CN109628394A - 一种研磨与混合酶结合的提取脐带间充质干细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种研磨与混合酶结合的提取脐带间充质干细胞的方法，其包含：步骤1、将脐带两端去除，并清洗脐带动静脉中的血渍；步骤2、将脐动脉和脐静脉剔除，将脐带剪成小块，剥离出来胶层，剪成更小的块状；步骤3、将组织块分装入离心管，用组织研磨机将组织研磨成肉糜；步骤4、用胶原蛋白酶和胰蛋白酶与肉糜悬液混合，置于摇床中震荡；步骤5、再用培养基中和后，离心去上清，再与培养液混合，加入细胞培养瓶中；步骤6、静置培养，然后用酶消化，再进行传代培养；步骤7、继续培养一段时间后，P1代再进行传代培养，P2代冻存。本发明基于组织研磨法与消化结合的方法，能够大大提高原代细胞得率，减少细胞损伤。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于哺乳动物细胞基因工程领域的提取方法，具体地，涉及一种能够有效地研磨与混合酶结合的提取脐带间充质干细胞的方法。
背景技术
脐带间充质干细胞是存在于新生儿脐带华通氏胶和血管周围组织中的一种间充质干细胞。来源于脐带的间充质干细胞因其取材方便，无道德伦理争议，可获取的细胞数量多、增殖能力强、免疫调节作用大，分泌细胞生长因子的总量也非常高，有利于皮肤组织损伤修复及皮肤过敏问题解决，基于此的药妆产品开发研究不断深入及干细胞产业逐渐大规模化和商业化。
具体而言，脐带间充质干细胞培养大多使用贴壁法，将脐带剪成小块贴于培养皿表面，贴壁一周左右，代细胞爬出长满后消化传代，这一方法耗时较长通常需要一个月左右时间才能进行第一次传代操作，其中最常见的问题是组织贴壁不牢，容易脱落，细胞爬出较少，原代培养时间过长使细胞老化，状态变差，使用效果变差等；贴壁法工程量巨大，例如一根脐带在P1代是细胞数量达10亿，由于贴壁不完全，大大增加操作难度，由于爬出细胞分化程度和分裂不一，容易在后期造成细胞质地不均一，影响细胞的质控和使用；贴壁法造成生产成本问题是，原代培养时间较长，耗费培养液和血清较多，使成本大大增加。
通常的酶消化法，通常是采用胶原蛋白酶和胰蛋白酶结合消化脐带的沃顿胶组织细胞进行培养，由于脐带组织表面较湿滑，剪碎较困难，经常时间剪碎操作后，多数仍为肉眼可见的组织小块，而胰蛋白酶是通过解离细胞间糖蛋白和黏蛋白来分离细胞的，消化过度容易对细胞造成损伤，损坏细胞膜，破坏细胞骨架影响细胞后续增殖和分化，酶作用于组织块表面，经常导致表面组织细胞消化过度而组织内部细胞仍接触不到消化液，导致消化法提取间充质干细胞得率低，细胞活性不佳，难以增殖到理想数目。
在需要大量制备脐带间充质干细胞时，多采用消化的方式进行原代细胞的提取和制备，由于个体差异，消化酶对组织的浸润及消化速率很难把控，组织表面消化过度会造成细胞大量损伤，原代获取细胞量少，给细胞扩增增加难度，细胞扩增后状态和活性变差，破坏细胞壁结构，影响细胞贴壁。
综上所述，脐带间充质干细胞大规模培养，原代使用贴壁法，贴壁不牢，培养时间较长，细胞状态变老，爬出细胞状态不均一，使用效果变差；且贴壁法工程量巨大，耗费较多的人力和物力，成产成本较高；脐带间充质干细胞大量培养采用常规消化法，酶作用于组织块表面，经常导致表面组织细胞消化过度而组织内部细胞仍接触不到消化液，导致消化法提取间充质干细胞得率低，细胞活性不佳，细胞壁被破坏，贴壁程度低，细胞状态差，难以增殖到理想数目，严重影响后期扩增与诱导或基因改造工作。
发明内容
本发明的目的是提供一种适于大规模培养脐带间充质干细胞的原代提取方法，针对现有的脐带间充质干细胞原代提取技术存在的诸多缺陷，基于组织研磨法与消化结合的方法，能够大大提高原代细胞得率，减少细胞损伤。
为了达到上述目的，本发明提供了一种研磨与混合酶结合的提取脐带间充质干细胞的方法，其中，所述的方法包含：步骤1、将脐带两端去除，并清洗脐带动静脉中的血渍；步骤2、将脐动脉和脐静脉剔除，将脐带剪成小块，剥离出来胶层，剪成更小的块状；步骤3、将组织块分装入离心管，用组织研磨机将组织研磨成肉糜；步骤4、用胶原蛋白酶和胰蛋白酶与肉糜悬液混合，置于摇床中震荡；步骤5、再用培养基中和后，离心去上清，再与培养液混合，加入细胞培养瓶中；步骤6、静置培养，然后用酶消化，再进行传代培养；步骤7、继续培养一段时间后，P1代再进行传代培养，P2代冻存。
