CN115044545A - 一种间充质干细胞及其制备方法 - Google Patents

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CN115044545A CN202210809965.XA CN202210809965A CN115044545A CN 115044545 A CN115044545 A CN 115044545A CN 202210809965 A CN202210809965 A CN 202210809965A CN 115044545 A CN115044545 A CN 115044545A
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Abstract

本申请提出了一种间充质干细胞及其制备方法，涉及干细胞培养技术领域。一种间充质干细胞的制备方法，其包括脐带预处理、去血管、植块接种、原代培养、再植、传代培养和收获、冻存等步骤。该制备方法可以显著缩短干细胞原代培养的周期(12‑16天)，且制备出的干细胞细胞活率及得率高，并具有良好的生物学活性。用上述指标方法所制备出的间充质干细胞具有以下优点：1、细胞活率高；2、具有多向分化的潜能；3、具有较强的向脂肪细胞和成骨细胞分化等的能力；4、细胞内具有多功能性基因的表达；5、该间充质干细胞的纯度较高，没有其他细胞的污染，6、具有较高的安全性。

Description

一种间充质干细胞及其制备方法
技术领域
本申请涉及干细胞培养技术领域，具体而言，涉及一种间充质干细胞及其制备方法。
背景技术
间充质干细胞是一类存在于多种组织(如骨髓、脐带血和脐带组织、胎盘组织、脂肪组织等)，具有多向分化潜力，非造血干细胞的成体干细胞。这类干细胞具有向多种间充质系列细胞(如成骨、成软骨及成脂肪细胞等)或非间充质系列的细胞分化潜能，并具有独特的细胞因子分泌功能。在体外可以分化诱导成骨、脂肪、软骨、神经等多种组织细胞。其具有向受损组织归巢并修复、重建受损或者病变的组织器官的特点，可以降低免疫排斥反应，提高移植成活率，使其成为当前成体干细胞研究的热点。人脐带结缔组织是间充质干细胞的丰富来源，相对于骨髓来源的间充质干细胞破坏侵入性分离过程而言，脐带间充质干细胞更加易获得，并对母亲和孩子均无损伤，使其成为细胞治疗中理想细胞而逐渐代替骨髓来源间充质干细胞。
目前对于脐带间充质干细胞分离的方法主要有贴壁法和酶消化法两种。其中贴壁法操作简便，对实验条件要求低，容易掌握。这种方法的缺点在于，获得原代细胞的周期长，液体的浮力使组织块漂起，使其丧失了长出细胞的能力，减少了细胞数量，此外，产物中混有部分内皮细胞，需要通过后期的酶消化处理进行进一步的筛选。采用胶原酶消化法虽然可在短时间内获得细胞，杂质少，但费用较高，并且条件不易掌握，如果常温中消化时间长可能损伤细胞，致使细胞不易贴壁和传代；如果消化时间短则液体粘稠，难以通过离心获得足够量细胞。而且目前已有的制备干细胞的培养方法，原代培养周期长，一般需要20-25天，生物活性也不高。因此开发一种可以快速稳定获取大量性状良好的干细胞的细胞培养技术显得尤为重要。
发明内容
本申请的目的在于提供一种间充质干细胞的制备方法，该制备方法可以显著缩短干细胞原代培养的周期，且制备出的干细胞具有良好的生物学活性。
本申请的另一目的在于提供一种间充质干细胞，该干细胞的细胞活率高；具有较强的成脂和成骨细胞分化能力；纯度较高，且具有较高的安全性。
本申请解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
一方面，本申请实施例提供一种间充质干细胞的制备方法，其包括以下步骤：
植块接种：将脐带预处理后得到的华通氏胶剪碎成1-1.5mm3的组织块，将所述组织块于无血清培养基中进行培养；
