CN111548990A - 脱落乳牙的牙髓干细胞聚合体及其制备方法和应用 - Google Patents

脱落乳牙的牙髓干细胞聚合体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种脱落乳牙的牙髓干细胞聚合体的制备方法，及由该制备方法制得的牙髓干细胞聚合体及其在制备用于恒牙再植的制剂中的用途。本发明的制备方法包括以下步骤：(1)将来自于脱落乳牙的牙髓组织洗净；(2)所述牙髓组织经胶原酶I和Dispase消化并获得细胞悬液；(3)加入VC培养液培养以获得牙髓干细胞聚合体；具体方法见下文。本发明的脱落乳牙的牙髓干细胞不仅有间充质干细胞特性，同时表达胚胎性干细胞相关基因，其诱导分化能力强于牙髓干细胞，对完全脱位年轻恒牙的牙髓再生及牙周愈合有理想的效果。

Description

脱落乳牙的牙髓干细胞聚合体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种脱落乳牙的牙髓干细胞聚合体及其制备方法和应用。
背景技术
牙齿再生的最终理想目标是用一颗再生的天然牙齿取代损失的牙齿。而乳牙干细胞正是修复受损或病变牙组织，甚至牙齿脱落后进行整体修复的绝佳治疗方案。2003年，美国施松涛教授课题组首次从脱落乳牙的冠和根的牙髓中分离出具有多分化能力的干细胞，将其命名为脱落乳牙牙髓间充质干细胞(stem cells from human exfoliated deciduousteeth,SHED)。
脱落乳牙牙髓干细胞与牙髓干细胞(DPSC)、根尖牙乳头干细胞(SCAP)均为牙源性干细胞且都来源于神经峭间充质细胞，但SHED是发育更早期的胚胎源性细胞，因此其增殖水平、群体倍增数、克隆形成能力、多向分化能力均显著高于二者。研究显示SHED除了具有成牙本质/牙髓分化，还可以分化为血管内皮细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌细胞、神经元细胞、脂肪细胞、肝细胞等。另外SHED还具有较强的免疫调节功能，可以抑制Th17细胞活性，维持机体的免疫平衡。基于上述SHED优越的生物学性能，一些研究者应用实验动物模型进行SHED尝试性治疗皮肤伤口、颅骨缺损、脊髓损伤、免疫疾病、肝损伤等，均取得了良好的治疗效果。脱落乳牙牙髓干细胞有广阔的应用前景，探索、优化和开发此干细胞的制备过程及新的应用形式，不仅有利于保证脱落乳牙牙髓干细胞的生物学特性和效应，而且为开展大规模临床试验治疗奠定了坚实的基础并提供了有力的保障。例如CN105087474A公开了一种乳牙牙髓干细胞的培养方法，其乳牙来源是临床上儿童因滞留而拔除的乳切牙。CN105087474A所公开的乳牙牙髓干细胞制备培养方法是牙髓组织胶原酶I消化后过筛，无血清培养，且加入表皮生长因子、碱性成纤维生长因子。CN105602895A所公开的乳牙牙髓干细胞制备培养方法是牙髓组织切块后，直接用间充质干细胞无血清培养(FasGrow)，添加因子为重组人血小板源生长因子、重组人表皮生长因子的混合物。这两个专利所公开的培养方法都是无血清培养、添加生长因子。血清含有丰富的营养成分，在促进干细胞增殖方面有很好的效果，并且对干细胞的贴壁生长、集落形成有重大影响，但过高浓度不利于干细胞生长。外源性生长因子对干细胞的生长有促进作用，但也有人认为多种生长因子对干细胞生长并无协同作用。因此，添加生长因子的有益作用可能不足以补充无血清培养带来的影响，脱落乳牙牙髓干细胞的制备方法和培养仍需不断优化和改进。
目前牙再生所采用的各种种子细胞多存在供源有限的问题，相对于从阻生牙和正畸拔除牙中获取牙源性干细胞，脱落乳牙是一个更容易获得种子细胞的途径，目前国外己经建立了多个SHED干细胞库。牙齿发育生物学研究显示牙齿的发育模式是由上皮和间充质细胞的凝聚细胞团相互作用的结果，因此金岩教授课题提出了一种新的组织工程牙齿构建方法——细胞聚合体组织工程(cell aggregate engineering)。其主要原理是将牙源性干细胞经过诱导培养制成适宜形态的细胞团块进而移植至体内，最终原位发育成组织工程牙齿组织。细胞聚合体技术通过细胞自身分泌的细胞外基质形成内源性支架(endogenousscaffold)，有利于细胞与细胞间、细胞与胞外基质间的交互作用和遗传信息的传递，有利于维持细胞三维有序的发育空间，有利于细胞外基质的分泌和局部微环境的建立，进而有利于组织工程牙齿组织的形态发生。脱落乳牙牙髓干细胞聚合体是由脱落乳牙牙髓干细胞与其分泌的基质蛋白所形成的机能环境或者微环境，含有牙齿发育所需生物因子、具有牙源性特征且形成了牙齿固有胶原网络结构，具有细胞悬液所没有的稳定的生物学特性、坚韧的机械特性及独特的诱导微环境。
