度在统计学上明显超过了其他病变(图5B)。
15.PET/CT试验
第8周，大鼠禁食12h，然后在PET成像前静脉内给予约500±25μCi18-氟-6-脱氧葡萄糖(FDG)。FDG注射60分钟后，用2％异氟烷麻醉大鼠并置于扫描床上，全身模式获取PET/CT图像20分钟，然后使用TransPET Discoverist 180系统(中国苏州Raycan科技有限公司)进行正常模式的CT扫描。PET图像采用三维(3D)OSEM方法重建，体素大小为0.5×0.5×0.5mm3。采用FDK算法以256×256×256矩阵重建CT图像。图像使用Carimas软件(图尔库PET中心，图尔库，芬兰)显示。按以下公式计算平均标准摄取值(SUV)：衰减校正感兴趣区域活度(μCi/kg)/(注射剂量[μCi]/重量[kg])的平均像素值。
16.电生理学
在完全麻醉下，对8周龄SD大鼠进行颅骨切除术，然后在冠状缝前2mm和矢状缝旁2mm处植入刺激电极。同时将两个钩形电极插入胫骨后神经，一个接地电极连接到背侧皮下。基于确定的复合动作电位和后肢肌肉收缩进行电刺激，并在所有大鼠中维持强度。参数包括3μV和5ms。结果叠加了100次。
为了确定SCI治疗的细胞机制，对脊髓病变和鼻端以及尾端残端进行了GFAP，NF，MBP和CGRP染色，以分别检测星形胶质瘤，轴突再生，雪旺氏细胞再生和神经功能。治疗后第8周，星形胶质细胞标记物GFAP表达在MSC处理的脊髓中比在对照处理的脊髓中显着上调，而在Spinor处理的脊髓中几乎检测不到(图5C，5D)。此外，在神经标志物NF的染色中可以发现相反的结果，在这三种治疗中，Spinor治疗引起轴突再生最多(图5C，5D)。此外，与MSC处理的脊髓相比，Spinor处理的脊髓中CGRP水平升高，再次支持Spinor在恢复脊髓神经功能方面比MSC更活跃。总之，Spinor通过抑制瘢痕化和促进脊髓损伤部位的轴突再生来增强再生效应。
17.细胞凋亡分析
采用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(Beyotime，C1089，China)检测细胞凋亡。手术1天和14天后，在SCI模型(Ctrl组)，MSC组和Spinor组的切片上计数TUNEL阳性细胞。TUNEL阳性细胞的平均数量是通过对每只动物病变部位的冠状切片进行计数得到的数值计算得出的(每组n＝6)。
18.生物相容性测试
将Spinor植入大鼠皮下以评估其生物相容性。简单地说，在植入1、3和7天后，取血进行血液学和血清生化试验，分别于1、2、4和8周采集皮肤和Spinor复合物，进行组织学分析和Spinor的吸收率。
其他安全性评价方面，在植入spinor 8周后，收集心脏，肝脏，肺，肾和脾等主要脏器，进行组织学分析。所有假手术组样本均作为健康对照(每组n＝6)。
19.组织学分析
在含有维生素C的培养基中培养Spinor 5天，进行HE染色。此外，还收集了皮下植入物和大鼠组织，包括皮肤，膀胱，肾脏和主要器官，进行HE染色。简而言之，将新鲜组织用福尔马林固定，洗涤，石蜡包埋，切成6μm切片(Leica，RM2235)，并用苏木精和伊红(H&E)染色。采用Olympus BX41显微镜(日本Olympus)拍摄图片。
20.ELISA试验
在Spinor植入1、3和7天后，收集血清并使用大鼠EIA试剂盒(NeoBioscience，深圳，中国)进行TGFβ1,TNFα,IL-6and IL-10ELISA分析，进行了所有的ELISA分析。
为了进一步探讨Spinor的临床应用潜力，系统地检测了Spinor皮下移植后的毒性。如预期的那样，通过HE染色(图6A)，血清炎症因子(图6B)和血细胞计数(图6C)未发现Spinor的免疫毒性。更重要的是，Spinor可以在体内降解和吸收(图7A)，从而进一步提高了其生物相容性。此外，心脏，肝脏，脾脏，肺和肾脏的HE染色结果也支持上述发现，即Spinor作为人体填充材料是足够安全的(图7B)。