原代培养：植块接种后1-2天，补充无血清培养基，第4-5天半量更换无血清培养基；
再植：将原代培养后的产物离心去上清，再将组织块重铺于无血清培养基中，培养；
传代培养：原代细胞长至传代标准后，加入胰蛋白酶进行消化，终止消化后离心，保留细胞沉淀，所述细胞沉淀用无血清培养基重悬后，再进行接种培养；
收获、冻存：待细胞生长至融合度≥80％时进行细胞收获，收获后的细胞在液氮中长期保存。
另一方面，本申请实施例提供一种由上述间充质干细胞的制备方法所制备的充质干细胞。
相对于现有技术，本申请的实施例至少具有如下优点或有益效果：
1、本申请提供的一种间充质干细胞的制备方法，该制备方法操作简单，可以显著缩短干细胞原代培养的周期(12-16天)，且用该制备方法制备出的干细胞，细胞活率高，并具有良好的生物学活性。
2、本申请提供的一种间充质干细胞，该间充质干细胞的细胞活率及得率高；具有多向分化的潜能；具有较强的成脂肪细胞和成骨细胞分化能力；该干细胞内具有多功能性基因的表达；该间充质干细胞的纯度较高，没有其他细胞的污染，且具有较高的安全性。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本申请实验例1中P0代间充质干细胞形态图；
图2为本申请实验例1中P1代间充质干细胞形态图；
图3为本申请实验例1中细胞存活率及数据；
图4为本申请实验例1中间充质干细胞生长周期图；
图5为本申请实验例1中间充质干细胞生长曲线图；
图6为本申请实验例2中间充质干细胞碱性磷酸酶染色结果图；
图7为本申请实验例2中间充质干细胞成脂、成骨分化能力检测结果；
其中，图7A为成脂染色结果图，图7B为成骨染色结果图；
图8为本申请实验例2中多功能基因SSEA-4、OCT-4、SOX-2和NANOG基因PCR检测结果。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本申请。
一种间充质干细胞的制备方法，其包括以下步骤：
植块接种：将脐带预处理后得到的华通氏胶剪碎成1-1.5mm3的组织块，将所述组织块于无血清培养基中进行培养；
原代培养：植块接种后1-2天，补充无血清培养基，第4-5天半量更换无血清培养基；
再植：将原代培养后的产物离心去上清，再将组织块重铺于无血清培养基中，培养；
传代培养：原代细胞长至传代标准后，加入胰蛋白酶进行消化，终止消化后离心，保留细胞沉淀，所述细胞沉淀用无血清培养基重悬后，再进行接种培养；
收获、冻存：待细胞生长至融合度≥80％时进行细胞收获，收获后的细胞在液氮中长期保存。
经过对比，脐带组织块体积为1-1.5mm3，细胞的生长速度更快，组织块太大，细胞长出速度慢；组织块太小，操作时间长，脐带组织在外暴露时间长，不利于后续细胞生长。第4-5天半量更换无血清培养基，因为这个时候细胞还没有生长出来，全量换液会引起组织块漂浮，不利于细胞长出，而半量更换无血清培养基更有利于细胞的生长。
在本申请的一些实施例中，上述脐带预处理为：取脐带至培养皿中，止血钳夹住一端横截面端部组织，用另一把止血钳夹住外壁，将其撕脱开来，去除2根脐动脉和1根脐静脉，用生理盐水清洗至表面没有血液，如有清理不干净的地方，直接将此部分剪掉，弃用。用生理盐水清洗至表面没有血液，是为了使培养过程中不参杂有血细胞，因为有血细胞存在会影响细胞的培养。
在本申请的一些实施例中，上述脐带组织植块步骤中，每根脐带接种5-10个培养皿，上述培养皿的规格为60cm2或150cm2。接种培养皿的多少主要取决于脐带的长度和脐带的直径，组织块均匀铺满培养皿面积的50％-60％，组织块铺的太多，会影响细胞的长出，并影响整根脐带细胞的得率；组织块铺的太少，细胞生长相对缓慢。
在本申请的一些实施例中，上述植块接种步骤中，单个培养皿中加入的无血清培养基的量为3-4ml。无血清培养基里面主要是培养液，培养液加入太多，组织块容易漂浮，不容易固定在培养皿上，细胞也不容易长出；加3-4ml的培养液，刚好铺在组织块上，组织块既不漂移，也不会因缺少培养液而影响细胞的生长速度。
