CN111778206A - 一种抗皮肤衰老的鹿茸干细胞条件培养液的制备方法 - Google Patents
一种抗皮肤衰老的鹿茸干细胞条件培养液的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111778206A CN111778206A CN202010553580.2A CN202010553580A CN111778206A CN 111778206 A CN111778206 A CN 111778206A CN 202010553580 A CN202010553580 A CN 202010553580A CN 111778206 A CN111778206 A CN 111778206A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antler
- medium
- conditioned medium
- stem cells
- periosteum
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 210000003056 antler Anatomy 0.000 title claims abstract description 110
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 75
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 title claims abstract description 41
- 230000009759 skin aging Effects 0.000 title claims abstract description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 19
- 210000003460 periosteum Anatomy 0.000 claims description 32
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 21
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 claims description 19
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 13
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 13
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 12
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 11
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 11
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 10
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 9
- 208000006735 Periostitis Diseases 0.000 claims description 8
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 5
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 claims description 5
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 claims description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 4
- 239000012879 subculture medium Substances 0.000 claims description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 3
- YRQNKMKHABXEJZ-UVQQGXFZSA-N chembl176323 Chemical compound C1C[C@]2(C)[C@@]3(C)CC(N=C4C[C@]5(C)CCC6[C@]7(C)CC[C@@H]([C@]7(CC[C@]6(C)[C@@]5(C)CC4=N4)C)CCCCCCCC)=C4C[C@]3(C)CCC2[C@]2(C)CC[C@H](CCCCCCCC)[C@]21C YRQNKMKHABXEJZ-UVQQGXFZSA-N 0.000 claims description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims description 3
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 3
- 238000009777 vacuum freeze-drying Methods 0.000 claims description 3
