CN104862274A - 高效分离脐带间充质干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种高效分离脐带间充质干细胞的方法。本发明直接从脐带内分离华通氏胶，避免了杂细胞的污染，无需多次传代，保证了细胞的纯度和活力；能有效的减少脐带分离过程的污染，且能降低分离的成本。在分离过程中不需要机械破碎脐带，减少机械剪切力对细胞的损害，获得的细胞活率更高；由于在分离过程中未采用异种消化酶和异种血清，所以所得到的细胞不含异种蛋白，也更安全，可以满足临床使用的需要，也为建立脐带间充质干细胞库提供了技术保障；采用组织块法的方法，更加方便和快捷，对细胞损伤小，能最大可能的保护间充质干细胞，不受损伤，使其具有更高活率。

Description

高效分离脐带间充质干细胞的方法

技术领域

本发明涉及生物科学技术领域，尤其是一种高效分离脐带间充质干细胞的方法。

背景技术

间充质干细胞 (mesenchyma1 stem cells ，MSC_S) 是来源于发育早期中胚层和外 胚层的一类多能干细胞，最初在骨髓中发现，因其具有以下特点；1 造血支持作用。作为造血微环境主要细胞成分－基质细胞系的干/祖细胞,MSC_S与造血干细胞共同移植可促进 造血干祖细胞的植入。 2免疫调控。MSC_S不表达 CD80 ，CD86 ，HLA-DR 等协同剌激分子，体外可抑制混合淋巴细胞反应，对于预防和治疗异基因造血细胞移植后引起的移植物抗宿主 病，治疗自身免疫系统疾病有重要意义。3基因治疗。由于 MSC_S体外扩增、增殖能力强，可以作为基因操作的干细胞平台，加之MSC具有对肿瘤的靶向性，在肿瘤的基因治疗中有着十分诱人的前景。4 多向分化潜能。在体外特定的诱导条件下可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌脏、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多 向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于组织工程。

脐带是连接胎儿与胎盘问的索状结构，外被羊膜包围，内含茹液性的结缔组织，该结缔组织内有脐动脉和脐静脉。血管周围被乳蛋白样组织所包裹，后者被称为华通氏胶 (Wharton S jelly) ，它富含透明质酸，形成了成纤维细胞周围的水凝胶结构。目前己有众多研究组从脐带中分离出能形成成纤维细胞集落形成单位 (CFU-F)的细胞，这些细胞符合国际细胞治疗协会 (The Internationa1   Society for Ce11u1ar Therapy，ISCT) 制定的 最低标准【 Cytotherapy(2006)Vo1.8，No.4，315-317 】; (1)贴壁(塑料材质培养器皿)生长能力；(2)细胞表型：应该表达的一类表型 CD73 、CD90 和 CD105 必须阳性，阳性率不低于 95%; 同时为了确保 MSC  中没有混杂原代分离培养物中存在的一些细胞，选取一组己去口的 MSC不表达的表型做为辅助的排查标准， CD34 (造血祖细胞和内皮细胞标记)、 CD45 (白细胞标记)、 CD14/CDllb   (单核细胞和巨噬细胞标记)、CD79α/CD19   (B 细胞标记)和 HLA-DR  阴性，阳性 率不高于 2% ; (3) 多向分化潜能，包括向骨、软骨、脂肪分化的能力。

目前的研究结果显示，脐带组织中的问充质干细胞主要分布在:①脐带血管周围，从人脐带血管内皮和内皮下分离出形态学和免疫表型类似于 BM-MSC 的细胞，并表现出多向分化潜能;②华通氏胶 (Wharton' s Je11y)，在华通氏胶中发现了一种细胞，具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。这两种细胞均为间充质干细胞，同样具有多向分化能力，同样具有免疫调节洁性。

目前，己经有多个单位申请了脐带间充质干细胞分离的专利，这些专利从脐带中获得间充质干细胞的方法多为用胶原酶或混合酶消化而获得或者是组织块贴壁法。这些方法的一个共同特点是需要将脐带组织通过机械力破碎。由于产妇大部分生产方式为顺产，在生产过程中，尤其是顺产过程中会导致脐带外 表携带细菌等微生物。虽然在分离脐带间充质干细胞过程前会对脐带进行清洗，但这并不 能完全去除脐带表面携带的细菌等微生物，在机械力破碎脐带的过程会导致分离的细胞被 污染。目前，国内外己经建立了多个脐带间充质干细胞库，对每个保存脐带间充质干细胞的储户来说，干细胞资源是独一无二的，细胞污染是很难被接受的，所以开发新的工艺迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的是：提供一种高效分离脐带间充质干细胞的方法，它对细胞损伤小，能更快的得到完全来自母体的脐带间充质干细胞。