但是目前关于SHED细胞聚合体的生物学性能研究较少，缺乏一种有效地利用脱落乳牙培养干细胞聚合体的方法。
发明内容
为克服现有技术中缺乏有效地利用脱落乳牙培养干细胞聚合体并用于恒牙再植的缺陷，本发明提供了一种脱落乳牙牙髓干细胞的制备方法及其应用。
现有技术制备干细胞聚合体的方法有1)使用细胞粘附因子或其他组分涂布培养皿；2)搅拌悬浮培养、磁性纳米颗粒介导；3)采用无血清培养基培养基，并添加维生素C和地塞米松等。现有技术脱落乳牙培养干细胞聚合体的培养过程并不利于后续临床移植，本发明人发现，利用本发明的制备方法，使用仅含维生素C的培养液和含血清的培养基，可有效地制备出可用于年轻恒牙移植的牙髓干细胞聚合体。发明人通过比较SHED细胞和恒牙DPSC的细胞生物学行为，并检测脱落乳牙牙髓干细胞聚合体的相关生物学性能；并且开展临床试验的初步探索性治疗，描述了一例接受SHED细胞聚合体用于冻干牙延迟再植完全脱位年轻恒牙的治疗及预后评估，以期为后续临床试验的治疗和评估提供经验，为SHED的临床转化应用有效性提供临床基础。
为解决上述技术问题，本发明的第一方面提供一种脱落乳牙的牙髓干细胞的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将来自于脱落乳牙的牙髓组织洗净，其中所述脱落乳牙自然脱落或松动后经人工拔除，所述洗净为反复用PBS冲洗至表面无血液残留；
(2)所述牙髓组织经胶原酶I和Dispase消化至无成形牙髓组织，终止消化后获得细胞悬液，其中所述胶原酶I的浓度为100-300CDU/mL，所述Dispase的浓度为1-2.4U/mL。
(3)加入20-40mg/mL VC培养液培养以获得牙髓干细胞聚合体。
优选地，在所述步骤(2)后、所述步骤(3)之前还包括以下步骤：
(2.1)将所述细胞悬液用含血清和抗生素的a-MEM培养基培养，以获得牙髓干细胞；优选培养所述牙髓干细胞至80-85％汇合度；
(2.2)PBS冲洗所述牙髓干细胞，优选冲洗2-3遍；和/或，
(2.3)用胰蛋白酶消化所述牙髓干细胞以获得含单细胞的细胞悬液；
更优选地，还包括以下步骤：
(2.4)检测所述牙髓干细胞的间充质干细胞标志物和/或胚胎干细胞标志物，和/或，在诱导成骨、成脂后检测成骨相关基因和/或成脂相关基因的表达；所述检测的结果为阳性。
优选地，所述步骤(3)为：
以1-10×105/孔接种所述牙髓干细胞，并加入20-40mg/mL VC培养液培养后获得牙髓干细胞聚合体，和/或，所述培养为培养12-14天；优选地，所示胶原酶I的浓度为200CDU/mL，所述Dispase的浓度为2U/mL，所述VC培养液的浓度为30mg/mL，和/或，所述接种以6-8×105/孔优选7×105/孔接种。接种可于本领域常规的细胞培养板中，例如于6孔板内。
优选地，在所述步骤(2)中，所述消化为在37℃孵箱内消化40min-1h，优选每隔5-l0min轻轻摇晃。
优选地，在所述步骤(2.1)中，所述血清为10％胎牛血清，所述抗生素为100U/mL青霉素和/或链霉素，所述培养在37℃、CO2饱和度为5％的恒温箱培养。
优选地，在所述步骤(2.3)中，所述胰蛋白酶的浓度为2-3％优选2.5％，所述消化的温度为37℃，和/或，所述消化的时间为30-60s优选40s。如无特殊说明，上述浓度指终浓度。
优选地，在所述步骤(2.4)中，所述间充质干细胞标志物为Stro-1、CD34、CD45、CD90、CD105和CD146中的一种或多种，所述胚胎干细胞标志物为Oct4和/或Nanog，所述成骨相关基因为ALP、OCN、COL-1、RUNX-2，所述成脂相关基因为PPAR-r、LPL；优选地，所述间充质干细胞标志物使用流式细胞仪检测，所述胚胎干细胞标志物、所述成骨相关基因和/或成脂相关基因使用RT-PCR检测。