- UEEJHVSXFDXPFK-UHFFFAOYSA-N N-dimethylaminoethanol Chemical compound CN(C)CCO UEEJHVSXFDXPFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000003712 anti-aging effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000012972 dimethylethanolamine Substances 0.000 claims description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 2
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 claims description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 7
- HHEAADYXPMHMCT-UHFFFAOYSA-N dpph Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC([N+](=O)[O-])=CC([N+]([O-])=O)=C1[N]N(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 HHEAADYXPMHMCT-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 5
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 abstract description 3
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 abstract description 3
- 210000002782 epithelial mesenchymal cell Anatomy 0.000 abstract description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 abstract description 3
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 abstract description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 abstract description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 abstract description 3
- 230000023402 cell communication Effects 0.000 abstract description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 abstract description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 abstract description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 abstract description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 abstract description 2
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 abstract description 2
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 abstract description 2
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 abstract description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 abstract description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 abstract description 2
- 102000005755 Intercellular Signaling Peptides and Proteins Human genes 0.000 abstract 1
- 108010070716 Intercellular Signaling Peptides and Proteins Proteins 0.000 abstract 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 abstract 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 abstract 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 7
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 3
- -1 DPPH free radical Chemical class 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 230000000249 desinfective effect Effects 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 2
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 2
- 102400000888 Cholecystokinin-8 Human genes 0.000 description 1
- 101800005151 Cholecystokinin-8 Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- MGJZITXUQXWAKY-UHFFFAOYSA-N diphenyl-(2,4,6-trinitrophenyl)iminoazanium Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC([N+](=O)[O-])=CC([N+]([O-])=O)=C1N=[N+](C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 MGJZITXUQXWAKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N iodine Chemical compound II PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 108010048734 sclerotin Proteins 0.000 description 1
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 238000011476 stem cell transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
- C12N5/0629—Keratinocytes; Whole skin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0656—Adult fibroblasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/70—Undefined extracts
- C12N2500/80—Undefined extracts from animals
- C12N2500/84—Undefined extracts from animals from mammals
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种抗皮肤衰老的鹿茸干细胞条件培养液的制备方法，属于组织工程技术领域。本发明解决了现有鹿茸干细胞具有储存和运输不便，且存在免疫排斥反应和促进肿瘤细胞转移和刺激上皮‑间质细胞转化的问题。本发明包括鹿茸干细胞的原代分离培养、传代培养、条件培养液的收集、保存、处理、冻干等步骤。本发明的方法获得的鹿茸干细胞条件培养液中含有大量的细胞因子、生长因子、miRNA、mRNAs等多种成分，这些因子可短期或长期参与细胞交流、细胞信号转导、细胞或组织代谢改变等生理过程，能够清除DPPH自由基，清除率可达74.63％‑82.45％，且对于人角质形成细胞和真皮成纤维细胞增殖具有促进作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗皮肤衰老的鹿茸干细胞条件培养液的制备方法，属于组织工程技术领域。
背景技术
鹿茸是目前所知的唯一能够完全再生的哺乳动物器官，且其生长速度可达2cm/d。鹿茸完全再生和快速生长能力主要由于鹿茸干细胞的存在。经鉴定，鹿茸干细胞为介于胚胎干细胞和间充质干细胞之间的一种特殊的干细胞类型。与目前所常用的骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞等干细胞相比，鹿茸干细胞更易于获取，增殖速度快，分泌大量的细胞因子和生物活性因子。
近年来，利用干细胞移植补充人体干细胞来抗衰老被认为是一项新的有效的措施。骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞、脐带间充质干细胞等多种干细胞已被证明可以改善机体衰老。然而，直接使用干细胞具有储存和运输不便以及免疫排斥方面的缺点。另外，干细胞容易分化成其它基质细胞，可能会促进肿瘤细胞转移和刺激上皮-间质细胞转化，存在安全隐患。因此，提供一种能够将鹿茸干细胞应用于抗皮肤衰老的方法是十分必要的。
发明内容
本发明为了解决现有鹿茸干细胞具有储存和运输不便，且存在免疫排斥反应和促进肿瘤细胞转移和刺激上皮-间质细胞转化的问题，提供一种抗皮肤衰老的鹿茸干细胞条件培养液的制备方法。
本发明的技术方案：
一种抗皮肤衰老的鹿茸干细胞条件培养液的制备方法，该方法包括以下步骤：
步骤一，鹿茸干细胞的分离培养；
鹿茸干细胞来源于鹿生茸区骨膜组织、鹿角柄骨膜组织和鹿茸间充质组织，采集鹿生茸区骨膜组织、鹿角柄骨膜组织和鹿茸间充质组织后置于运输液中；
步骤二，鹿茸干细胞的原代培养；
(1)将步骤一采集的鹿生茸区骨膜组织、鹿角柄骨膜组织和鹿茸间充质组织从运输液中取出，使用PBS溶液反复清洗直至完全取出血污，然后在一次性无菌平皿中，使用小刀将鹿生茸区骨膜组织、鹿角柄骨膜组织和鹿茸间充质组织成切割为0.7mm3的碎块；
(2)取2-4g碎块，使用洗涤液洗涤碎块，然后转入50mL离心管中，在100rpm的条件下离心5min，弃上清液，收集沉淀；