在本申请的一些实施例中，上述传代培养步骤中，采用3-5ml无血清培养基终止消化。细胞培养过程中用到的就是无血清培养基，终止消化用同样的培养基，可以保持pH值的稳定，培养基成分的稳定和均一。
在本申请的一些实施例中，上述离心为400-500g，离心4-6min。离心力低于400g，会有部分细胞离心不完全，不能正常收集，会引起细胞损伤；离心力高于500g会造成部分细胞死亡。
在本申请的一些实施例中，上述传代培养步骤中，接种的密度为1.2×104-1.5×104cells/cm2。组织块均匀铺满培养皿面积的50％-60％即可，组织块铺的太多，会影响细胞的长出，并影响整根脐带细胞的得率；组织块铺的太少，细胞生长相对缓慢。细胞生长具有聚集作用，细胞接种密度太低，细胞生长速度会减慢，影响细胞生长，同时细胞活力容易下降；细胞密度太大，细胞传代一次细胞得率太低，影响细胞整体数量。因此，在此接种密度范围内为合适。
在本申请的一些实施例中，上述消化步骤中，加入胰蛋白酶的量为3-5ml。胰蛋白酶具有消化细胞的作用，但使用量一定要控制在合适的量，满足刚好能细胞消化完细胞即可。胰蛋白酶量太少，不够铺满整个培养皿或培养皿，不利于细胞的消化；胰蛋白酶量太大，会导致消化速度太快，细胞可能发生损伤，同时增加胰蛋白酶的成本和终止消化的培养液的成本。
在本申请的一些实施例中，上述消化的时间为0.5-1.0min。经过长期细胞培养发现，细胞消化时间太长，细胞的活性和活率都会相应的下降，在此时间范围内为合适。消化液加到培养皿里铺满瓶底后，轻拍培养皿，细胞很快脱落，如果消化时间太长，细胞自然脱落的话，细胞的整体状态，增殖速度都会下降，传代后死亡率也会增多。
一种由上述间充质干细胞的制备方法所制备的间充质干细胞。
以下结合实施例对本申请的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
一种间充质干细胞的制备方法，其包括以下步骤：
脐带预处理：取新生儿脐带，将脐带剪成不超过10cm的小段，挤出残留的血液，将脐带段转入新的培养皿中，加入0.9％的生理盐水清洗；
去血管：取脐带段至弯盘或培养皿中，用止血钳夹住一端横截面端部组织，用另一把止血钳夹住外壁，将其撕脱开来，同时去除暴露的2根动脉和1根静脉，用生理盐水清洗至表面没有血液，如有清理不干净的地方，直接将此部分剪掉，弃用，再将剩余的华通氏胶剪碎，得到体积为1.5mm3的组织块；
植块接种：将上述组织块加入无血清培养基中，得到组织混悬液，将3ml上述组织混悬液加入到60cm2培养皿中，摇匀，于37℃，5％CO2培养箱中培养，每根脐带接种7个60cm2培养皿；
原代培养：植块接种后1天，每瓶补充5ml无血清培养基，第4天将培养皿中一半的无血清培养基进行换新；在培养至第12天左右，可以开始准备取样进行显微镜观察，50％以上的组织块周围爬出细胞且局部融合度在80％以上时，可以考虑收集组织，进行细胞传代及组织再植；若没有达到要求，可根据实际情况间隔1天或者几个小时再次进行取样观察，直至达到上述要求时开始进行细胞收获或者进行再植；培养期间，尽量减少移动培养皿；
再植：取上述原代培养中带有脐带组织块的60cm2培养皿，晃动培养皿，使组织块从瓶底脱落，将其倒入50ml离心管中，离心(400g，5min)弃上清，将组织块重新接种于新的60cm2培养皿中，每个60cm2培养皿加入5ml无血清培养基，于37℃，5％CO2培养箱中培养；
传代培养：去除培养皿中的组织块后，向60cm2培养皿中加入3ml0.25％胰蛋白酶进行消化，消化的时间为1.0min，再加入5ml无血清培养基终止消化，拍打培养皿两侧，使细胞脱落，得到细胞悬液，离心(400g，5min)，保留细胞沉淀，细胞沉淀用无血清培养基重悬，平均分装到5个75cm2培养皿中，于37℃，5％CO2培养箱中培养，其接种的密度为1.3×104cells/cm2。
