CN107177545A - 一种改良组织块法从人脐带分离间充质干细胞的方法 - Google Patents

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李航
凌发忠
苏军
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Abstract

本发明公开了一种改良组织块法从人脐带分离间充质干细胞的方法，包括3个部分：人脐带间充质干细胞的原代分离、人脐带间充质干细胞的传代培养和人脐带间充质干细胞的冻存，具体采用的操作是：将脐带去除血管后，直接剪至3‑4cm2大小；然后将华通胶的一面贴于细胞培养瓶底部，静止培养直至干细胞爬出；最后，将细胞进行传代和冻存等操作。本发明提供的一种改良的组织块贴壁法，相比现有技术具有以下优点：本方法省去了撕取华通胶以及剪碎等最为繁琐的过程，明显缩短了操作时间，同时也避免了混有其他种类细胞的风险，操作上比传统方法更简便。

Description

一种改良组织块法从人脐带分离间充质干细胞的方法
技术领域
本发明涉及人脐带间充质干细胞技术领域，具体为一种改良组织块法从人脐带分离间充质干细胞的方法。
背景技术
脐带间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞。脐带间充质干细胞具有自我复制能力和多向分化潜能，并有造血支持和促进干细胞植入、免疫调节能力；其多向分化潜能表现为，在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、神经、肌肉、肝脏、内皮等多种组织和细胞，它在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的应用前景。
脐带间充质干细胞存在于脐带华通胶(Wharton’s jelly)和血管周围组织中，其特点主要是来源广泛，便于取材，在体外易于分离扩增。目前，分离脐带间充质干细胞方法主要分为组织块贴壁培养法和胶原酶消化法。其中，组织块贴壁培养法通常是先去除血管后，一种是使用齿直镊撕下华通胶，但该操作费时费力，同时操作时间长也易造成细菌污染；另一种是直接将脐带剪碎后贴壁培养，但这会增加脐带间充质干细胞混有其他种类细胞的风险。因此，建立一种简单实用、便于操作、可行的分离脐带间充质干细胞的方法，是非常必要的。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种改良组织块法从人脐带分离间充质干细胞的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种改良组织块法从人脐带分离间充质干细胞的方法，其特征在于：包括3个部分：人脐带间充质干细胞的原代分离、人脐带间充质干细胞的传代培养和人脐带间充质干细胞的冻存，所述人脐带间充质干细胞的原代分离的步骤如下：
S1、将脐带组织置于无菌采集瓶中,低温保存；
S2、取出脐带，放入培养皿中，剪成约2cm若干小段；
S3、去除脐带中的血管(一根静脉、二根动脉)；
S4、将剥离血管的脐带用生理盐水冲洗4-5次；
S5、将脐带华通胶的一面小心地放置在瓶子底部；
S6、在培养瓶中缓慢滴加适量培养基；
S7、放入二氧化碳培养箱中，水平静置培养至第7-10天后，待细胞爬出，进行传代培养。
优选的，所述人脐带间充质干细胞的传代培养的步骤如下：
S1、待细胞爬出，小心地弃去旧培养基和组织块；
S2、加胰酶消化，待细胞变圆后加终止液；
S3、根据细胞数铺瓶，使细胞浓度为104cells/cm2，标记，置于培养箱中培养。