(3)向(2)获得的沉淀2-4g中加入20mL消化液，在37℃条件下震荡进行消化，每间隔10min在显微镜下观察消化情况，在碎块边缘出现毛刷样毛边时，停止消化，在1000rpm的条件下离心5min，弃上清液，使用DMEM完全培养液洗涤，然后在1000rpm的条件下离心5min，弃上清液，收集沉淀；
(4)取(3)获得的沉淀0.5-1g，均匀涂在细胞培养瓶底部，倒置培养瓶并加入1-2mL的原代培养液，置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养2-4h，然后加入2mL的原代培养液，正置培养瓶继续静置培养，2-3天后，开始在显微镜下观察组织块的贴壁及细胞发散情况，5-7后细胞达到70％汇合，将细胞进行胰蛋白酶消化，冻存，获得原代鹿茸干细胞；
步骤三，鹿茸干细胞的传代培养；
将步骤二获得的原代鹿茸干细胞在传代培养基上进行传代培养，传至3-5代，鹿茸干细胞生长至70-80％汇合，转至无血清培养基培养48h，收集细胞培养上清液，在1000rpm条件下离心，收集上清液，获得鹿茸干细胞条件培养液，将培养液进行真空冷冻干燥，得到鹿茸干细胞条件培养液的活性物冻干粉。
进一步地，步骤一中鹿生茸区骨膜组织采集于鹿生茸区未开始发育的1岁龄公鹿的额外嵴生茸区。
进一步地，步骤一中鹿角柄骨膜组织采集于2岁龄公鹿的角柄骨膜。
进一步地，步骤一中鹿茸间充质组织采集于生长期10-60天的鹿茸。
进一步地，运输液为DMEA完全培养液。
进一步地，洗涤液为不含FBS，含双抗的DMEM培养液。
进一步地，消化液为50U/mL的胶原酶Ⅰ。
进一步地，原代培养液为含20％FBS，含双抗的DMEM培养液。
进一步地，传代培养基由含10％FBS，含双抗的DMEM培养液和mTeSRTM1培养基组成，其中mTeSRTM1培养基所占的质量为传代培养基总质量的30％。
进一步地，无血清培养基由DMEM完全培养基和mTeSRTM1培养基组成，其中mTeSRTM1培养基所占的质量为无血清培养基总质量的30％。
本发明具有以下有益效果：本发明的方法获得的鹿茸干细胞条件培养液中含有大量的细胞因子、生长因子、miRNA、mRNAs等多种成分，这些因子可短期或长期参与细胞交流、细胞信号转导、细胞或组织代谢改变等生理过程，能够清除DPPH自由基，清除率可达74.63％-82.45％，具有抗氧化功能，且对于人角质形成细胞(Hacat)和真皮成纤维细胞(NHDF)增殖具有促进作用。并且本申请的方法获得的鹿茸干细胞条件培养液中与人骨髓间充质干细胞条件培养液相比，鹿茸干细胞更容易获取、增殖速度是人骨髓间充质的十几倍。
附图说明
图1为鹿茸干细胞条件培养液对Hacat细胞增殖的影响；
图2为鹿茸干细胞条件培养液对NHDF细胞增殖的影响。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。所用材料、试剂、方法和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、方法和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。
实施例1：
一、鹿茸干细胞的分离培养；鹿茸干细胞来源于鹿生茸区骨膜组织、鹿角柄骨膜组织和鹿茸间充质组织。
(1)采集鹿生茸区骨膜组织的具体操作过程为：麻醉鹿生茸区未开始发育的1岁龄公鹿，麻醉后对额外嵴生茸区进行备皮，消毒，并在无菌环境下，切开生茸区皮肤，暴露生茸区骨膜，清理掉疏松结缔组织，然后用干净的手术刀沿着生茸区鼓包处的最低线进行切割，需要将生茸区全部包含在内，然后鼠牙镊子将切割的骨膜从骨质上撕下来，迅速放入运输液中，运输液为含双倍双抗的DMEM培养基。
(2)采集鹿角柄骨膜组织的具体操作过程为：麻醉2岁龄公鹿，麻醉后对角柄进行备皮，消毒，并在无菌环境下，沿着角柄切开角柄皮肤，暴露角柄骨膜，清理掉疏松结缔组织，然后用干净的无菌手术刀沿着角柄把角柄骨膜工字型切开，将其切割成5mm左右的若干个长条，然后用鼠牙镊子将每一条角柄骨膜撕下来，迅速放入运输液中，运输液为含双倍双抗的DMEM培养基。
(3)采集鹿茸间充质组织的具体操作过程为：取生长期10-60天的鹿茸，无菌纱布清洁鹿茸表面，备皮后用碘酒和75％酒精进行消毒处理。在生物安全柜内用组织切片刀片切下3-5cm的鹿茸尖部，置于无菌培养皿内，然后沿纵向将其分割为0.5cm左右的薄片，平放于新的培养皿内，沿着皮下结缔组织将皮肤和皮下鹿茸组织切开，去掉皮肤，然后用手术刀切下皮下微微凸起的弧形半透明的一层组织，迅速放入运输液中，运输液为含双倍双抗的DMEM培养基。
二、鹿茸干细胞的原代培养；
(1)将采集的生茸区骨膜/角柄骨膜/鹿茸间充质层组织从运输液(DMEM液)中用无菌镊子取出，用PBS反复清洗，直至完全去除血污。在一次性无菌平皿中，用自制的无菌的小铡刀(发明专利)将生茸骨膜/角柄骨膜/鹿茸间充质组织切割成0.7mm3左右的均匀的碎块。
(2)用不含FBS、含双倍双抗(200U/mL)的DMEM液洗涤2-4g碎块，并将其转入50mL无菌离心管中，在1000rpm条件下离心5min，收集沉淀。
(3)轻缓去除上清，加20mL消化液(50U/mL胶原酶Ⅰ)，在37℃水浴中轻微震荡进行消化，以10min的时间间隔在显微镜下观察消化情况，当大多数组织块边缘出现毛刷样毛边时，停止消化，在1000rpm条件下离心5min，收集沉淀。
(4)然后弃上清，加20mL DMEM完全培养液洗涤，1000rpm，离心5min，收集沉淀。
(5)然后吸取(4)的沉淀物，并将其均匀的涂在细胞培养瓶底部，倒置培养瓶并加入1～2mL的DMEM原代培养液(DMEM+20％FBS+双抗)。