本发明开发了一种由牙髓衍生的MSC自组装而成称为Spinor的脊髓类器官，称为Spinor，以充分利用MSC衍生的外泌体的优势进行SCI治疗，同时避免了提取外泌体的麻烦。Spinor作为脊髓填充和外泌体的母体，与MSC相比具有与脊髓组织相似的几何结构和优化的外泌体分泌能力。更重要的是，Spinor通过固有和优化外泌体的内容物抑制瘢痕形成以及炎症和促进轴突再生等多种机制为脊髓再生创造了良好的微环境。结果表明，在完全性SCI大鼠中，Spinor原位治疗引起了明显的运动改善，感觉恢复和更快的尿反射恢复。总的来说，这项工作不仅提供证据表明Spinor是SCI治疗临床应用的一种潜在可行治疗范例，而且表明适当的MSC组装在提供新的外泌体衍生疗法方面有巨大的希望，从而彻底改变了治疗中枢神经系统损伤的传统方法。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.利用牙髓间充质干细胞获得人工脊髓的制备方法，其特征在于，由以下步骤组成：
步骤1：采集因正畸原因拔除的健康乳牙，用I型胶原酶消化并接种于培养瓶中，洗涤弃掉未贴壁细胞，将贴壁细胞重悬后进行培养获得牙髓间充质干细胞，
步骤2：利用α-MEM培养基对牙髓间充质干细胞培养使其增殖，
步骤3：选取第三代牙髓间充质干细胞，当细胞融合率为90％时，利用含有维生素C的α-MEM培养基对牙髓间充质干细胞培养得到白色膜状结构，并通过体外塑性，最终获得具备三维结构的人工脊髓。
2.根据权利要求1所述的利用牙髓间充质干细胞获得人工脊髓的制备方法，其特征在于，其中，步骤1和步骤2之间需对获得牙髓间充质干细胞进行细胞鉴定，其鉴定方法为：
将牙髓间充质干细胞与PE或FITC偶联的抗人CD73、CD146、CD105、CD11b、CD34或CD45的单克隆抗体孵育，
使用流式细胞仪对牙髓间充质干细胞进行表面标记的鉴定，
利用成骨诱导培养基对牙髓间充质干细胞进行培养，
对牙髓间充质干细胞进行固定和染色，
利用成脂诱导培养基对牙髓间充质干细胞进行培育，
利用油红O溶液染色检测细胞内脂质积累，对其进行鉴定。
3.根据权利要求2所述的利用牙髓间充质干细胞获得人工脊髓的制备方法，其特征在于，其中，所述成骨诱导培养基的配方为：100nmol/L地塞米松、50mg/mL抗坏血酸和1mmol/Lβ-甘油磷酸盐。
4.根据权利要求3所述的利用牙髓间充质干细胞获得人工脊髓的制备方法，其特征在于，其中，所述成脂诱导培养基的配方为：0.5mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，0.5mmol/L氢化可的松，60mmol/L吲哚美辛和10μg/mL胰岛素。
5.根据权利要求1-4任一所述的利用牙髓间充质干细胞获得人工脊髓的制备方法，其特征在于，其中步骤3中的含有维生素C的α-MEM培养基中维生素C的含量为60-240μg/mL。
6.根据权利要求5所述的利用牙髓间充质干细胞获得人工脊髓的制备方法，其特征在于，其中步骤3中的含有维生素C的α-MEM培养基中维生素C的含量为120μg/mL。
7.一种应用于脊髓损伤治疗方法的产品，其特征在于：所述产品包括来源于牙髓间充质干细胞，而所述治疗方法包括：至少将所述牙髓间充质干细胞制备得到的人工脊髓移植到同种动物的脊髓损伤部位，形成连续脊髓。
8.牙髓间充质干细胞作为脊髓损伤动物模型治疗产品的用途，所述牙髓间充质干细胞来源于与动物模型同种的动物，所述用途包括：至少将所述牙髓间充质干细胞制备得到的人工脊髓移植到动物模型的脊髓损伤部位，形成连续脊髓。
9.根据权利要求8所述的牙髓间充质干细胞作为脊髓损伤动物模型治疗产品的用途，其特征在于，所述用途还包括：人工脊髓用于通过抑制瘢痕形成和炎症以及促进轴突再生形成连续脊髓。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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