收获、冻存：镜下观察，细胞生长至融合度80％或以上时，用生理盐水洗涤细胞2次，加入3ml 0.25％胰蛋白酶进行消化，消化的时间为1.0min，用5ml细胞培养上清液终止消化；离心(400g，5min)弃去上清；用无血清冻存液重新悬浮细胞沉淀后转入冻存管中，-80℃超低温冰箱中过夜保存后再转入液氮罐进行长期保存。
实施例2
本实施例与实施例1基本相同，区别在于：1、去血管步骤中，将剩余的华通氏胶剪碎，得到体积为1mm3的组织块；2、植块接种步骤中，每根脐带接种10个60cm2培养皿；3、原代培养：植块接种后2天，每瓶补充5ml无血清培养基，第5天将培养皿中一半的无血清培养基进行换新；4、传代培养步骤中，向60cm2培养皿中加入5ml 0.25％胰蛋白酶进行消化，消化的时间为0.5min，再加入3ml无血清培养基终止消化，离心条件为500g，4min；其接种的密度为1.2×104cells/cm2；5、收获、冻存步骤中，加入5ml 0.25％胰蛋白酶进行消化，消化的时间为0.5min，用3ml细胞培养上清液终止消化；离心(500g，4min)弃去上清。
实施例3
本实施例与实施例1基本相同，区别在于：1、去血管步骤中，将剩余的华通氏胶剪碎，得到体积为1.3mm3的组织块；2、植块接种步骤中，将3.5ml上述组织混悬液加入到60cm2培养皿中，每根脐带接种7个60cm2培养皿；3、原代培养：植块接种后1.5天，每瓶补充5ml无血清培养基；4、传代培养步骤中，向60cm2培养皿中加入4ml 0.25％胰蛋白酶进行消化，消化的时间为0.8min，再加入4ml无血清培养基终止消化；5、收获、冻存步骤中，加入3ml0.25％胰蛋白酶进行消化，消化的时间为0.8min，用4ml细胞培养上清液终止消化。
实施例4
一种间充质干细胞的制备方法，其包括以下步骤：
脐带预处理：取新生儿脐带，将脐带剪成不超过10cm的小段，挤出残留的血液，将脐带段转入新的培养皿中，加入0.9％的生理盐水清洗；
去血管：取脐带小段至弯盘或培养皿中，用止血钳夹住一端横截面端部组织，用另一把止血钳夹住外壁，将其撕脱开来，同时去除暴露的2根动脉和1根静脉，用生理盐水清洗至表面没有血液，如有清理不干净的地方，直接将此部分剪掉，弃用，再将剩余的华通氏胶剪碎，得到体积为1.2mm3的组织块；
植块接种：将上述组织块加入无血清培养基中，得到组织混悬液，将4ml上述组织混悬液加入到60cm2培养皿中，摇匀，于37℃，5％CO2培养箱中培养，每根脐带接种6个60cm2培养皿；
原代培养：植块接种后1天，每瓶补充5ml无血清培养基，第4.5天将培养皿中一半的无血清培养基进行换新；在培养至第12天左右，可以开始准备取样进行显微镜观察，50％以上的组织块周围爬出细胞且，可以收集组织，进行细胞传代及组织再植；若没有达到要求，可根据实际情况间隔1天或者几个小时再次进行取样观察，直至达到上述要求时开始进行细胞收获或者进行再植；培养期间，尽量减少移动培养皿；
再植：取上述原代培养中带有脐带组织块的60cm2培养皿，晃动培养皿，使组织块从瓶底脱落，将其倒入250ml离心管中，离心(450g，6min)弃上清，将组织块重新接种于新的150cm2培养皿中，每个175cm2培养皿加入5ml无血清培养基，于37℃，5％CO2培养箱中培养；
传代培养：去除培养皿中的组织块后，向150cm2培养皿中加入5ml0.25％胰蛋白酶进行消化，消化的时间为1.0min，再加入5ml无血清培养基终止消化，拍打培养皿两侧，使细胞脱落，得到细胞悬液，离心(450g，6min)，保留细胞沉淀，细胞沉淀用无血清培养基重悬，平均分装到5个175cm2培养瓶中，于37℃，5％CO2培养箱中培养，其接种的密度为1.5×104cells/cm2。