本发明是这样实现的：高效分离脐带间充质干细胞的方法，包括如下步骤：

1) 华通氏胶的分离：将采集瓶中采集液倒出，仅保留脐带在采集瓶中；加入质量百分比为75%的酒精将脐带完全浸没，并浸泡2分钟；再将脐带转移到培养皿中，用生理盐水清洗2次，直至脐带表面不含血迹；将清洗过的脐带两端去除，并去除动脉血管、静脉血管和羊膜，分离出华通氏胶，放入培养皿中用生理盐水清洗；清洗完成后将华通氏胶剪成1-4mm³的小块,并转移至50ml离心管中；

2）将剪碎的华通氏胶接种到2个T-75培养瓶中，每瓶不少于1.0g，再向每个培养瓶中加入9ml完全培养基，将培养瓶水平放入 37℃,体积百分比为5%的 CO₂培养箱中培养；

3）换液：每5天换液一次，直至达到60–70%的融合率；然后将培养基分别倒入50ml离心管中，并标记，在2000rpm下离心5分钟，去除上清；向每个离心管中加入9ml新鲜的完全培养基，并充分混合均匀；将培养基从50ml离心管中转移到原来的培养瓶中，并在培养瓶上标记换液日期；将培养瓶水平放入 37℃,体积百分比为5%的 CO₂培养箱中培养；每4-5天在显微镜下观察生长情况，当细胞达到60%-70%融合时进行收集；

4）传代：将用过的培养基收集到50ml离心管中，在2000rpm下离心5分钟；再用10-20 ml 的生理盐水清洗T-75培养瓶1次；向清洗后的每个T-75培养瓶中加入3ml预热到室温的质量百分比为0.125%的胰酶；在显微镜下观察，直至有80%的细胞变圆脱落漂浮，即用静置后的培养基上清终止消化，消化过程在室温条件下2分钟；将离心管中剩余组织块倒入1个新的T-75培养瓶中，加入8ml完全培养基作为备份；用10-20 ml 的生理盐水清洗一遍T-75培养瓶，洗液也倒入50ml离心管中；用细胞滤器过滤细胞悬液去除细胞组织块；将过滤好的细胞悬液收集到一个新的50ml离心管中；取0.5ml过滤后的细胞悬液计数，测活力；根据计数和活力结果，按照8×10³/cm²-1×10⁴/cm²的接种密度选择T-175培养瓶或T-75培养瓶；将需要的细胞离心300g10分钟，去除上清；在离心管中加入5ml的完全培养基吹散细胞，再加入20ml完全培养基充分混匀；将细胞悬液接种细胞到1个T-175培养瓶中，将培养瓶水平放入 37℃,体积百分比为5%的 CO₂培养箱中培养；每天在显微镜下观察生长情况，当细胞达到80%-90%融合时进行收集；

5）收集：将用过的培养基收集到50ml离心管中，将收集培养基300g离心5分钟；用20 ml 的生理盐水清洗T-175培养瓶1次，并向每瓶加入6ml预热过的质量百分比为0.125%的胰酶，在显微镜下观察，直至有80%的细胞变圆脱落漂浮，即用离心后的培养基上清终止消化，消化过程室温条件下2分钟；将终止的细胞悬液收集到一个50ml离心管中；用20 ml 的生理盐水清洗一遍T-175培养瓶，洗液也倒入50ml离心管中，并将洗液300g离心10分钟；

6）冻存: 用5ml完全培养基稀释细胞团块，再加入20ml培养基混合均匀；从细胞悬液中取1-2滴进行细胞计数和活力测定，活力需达到85%以上，细胞数达到8x10⁸以上，取流式，流式检测细胞数需达到2x10⁶；将300g细胞悬液离心5min；在收集到的细胞团中加入2ml 完全培养基、并打散，再加入2ml  4℃预冷30分钟的含质量百分比20%的DMSO的冻存液，并混合均匀；将4ml细胞悬液加入到3个冻存管中，每管1.3ml，每管的细胞数为 2x10⁶；最后利用程序降温盒或程控降温仪冻存细胞。

由于采用了以上技术方案，本发明直接从脐带内分离华通氏胶，避免了杂细胞的污染，无需多次传代，保证了细胞的纯度和活力；能有效的减少脐带分离过程的污染，且能降低分离的成本。在分离过程中不需要机械破碎脐带，减少机械剪切力对细胞的损害，获得的细胞活率更高；由于在分离过程中未采用异种消化酶和异种血清，所以所得到的细胞不 含异种蛋白，也更安全，可以满足临床使用的需要，也为建立脐带间充质干细胞库提供了技术保障；采用组织块法的方法，更加方便和快捷，对细胞损伤小，能最大可能的保护问充质干细胞，不受损伤，使其具有更高活率。本发明简单易行，成本低廉，使用效果好。