为解决上述技术问题，本发明的第二方面提供由第一方面所述的制备方法制得的牙髓干细胞聚合体。
为解决上述技术问题，本发明的第三方面提供如第一方面所述的牙髓干细胞聚合体在制备用于恒牙再植的制剂中的用途。
较佳地，所述恒牙为年轻恒牙，优选完全脱位的年轻恒牙；更佳地，所述乳牙牙髓干细胞聚合体具有：抗炎症反应、抑制细胞凋亡、促进细胞增殖和血管生成的作用，和/或，可促进恒牙的牙髓再生及牙周愈合。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本专利的制备方法获得的脱落乳牙的牙髓干细胞不仅有间充质干细胞特性，同时表达胚胎性干细胞相关基因，其诱导分化能力强于牙髓干细胞。此脱落乳牙牙髓干细胞聚合体可用于冻干牙延迟再植恒牙，优选完全脱位年轻恒牙；不仅仅有抗炎症反应、抑制细胞凋亡、促进细胞增殖和血管生成的作用，更对完全脱位年轻恒牙的牙髓再生及牙周愈合有理想的效果。
附图说明
图1显示了脱落乳牙牙髓干细胞的增殖能力；
图2显示了脱落乳牙牙髓干细胞的诱导分化能力；
图3为脱落乳牙牙髓干细胞的胚胎干细胞相关基因表达分析；
图4为诱导分化后脱落乳牙牙髓干细胞的成骨、成脂、软骨细胞染色鉴定；
图5为乳牙牙髓干细胞聚合体HE染色和PCNA免疫组化。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1脱落乳牙牙髓干细胞的分离培养和鉴定
1.脱落乳牙牙髓干细胞的分离培养
(1)获得临床病人脱落的乳牙，置于装有培养液离心管内。
(2)在超净台内，取出牙齿并放在培养皿中，用PBS反复冲洗牙齿后将牙齿移至另一培养皿内，取出牙髓组织。
(3)将牙髓组织反复用PBS冲洗，直至表面血液被冲洗干净。在培养皿内将牙髓组织剪碎并且在避光条件下置于含有Ⅰ型胶原酶(简称胶原酶I)以及Dispase的消化液中，并且至于37℃孵箱内消化40min-1h，期间每隔5-l0min轻轻摇晃，直至无成形牙髓组织，加入培养液终止消化。具体胶原酶I和Dispase的配比及实验分组如下表1所示。
表1胶原酶I和Dispase的配比及实验分组
Figure BDA0002503715300000061
(4)将消化好的细胞悬液以800r/min离心5min后，弃去上清液，加入含10％胎牛血清和100U/mL青霉素、链霉素的a-MEM培养基2ml重悬并反复吹匀后计数，将剩余细胞接种于6孔板内，放至于37℃，CO2饱和度为5％的恒温箱培养。
2.脱落乳牙牙髓干细胞的传代培养
(1)当6孔板内细胞生长至80％-85％以后，弃去培养液，PBS冲洗2-3遍。
(2)用2.5％胰蛋白酶37℃消化40s后至于倒置显微镜下观察至细胞缩成圆形时，加入等量含血清的培养基以中止消化并且吹打细胞以获得单细胞悬液。
(3)800r/min离心5min后，弃去上清液并加入培养液重悬细胞，并且以7×105/cm2密度接种传代。
3.SHED的储存
细胞冻存是细胞保存的主要方法之一，使细胞暂时脱离生长状态而使其细胞特性得以保存，需要时再复苏细胞。细胞冻存时，向培养基中加入保护剂二甲基亚飒，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。对于干细胞冻存的温度，多数学者倾向于将其保存于液氮内，以最大限度保存干细胞的活性。
本研究SHED库的冻存方法如下：
1)将样本干细胞分为4份分别冻存于液氮中；
2)以每1.5mL的细胞冻存液含有1～2×106个细胞；
3)细胞冻存时应以1℃/min的降温速度降温至-85℃，随后库存于液氮。
4.SHED表型鉴定
4.1流式细胞术鉴定
(1)选取对数生长期的P1代SHED，常规消化并离心，弃上清，用PBS重悬细胞。
(2)以200μL分装到1.5mL EP管中，每管细胞数不少于1×106。
(3)除空白管外，每个离心管分别加入2μL抗人单克隆荧光标记抗体STRO-1-FITC、CD34-PE、CD45-FITC、CD90-PE、CD105-PE、CD146-PE(Abcam,美国)。4℃避光孵育2h，再用PBS洗涤3次，800r/min离心5min，最后以300μL PBS重悬细胞。
(4)流式细胞仪检测细胞表面抗原阳性表达率，单位用百分比(％)表示。
4.2细胞免疫荧光鉴定