收获、冻存：待细胞生长至融合度80％或以上时，用PBS洗涤细胞2次，加入5ml0.25％胰蛋白酶进行消化，消化的时间为1.0min，用10ml细胞培养上清液终止消化；离心(450g，6min)弃去上清；用无血清冻存液重新悬浮细胞沉淀后转入冻存管中，-80℃超低温冰箱中过夜保存后再转入液氮罐进行长期保存。
实施例5
本实施例与实施例4基本相同，区别在于：1、传代培养中，加入4ml无血清培养基终止消化，消化的时间为0.7min；2、离心条件均为400g，离心5min；3、收获、冻存步骤中，用4ml细胞培养上清液终止消化。
实验例1
本实验例采用实施例1所制备的间充质干细胞进行以下实验：
1、形态学观察：从培养箱中取出正在培养的脐带间充质干细胞培养皿或培养瓶，倒置于显微镜载物台上，调节放大倍数进行观察，其P0、P1代间充质干细胞如图1和图2所示。
由图1和图2可以看出，细胞贴壁生长，单个细胞呈纺锤形或梭形，细胞集落呈旋涡状或放射状生长。
2、细胞存活率测定：取P0-P3代的间充质干细胞消化后收获的细胞，用细胞活力分析仪检测活细胞和总细胞数，通过活细胞和中细胞比例得出细胞存活率，其结果如图3所示。
由图3可知，获得的细胞数为5.37×106cells/ml，活细胞数5.33×106cells/ml，细胞存活率(viability)为99.2％，上述结果表明，该间充质干细胞的细胞活率较高。
3、细胞增殖特性测定：将P2-P6代细胞以1×105cells/孔的密度接种于两个6孔细胞培养板中，每孔加无血清培养基2mL；置于37℃，5％CO2培养箱中培养。细胞接种10h后，收集2孔细胞量，4℃，1200r/min离心6min；弃上清，将离心管底细胞轻微漩震，加0.5L PBS制成细胞悬液，转移到细胞活力分析仪样品管内；每个样本共测6个点，每个测样点间隔12h(浓度在5×105-1×107cells/mL检测效果最佳)。将样品管置于自动进样转盘上，创建新生物过程，在Vi-Cell细胞活力分析仪上标注样品ID，选择细胞类型为间充质干细胞，仪器自动分析细胞大小和增殖曲线，其细胞生长周期与细胞生长曲线分别如图4和图5所示。
由图4可以看出，间充质干细胞增殖具有潜伏期、对数生长期、平台期，呈典型的“S”型生长。
由图5可以看出，G0/G1期细胞占总的72.12％，峰位于横座标的63.24；G2/M期占15.37％，峰位于横座标的123.32，S期占12.52％，G2/G1为1.95(即G2期为4倍体细胞，而G1期为2倍体细胞，比值为1.95)，峰的变异系数(CV)为2.06％，一般CV越小，峰形越好，越尖锐，CV值低于10％为认可标准；细胞碎片为2.38％，细胞聚集体有1.86％。总的细胞数(仪器检测到的)为7662个，在细胞周期中分析的细胞数为7337个(即排除了碎片及聚集体后)；RCS拟合度为2.764，表示拟合的曲线与真实结果的吻合程度(一般小于3是最好的，3-5较好，大于5不是很好)；细胞增殖指数为S+G2/M，即15.37+12.52＝27.89，在10-50之间，表明该脐带间充质干细胞有丝分裂旺盛，增殖能力强及可维持细胞性状稳定。
实验例2
本实验例采用实施例1所获得的间充质干细胞进行实验，本实验例主要目的是检测该间充质干细胞的多能性。
1、对脐带间充质干细胞进行碱性磷酸酶(AKP)染色
AKP在碱性(pH 9.0-9.8)缓冲液中，水解磷酸萘酚，生成萘酚，后者与重氮盐偶联，生成不溶性的有色沉淀，定位于胞质中的酶活性部位。多能干细胞能高水平表达AKP，细胞一旦分化，AKP表达水平显著下降。因此，AKP染色是一种有效的检测干细胞是否分化的手段。
将实施例1所制备的将P3-P6代脐带间充质干细胞以1×105/孔的密度接种于24孔板中，每孔加1mL无血清培养基，置于37℃，5％CO2培养箱中孵育，镜检观察，当细胞生长至60％-80％，方可进行碱性磷酸酶(AKP)染色。染色结束后，于显微镜下观察染色结果，其染色结果如图6所示，其判定标准如下：