优选的，所述人脐带间充质干细胞的冻存的步骤如下：
S1、待细胞融合至80％-90％，用吸管弃去旧培养基；
S2、加胰酶消化，待细胞变圆后加终止液；
S3、根据计数结果，加入适量的冻存液使细胞密度为(2～5)×106/ml；
S4、将细胞分装到冻存管中，做好标记，冻存管置于程序降温盒中，放置-80℃冰箱中过夜，再转入液氮罐中。
作为优选，人脐带间充质干细胞的原代分离的步骤S5所述的培养瓶采用一次性75cm2培养瓶，培养瓶过火后，以4-6块/瓶的密度，将脐带华通胶的一面小心地贴在瓶子底部。
作为优选，人脐带间充质干细胞的原代分离的步骤S6所述的培养基使用量以刚好没过脐带3/4处，培养基太多不利于细胞的爬出。
本发明提供提供一种改良组织块法从人脐带分离间充质干细胞的方法，包括3个部分：人脐带间充质干细胞的原代分离、人脐带间充质干细胞的传代培养和人脐带间充质干细胞的冻存，具体采用的操作是：将脐带去除血管后，直接剪至3-4cm2大小；然后将华通胶的一面贴于细胞培养瓶底部，静止培养直至干细胞爬出；最后，将细胞进行传代和冻存等操作。本发明提供的一种改良的组织块贴壁法，相比现有技术具有以下优点：本方法省去了撕取华通胶以及剪碎等最为繁琐的过程，明显缩短了操作时间，同时也避免了混有其他种类细胞的风险，操作上比传统方法更简便。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
一种改良组织块法从人脐带分离间充质干细胞的方法，其步骤如下：
(1)人脐带间充质干细胞的原代分离
S1、将临床检测合格的脐带组织放置于含50ml培养基的无菌采集瓶中，使用保温箱低温保存，送至无菌实验室；
S2、将放有脐带的采集瓶置于超净台内，取出脐带，放入培养皿中，剪成约2cm若干小段；
S3、用手术剪将脐带沿静脉血管平行方向纵向剖开，去除静脉血管后，再使用齿直镊撕下两条动脉；
S4、将剥离血管的脐带用生理盐水冲洗4-5次；
S5、一次性75cm2培养瓶过火后，以4-6块/瓶的密度，将脐带华通胶的一面小心地贴在瓶子底部；
S6、脐带放置好后，在培养瓶中缓慢滴加培养基，培养基使用量以刚好没过脐带1/2处；
S7、盖上瓶盖，做好标记放入二氧化碳培养箱中，水平放置；
S8、培养至第7-10天后，待细胞爬出，进行传代培养。
(2)人脐带间充质干细胞的传代培养
S1、待细胞爬出，弃去旧培养基和组织块；
S2、在非细胞培养面加入10ml生理盐水，轻轻摇晃洗涤组织贴壁面，弃去，重复2次；
S3、每瓶加胰酶1-2ml，均匀浸润贴壁面，约1min，待细胞变圆后加终止液；
S4、快速震荡洗涤后倒入50ml离心管中，再用生理盐水吹洗一次，收集于50ml离心管中；
S5、将50ml离心管1000rpm，5min，弃上清，10ml培养基重悬细胞，计数；
S6、根据细胞数铺瓶，使细胞浓度为104cells/cm2，标记，置于培养箱中培养；
(3)人脐带间充质干细胞的冻存
S1、待细胞融合至80％-90％，用吸管弃去旧培养基；
S2、在非细胞培养面加入10ml生理盐水，轻轻摇晃洗涤组织贴壁面，弃去，重复2次；
S3、每瓶加胰酶1-2ml，均匀浸润贴壁面，约1min，待细胞变圆后加终止液；
S4、快速震荡洗涤后倒入50ml离心管中，再用生理盐水吹洗一次，收集于50ml离心管中；
S5、将50ml离心管1000rpm，5min，弃上清；
S6、根据计数结果，加入适量的冻存液(90％FBS+10％DMSO)，使细胞密度为(2～5)×106/ml；
S7、将细胞分装到冻存管中，做好标记，置于程序降温盒中，-80℃冰箱中过夜，再转入液氮罐中。