上述的研磨与混合酶结合的提取脐带间充质干细胞的方法，其中，所述的步骤1中，用含有庆大霉素和双抗的生理盐水清洗脐带动静脉中的血渍。
上述的研磨与混合酶结合的提取脐带间充质干细胞的方法，其中，所述的步骤2中，将两根脐动脉和一根脐静脉剔除，将脐带剪成长度为1cm的小块，剥离出来胶层，剪成直径为3mm的小块。
上述的研磨与混合酶结合的提取脐带间充质干细胞的方法，其中，所述的步骤3中，将组织块分装入15ml离心管，每管内的装入体积为2ml，调节组织研磨机的转速为800rpm，研磨1min，通过组织研磨机将组织研磨成肉糜。组织研磨机采用FLUKO公司生产的F6-10型号的组织研磨机。
上述的研磨与混合酶结合的提取脐带间充质干细胞的方法，其中，所述的步骤4中，用含有10mg/ml胶原蛋白酶的质量百分比为0.125％的胰蛋白酶与肉糜悬液按体积比1:10混合，置于37℃的摇床中震荡5min。
上述的研磨与混合酶结合的提取脐带间充质干细胞的方法，其中，所述的步骤5中，用培养基中和后，以1200rpm/min的转速离心5min，去上清，再与培养液混合，所得的细胞悬液加入T225瓶中，每个T225瓶中加入50ml细胞悬液。T225瓶优选为Corning康宁T225细胞培养瓶。
上述的研磨与混合酶结合的提取脐带间充质干细胞的方法，其中，所述的步骤5中，采用Gbico公司的无血清DMEM液体培养基中和后，离心去上清。DMEM是dulbecco’smodified eagle medium的缩写，是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，是在MEM培养基的基础上研制的。
上述的研磨与混合酶结合的提取脐带间充质干细胞的方法，其中，所述的步骤5中，离心去上清后与培养液混合，所述的培养液为Gbico公司的DMEM/F12加10％FBS(fetalbovine serum，胎牛血清)的液体培养基。F12培养基，即Ham’s F 12nutrient medium动物细胞培养基，成分复杂，含有多种微量元素，常和DMEM以1:1结合，称为DMEM/F12培养基，作为开发无血清配方的基础，以利用F12含有较丰富的成分和DMEM含有较高浓度的营养成分的优点。
上述的研磨与混合酶结合的提取脐带间充质干细胞的方法，其中，所述的步骤6中，静置培养1周，待细胞爬出融合度为80％的时候，按质量百分比计用含0.02％EDTA(乙二胺四乙酸)的0.25％的胰蛋白酶，进行1传6的消化传代。
上述的研磨与混合酶结合的提取脐带间充质干细胞的方法，其中，所述的步骤7中，继续培养5天后，P1代再进行1传6的传代培养，P2代冻存。
本发明提供的研磨与混合酶结合的提取脐带间充质干细胞的方法具有以下优点：
本发明涉及通过一种组织研磨后用混合蛋白消化酶以最优比例混合的改良的的方法提取原代脐带间充质干细胞，本发明提供的该脐带间充质干细胞原代提取方法适合用于商业化大规模生产。改良后的脐带间充质干细胞原代消化提取贴壁法，解决了普通贴壁法原代培养时间长、消耗成本高的及普通消化法组织消化不充分或消化过度、细胞得率低活力差等问题，具有原代提取用时短、细胞得率高、细胞活性强、增殖快速的优点，并降低了细胞原代提取和大规模培养的成本，为无血清培养定下良好基础，证实了制备获得的一种组织研磨与多种蛋白消化酶结合的提取脐带间充质干细胞原代细胞的技术，适用于商品化大规模生产，具有显著突出的技术效果。
附图说明
图1为普通消化法与组织研磨消化法消化后混悬液中组织分离出单细胞的状态图；图1A为普通组织块消化，图2B为转速1000rpm时研磨后组织消化，图1C为本发明的研磨消化。
图2为普通贴壁法(简称TB)图2B、普通胰酶消化法(简称Try)图2C与本发明的组织研磨消化法(简称GT)图2A三种方法提取的脐带间充质干细胞在生长一周后细胞状态图。