阴性：胞浆中无咖啡色或深棕色颗粒；
弱阳性：胞浆中偶见或有少量咖啡色或深棕色颗粒；
阳性：可见显著深棕色或咖啡色或黑色颗粒、块状、条状沉淀充满胞浆中。
由图5可见，碱性磷酸酶表达检测结果呈阳性，表明该间充质干细胞具有多向分化的潜能。
2、诱导分化能力检测(成脂、成骨分化能力)
对脐带间充质干细胞进行体外向成脂肪细胞、成骨细胞诱导分化，并用油红O对成脂肪细胞进行鉴定，用茜素红对成骨细胞进行鉴定。
脐带间充质干细胞在含有胎牛血清、地塞米松、胰岛素、吲哚乙酸和1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤的培养基中可以向脂肪细胞分化。在成脂诱导过程中，胞浆中不断有油滴累积，并不断增多变大，最后整个细胞的胞浆充满油滴。油红O(Oil Red O)是一种油溶性偶氮染料。利用其油溶性，对脂肪细胞的结构进行着色，而其本身对其它的细胞结构着色性差。
脐带间充质干细胞在含有胎牛血清、地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸盐和骨形态发生蛋白的培养基中，可以向成骨细胞分化。成骨诱导的过程是使钙离子能够以钙盐的方式沉淀下来，也就是“钙结节”。而茜素红是一种易溶于水的有机化合物，能与钙发生显色反应，产生一种深红色的带色化合物，这样成骨诱导的细胞外面沉积的钙结节也就被染成了深红色。
2.1成脂诱导
将P3-P6代脐带间充质干细胞以2×104cells/cm2的密度接种到6孔板上，放入37℃，5％CO2恒温培养箱中培养。待细胞达到100％汇合后，温和吸弃旧培养液，加入2mL成脂诱导分化培养基诱导液，三天后更换成脂分化培养基维持液，24h后再更换为成脂诱导液，如此进行3个循环，当脂滴出现较多但较小时，可以用成脂维持液维持7天(每3天换液一次)，待脂滴增大，结束诱导分化，进行油红O染色实验。
2.1.1油红O染色
成脂诱导结束后，吸弃培养基PBS清洗3min；然后用4％多聚甲醛固定细胞30min；吸弃固定液，每孔加1mL PBS清洗细胞两次，每次3min；加1mL油红O工作液加到细胞中染色30min；吸弃染色液，每孔加1mL PBS清洗细胞2-3次，每次3min；倒置显微镜下观察拍照，其结果如图7A所示。
2.1.2结果分析
其结果判定标准如下：
阴性结果：细胞形态未发生明显变化，油红O染色没有或罕见红色化合物。
阳性结果：诱导生成的成脂细胞细胞形态由长梭形变椭圆形，胞浆内形成圆形脂肪泡，与油红O发生显色反应，产生深红色球状化合物。
从图7A可以看出该间充质干细胞经诱导后出现很明显的脂滴，说明细胞具有较强的向脂肪细胞分化的能力。
2.2成骨诱导
将P3-P6代脐带间充质干细胞以3×104cells/cm2的密度接种到6孔板中，每孔加入2mL新鲜培养基，放入37℃、5％CO2培养箱中培养；24h后，温和吸弃旧培养基，每孔添加新鲜配制的人脐带间充质干细胞成骨诱导分化培养基2mL；每3天换液新培养基；持续诱导2-3周后，“钙结节”形成后，进行成骨分化结果染色。
2.2.1茜素红染色鉴定
成骨诱导结束后，温和吸弃成骨诱导液，每孔用1mL PBS缓冲液清洗3次，每次3min；清洗结束后，每孔加1mL 4％多聚甲醛固定细胞30min；吸弃固定液，每孔加1mL PBS清洗细胞两次，每次3min；每孔细胞加1mL茜素红工作液染色3-5min；吸弃染色液，每孔加1mLPBS清洗细胞2-3次，每次3min；倒置显微镜下观察染色结果并拍照，其结果如图7B所示。
2.2.2结果分析
从图7B可以看出诱导分化的细胞已经形成骨细胞钙化结节，说明该间充质干细胞具有向成骨细胞分化能力。
3、多能性基因SSEA-4、OCT-4、SOX-2和NANOG表达情况
用RT-PCR法，对脐带间充质干细胞进行RNA水平鉴定。