实施例2
一种改良组织块法从人脐带分离间充质干细胞的方法，其步骤如下：
(1)人脐带间充质干细胞的原代分离
S1、将临床检测合格的脐带组织放置于含50ml培养基的无菌采集瓶中，使用保温箱低温保存，送至无菌实验室；
S2、将放有脐带的采集瓶置于超净台内，取出脐带，放入培养皿中，剪成约2cm若干小段；
S3、用手术剪将脐带沿静脉血管平行方向纵向剖开，去除静脉血管后，再使用齿直镊撕下两条动脉；
S4、将剥离血管的脐带用生理盐水冲洗4-5次；
S5、一次性75cm2培养瓶过火后，以4-6块/瓶的密度，将脐带华通胶的一面小心地贴在瓶子底部；
S6、脐带放置好后，在培养瓶中缓慢滴加培养基，培养基使用量以刚好没过脐带2/3处；
S7、盖上瓶盖，做好标记放入二氧化碳培养箱中，水平放置；
S8、培养至第7-10天后，待细胞爬出，进行传代培养。
(2)人脐带间充质干细胞的传代培养
S1、待细胞爬出，弃去旧培养基和组织块；
S2、在非细胞培养面加入10ml生理盐水，轻轻摇晃洗涤组织贴壁面，弃去，重复2次；
S3、每瓶加胰酶1-2ml，均匀浸润贴壁面，约1min，待细胞变圆后加终止液；
S4、快速震荡洗涤后倒入50ml离心管中，再用生理盐水吹洗一次，收集于50ml离心管中；
S5、将50ml离心管1000rpm，5min，弃上清，10ml培养基重悬细胞，计数；
S6、根据细胞数铺瓶，使细胞浓度为104cells/cm2，标记，置于培养箱中培养；
(3)人脐带间充质干细胞的冻存
S1、待细胞融合至80％-90％，用吸管弃去旧培养基；
S2、在非细胞培养面加入10ml生理盐水，轻轻摇晃洗涤组织贴壁面，弃去，重复2次；
S3、每瓶加胰酶1-2ml，均匀浸润贴壁面，约1min，待细胞变圆后加终止液；
S4、快速震荡洗涤后倒入50ml离心管中，再用生理盐水吹洗一次，收集于50ml离心管中；
S5、将50ml离心管1000rpm，5min，弃上清；
S6、根据计数结果，加入适量的冻存液(90％FBS+10％DMSO)，使细胞密度为(2～5)×106/ml；
S7、将细胞分装到冻存管中，做好标记，置于程序降温盒中，-80℃冰箱中过夜，再转入液氮罐中。
实施例3
一种改良组织块法从人脐带分离间充质干细胞的方法，其步骤如下：
(1)人脐带间充质干细胞的原代分离
S1、将临床检测合格的脐带组织放置于含50ml培养基的无菌采集瓶中，使用保温箱低温保存，送至无菌实验室；
S2、将放有脐带的采集瓶置于超净台内，取出脐带，放入培养皿中，剪成约2cm若干小段；
S3、用手术剪将脐带沿静脉血管平行方向纵向剖开，去除静脉血管后，再使用齿直镊撕下两条动脉；
S4、将剥离血管的脐带用生理盐水冲洗4-5次；
S5、一次性75cm2培养瓶过火后，以4-6块/瓶的密度，将脐带华通胶的一面小心地贴在瓶子底部；
S6、脐带放置好后，在培养瓶中缓慢滴加培养基，培养基使用量以刚好没过脐带3/4处；
S7、盖上瓶盖，做好标记放入二氧化碳培养箱中，水平放置；
S8、培养至第7-10天后，待细胞爬出，进行传代培养。
(2)人脐带间充质干细胞的传代培养
S1、待细胞爬出，弃去旧培养基和组织块；
S2、在非细胞培养面加入10ml生理盐水，轻轻摇晃洗涤组织贴壁面，弃去，重复2次；
S3、每瓶加胰酶1-2ml，均匀浸润贴壁面，约1min，待细胞变圆后加终止液；
S4、快速震荡洗涤后倒入50ml离心管中，再用生理盐水吹洗一次，收集于50ml离心管中；
S5、将50ml离心管1000rpm，5min，弃上清，10ml培养基重悬细胞，计数；
S6、根据细胞数铺瓶，使细胞浓度为104cells/cm2，标记，置于培养箱中培养；