(1)选取对数生长期的P2代SHED，接种于24孔板内，常规培养液培养，培养8小时后显微镜下观察细胞，当细胞完全贴壁后，弃去培养液，PBS冲洗2-3遍，加入固定液固定30min。
(2)PBS洗2-3遍，1％Triton处理25min-30min，PBS洗2-3遍。
(3)山羊血清封闭：37℃，30min。
(4)不洗直接弃去山羊血清，加入一抗后4℃处理24h。
(5)第二日复温30min，PBS洗2-3遍。
(6)避光条件下加入荧光二抗，于37℃孵箱内处理3小时。
(7)PBS洗2-3遍，加入hochst 15min后PBS洗2-3遍干燥后与激光共聚焦显微镜下观察。
5.细胞增殖能力检测
克隆形成率检测
(1)分别取对数生长期的P1代乳牙牙髓干细胞，以1×103个细胞接种于l0cm培养皿中，摇晃使细胞均匀分布。
(2)当每个克隆集落中大于等于50个细胞且彼此不相连接时，弃培养液，PBS洗涤3遍，4％多聚甲醛固定20-40min，甲苯胺蓝染色，观察克隆形成集落总量及单个克隆形态、计数，分别计算克隆形成率。
6.细胞多向分化能力的检测
6.1成骨分化能力检测
(1)将P3代乳牙牙髓干细胞细胞按5×105/孔接种于6孔板内。待细胞生长融合至孔板底面积的95％时，弃原有培养基，加入成骨诱导培养基。每隔3天换液。
(2)进行成骨诱导第第21天时，茜素红(alizarin red)染色。弃培养基，PBS洗涤3遍，每次5min，4％多聚甲醛固定细胞20-30min。
(3)茜素红染色：每孔加入500μL茜素红染色工作液，室温下染色20min。弃染色液，PBS洗涤3遍，在微湿润的状态下，肉眼观察染色深浅，利用倒置相差显微镜观察并拍照。染色后每孔内加入100mmo1/L的氯化十六烷基吡啶溶液1ml，微震荡使其充分溶解，吸取100μL的溶解液置于96孔培养板中，于540nm波长处分别检测吸光度值。
6.2细胞成脂分化能力的检测
(1)将P3代乳牙牙髓干细胞按照5×105/孔接种于6孔板内。待细胞生长融合至孔板底面积的95％时，弃原有培养基，加入成脂诱导培养基。每隔3天换液。
(2)第14天做油红“O”(oil red"O")染色：弃培养基，PBS洗涤3遍，4％多聚甲醛固定细胞20min，PBS洗涤3遍，室温下染色20min。在微湿润的状态下，利用倒置相差显微镜观察并拍照。染色之后每孔加入1mL异丙醇，微震荡使其充分溶解，吸取100μL的溶解液置于96孔培养板中，于520nm波长处分别检测吸光度值。
7.RT-PCR检测
7.1总RNA提取
(1)收集常规培养及成骨、成脂诱导的乳牙牙髓干细胞106个，胰酶消化，PBS洗2-3遍，按照按1×106个细胞/1ml Trizol加入Trizol Reagent试剂，室温下裂解5min。加入0.2m1三氯甲烷并且充分震荡，室温静置5min。
(2)4℃，12000r/min离心15min，吸取上层无液相。加入等体积异丙醇，12000r/min离心10min。可见EP管底部有少许白色沉淀，即为RNA。弃上清，加入预冷的75％乙醇，离心，弃上清，通风橱内自然干燥。加入20μL DEPC水，微震荡使RNA充分溶解，置于冰上保存。
(3)测量总RNA浓度。
7.2逆转录
实验采取20μL体系进行逆转录。反转录反应条件：反转录反应37℃(15min×3个循环)，50℃(5min×3个循环)，反转录酶失活反应98℃(5min),获得的cDNA于-20℃保存。
7.3RT-PCR
以cDNA为模板扩增mRNA，以GAPDH为内参照，反应体系设定为20μL，采用两步法扩增标准程序。反应条件为：预变性95℃(3min，变性95℃(15s)，延伸60℃(30s)，共39个反应循环。
7.4引物的设计和合成
检测基因引物序列如下表2：
表2基因及其对应的引物序列
Figure BDA0002503715300000101
Figure BDA0002503715300000111
图1利用克隆形成实验表明了实验例和对比例的细胞增殖能力存在一定差别。其中实验例2的脱落乳牙牙髓干细胞的增殖能力最强，而对比例1的细胞增殖能力最低。
图2显示了荧光定量PCR技术分析脱落乳牙牙髓干细胞的成骨、成脂、软骨基因ALP、OCN、RUNX-2、COL-1、PPAR-r和LPL的表达水平，实验例所制备的细胞这6个检测基因的表达水平明显高于对比例，说明实验例所制备的脱落乳牙牙髓干细胞诱导分化能力更强。