样品经过提取DNA后，针对SOX-2、SSEA-4、NANOG以及OCT-4四个多能性基因mRNA序列设计引物，通过反转录PCR获得cDNA样本，然后以cDNA为模板进行PCR扩增，根据扩增结果，定性分析脐带间充质干细胞在RNA水平的多能性。
PCR扩增产物电泳检测：
用电泳缓冲液(1×TBE或TAE)制备2％琼脂糖凝胶(其中在55℃-60℃左右加入EB至终浓度为0.5μg/mL。也可在电泳后进行染色)。将10μL PCR扩增产物分别和2μL上样缓冲液混合后，进行点样，用500bp Ladder DNA Marker或相应的DNA Marker做相对分子质量标记。3V/cm-5V/cm恒压，电泳20min，凝胶成像仪观察并分析记录，其结果如图8所示。
结果判定标准如下：
阳性结果：各泳道在β-Actin同等程度清晰情况下，脐带间充质干细胞多能性基因在相应分子量大小位置出现明亮条带；
阴性结果：各泳道在β-Actin同等程度清晰情况下，脐带间充质干细胞多能性基因在相应分子量大小位置未出现条带。
从图8可以看出脐带间充质干细胞的4个多能性基因均在相应分子量大小位置出现明亮条带，表明充质干细胞的4个多能性基因在细胞内均进行了表达。
实验例3
本实验例采用实施例1所制备的间充质干细胞进行实验，本实验例主要目的是利用流式细胞仪检测该间充质干细胞的纯度。
以CD分子及HLA表达水平作为脐带间充质干细胞纯度检验指标。阴性指标为CD11b、CD14、CD19、CD34、CD45及HLA-DR；阳性指标为HLA-ABC、CD105、CD29、CD44、CD73及CD90；相关指标要求见表1。
收集1×105个P3-P6代细胞加500μL PBS缓冲液制成细胞悬液，加入流式样品管内；按抗体说明书分别向每管细胞悬液内加适量带荧光标记的抗体或同型对照，涡旋混匀后置于4℃冰箱内避光孵育30min；从冰箱中取出各管细胞，4℃，1200r/min，离心5min，弃去上清，重新加入1mL PBS缓冲液漩涡震荡混匀以清洗残留抗体，重复清洗2次后加入500μLPBS缓冲液重悬混匀，过300目筛后加入流试样品管，2h内完成上机检测，其检测结果如表1所示。
表1脐带间充质干细胞纯度检测结果
Figure BDA0003740158050000181
如表1所示，本申请所提供的制备方法制备的间充质干细胞，CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和HLA-ABC的阳性率都大于95％；而CD11b、CD14、CD19、CD34、CD45及HLA-DR的阳性率都低于1％。上述实验结果表明该间充质干细胞的纯度较高，没有其他细胞的污染。
实验例4
本实验例采用实施例1所制备的间充质干细胞进行实验，本实验例主要目的是检测该间充质干细胞的安全性。
对实施例1所制备的间充质干细胞进行安全指标检测，以外源污染物和细胞内外源致病因子作为间充质干细胞安全性指标，相关要求见表2。
表2脐带间充质干细胞安全性检测指标
Figure BDA0003740158050000191
经检测，所有的检测指标均呈阴性，表明本申请所提供的间充质干细胞安全性较高。
综上所述，本申请实施例的一种间充质干细胞及其制备方法，脐带组织块体积为1-1.5mm3，细胞的生长速度更快；进一步的，控制接种的密度为1.2×104-1.5×104cells/cm2，组织块均匀铺满培养皿面积的50％-60％即为合适，这样细胞后面贴壁生长时会更分布的更加均匀，不会出现扎堆生长的情况出现，更有利于细胞的生长环境，从而加快细胞的生长速度和提高细胞的存活率和生物学活性。组织块铺的太多，会影响细胞的长出，并影响整根脐带细胞的得率；组织块铺的太少，细胞生长相对缓慢。此外，单个培养皿中加入的无血清培养基的量为3-4ml。无血清培养基里面主要是培养液，培养液加入太多，组织块容易漂浮，不容易固定在培养皿上，细胞也不容易长出；加3-4ml的培养液，刚好铺在组织块上，组织块既不漂移，也不会因缺少培养液而影响细胞的生长速度。在干细胞的培养过程中，需要对其生长的各个环节进行把控，协同作用下，才能使最后获得的干细胞活率及得率高且生物活性好，还能缩短细胞生长周期(12-16天)。