(6)放入37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养2-4h，加2mLDMEM原代培养液，正置培养瓶继续静止培养。
(7)3天后，在显微镜下观察组织块的贴壁及细胞发散情况，7天后细胞达到70％汇合时，将细胞进行胰蛋白酶消化(0.25％胰蛋白酶，消化1-2分钟，细胞收缩变圆后，终止消化)，获得原代鹿茸干细胞。
三、鹿茸干细胞的传代培养；
将获得的原代鹿茸干细胞用70％DMEM完全培养基(DMEM+10％FBS+双抗)加上30％mTeSRTM1培养基进行传代培养，传至第3-5代时，进行条件培养基的制备，即鹿茸干细胞生长至70-80％汇合时，去除现用的培养基，用PBS洗2-3次，换成无血清培养基(70％DMEM+30％mTeSRTM1)继续培养48h后，收集细胞培养上清液；1000rpm离心，去除脱落细胞及其碎片，收集上清溶液，获得鹿茸干细胞条件培养液。
将鹿茸干细胞条件培养液进行真空冷冻干燥，得到鹿茸干细胞条件培养液的活性物冻干粉。
实施例2：
(1)对实施例1获得的鹿茸干细胞条件培养液进行清除DPPH自由基活性检测。
称量1mg DPPH溶于20ml无水乙醇中，每管反应体系中加入1毫升DPPH溶液和0.5毫升鹿茸干细胞条件培养液样品，混匀，静置30min后在519nm处测定吸光度值。
以空白培养基作为空白对照，样品对照组为1mL乙醇溶液和0.5mL鹿茸干细胞条件培养液样品。按下列公式计算DPPH自由基清除率。
DPPH自由基清除率＝[1-(A样品组-A样品对照组)/A空白对照组]X100％
测得鹿茸干细胞条件培养液及其冻干粉具有明显的清除DPPH自由基的作用，清除率可达74.63％-82.45％。
(2)对实施例1获得的鹿茸干细胞条件培养液进行人角质形成细胞(Hacat)和真皮成纤维细胞(NHDF)的增殖促进检测。
分别培养Hacat和NHDF细胞，以5000个/孔的密度接种于96孔细胞培养板，培养6h左右，细胞贴壁良好后，分别换成含50％鹿茸干细胞条件培养基的细胞培养液，培养24h后，加入10ul CCK8，37℃孵育2h后，于410nm检测吸光度。
测试结果如图1和图2所示，结果发现鹿茸干细胞条件培养液具有明显的促进Hacat细胞和NHDF细胞增殖的作用。
Claims (10)
1.一种抗皮肤衰老的鹿茸干细胞条件培养液的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤一，鹿茸干细胞的分离培养；
鹿茸干细胞来源于鹿生茸区骨膜组织、鹿角柄骨膜组织和鹿茸间充质组织，采集鹿生茸区骨膜组织、鹿角柄骨膜组织和鹿茸间充质组织后置于运输液中；
步骤二，鹿茸干细胞的原代培养；
(1)将步骤一采集的鹿生茸区骨膜组织、鹿角柄骨膜组织和鹿茸间充质组织从运输液中取出，使用PBS溶液反复清洗直至完全取出血污，然后在一次性无菌平皿中，使用小刀将鹿生茸区骨膜组织、鹿角柄骨膜组织和鹿茸间充质组织成切割为0.7mm3的碎块；
(2)取2-4g碎块，使用洗涤液洗涤碎块，然后转入50mL离心管中，在100rpm的条件下离心5min，弃上清液，收集沉淀；
(3)向(2)获得的沉淀2-4g中加入20mL消化液，在37℃条件下震荡进行消化，每间隔10min在显微镜下观察消化情况，在碎块边缘出现毛刷样毛边时，停止消化，在1000rpm的条件下离心5min，弃上清液，使用DMEA完全培养液洗涤，然后在1000rpm的条件下离心5min，弃上清液，收集沉淀；
(4)取(3)获得的沉淀0.5-1g，均匀涂在细胞培养瓶底部，倒置培养瓶并加入1-2mL的原代培养液，置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养2-4h，然后加入2mL的原代培养液，正置培养瓶继续静置培养，2-3天后，开始在显微镜下观察组织块的贴壁及细胞发散情况，5-7后细胞达到70％汇合，将细胞进行胰蛋白酶消化，冻存，获得原代鹿茸干细胞；
步骤三，鹿茸干细胞的传代培养；
将步骤二获得的原代鹿茸干细胞在传代培养基上进行传代培养，传至3-5代，鹿茸干细胞生长至70-80％汇合，转至无血清培养基培养48h，收集细胞培养上清液，在1000rpm条件下离心，收集上清液，获得鹿茸干细胞条件培养液，将培养液进行真空冷冻干燥，得到鹿茸干细胞条件培养液的活性物冻干粉。
2.根据权利要求1所述的一种抗皮肤衰老的鹿茸干细胞条件培养液的制备方法，其特征在于，所述的步骤一中鹿生茸区骨膜组织采集于鹿生茸区未开始发育的1岁龄公鹿的额外嵴生茸区。
3.根据权利要求1所述的一种抗皮肤衰老的鹿茸干细胞条件培养液的制备方法，其特征在于，所述的步骤一中鹿角柄骨膜组织采集于2岁龄公鹿的角柄骨膜。
4.根据权利要求1所述的一种抗皮肤衰老的鹿茸干细胞条件培养液的制备方法，其特征在于，所述的步骤一中鹿茸间充质组织采集于生长期10-60天的鹿茸。
5.根据权利要求1所述的一种抗皮肤衰老的鹿茸干细胞条件培养液的制备方法，其特征在于，所述的运输液为双倍双抗的DMEM完全培养液。
6.根据权利要求1所述的一种抗皮肤衰老的鹿茸干细胞条件培养液的制备方法，其特征在于，所述的洗涤液为不含FBS，含双抗的DMEM培养液。
7.根据权利要求1所述的一种抗皮肤衰老的鹿茸干细胞条件培养液的制备方法，其特征在于，所述的消化液为50U/mL的胶原酶Ⅰ。
8.根据权利要求1所述的一种抗皮肤衰老的鹿茸干细胞条件培养液的制备方法，其特征在于，所述的原代培养液为含20％FBS，含双抗的DMEM培养液。
9.根据权利要求1所述的一种抗皮肤衰老的鹿茸干细胞条件培养液的制备方法，其特征在于，所述的传代培养基由含10％FBS，含双抗的DMEM培养液和mTeSRTM1培养基组成，其中mTeSRTM1培养基所占的质量为传代培养基总质量的30％。