图3显示了荧光定量PCR技术分析各实验例和对比例的胚胎干细胞相关基因Oct4和Nanog的表达水平，其中，实验例所制备的细胞这2个检测基因的表达水平明显高于对比例，说明实验例所制备的脱落乳牙牙髓干细胞具备胚胎干细胞特征。
经20天成骨诱导后，图4显示了茜素红染色鉴定出现钙结节；经14天成脂诱导后，油红O染色鉴定，细胞出现脂滴。经14天成软骨诱导后，阿尔新蓝染色鉴定，糖胺多糖出现软骨雏型。实验例所制备的细胞出现钙结节、脂滴、软骨雏型染色明显高于对比例，说明实验例所制备的脱落乳牙牙髓干细胞诱导分化能力更强。
8.乳牙牙髓干细胞聚合体的培养及其组织学检测
8.1乳牙牙髓干细胞聚合体的培养
将实验例2处理后产生的P2代细胞按照7×105/孔接种于6孔板内，加入含有VC(30mg/mL)的培养液，待细胞生长至85-90％时弃去原有培养液，每3天换液一次，培养12-14天。具体分组如下表2所示。
表3实施例和对比例的VC培养液浓度
Figure BDA0002503715300000121
8.2乳牙牙髓干细胞聚合体的组织学检测
将培养完成的乳牙牙髓干细胞聚合体(培养14天)弃去培养液，PBS冲洗2-3遍，使用无菌器械将其从6孔板底揭起后加入4％多聚甲醛固定，并于4℃冰箱内保存1日。
8.2.1乳牙牙髓干细胞聚合体的HE染色
(1)将固定好的乳牙牙髓干细胞聚合体组织进行脱水、石蜡包埋、切片。
(2)将切片按顺序浸入二甲苯、二甲苯、无水酒精、95％酒精、85％酒精、75％酒精分别15min、15min、5min、5min、5min、5min进行脱蜡、透明。流水冲洗2-3次。
(3)浸入苏木素中15min，流水冲洗2-3次。
(4)盐酸酒精分化1-2s，流水冲洗，随后浸入氨水中5s，流水冲洗，最后进入伊红中4-5min，流水冲洗。
(5)将切片按顺序进入75％酒精、85％酒精、95％酒精、无水酒精各1min后至于烤箱内烘干脱水。随后按照顺序2次浸入二甲苯中各15min进行固定。随后使用中性树胶封片，干燥后显微镜下观察。
8.2.2乳牙牙髓干细胞聚合体的MASSON染色
将乳牙牙髓干细胞聚合体组织切片进行脱蜡及透明后流水冲洗2-3遍。
(1)使用蜡笔画蜡圈，使用铁苏木素染色15min(A、B液1:1混合)，流水冲洗2-3遍。
(2)使用丽春红染色5-l0min，流水冲洗。
(3)使用磷铝酸处理5min，不冲洗直接用苯胺蓝染色5min，流水冲洗。
(4)使用冰醋酸处理1min，流水冲洗后脱水、固定、封片。并于镜下观察。
8.2.3乳牙牙髓干细胞聚合体的免疫组化染色(ABC试剂盒法)
(1)将乳牙牙髓干细胞聚合体切片进行脱蜡及透明后流水冲洗2-3遍，擦净切片上多余水，使用蜡笔画蜡圈，将组织圈在蜡圈中，随后使用胰蛋白酶于37℃孵箱内进行抗原修复20min，结束后PBS冲洗2次/3min。
(2)使用3％双氧水于37℃孵箱内处理20min，结束后PBS冲洗2次。
(3)使用山羊血清于37℃孵箱内封闭30min后甩去血清，不冲洗直接加入一抗(DSP，CD31，NESTIN，PCNA)。置入4℃冰箱内过夜。
(4)第二日将切片从冰箱取出，室温下复温30min，PBS冲洗2遍后加入二抗(根据一抗种属来源)于孵箱内孵育30min，同时将A、B液与PBS以10uL:10uL:1mL的比例配制好后室温静置30min后待用。
(5)二抗孵育结束后，PBS洗2遍，加入预先配置好的ABC复合物混合液于孵箱内孵育30min。
(6)孵育结束后PBS洗2遍后加入配置好的显色液DAB(A:B＝1:50)，镜下观察组织显示出棕色时甩去显色液并与流水冲洗2-3遍。浸入苏木素40s，观察着色情况，如着色较浅则继续浸入。流水冲洗后干燥、固定、封片以及显微镜下观察。
如图5所示，HE染色后观察到实验例所得细胞聚合体结构更致密、细胞间连接更紧密，MASSON染色后观察到实验例含有较多血管组织和胶原结构且PCNA表达明显高于对比例，说明实验例所得到的乳牙牙髓干细胞聚合体组织特性更强、增殖能力也更强。
实施例2乳牙牙髓干细胞聚合体用于冻干牙延迟再植完全脱位年轻恒牙的初期临床试验
1.纳入标准
研究对象的纳入标准:年龄在7至12岁之间因外伤导致上前牙完全脱位的儿童；患牙完整但离体牙干燥保存大于3h(符合延期再植的条件)；患牙牙根未发育完全且口腔内有尚未替换的乳牙；患者身体无其他异常并同意签署知情同意书。