附图说明

图 1为本发明的脐带间充质干细胞快速增殖图片；

图2为本发明的脐带间充质干细胞表面标志物鉴定。

具体实施方式

本发明的实施例：高效分离脐带间充质干细胞的方法，包括如下步骤：

1) 华通氏胶的分离：将采集瓶中采集液倒出，仅保留脐带在采集瓶中；加入质量百分比为75%的酒精将脐带完全浸没，并浸泡2分钟；再将脐带转移到培养皿中，用生理盐水清洗2次，直至脐带表面不含血迹；将清洗过的脐带两端去除，并去除动脉血管、静脉血管和羊膜，分离出华通氏胶，放入培养皿中用生理盐水清洗；清洗完成后将华通氏胶剪成1-4mm³的小块,并转移至50ml离心管中；

2）将剪碎的华通氏胶接种到2个T-75培养瓶中，每瓶不少于1.0g，再向每个培养瓶中加入9ml完全培养基，将培养瓶水平放入 37℃,体积百分比为5%的 CO₂培养箱中培养；

3）换液：每5天换液一次，直至达到60–70%的融合率；然后将培养基分别倒入50ml离心管中，并标记，在2000rpm下离心5分钟，去除上清；向每个离心管中加入9ml新鲜的完全培养基，并充分混合均匀；将培养基从50ml离心管中转移到原来的培养瓶中，并在培养瓶上标记换液日期；将培养瓶水平放入 37℃,体积百分比为5%的 CO₂培养箱中培养；每4-5天在显微镜下观察生长情况，当细胞达到60%-70%融合时进行收集；

4）传代：将用过的培养基收集到50ml离心管中，在2000rpm下离心5分钟；再用10-20 ml 的生理盐水清洗T-75培养瓶1次；向清洗后的每个T-75培养瓶中加入3ml预热到室温的质量百分比为0.125%的胰酶；在显微镜下观察，直至有80%的细胞变圆脱落漂浮，即用静置后的培养基上清终止消化，消化过程在室温条件下2分钟；将离心管中剩余组织块倒入1个新的T-75培养瓶中，加入8ml完全培养基作为备份；用10-20 ml 的生理盐水清洗一遍T-75培养瓶，洗液也倒入50ml离心管中；用细胞滤器过滤细胞悬液去除细胞组织块；将过滤好的细胞悬液收集到一个新的50ml离心管中；取0.5ml过滤后的细胞悬液计数，测活力；根据计数和活力结果，按照8×10³/cm²-1×10⁴/cm²的接种密度选择T-175培养瓶或T-75培养瓶；将需要的细胞300g离心10分钟，去除上清；在离心管中加入5ml的完全培养基吹散细胞，再加入20ml完全培养基充分混匀；将细胞悬液接种细胞到1个T-175培养瓶中，将培养瓶水平放入 37℃,体积百分比为5%的 CO₂培养箱中培养；每天在显微镜下观察生长情况，当细胞达到80%-90%融合时进行收集；

5）收集：将用过的培养基收集到50ml离心管中，将收集培养基300g离心5分钟；用20 ml 的生理盐水清洗T-175培养瓶1次，并向每瓶加入6ml预热过的质量百分比为0.125%的胰酶，在显微镜下观察，直至有80%的细胞变圆脱落漂浮，即用离心后的培养基上清终止消化，消化过程室温条件下2分钟；将终止的细胞悬液收集到一个50ml离心管中；用20 ml 的生理盐水清洗一遍T-175培养瓶，洗液也倒入50ml离心管中，并将洗液300g离心10分钟；

6）冻存: 用5ml完全培养基稀释细胞团块，再加入20ml培养基混合均匀；从细胞悬液中取1-2滴进行细胞计数和活力测定，活力需达到85%以上，细胞数达到8x10⁸以上，取流式，流式检测细胞数需达到2x10⁶；将300g细胞悬液离心5min；在收集到的细胞团中加入2ml 完全培养基、并打散，再加入2ml  4℃预冷30分钟的含质量百分比20%的DMSO的冻存液，并混合均匀；将4ml细胞悬液加入到3个冻存管中，每管1.3ml，每管的细胞数为 2x10⁶；最后利用程序降温盒或程控降温仪冻存细胞。

