CN109652368A - 从脐带组织中获取原代间充质干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从脐带组织中获取原代间充质干细胞的方法，与现有技术相比，本发明采用组织块贴壁法对华通氏胶组织进行多次培养，可获得更多的原代间充质干细胞，提高了原代间充质干细胞的产量；而且使用无血清培养基加血清代替物培养，培养过程不使用胎牛血清，避免了因动物源成分的引入造成污染和对所述干细胞后期使用的不良影响；另外，用消化酶TrypLE消化细胞，该酶为非动物来源，且对细胞作用温和，大大降低细胞的消化损伤；获得原代间充质干细胞后，通过滤网过滤掉细胞悬液中的残余组织块，提高了原代间充质干细胞的均一度。

Description

从脐带组织中获取原代间充质干细胞的方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种从脐带组织中获取原代间充质干细胞的方法。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSC)是一类来源于发育早期中胚层及外胚层的多能干细胞，具有自我更新和多向分化的能力。间充质干细胞在临床上可应用于解决多种血液系统疾病、心血管疾病、肝硬化、神经系统疾病、膝关节半月板部分切除损伤修复、自身免疫性疾病等，此外还在神经系统修复等方面具有发展前景。

间充质干细胞最早在骨髓中发现，随后发现存在于人体发生、发育过程的许多种组织中。目前用得最多的是骨髓来源的间充质干细胞，但存在以下问题：随着年龄的老化，骨髓间充质干细胞数目显著降低、增殖分化能力大幅度衰退；其制备过程不容易质控；移植给异体时可能引起免疫反应；取材时对患者有损伤，患者有骨髓疾病时不能采集，即使是健康供者，亦不能抽取太多的骨髓。

研究表明，脐带来源的间充质干细胞表达多种胚胎干细胞的特有分子标志物，并具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低的特性；另外其取材方便，无道德伦理问题的限制，更易于工业化制备。因此，脐带间充质干细胞不仅能够成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，而且具有更大的应用潜能。

目前脐带源间充质干细胞的制备方法主要有胶原酶消化法和组织块贴壁法。对于胶原酶消化法，胶原酶对华通氏胶(Wharton’sjelly)进行消化分解的过程中，难免会对原代细胞造成一定的损伤，从而影响间充质干细胞的质量。对于组织块贴壁法，因为华通氏胶没有经过生物化学手段的处理，只是简单地对华通氏胶破碎后进行贴壁，使细胞自行爬出，故而这种方法能够使间充质干细胞的特性得到很好的保持；但组织块贴壁培养过程中一般地会用到胎牛血清，这样就会引入动物源成分。一方面，动物源成分作为异种蛋白成分的残留可能会对其临床研究及应用造成影响，如异种蛋白会使人产生过敏等症状；另一方面也可能会携带病原体，如疯牛病病原体，对细胞造成污染是影响细胞研究及应用的潜在风险。组织块贴壁法制备的原代干细胞会残留一定量组织块，也影响到后续的传代培养。另外，传统的细胞消化都是采用一定浓度的胰酶，首先胰酶是动物源的，一般是猪源的，其次胰酶在使用过程中，需要对其浓度和消化时间进行严格的控制，并对细胞的消化程度进行严格的判断，因此容易由于对细胞消化过度而造成细胞损伤，从而改变细胞特性。

综上所述，如何有效地获取更多具有较高活性的脐带原代间充质干细胞是目前本领域技术人员急需解决的问题。

发明内容

为了克服上述现有技术存在的从脐带组织获取原代间充质干细胞的方法中的缺点，本发明的目的在于提供一种更为高效的从脐带组织中获取原代间充质干细胞的方法，其包括以下步骤：

1)将脐带华通氏胶组织段剪碎至4-10mm³大小的组织块，然后将所述组织块转移至细胞培养皿中平铺贴壁，适当风干组织块以使其减少水分、贴壁牢固；

2)加入由基础培养基和血清替代物组成的完全培养基，其中所述完全培养基中含有3-5％体积比的血清替代物，然后放入细胞培养箱孵育培养；

3)待华通氏胶组织块中爬出大量间充质干细胞后，倒掉培养基上清，用生理盐水润洗1-3次，然后使用蛋白酶对爬出的间充质干细胞进行充分消化，镜下观察到细胞伪足收缩、细胞变圆，则用所述完全培养基终止消化，然后收集消化后的间充质干细胞；