2.实验方法及流程
患儿，男，8周岁，2天前由外伤导致11，21牙完全脱位，体外干燥保存，家长在充分了解治疗方法及可能出现的各种并发症后签署知情同意书。初诊时，对该患儿进行血常规及全身检查，明确离体患牙牙根发育情况，而后用拔髓针从根方清除残留牙髓组织，超声震荡清洗根管及牙根表面，使用高速牙科手机(广东精美JINME)将牙根尖预备成形。而后将牙齿按冻干的详细步骤进行处理后备用。从健康53牙冠方开髓，取牙髓后进行SHED细胞聚合体的培养，而后进行53牙乳牙根管药物治疗术；复诊时，清理冲洗牙槽窝，冻干牙根管内倒充填自体SHED细胞聚合体，并于牙根表面包裹一层聚合体，而后再植入牙槽窝内，复位固定(半弹性固定1个月)，缝合创口，下领合垫抬高咬合；术后7天及6个月时分别对患者进行血清免疫学和淋巴细胞分析。
乳牙牙髓干细胞的分离培养及鉴定
1.乳牙牙髓干细胞的分离培养
分离培养的人乳牙牙髓干细胞SHED在形态上与恒牙牙髓干细胞(DPSC)相似，细胞略小，多为纺锤形或长梭形。根据以往文献选取Stro-1、CD90、CD105、CD146为阳性标记物，其阳性表达率分别为17.8％、90.28％、51.3％、35.89％；CD34、CD45为阴性标记物，其阳性表达率为1.07％、1.35％。结果提示该细胞为间充质干细胞来源，而非造血系来源的干细胞。
细胞免疫荧光显示CD31、CD90、CD146及DSP、NESTIN、GFAP、VEGF均为阳性表达，可见胞核周围阳性表达红色荧光信号。同时CD34则为阴性表达。
2.细胞增殖能力比较
MTT显示从第3天开始，乳牙牙髓干细胞较恒牙牙髓干细胞OD值较高，两组之间有统计学差异(P<0.05)。
克隆形成实验显示，肉眼观下，乳牙及恒牙牙髓干细胞培养皿内均可见蓝染的细胞克隆集落，显微镜下两组均可见细胞生长紧密，成集落簇状生长，乳牙牙髓干细胞克隆形成率略高于恒牙组。乳恒牙克隆集落数分别为321±1，216±8，两组间存在统计学差异(P<0.05)。
3.细胞成骨成脂分化能力的检测
茜素红染色显示成骨诱导后乳牙、恒牙牙髓干细胞镜下均可形成大量矿化结节；油红染色显示成脂诱导后两组镜下均可见多个红染脂滴。乳牙牙髓干细胞成骨、成脂诱导后OD值均高于牙髓干细胞组，并且具有统计学差异。
RT-PCR结果显示，乳牙、恒牙牙髓干细胞经过成骨诱导后，成骨相关基因ALP、OCN、COL-1、RUNX-2表达上调且具有统计学差异；在成脂诱导后成脂相关基因PPAR-y和LPL表达均有上调且具有统计学差异；同时乳牙牙髓干细胞有Oct4、Nanog胚胎性干细胞相关基因表达，成骨、成脂相关基因表达均高于牙髓干细胞组并且具有统计学差异。
此处定量PCR检测结果表明乳牙牙髓干细胞不仅有间充质干细胞特性，同时表达胚胎性干细胞相关基因，其诱导分化能力强于牙髓干细胞。
4.乳牙牙髓干细胞复苏
冻存于液氮内的SHED，储存2年后复苏，发现冻存后的干细胞增殖率多向分化能力与新鲜培养DPSC的差别无统计学意义。
5.乳牙牙髓干细胞聚合体的组织学检测
肉眼观察聚合体厚度适中，结构致密，质地较为坚韧，抗拉伸性能较好；；HE染色镜下观察可见聚合体内细胞量丰富，细胞间连接较为紧密，可见细胞间大量细胞外基质的存在。MASSON染色未能见到血管以及胶原纤维组织，同时免疫组化染色中PCNA为阳性提示细胞增殖能力较强，但DSP、NESTIN、CD31均为阴性结果。
实施例3乳牙牙髓干细胞聚合体用于冻干牙延迟再植完全脱位年轻恒牙的初期临床试验：
本实施例的受试者同上一实施例。
1.口腔常规检查
牙冠颜色正常有光泽，牙冠萌出高度与对侧同名牙一致；叩痛(一)，无冷热刺激痛，6个月复诊进行磨改实验时患牙对刺激有反应；一个月拆除固定装置时牙齿仍有I度松动，12个月复诊时动度正常。
2.放射学检查
RVG检查显示，6个月复诊发现根尖周无阴影、根管壁平滑无可见的炎性吸收区，牙周膜腔在牙颈部处略宽但连续完整、硬骨板清晰且连续；12个月复诊发现牙根牙根长度有所增加，根尖有一定的闭合趋势，但仍未完全闭合。
3.牙髓血流检测
术后6月多普勒血流检测结果分为11牙8.43、21牙9.11，术后12个月为11牙9.03，21牙9.68，与正常对照牙9-11的数值近似，提示牙髓血运状况良好。
4.牙髓活力检测