图3为三种方法提取的脐带间充质干细胞P1代生长速度示意图。
图4为三种方法提取的脐带间充质干细胞P2代在5％FBS条件下生长情况图；图4A为GT法，图4B为TB法，图4C为Try法。
图5为三种方法提取的脐带间充质干细胞P2代表型比较图；图5A为TB法，图5B为Try法，图5C为GT法。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施方式作进一步地说明。
本发明提供的研磨与混合酶结合的提取脐带间充质干细胞的方法，其包含：步骤1、将脐带两端去除，并清洗脐带动静脉中的血渍；步骤2、将脐动脉和脐静脉剔除，将脐带剪成小块，剥离出来胶层，剪成更小的块状；步骤3、将组织块分装入离心管，用组织研磨机将组织研磨成肉糜；步骤4、用胶原蛋白酶和胰蛋白酶与肉糜悬液混合，置于摇床中震荡；步骤5、再用培养基中和后，离心去上清，再与培养液混合，加入细胞培养瓶中；步骤6、静置培养，然后用酶消化，再进行传代培养；步骤7、继续培养一段时间后，P1代再进行传代培养，P2代冻存。
步骤1中用含有庆大霉素和双抗的生理盐水清洗脐带动静脉中的血渍。
步骤2中将两根脐动脉和一根脐静脉剔除，将脐带剪成长度为1cm的小块，剥离出来胶层，剪成直径为3mm的小块。
步骤3中将组织块分装入15ml离心管，每管内的装入体积为2ml，调节组织研磨机的转速为800rpm，研磨1min，通过组织研磨机将组织研磨成肉糜。组织研磨机采用FLUKO公司生产的F6-10型号的组织研磨机。
步骤4中用含有10mg/ml胶原蛋白酶的质量百分比为0.125％的胰蛋白酶与肉糜悬液按体积比1:10混合，置于37℃的摇床中震荡5min。
步骤5中用培养基中和后，以1200rpm/min的转速离心5min，去上清，再与培养液混合，所得的细胞悬液加入T225瓶中，每个T225瓶中加入50ml细胞悬液。T225瓶优选为Corning康宁T225细胞培养瓶。
步骤5中采用Gbico公司的无血清DMEM液体培养基中和后，离心去上清。DMEM是dulbecco’s modified eagle medium的缩写，是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，是在MEM培养基的基础上研制的。
步骤5中离心去上清后与培养液混合，培养液为Gbico公司的DMEM/F12加10％FBS(fetal bovine serum，胎牛血清)的液体培养基。F12培养基，即Ham’s F 12nutrientmedium动物细胞培养基，成分复杂，含有多种微量元素，常和DMEM以1:1结合，称为DMEM/F12培养基，作为开发无血清配方的基础，以利用F12含有较丰富的成分和DMEM含有较高浓度的营养成分的优点。
步骤6中静置培养1周，待细胞爬出融合度为80％的时候，按质量百分比计用含0.02％EDTA(乙二胺四乙酸)的0.25％的胰蛋白酶，进行1传6的消化传代。
步骤7中继续培养5天后，P1代再进行1传6的传代培养，P2代冻存。
下面结合实施例对本发明提供的研磨与混合酶结合的提取脐带间充质干细胞的方法做更进一步描述。
实施例1
一种研磨与混合酶结合的提取脐带间充质干细胞的方法，其包含：
步骤1、将脐带两端去除，并用含有庆大霉素和双抗的生理盐水清洗脐带动静脉中的血渍。
步骤2、将两根脐动脉和一根脐静脉剔除，将脐带剪成长度为1cm的小块，剥离出来胶层，剪成直径为3mm的小块。
步骤3、将组织块分装入15ml离心管，每管内的装入体积为2ml，调节组织研磨机的转速为800rpm，研磨1min，通过组织研磨机将组织研磨成肉糜。组织研磨机采用FLUKO公司生产的F6-10型号的组织研磨机。
步骤4、用含有10mg/ml胶原蛋白酶的质量百分比为0.125％的胰蛋白酶与肉糜悬液按体积比1:10混合，置于37℃的摇床中震荡5min。