4)使用生理盐水对所述细胞培养皿中的华通氏胶组织块进行多次洗涤，对贴壁牢固的华通氏胶组织块重复步骤2)-3)，直到没有间充质干细胞从所述华通氏胶组织块中爬出，以获得更多消化后的间充质干细胞；

5)将获得的间充质干细胞通过筛网过滤，以除去细胞悬液中残余的华通氏胶组织块，所得过滤后的细胞即为制备的原代间充质干细胞。

在本发明的一些实施方案中，所述脐带组织为人源脐带组织。

在本发明的一些实施方案中，所述细胞培养箱中的环境为37℃、5％CO₂。

在本发明的一些实施方案中，所述基础培养基为α-MEM基础培养基如Corning、Hyclone或BI牌的产品，且所述血清替代物为GMP级的血清替代物如Helios或PALL牌的产品。

在本发明的一些实施方案中，步骤3)所述消化酶为美国赛默飞世尔科技公司的Gibco牌TrypLE。

在本发明的一些实施方案中，所述筛网大小为100-200目。

在本发明的一些实施方案中，所述生理盐水含1％双抗(青霉素-链霉素混合溶液)。

在本发明的一些实施方案中，剪碎的华通氏胶组织块大小为3mm×3mm×1mm。

在本发明的一些实施方案中，将剪碎的华通氏胶组织块按照1块/cm²的密度进行贴壁。

在本发明的一些实施方案中，步骤2)中加入所述完全培养基培养3-5天后，按每个培养皿5-7mL补加所述完全培养基，继续静置培养5-9天，期间每隔3-4天更换新的完全培养基。

本发明使用人源脐带制备原代间充质干细胞后，通过后续传代培养，可获取足够数量的人源脐带原代间充质干细胞，用于存储和临床使用。

有益效果

与现有技术相比，本发明具有以下优点：1)采用组织块贴壁法对华通氏胶组织进行多次培养消化，可获得更多的原代间充质干细胞，提高了原代间充质干细胞的产量；2)使用无血清基础培养基加血清代替物培养，培养过程不使用胎牛血清，避免了因动物源成分的引入造成污染和对所述干细胞后期使用的不良影响；3)TrypLE消化酶是非动物源的，且对细胞消化温和，使用TrypLE消化酶消化细胞可到达降低消化过程对细胞造成的损伤；4)获得的原代间充质干细胞后，通过滤网过滤掉细胞悬液中的残余组织块，提高了原代间充质干细胞的均一性。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例

实施例1：脐带组织小块的获取

1)将处理好的足月剖腹产健康新生儿脐带，去除脐带的结扎两端，并用眼科剪将该长约10-15cm的中间段剪成2-3cm长的脐带组织段，用含1％双抗(青霉素-链霉素混合溶液)的生理盐水反复漂洗所述脐带组织段以去除血迹。

2)剖开上述脐带组织段，并去除动脉和静脉血管(2条动脉和1条静脉)及表皮组织，获得脐带华通氏胶组织段，用含1％双抗的生理盐水反复漂洗后，将其剪碎成约3mm×3mm×1mm的华通氏胶组织块。

实施例2：华通氏胶组织块的贴壁培养与原代间充质干细胞的获取

1)按照1块/cm²将实施例1的华通氏胶组织块接种至直径10cm的培养皿中平铺贴壁，每个培养皿中加入约30-50块所述组织块，在生物安全柜内风干华通氏胶组织块约10-15min，以使其减少水分、贴壁牢固；

2)分别向每个培养皿中轻轻加入7mL由α-MEM Cornig基础培养基和GMP级Helios血清替代物组成的完全培养基，其中所述完全培养基中含有3-5％体积比的血清替代物，不要将组织块吹起，随后放入37℃、5％CO₂的细胞培养箱中孵育培养；培养3-5天后每个培养皿中补加约5-7mL所述完全培养基，再放入37℃、5％CO₂的培养箱中继续静置培养5-9天，期间每隔3-4天更换新的完全培养基；