(3)人脐带间充质干细胞的冻存
S1、待细胞融合至80％-90％，用吸管弃去旧培养基；
S2、在非细胞培养面加入10ml生理盐水，轻轻摇晃洗涤组织贴壁面，弃去，重复2次；
S3、每瓶加胰酶1-2ml，均匀浸润贴壁面，约1min，待细胞变圆后加终止液；
S4、快速震荡洗涤后倒入50ml离心管中，再用生理盐水吹洗一次，收集于50ml离心管中；
S5、将50ml离心管1000rpm，5min，弃上清；
S6、根据计数结果，加入适量的冻存液(90％FBS+10％DMSO)，使细胞密度为(2～5)×106/ml；
S7、将细胞分装到冻存管中，做好标记，置于程序降温盒中，-80℃冰箱中过夜，再转入液氮罐中。
实施例4
一种改良组织块法从人脐带分离间充质干细胞的方法，其步骤如下：
(1)人脐带间充质干细胞的原代分离
S1、将临床检测合格的脐带组织放置于含50ml培养基的无菌采集瓶中，使用保温箱低温保存，送至无菌实验室；
S2、将放有脐带的采集瓶置于超净台内，取出脐带，放入培养皿中，剪成约2cm若干小段；
S3、用手术剪将脐带沿静脉血管平行方向纵向剖开，去除静脉血管后，再使用齿直镊撕下两条动脉；
S4、将剥离血管的脐带用生理盐水冲洗4-5次；
S5、一次性75cm2培养瓶过火后，以4-6块/瓶的密度，将脐带华通胶的一面小心地贴在瓶子底部；
S6、脐带放置好后，在培养瓶中缓慢滴加培养基，培养基使用量以刚好没过脐带4/5处；
S7、盖上瓶盖，做好标记放入二氧化碳培养箱中，水平放置；
S8、培养至第7-10天后，待细胞爬出，进行传代培养。
(2)人脐带间充质干细胞的传代培养
S1、待细胞爬出，弃去旧培养基和组织块；
S2、在非细胞培养面加入10ml生理盐水，轻轻摇晃洗涤组织贴壁面，弃去，重复2次；
S3、每瓶加胰酶1-2ml，均匀浸润贴壁面，约1min，待细胞变圆后加终止液；
S4、快速震荡洗涤后倒入50ml离心管中，再用生理盐水吹洗一次，收集于50ml离心管中；
S5、将50ml离心管1000rpm，5min，弃上清，10ml培养基重悬细胞，计数；
S6、根据细胞数铺瓶，使细胞浓度为104cells/cm2，标记，置于培养箱中培养；
(3)人脐带间充质干细胞的冻存
S1、待细胞融合至80％-90％，用吸管弃去旧培养基；
S2、在非细胞培养面加入10ml生理盐水，轻轻摇晃洗涤组织贴壁面，弃去，重复2次；
S3、每瓶加胰酶1-2ml，均匀浸润贴壁面，约1min，待细胞变圆后加终止液；
S4、快速震荡洗涤后倒入50ml离心管中，再用生理盐水吹洗一次，收集于50ml离心管中；
S5、将50ml离心管1000rpm，5min，弃上清；
S6、根据计数结果，加入适量的冻存液(90％FBS+10％DMSO)，使细胞密度为(2～5)×106/ml；
S7、将细胞分装到冻存管中，做好标记，置于程序降温盒中，-80℃冰箱中过夜，再转入液氮罐中。
实施例5
一种改良组织块法从人脐带分离间充质干细胞的方法，其步骤如下：
(1)人脐带间充质干细胞的原代分离
S1、将临床检测合格的脐带组织放置于含50ml培养基的无菌采集瓶中，使用保温箱低温保存，送至无菌实验室；
S2、将放有脐带的采集瓶置于超净台内，取出脐带，放入培养皿中，剪成约2cm若干小段；
S3、用手术剪将脐带沿静脉血管平行方向纵向剖开，去除静脉血管后，再使用齿直镊撕下两条动脉；
S4、将剥离血管的脐带用生理盐水冲洗4-5次；
S5、一次性75cm2培养瓶过火后，以4-6块/瓶的密度，将脐带华通胶的一面小心地贴在瓶子底部；
S6、脐带放置好后，在培养瓶中缓慢滴加培养基，培养基使用量以刚好没过脐带5/6处；