用本申请提供的干细胞制备方法所制备出的间充质干细胞具有以下优点：1、细胞活率及得率高；2、具有多向分化的潜能；3、具有较强的向脂肪细胞和成骨细胞分化等的能力；4、细胞内具有多功能性基因的表达；5、该间充质干细胞的纯度较高，没有其他细胞的污染，6、具有较高的安全性。
以上所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。本申请的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本申请的范围，而是仅仅表示本申请的选定实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保的范围。

Claims (10)

1.一种间充质干细胞的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：
植块接种：将脐带预处理后得到的华通氏胶剪碎成1-1.5mm3的组织块，将所述组织块于无血清培养基中进行培养；
原代培养：植块接种后1-2天，补充无血清培养基，第4-5天半量更换无血清培养基；
再植：将原代培养后的产物离心去上清，再将组织块重铺于无血清培养基中，培养；
传代培养：原代细胞长至传代标准后，加入胰蛋白酶进行消化，终止消化后离心，保留细胞沉淀，所述细胞沉淀用无血清培养基重悬后，再进行接种培养；
收获、冻存：待细胞生长至融合度≥80％时进行细胞收获，收获后的细胞在液氮中长期保存。
2.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述脐带预处理为：取脐带至培养皿中，止血钳夹住一端横截面端部组织，用另一把止血钳夹住外壁，将其撕脱开来，去除2根脐动脉和1根脐静脉，用生理盐水清洗至表面没有血液，如有清理不干净的地方，直接将此部分剪掉，弃用。
3.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述植块接种步骤中，每根脐带接种5-10个培养皿，所述培养皿的规格为60cm2或150cm2。
4.根据权利要求3所述的一种间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述植块接种步骤中，单个培养皿中加入无血清培养基的量为3-4ml。
5.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述传代培养步骤中，采用3-5ml无血清培养基终止消化。
6.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述离心为400-500g，离心4-6min。
7.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述传代培养步骤中，接种的密度为1.2×104-1.5×104cells/cm2。
8.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述胰蛋白酶的加入量为3-5ml。
9.根据权利要求8所述的一种间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述消化的时间为0.5-1.0min。
10.一种如权利要求1-9任一项所述的间充质干细胞的制备方法所制备的间充质干细胞。
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