步骤5、再用Gbico公司的无血清DMEM液体培养基中和后，以1200rpm/min的转速离心5min，去上清，再与Gbico公司的DMEM/F12+10％FBS的培养液混合，所得的细胞悬液加入T225瓶中，每个T225瓶中加入50ml细胞悬液。T225瓶优选为Corning康宁T225细胞培养瓶。
步骤6、步骤6中静置培养1周，待细胞爬出融合度为80％的时候，按质量百分比计用含0.02％EDTA的0.25％的胰蛋白酶，进行1传6的消化传代。
步骤7、继续培养5天后，P1代再进行1传6的传代培养，P2代冻存。
实施例2
比较普通消化法与组织研磨消化法，消化后混悬液中组织分离出单细胞的状态，如图1所示。
图1A为普通组织块消化法，可见组织块周边消化成丝状出现严重消化过度现象，组织中间还没有没消化到位，图1B为转速1000rpm时研磨后组织消化严重过度，只剩下丝状物质，并无成型的细胞分离出，图1C为本发明实施例1的研磨消化法，可以分离出完整的单细胞。
实施例3
普通贴壁法(以下简称TB)、普通胰酶消化法(以下简称Try)与本发明实施例1的组织研磨消化法(以下简称GT)一周细胞生长情况比较，如图2所示。
从图2中可以看出，本发明实施例1提供的消化法提取的细胞一周生长情况最良好融合度达80-90％，贴壁法次之，一周后融合度10％不到，胰蛋白酶消化法提取的细胞融合度一周只有10-20％。
实施例4
三种方法获得的细胞P1代后细胞生长速度比较，如图3所示。
用CCK8检测方法获得的细胞P1代后细胞生长速度结果可以看出，本发明实施例1的方法提取的细胞生长速度最快，说明细胞活性最强，利于大规模培养，缩短培养周期，降低成本；贴壁法次之，普通胰蛋白酶消化法提取的细胞生长速度最慢。
实施例5
三种方法获得的细胞P2代，在只含有5％FBS的培养基中生长的状态比较，如图4所示。
在培养液中只含5％胎牛血清FBS的时候三种提取方法细胞的状态中可以看出，本发明实施例1中的消化法提取的细胞受血清减少的影响较小，普通胰蛋白酶消化提取的细胞受血清影响较大，并且细胞增长缓慢的同时细胞拉丝较严重，背景较脏，本发明实施例1提取的细胞为无血清培养奠定了良好的基础。
实施例6
三种提取方法的细胞表型比较，如图5和下表1所示。
表1：三种方法提取的脐带间充质干细胞P2代表型比较(％)。
图5中是通过流式细胞仪的PE通道检测，以PE-A来作图，A为曲线下面积。从三种方法提取的脐带间充质干细胞P2代表型流式检测结果可以看出，本发明实施例1的G法提取的细胞表型最优，贴壁法提取的细胞表型次之，普通消化方法得到的细胞表型最差。
随着现在干细胞临床医疗及美容产业飞速发展，为符合间充质干细胞的大规模商业化生产的需求，针对现有的脐带间充质干细胞原代提取技术存在的诸多缺陷，例如：如采用贴壁法，细胞状态不均一，收集难度大；如采用普通消化法，消化酶对细胞损伤较大，细胞得率低，状态差，无法多代扩增等，本发明提供了研磨与混合酶结合的提取脐带间充质干细胞的方法，是一种适于大规模培养脐带间充质干细胞的原代提取方法，基于组织研磨法与消化结合的方法，大大提高原代细胞得率，减少细胞损伤。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
Claims (10)
1.一种研磨与混合酶结合的提取脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的方法包含：
步骤1、将脐带两端去除，并清洗脐带动静脉中的血渍；
步骤2、将脐动脉和脐静脉剔除，将脐带剪成小块，剥离出来胶层，剪成更小的块状；
步骤3、将组织块分装入离心管，用组织研磨机将组织研磨成肉糜；
步骤4、用胶原蛋白酶和胰蛋白酶与肉糜悬液混合，置于摇床中震荡；
步骤5、再用培养基中和后，离心去上清，再与培养液混合，加入细胞培养瓶中；
步骤6、静置培养，然后用酶消化，再进行传代培养；
步骤7、继续培养一段时间后，P1代再进行传代培养，P2代冻存。
2.如权利要求1所述的研磨与混合酶结合的提取脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的步骤1中，用含有庆大霉素和双抗的生理盐水清洗脐带动静脉中的血渍。
3.如权利要求1所述的研磨与混合酶结合的提取脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的步骤2中，将两根脐动脉和一根脐静脉剔除，将脐带剪成长度为1cm的小块，剥离出来胶层，剪成直径为3mm的小块。
4.如权利要求1所述的研磨与混合酶结合的提取脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的步骤3中，将组织块分装入15ml离心管，每管内的装入体积为2ml，调节组织研磨机的转速为800rpm，研磨1min，通过组织研磨机将组织研磨成肉糜。
5.如权利要求1所述的研磨与混合酶结合的提取脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的步骤4中，用含有10mg/ml胶原蛋白酶的质量百分比为0.125％的胰蛋白酶与肉糜悬液按体积比1:10混合，置于37℃的摇床中震荡5min。
6.如权利要求1所述的研磨与混合酶结合的提取脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的步骤5中，用培养基中和后，以1200rpm/min的转速离心5min，去上清，再与培养液混合，所得的细胞悬液加入T225瓶中，每个T225瓶中加入50ml细胞悬液。
7.如权利要求6所述的研磨与混合酶结合的提取脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的步骤5中，采用无血清DMEM培养基中和后，离心去上清。
8.如权利要求6所述的研磨与混合酶结合的提取脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的步骤5中，离心去上清后与培养液混合，所述的培养液为DMEM/F12加10％FBS的培养基。
9.如权利要求1所述的研磨与混合酶结合的提取脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的步骤6中，静置培养1周，待细胞爬出融合度为80％的时候，按质量百分比计用含0.02％EDTA的0.25％的胰蛋白酶，进行1传6的消化传代。
10.如权利要求1所述的研磨与混合酶结合的提取脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的步骤7中，继续培养5天后，P1代再进行1传6的传代培养，P2代冻存。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110269833A (zh) * | 2019-06-05 | 2019-09-24 | 湖南丰晖生物科技有限公司 | 一种脐带间充质干细胞制剂及其制备方法和应用 |
| CN113234658A (zh) * | 2021-06-30 | 2021-08-10 | 成都导胜生物技术有限公司 | 一种基于研磨制备存活单细胞的方法 |
| CN114457012A (zh) * | 2022-03-23 | 2022-05-10 | 厦门骨本生物科技有限公司 | 一种脐带间充质干细胞的分离方法 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101451124A (zh) * | 2008-12-10 | 2009-06-10 | 戴育成 | 人脐带间充质干细胞创面涂抹剂的制备和储存应用方法 |
| CN102965335A (zh) * | 2011-09-01 | 2013-03-13 | 北京清美联创干细胞科技有限公司 | 用于间充质干细胞培养的试剂盒及其应用 |
| WO2014132936A1 (ja) * | 2013-02-28 | 2014-09-04 | 国立大学法人 富山大学 | 胎盤・胎盤周囲組織幹細胞の選択的増幅方法 |
| CN104862274A (zh) * | 2015-05-27 | 2015-08-26 | 贵州北科泛特尔生物科技有限公司 | 高效分离脐带间充质干细胞的方法 |
| CN105586309A (zh) * | 2016-02-06 | 2016-05-18 | 福建省银丰干细胞工程有限公司 | 一种获得安全、有效的脐带间充质干细胞的方法 |
| CN106978395A (zh) * | 2017-04-10 | 2017-07-25 | 广东省第二人民医院 | 一种高效分离培养脐带间充质干细胞的方法 |
| CN108096278A (zh) * | 2018-01-18 | 2018-06-01 | 刘馨 | 一种人间充质干细胞活性成分乌发产品的制备方法 |
-
2019
- 2019-01-29 CN CN201910088003.8A patent/CN109628394A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101451124A (zh) * | 2008-12-10 | 2009-06-10 | 戴育成 | 人脐带间充质干细胞创面涂抹剂的制备和储存应用方法 |
| CN102965335A (zh) * | 2011-09-01 | 2013-03-13 | 北京清美联创干细胞科技有限公司 | 用于间充质干细胞培养的试剂盒及其应用 |
| WO2014132936A1 (ja) * | 2013-02-28 | 2014-09-04 | 国立大学法人 富山大学 | 胎盤・胎盤周囲組織幹細胞の選択的増幅方法 |
| CN104862274A (zh) * | 2015-05-27 | 2015-08-26 | 贵州北科泛特尔生物科技有限公司 | 高效分离脐带间充质干细胞的方法 |
| CN105586309A (zh) * | 2016-02-06 | 2016-05-18 | 福建省银丰干细胞工程有限公司 | 一种获得安全、有效的脐带间充质干细胞的方法 |
| CN106978395A (zh) * | 2017-04-10 | 2017-07-25 | 广东省第二人民医院 | 一种高效分离培养脐带间充质干细胞的方法 |
| CN108096278A (zh) * | 2018-01-18 | 2018-06-01 | 刘馨 | 一种人间充质干细胞活性成分乌发产品的制备方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| BANITALEBI DEHKORDI等: "A simple，rapid，and efficient method for isolating mesenchymal stem cells from the entire unbilical cord.", 《CELL TRANSPLANTATION》 * |
| 刘洋等: "胎盘源间充质干细胞分离提取的新方法", 《中国组织工程》 * |
| 黄鹏等: "人脐带间充质干细胞的应用研究现状", 《中国输血杂志》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110269833A (zh) * | 2019-06-05 | 2019-09-24 | 湖南丰晖生物科技有限公司 | 一种脐带间充质干细胞制剂及其制备方法和应用 |
| CN113234658A (zh) * | 2021-06-30 | 2021-08-10 | 成都导胜生物技术有限公司 | 一种基于研磨制备存活单细胞的方法 |
| CN113234658B (zh) * | 2021-06-30 | 2023-04-07 | 成都导胜生物技术有限公司 | 一种基于研磨制备存活单细胞的方法 |
| CN114457012A (zh) * | 2022-03-23 | 2022-05-10 | 厦门骨本生物科技有限公司 | 一种脐带间充质干细胞的分离方法 |
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