S7、盖上瓶盖，做好标记放入二氧化碳培养箱中，水平放置；
S8、培养至第7-10天后，待细胞爬出，进行传代培养。
(2)人脐带间充质干细胞的传代培养
S1、待细胞爬出，弃去旧培养基和组织块；
S2、在非细胞培养面加入10ml生理盐水，轻轻摇晃洗涤组织贴壁面，弃去，重复2次；
S3、每瓶加胰酶1-2ml，均匀浸润贴壁面，约1min，待细胞变圆后加终止液；
S4、快速震荡洗涤后倒入50ml离心管中，再用生理盐水吹洗一次，收集于50ml离心管中；
S5、将50ml离心管1000rpm，5min，弃上清，10ml培养基重悬细胞，计数；
S6、根据细胞数铺瓶，使细胞浓度为104cells/cm2，标记，置于培养箱中培养；
(3)人脐带间充质干细胞的冻存
S1、待细胞融合至80％-90％，用吸管弃去旧培养基；
S2、在非细胞培养面加入10ml生理盐水，轻轻摇晃洗涤组织贴壁面，弃去，重复2次；
S3、每瓶加胰酶1-2ml，均匀浸润贴壁面，约1min，待细胞变圆后加终止液；
S4、快速震荡洗涤后倒入50ml离心管中，再用生理盐水吹洗一次，收集于50ml离心管中；
S5、将50ml离心管1000rpm，5min，弃上清；
S6、根据计数结果，加入适量的冻存液(90％FBS+10％DMSO)，使细胞密度为(2～5)×106/ml；
S7、将细胞分装到冻存管中，做好标记，置于程序降温盒中，-80℃冰箱中过夜，再转入液氮罐中。
综上所述，本发明提供一种改良组织块法从人脐带分离间充质干细胞的方法，包括3个部分：人脐带间充质干细胞的原代分离、人脐带间充质干细胞的传代培养和人脐带间充质干细胞的冻存，具体采用的操作是：将脐带去除血管后，直接剪至3-4cm2大小；然后将华通胶的一面贴于细胞培养瓶底部，静止培养直至干细胞爬出；最后，将细胞进行传代和冻存等操作，此外，培养基使用量以刚好没过脐带5/6处，培养基太多不利于细胞的爬出。本发明提供的一种改良的组织块贴壁法，相比现有技术具有以下优点：本方法省去了撕取华通胶以及剪碎等最为繁琐的过程，明显缩短了操作时间，同时也避免了混有其他种类细胞的风险，操作上比传统方法更简便。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种改良组织块法从人脐带分离间充质干细胞的方法，其特征在于：包括3个部分：人脐带间充质干细胞的原代分离、人脐带间充质干细胞的传代培养和人脐带间充质干细胞的冻存，所述人脐带间充质干细胞的原代分离的步骤如下：
S1、将脐带组织置于无菌采集瓶中,低温保存；
S2、取出脐带，放入培养皿中，剪成约2cm若干小段；
S3、去除脐带中的血管(一根静脉、二根动脉)；
S4、将剥离血管的脐带用生理盐水冲洗4-5次；
S5、将脐带华通胶的一面小心地放置在瓶子底部；
S6、在培养瓶中缓慢滴加适量培养基；
S7、放入二氧化碳培养箱中，水平静置培养至第7-10天后，待细胞爬出，进行传代培养。
2.根据权利要求1所述的一种改良组织块法从人脐带分离间充质干细胞的方法，其特征在于：所述人脐带间充质干细胞的传代培养的步骤如下：
S1、待细胞爬出，小心地弃去旧培养基和组织块；
S2、加胰酶消化，待细胞变圆后加终止液；
S3、根据细胞数铺瓶，使细胞浓度为104cells/cm2，标记，置于培养箱中培养。
3.根据权利要求1所述的一种改良组织块法从人脐带分离间充质干细胞的方法，其特征在于：所述人脐带间充质干细胞的冻存的步骤如下：
S1、待细胞融合至80％-90％，用吸管弃去旧培养基；
S2、加胰酶消化，待细胞变圆后加终止液；