术后6月牙髓活力电测仪检测结果为11牙32，21牙35，下领同名牙数值分别为23和19，提示患牙牙髓出现活力。术后12个月时的测试结果为11牙25，21牙23，与下领同名牙20和19的测试值差异不大，提示牙髓活力与正常牙类似。
5.牙周组织检查
患牙3个月复诊时仍有I度松动，但随着复诊时间延长逐渐恢复了正常牙齿的生理性松动度。牙周探诊龋沟深度正常无牙龋出血。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳至博生物科技有限公司
<120> 脱落乳牙的牙髓干细胞聚合体及其制备方法和应用
<130> P19011828C
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oct4 Forward primer
<400> 1
gggagattga taactggtgt gtt 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oct4 Reverse primer
<400> 2
gtgtatatcc cagggtgatc ctc 23
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nanog Forward primer
<400> 3
tttgtgggcc tgaagaaaac t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nanog Reverse primer
<400> 4
agggctgtcc tgaataagca g 21
<210> 5
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ALP Forward primer
<400> 5
ccttgtagcc aggcccattg 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ALP Reverse primer
<400> 6
ggaccattcc cacgtcttca c 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OCN Forward primer
<400> 7
cccaggcgct acctgtatca a 21
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OCN Reverse primer
<400> 8
ggtcagccaa ctcgtcacag tc 22
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RUNX-2 Forward primer
<400> 9
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RUNX-2 Reverse primer
<400> 10
tccggagctc agcagaataa 20
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> COL-1 Forward primer
<400> 11
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<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> COL-1 Reverse primer
<400> 12
tggtcggtgg gtgactctg 19
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PPAR-r Forward primer
<400> 13
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PPAR-r Reverse primer
<400> 14
aactcaaact tgggctccat aaa 23
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LPL Forward primer