流式细胞仪检测

采用流式细胞仪对第 3 代 UC-MSCs 进行表面标记的鉴定。结果发现，UC-MSCs 高表达基质细胞与干细胞标记 CD29、CD44、CD105，其阳性表达率分别为 99.9%、99.8%和 99.7%，阳性率均 90%以上，而低表达内皮与造血干细胞标记 CD34 与 CD45，其阳性率分别为 0.6%与 0.7%。如图2所示

本发明所述并不限于具体实施方式中所述的实施例，本领域技术人员根据本发明的技术方案得出其他的实施方式，同样属于本发明的技术创新范围。显然本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术范围内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (1)

1.一种高效分离脐带间充质干细胞的方法，其特征在于：包括如下步骤：

1) 华通氏胶的分离：将采集瓶中采集液倒出，仅保留脐带在采集瓶中；加入质量百分比为75%的酒精将脐带完全浸没，并浸泡2分钟；再将脐带转移到培养皿中，用生理盐水清洗2次，直至脐带表面不含血迹；将清洗过的脐带两端去除，并去除动脉血管、静脉血管和羊膜，分离出华通氏胶，放入培养皿中用生理盐水清洗；清洗完成后将华通氏胶剪成1-4mm³的小块,并转移至50ml离心管中；

2）将剪碎的华通氏胶接种到2个T-75培养瓶中，每瓶不少于1.0g，再向每个培养瓶中加入9ml完全培养基，将培养瓶水平放入 37℃,体积百分比为5%的 CO₂培养箱中培养；

3）换液：每5天换液一次，直至达到60–70%的融合率；然后将培养基分别倒入50ml离心管中，并标记，在2000rpm下离心5分钟，去除上清；向每个离心管中加入9ml新鲜的完全培养基，并充分混合均匀；将培养基从50ml离心管中转移到原来的培养瓶中，并在培养瓶上标记换液日期；将培养瓶水平放入 37℃,体积百分比为5%的 CO₂培养箱中培养；每4-5天在显微镜下观察生长情况，当细胞达到60%-70%融合时进行收集；

4）传代：将用过的培养基收集到50ml离心管中，在2000rpm下离心5分钟；再用10-20 ml 的生理盐水清洗T-75培养瓶1次；向清洗后的每个T-75培养瓶中加入3ml预热到室温的质量百分比为0.125%的胰酶；在显微镜下观察，直至有80%的细胞变圆脱落漂浮，即用静置后的培养基上清终止消化，消化过程在室温条件下2分钟；将离心管中剩余组织块倒入1个新的T-75培养瓶中，加入8ml完全培养基作为备份；用10-20 ml 的生理盐水清洗一遍T-75培养瓶，洗液也倒入50ml离心管中；用细胞滤器过滤细胞悬液去除细胞组织块；将过滤好的细胞悬液收集到一个新的50ml离心管中；取0.5ml过滤后的细胞悬液计数，测活力；根据计数和活力结果，按照8×10³/cm²-1×10⁴/cm²的接种密度选择T-175培养瓶或T-75培养瓶；将需要的细胞300g离心10分钟，去除上清；在离心管中加入5ml的完全培养基吹散细胞，再加入20ml完全培养基充分混匀；将细胞悬液接种细胞到1个T-175培养瓶中，将培养瓶水平放入 37℃,体积百分比为5%的 CO₂培养箱中培养；每天在显微镜下观察生长情况，当细胞达到80%-90%融合时进行收集；

5）收集：将用过的培养基收集到50ml离心管中，将收集的培养基300g离心5分钟；用20 ml 的生理盐水清洗T-175培养瓶1次，并向每瓶加入6ml预热过的质量百分比为0.125%的胰酶，在显微镜下观察，直至有80%的细胞变圆脱落漂浮，即用离心后的培养基上清终止消化，消化过程室温条件下2分钟；将终止的细胞悬液收集到一个50ml离心管中；用20 ml 的生理盐水清洗一遍T-175培养瓶，洗液也倒入50ml离心管中，并将洗液300g离心10分钟；

6）冻存: 用5ml完全培养基稀释细胞团块，再加入20ml培养基混合均匀；从细胞悬液中取1-2滴进行细胞计数和活力测定，活力需达到85%以上，细胞数达到8x10⁸以上，取流式，流式检测细胞数需达到2x10⁶；将300g细胞悬液离心5min；在收集到的细胞团中加入2ml 完全培养基、并打散，再加入2ml  4℃预冷30分钟的含质量百分比20%的DMSO的冻存液，并混合均匀；将4ml细胞悬液加入到3个冻存管中，每管1.3ml，每管的细胞数为 2x10⁶；最后利用程序降温盒或程控降温仪冻存细胞。