S3、根据计数结果，加入适量的冻存液使细胞密度为(2～5)×106/ml；
S4、将细胞分装到冻存管中，做好标记，冻存管置于程序降温盒中，放置-80℃冰箱中过夜，再转入液氮罐中。
4.根据权利要求1所述的一种改良组织块法从人脐带分离间充质干细胞的方法，其特征在于：人脐带间充质干细胞的原代分离的步骤S5所述的培养瓶采用一次性75cm2培养瓶，培养瓶过火后，以4-6块/瓶的密度，将脐带华通胶的一面小心地贴在瓶子底部。
5.根据权利要求1所述的一种改良组织块法从人脐带分离间充质干细胞的方法，其特征在于：人脐带间充质干细胞的原代分离的步骤S6所述的培养基使用量以刚好没过脐带3/4处，培养基太多不利于细胞的爬出。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101922048A (zh) * 2010-08-06 2010-12-22 青岛奥克生物开发有限公司 一种脐带间充质干细胞公共库的建库方法
CN101974484A (zh) * 2010-11-03 2011-02-16 江苏省北科生物科技有限公司 一种人脐带间充质干细胞的制备方法
CN103013911A (zh) * 2012-11-30 2013-04-03 陆华 贴壁密度梯度法联合egf培养人脐带间充质干细胞的方法
CN104862274A (zh) * 2015-05-27 2015-08-26 贵州北科泛特尔生物科技有限公司 高效分离脐带间充质干细胞的方法
CN105586309A (zh) * 2016-02-06 2016-05-18 福建省银丰干细胞工程有限公司 一种获得安全、有效的脐带间充质干细胞的方法
CN106754686A (zh) * 2017-02-06 2017-05-31 贵州泛特尔细胞生物技术有限公司 一种脐带间充质干细胞的分离及培养方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101922048A (zh) * 2010-08-06 2010-12-22 青岛奥克生物开发有限公司 一种脐带间充质干细胞公共库的建库方法
CN101974484A (zh) * 2010-11-03 2011-02-16 江苏省北科生物科技有限公司 一种人脐带间充质干细胞的制备方法
CN103013911A (zh) * 2012-11-30 2013-04-03 陆华 贴壁密度梯度法联合egf培养人脐带间充质干细胞的方法
CN104862274A (zh) * 2015-05-27 2015-08-26 贵州北科泛特尔生物科技有限公司 高效分离脐带间充质干细胞的方法
CN105586309A (zh) * 2016-02-06 2016-05-18 福建省银丰干细胞工程有限公司 一种获得安全、有效的脐带间充质干细胞的方法
CN106754686A (zh) * 2017-02-06 2017-05-31 贵州泛特尔细胞生物技术有限公司 一种脐带间充质干细胞的分离及培养方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
尹富华等: ""人脐带间充质干细胞3 种分离制备方法的比较"", 《临床检验技术研究》 *
杨晓清等: ""人脐带华通氏胶间充质干细胞的分离、培养、鉴定及冻存、复苏"", 《南通大学学报（医学版）》 *
贾宇臣等: ""改良组织块贴壁法制备人脐带间充质干细胞"", 《中国生物制品学杂志》 *

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