10.根据权利要求1所述的一种抗皮肤衰老的鹿茸干细胞条件培养液的制备方法，其特征在于，所述的无血清培养基由DMEM完全培养基和mTeSRTM1培养基组成，其中mTeSRTM1培养基所占的质量为无血清培养基总质量的30％。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010553580.2A CN111778206B (zh) | 2020-06-17 | 2020-06-17 | 一种抗皮肤衰老的鹿茸干细胞条件培养液的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010553580.2A CN111778206B (zh) | 2020-06-17 | 2020-06-17 | 一种抗皮肤衰老的鹿茸干细胞条件培养液的制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111778206A true CN111778206A (zh) | 2020-10-16 |
| CN111778206B CN111778206B (zh) | 2023-10-31 |
Family
ID=72756897
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010553580.2A Active CN111778206B (zh) | 2020-06-17 | 2020-06-17 | 一种抗皮肤衰老的鹿茸干细胞条件培养液的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111778206B (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114569634A (zh) * | 2022-03-14 | 2022-06-03 | 广州医科大学附属口腔医院 | 鹿茸间充质干细胞条件培养基在牙周炎药物中的用途 |
| CN115386542A (zh) * | 2022-06-21 | 2022-11-25 | 长春科技学院 | 工程化的鹿茸干细胞外泌体和制备方法、及在骨肉瘤治疗中的应用 |
| CN115433711A (zh) * | 2022-08-29 | 2022-12-06 | 长春科技学院 | 一种鹿茸干细胞细胞外基质及其制备方法和运用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130004583A1 (en) * | 2010-01-26 | 2013-01-03 | Wojciech Dziewiszek | Cell homogenate from stem cells derived from growing deer antlers, a method of obtaining it and its use |
| CN104152400A (zh) * | 2014-08-15 | 2014-11-19 | 中国农业科学院特产研究所 | 一种鹿骨膜条件培养液的制备方法及应用 |
| KR20180047952A (ko) * | 2016-11-02 | 2018-05-10 | (주)프로스테믹스 | 녹용 줄기세포 배양액을 포함하는 기능성 조성물 |
| CN108192862A (zh) * | 2018-01-17 | 2018-06-22 | 李春义 | 一种鹿茸干细胞的制备方法、鹿茸干细胞及其应用 |
| CN109777770A (zh) * | 2019-02-01 | 2019-05-21 | 中国农业科学院特产研究所 | 一种外泌体及其制备方法与应用 |
-
2020
- 2020-06-17 CN CN202010553580.2A patent/CN111778206B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130004583A1 (en) * | 2010-01-26 | 2013-01-03 | Wojciech Dziewiszek | Cell homogenate from stem cells derived from growing deer antlers, a method of obtaining it and its use |
| CN104152400A (zh) * | 2014-08-15 | 2014-11-19 | 中国农业科学院特产研究所 | 一种鹿骨膜条件培养液的制备方法及应用 |
| KR20180047952A (ko) * | 2016-11-02 | 2018-05-10 | (주)프로스테믹스 | 녹용 줄기세포 배양액을 포함하는 기능성 조성물 |
| CN108192862A (zh) * | 2018-01-17 | 2018-06-22 | 李春义 | 一种鹿茸干细胞的制备方法、鹿茸干细胞及其应用 |
| CN109777770A (zh) * | 2019-02-01 | 2019-05-21 | 中国农业科学院特产研究所 | 一种外泌体及其制备方法与应用 |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| CHUNYI LI等: "Antler Stem Cells Sustain Regenerative Wound Healing in Deer and in Rats" * |