<400> 15
tccgtggcta cctgtcattc 20
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LPL Reverse primer
<400> 16
tctcatacat tcctgttacc gtcc 24

Claims (10)

1.一种脱落乳牙的牙髓干细胞聚合体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将来自于脱落乳牙的牙髓组织洗净，其中所述脱落乳牙为自然脱落或松动后经人工拔除，所述洗净为反复用PBS冲洗至表面无血液残留；
(2)所述牙髓组织经胶原酶I和Dispase消化至无成形牙髓组织，终止消化后获得细胞悬液，其中所述胶原酶I的浓度为100-300CDU/mL，所述Dispase的浓度为1-2.4U/mL；
(3)加入20-40mg/mL VC培养液培养以获得牙髓干细胞聚合体。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)后、所述步骤(3)之前还包括以下步骤：
(2.1)将所述细胞悬液用含血清和抗生素的a-MEM培养基培养，以获得牙髓干细胞；优选培养所述牙髓干细胞至80-85％汇合度；
(2.2)PBS冲洗所述牙髓干细胞，优选冲洗2-3遍；和/或，
(2.3)用胰蛋白酶消化所述牙髓干细胞以获得含单细胞的细胞悬液；
优选地，还包括以下步骤：
(2.4)检测所述牙髓干细胞的间充质干细胞标志物和/或胚胎干细胞标志物，和/或，在诱导成骨、成脂后检测成骨相关基因和/或成脂相关基因的表达；所述检测的结果为阳性。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)为：
以1-10×105/孔接种所述牙髓干细胞，并加入20-40mg/mL VC培养液培养后获得牙髓干细胞聚合体，和/或，所述培养为培养12-14天；优选地，所示胶原酶I的浓度为200CDU/mL，所述Dispase的浓度为2U/mL，所述VC培养液的浓度为30mg/mL，和/或，所述接种以6-8×105/孔优选7×105/孔接种。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述消化为在37℃孵箱内消化40min-1h，优选每隔5-l0min轻轻摇晃。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，
在所述步骤(2.1)中，所述血清为10％胎牛血清，所述抗生素为100U/mL青霉素和/或链霉素，所述培养在37℃、CO2饱和度为5％的恒温箱培养。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，
在所述步骤(2.3)中，所述胰蛋白酶的浓度为2-3％优选2.5％，所述消化的温度为37℃，和/或，所述消化的时间为30-60s优选40s。
7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，
在所述步骤(2.4)中，所述间充质干细胞标志物为Stro-1、CD34、CD45、CD90、CD105和CD146中的一种或多种，所述胚胎干细胞标志物为Oct4和/或Nanog，所述成骨相关基因为ALP、OCN、COL-1、RUNX-2，所述成脂相关基因为PPAR-r、LPL；优选地，所述间充质干细胞标志物使用流式细胞仪检测，所述胚胎干细胞标志物、所述成骨相关基因和/或成脂相关基因使用RT-PCR检测。
8.一种由权利要求1-7中任一项所述的制备方法制得的牙髓干细胞聚合体。
9.如权利要求8所述的牙髓干细胞聚合体在制备用于恒牙再植的制剂中的用途。
10.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述恒牙为年轻恒牙，优选完全脱位的年轻恒牙；更优选地，所述乳牙牙髓干细胞聚合体具有：抗炎症反应、抑制细胞凋亡、促进细胞增殖和血管生成的作用，和/或，可促进恒牙的牙髓再生及牙周愈合。
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