3)观察到华通氏胶组织块中爬出大量间充质干细胞后，用移液管轻轻吸掉培养基上清液，用生理盐水润洗培养皿2次，然后每个培养皿使用7mL TrypLE对爬出的间充质干细胞进行充分消化约3-5min，待细胞伪足完全回缩、细胞变圆后，用移液管将消化后的间充质干细胞转移至50mL离心管；

4)使用生理盐水对所述细胞培养皿中的华通氏胶组织块进行2-3次洗涤，弃掉漂浮起来的华通氏胶组织块，对贴壁牢固的华通氏胶组织块重复步骤2)至3)，经2-3次培养及消化后，获得尽可能多的消化后的间充质干细胞；

5)将收集的消化后的间充质干细胞使用滤网(100-200μm)过滤，以除去细胞悬液中残余的华通氏胶组织块，所得过滤后的细胞即为制备的原代间充质干细胞。

本方法在较短时间内最终可得到大量的原代间充质干细胞，按照T175细胞培养瓶计量，可由一根新生儿脐带获得不少于20瓶原代细胞，不少于1.0×10⁷个细胞/瓶；所得干细胞体积较小，细胞形态呈梭形、角形或多角形且轮廓清晰，生长形态多成涡旋状或平行状；细胞增殖活力很高，最高传代比可做到1:8-12，3-4天即可传代。

本方法采用Corning、Hyclone或BI牌α-MEM基础培养基，GMP级的Helios或PALL牌的血清替代物，以及更换与TrypLE类似的消化酶进行操作，均可获得较为稳定的结果。

相比传统的一次贴壁培养，本发明的培养方法得到的细胞数量多出2-3倍，相当于2-3次的一次性原代贴壁培养，大大节约了原代细胞成本及培养时间，也大大降低了原代间充质干细胞操作的风险；同一根脐带来源的细胞数量大大增加，这也将为后期细胞的研究及临床应用提供重要的基础。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种从脐带组织中获取原代间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将脐带华通氏胶组织段剪碎至4-10mm³大小的组织块，然后将所述组织块转移至细胞培养皿中平铺贴壁，适当风干组织块以使其减少水分、贴壁牢固；

2)加入由基础培养基和血清替代物组成的完全培养基，其中所述完全培养基中含有3-5％体积比的血清替代物，然后放入细胞培养箱孵育培养；

3)待华通氏胶组织块中爬出大量间充质干细胞后，倒掉培养基上清，用生理盐水润洗培养皿1-3次，然后使用蛋白酶对爬出的间充质干细胞进行充分消化，待细胞收缩变圆，用所述完全培养基终止消化，收集消化后的间充质干细胞；

4)使用生理盐水对所述细胞培养皿中的华通氏胶组织块进行多次洗涤，对贴壁牢固的华通氏胶组织块重复步骤2)-3)，直到没有间充质干细胞从所述华通氏胶组织块中爬出，以获得更多消化后的间充质干细胞；

5)将获得的间充质干细胞通过筛网过滤，以除去细胞悬液中残余的华通氏胶组织块，所得过滤后的细胞即为制备的原代间充质干细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脐带组织为人源脐带组织。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞培养箱中的环境为37℃、5％CO₂。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基础培养基为α-MEM基础培养基如Corning、Hyclone或BI牌的产品，且所述血清替代物为GMP级的血清替代物如Helios或PALL牌的产品。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述消化酶为美国赛默飞世尔科技公司的Gibco牌TrypLE。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述筛网大小为100-200目。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生理盐水含1％双抗。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，剪碎的华通氏胶组织块大小为约3mm×3mm×1mm。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将剪碎的华通氏胶组织块按照1块/cm²的密度进行贴壁。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中加入所述完全培养基培养3-5天后，按每个培养皿5-7mL补加所述完全培养基，继续静置培养5-9天，期间每隔3-4天更换新的完全培养基。