| MINKOO SEO等: "A Novel Secretory Vesicle from Deer Antlerogenic Mesenchymal Stem Cell-Conditioned Media (DaMSC-CM) Promotes Tissue Regeneration" * |
| XIAOLI RONG等: "Antler stem cell-conditioned medium stimulates regenerative wound healing in rats" * |
| ZHIGANG SUI等: "Quantitative proteomics analysis of deer antlerogenic periosteal cells reveals potential bioactive factors in velvet antlers" * |
| 何强等: "间充质干细胞来源外泌体在创面修复中的作用及其机制研究进展" * |
| 王大涛: "鹿茸干细胞的鉴定以及鹿茸再生关键调控基因的筛选" * |
| 荣小丽: "鹿茸干细胞及其分泌蛋白促进皮肤伤口愈合的作用及机制研究" * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114569634A (zh) * | 2022-03-14 | 2022-06-03 | 广州医科大学附属口腔医院 | 鹿茸间充质干细胞条件培养基在牙周炎药物中的用途 |
| CN114569634B (zh) * | 2022-03-14 | 2024-03-12 | 广州医科大学附属口腔医院 | 鹿茸间充质干细胞条件培养基在牙周炎药物中的用途 |
| CN115386542A (zh) * | 2022-06-21 | 2022-11-25 | 长春科技学院 | 工程化的鹿茸干细胞外泌体和制备方法、及在骨肉瘤治疗中的应用 |
| CN115386542B (zh) * | 2022-06-21 | 2024-04-23 | 长春科技学院 | 工程化的鹿茸干细胞外泌体和制备方法、及在骨肉瘤治疗中的应用 |
| CN115433711A (zh) * | 2022-08-29 | 2022-12-06 | 长春科技学院 | 一种鹿茸干细胞细胞外基质及其制备方法和运用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN111778206B (zh) | 2023-10-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111826340B (zh) | 一种抗皮肤衰老的鹿茸干细胞外泌体的制备方法及其应用 | |
| EP0236014B1 (en) | Stimulation of hair growth | |
| CN111778206A (zh) | 一种抗皮肤衰老的鹿茸干细胞条件培养液的制备方法 | |
| CN110577931B (zh) | 间断缺氧处理干细胞来源外泌体及在心肌组织中的应用 | |
| KR20190055790A (ko) | 세포 배양 배지를 사용한 제대 양막(umbilical cord amniotic membrane)으로부터 중간엽 줄기세포를 분리하는 방법 | |
| CN108685948B (zh) | 一种医用细胞修复剂的制备方法 | |
| TW201311145A (zh) | 臍帶組織及其衍生細胞之儲存、培養及應用 | |
| CN102712905A (zh) | 从脐带组织分离包括间充质祖细胞亚群的单核细胞和包括内皮祖细胞亚群的血管细胞的方法 | |
| CN108865986B (zh) | 用于修复关节软骨损伤/缺损的间充质干细胞制剂及其制备方法和应用 | |
| CN101591644A (zh) | 临床治疗用脐带间充质干细胞的制备和储存 | |
| CN111690601A (zh) | 一种脐带间充质干细胞制剂的制备方法 | |
| CN108192862A (zh) | 一种鹿茸干细胞的制备方法、鹿茸干细胞及其应用 | |
| CN105477626A (zh) | 混合干细胞制剂及其制备方法 | |
| CN111956668B (zh) | 一种皮肤再生修复细胞组合物及制备方法 | |
| KR20200143399A (ko) | 중간엽 줄기 세포의 창상 치유 특성을 유도 또는 개선시키는 방법 | |
| CN110938587A (zh) | 一种表皮干细胞混悬液的制备方法及其应用 | |
| CN112870445A (zh) | 一种软组织修复材料的制备方法及应用 | |
| CN109652368B (zh) | 从脐带组织中获取原代间充质干细胞的方法 | |
| CN111346051A (zh) | 一种用于治疗脑梗死的脐带间充质干细胞注射液制备方法 | |
| CN105456293A (zh) | 一种用于治疗糖尿病的干细胞制剂及其制备方法 | |
| CN111840330B (zh) | 一种防脱发修复组合物及应用 | |
| CN104971382A (zh) | 一种用无血清和牛垂体提取物培养液构建的创口贴式人工活性组织及其构建方法 | |
| CN107988152A (zh) | 人脐带间充质干细胞培养液中抗氧化活性成分的分离方法 | |
| CN112280735B (zh) | 脐带来源的间充质干细胞及其制备方法和应用 | |
| CN111363716A (zh) | 去细胞羊膜载体复合自体子宫内膜干细胞的制备 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |