CN114569634B - 鹿茸间充质干细胞条件培养基在牙周炎药物中的用途 - Google Patents

Abstract

鹿茸间充质干细胞条件培养基在制备抑制牙周炎药物中的用途及其药物，RMC‑CM通过降低破骨细胞的活性和改变M1和M2的比例，可显著减少牙周炎对象的牙槽骨吸收和牙龈组织炎症。RMC‑CM在作为抑制牙周炎药物中存在重要潜力，可作为抑制牙周炎的药物应用。

Description

鹿茸间充质干细胞条件培养基在牙周炎药物中的用途

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种鹿茸间充质干细胞条件培养基在制备抑制牙周炎药物中的用途以及通过鹿茸间充质干细胞条件培养基抑制牙周炎的药物。

背景技术

牙周炎(PD)是由口腔微生物菌群失调引起的慢性炎症性疾病，导致牙齿支持组织的破坏。PD不仅对口腔功能有负面影响，还与多种系统性疾病的进展有关，包括心血管疾病、癌症、肥胖、糖尿病和慢性肾炎。牙周组织破坏是由宿主免疫反应通过产生促炎细胞因子引起的。“Keystone”病原体定植后，组织内稳态被破坏，微生物群落的致病性升高。此后，会发生一系列反应，如免疫细胞的浸润和破骨细胞的激活，最终导致软组织和硬组织的牙周破坏。

牙周组织再生的目的是恢复牙龈、牙槽骨、牙周膜和牙骨质的结构和功能。在已有的治疗方案中，只有少数方法可被视为可形成真正的牙周组织再生。干细胞、支架和生长因子被认为是实现真正再生的有效途径。

抑制牙周炎药物也经历了长期的发展，相关的药物种类也多种多样。然而对牙周炎的抑制效果也各有优点，也各有不足。有必要研究新的抑制牙周炎的药物，以更好实现牙周炎抑制效果。

因此，针对现有技术不足，提供一种鹿茸间充质干细胞条件培养基在制备抑制牙周炎药物中的用途以及通过鹿茸间充质干细胞条件培养基抑制牙周炎的药物，以克服现有技术不足甚为必要。

发明内容

本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种鹿茸间充质干细胞条件培养基在制备抑制牙周炎药物中的用途以及提供通过鹿茸间充质干细胞条件培养基抑制牙周炎的药物，所制备的药物能够有效实现牙周炎抑制。

本发明的目的通过以下技术措施实现。

提供一种鹿茸间充质干细胞条件培养基在制备抑制牙周炎药物中的用途，

进一步的，鹿茸间充质干细胞条件培养基在制备减少牙周炎牙周组织破坏的药物中的用途。

进一步的，鹿茸间充质干细胞条件培养基在制备抑制牙龈组织的炎症药物中的用途。

进一步的，鹿茸间充质干细胞条件培养基减少牙槽骨吸收。

进一步的，鹿茸间充质干细胞条件培养基降低破骨细胞的分化。

进一步的，鹿茸间充质干细胞条件培养基通过上调M2巨噬细胞的比例降低牙龈组织炎症水平。

进一步的，鹿茸间充质干细胞条件培养基下调TNF-α和iNOS的表达、上调IL-10和CD206的表达。

优选的，在体外，鹿茸间充质干细胞条件培养基下调巨噬细胞细胞中TNF-α、IL-6和IL-1β的表达，并上调IL-10的表达，抑制破骨细胞生成。

优选的，鹿茸间充质干细胞条件培养基促进细胞迁移。

本发明还提供上述用途得到的通过鹿茸间充质干细胞条件培养基抑制牙周炎的药物。

本发明的鹿茸间充质干细胞条件培养基在制备抑制牙周炎药物中的用途及其药物，RMC-CM通过降低破骨细胞的活性和改变M1和M2的比例，可显著减少牙周炎对象的牙槽骨吸收和牙龈组织炎症。RMC-CM在作为抑制牙周炎药物中存在重要潜力，可作为抑制牙周炎的药物应用。

说明书附图

利用附图对本发明作进一步的说明，但附图中的内容不构成对本发明的任何限制。

图1是本发明实施例2方案的实施过程示意图。

图2是本发明实施例2中RMC-CM在实验性牙周炎模型中减少牙槽骨丧失作用的实验结果图。

图3是本发明实施例2的中RMC-CM对实验性牙周炎模型破骨细胞抑制的结果图。。

图4是RMC-CM对牙周炎模型牙龈组织炎症相关mRNA表达的影响结果图。

图5是RMC-CM对LPS诱导的RAW 264.7细胞中的作用的结果图。

图6是RMC-CM对破骨细胞活化的影响结果图。

图7是RMCs和hBMSCs的支原体检测结果图。

图8是重要器官包括胸腺、肝脏、脾脏和肾脏的HE染色图。

具体实施方式

结合以下实施例对本发明作进一步说明。

实施例1。

鹿茸间充质干细胞条件培养基(RMC-CM)在制备抑制牙周炎药物中的用途。具体的，鹿茸间充质干细胞条件培养基可减少牙周炎牙周组织破坏，抑制牙龈组织的炎症。

实验验证，鹿茸间充质干细胞条件培养基能有效减少牙槽骨吸收，降低破骨细胞的分化。

鹿茸间充质干细胞条件培养基通过上调M2巨噬细胞的比例降低牙龈组织炎症水平。巨噬细胞是一种免疫细胞，在抵御牙周病原体方面起着关键作用。针对不同的局部微环境，巨噬细胞表现出可塑性，获得独特的表型，分为促炎性巨噬细胞(M1)和抗炎性巨噬细胞(M2)。M1巨噬细胞是IL-1β、TNF-α和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的重要来源，可诱导牙槽骨丢失并促进牙周组织中破骨细胞的分化。M2巨噬细胞参与炎症分解和组织再生，可表达高水平CD206并产生大量IL-10。实验发现，RMC-CM可以通过调节M1和M2的比例来减轻牙龈组织的炎症水平。鹿茸间充质干细胞条件培养基下调TNF-α和iNOS的表达、上调IL-10和CD206的表达，诱导巨噬细胞向M2表型分化，提高了M2与M1的比例。

在体外，鹿茸间充质干细胞条件培养基下调细胞中TNF-α、IL-6和IL-1β的表达，并上调IL-10的表达，能够抑制破骨细胞生成。鹿茸间充质干细胞条件培养基促进细胞迁移。

根据上述用途可得到通过鹿茸间充质干细胞条件培养基抑制牙周炎的药物。

本实施例的鹿茸间充质干细胞条件培养基在制备抑制牙周炎药物中的用途及其药物，RMC-CM通过降低破骨细胞的活性和改变M1和M2的比例，可显著减少牙周炎对象的牙槽骨吸收和牙龈组织炎症。RMC-CM在作为抑制牙周炎药物中存在重要潜力，可作为抑制牙周炎的药物应用。

实施例2。

以具体实施例研究验证本发明的技术方案。在本实施例中，使用实验性牙周炎模型研究了RMC-CM减少牙周组织破坏的能力以及潜在机制，以提供牙周炎抑制药物用途及相应药物的技术方案。

如图1所示，实验过程具体如下：

1.细胞培养

RMCs根据论文Wang D,Berg D,Ba H,Sun H,Wang Z,Li C.Deer antler stemcells are a novel type of cells that sustain full regeneration of a mammalianorgan-deer antler.Cell Death Dis.2019；10(6):443.中的方法获取得到。hBMSCs购自赛业公司(中国苏州)。RMCs和hBMSCs在含有10％(v/v)胎牛血清(FBS；BI，以色列)和1％(v/v)青霉素/链霉素(P/S；Hyclone，美国)的α-MEM(Gibco美国)中培养。第4-6代的细胞用于所有实验。使用支原体检测试剂盒(Solarbio，北京，中国)在细胞培养期间对RMCs和hBMSCs进行支原体检测。图7是其中一组RMCs和hBMSCs的支原体检测结果。其中(A)、(C)是对照组的图像。(B)、(D)是实验组的图像。比例尺，0.4毫米。部分放大的图像放置在相应图像的右上角。比例尺，0.1毫米。简单地说，将细胞以2×10⁴个细胞/孔的密度接种到6孔板中，在含10％(v/v)FBS和1％(v/v)P/S的α-MEM中培养的RMCs和hBMSCs用作对照组，而在含10％FBS和不含P/S的α-MEM中培养的RMCs和hBMSCs用作实验组。培养5天后，丢弃上清液，将细胞固定并在Hoechst 33258溶液中避光培养。荧光显微镜(AMG Evos，美国热工科学公司)用于观察。小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞系购自CCTCC(中国武汉)，于含有10％的FBS和1％的P/S的DMEM中培养。

2.CMs制备

当RMCs和hBMSCs达到90％融合时，丢弃正常培养基，用磷酸盐缓冲盐水(PBS；Gibco，USA)清洗细胞。在α-MEM(不含FBS和P/S)中培养48小时后，收集上清液，离心(1000rpm，4℃下10分钟)，通过0.22μm孔径过滤器过滤(美国，Millipore公司)，并使用3kDa的超滤离心管(5000rpm，4℃下40分钟；美国，Millipore公司)进行浓缩，以制备CM。用改良BCA蛋白检测试剂盒(BEOOTIN，上海，中国)测定CMs中的总蛋白浓度，调整至1mg/ml，并储存在-80℃。空白对照(PBS)和阴性对照(α-MEM)浓缩方法如上所述。

3.动物模型

所有动物实验均获得动物伦理委员会批准。SPF雄性C57BL/6J小鼠(10-11周龄)购自辽宁长胜生物科技有限公司(中国辽宁)。实验组的样本量是根据之前的研究确定的(34)。小鼠在12小时的光暗循环下适应无病原体条件1周后，根据之前的研究建立了实验性牙周炎模型(35)。简单地说，称重小鼠，并将其放置在一个密封容器中，该容器中的异氟醚流量为4％(v/v)。完全麻醉后，在右上颌第一和第二磨牙之间放置双打结的5-0丝线(彼此相距约2.5mm)，以引发牙龈组织炎症和牙周骨丢失。实验性牙周炎小鼠随机分为四组(对照组、α-MEM组、hBMSC-CM组和RMC-CM组)。将RMC-CM和hBMSC-CM的浓缩10倍，每2天局部注射5μL。PBS和α-MEM以等体积局部注射。分别于1周和2周处死各组小鼠。收集的所有三颗磨牙周围的牙龈组织储存在-80℃下，上颌固定在4％(v/v)多聚甲醛(PFA)中。

4.Micro-CT扫描

使用高分辨率显微CT扫描小鼠的上颌骨(瑞士巴塞斯多夫Scano Medical AG)。关键参数设置为70kV、150mA和10μm增量，积分时间为300ms。扫描文件使用MimicsInnovation Suite软件(比利时，Materialise)重建和分析。测量3D图像中第一磨牙(远颊根)和第二磨牙(近颊根)的CEJ-ABC之间的距离。在每个部位重复测量两次，计算平均距离，以毫米为单位。

5.组织学和免疫组织化学(IHC)染色

样本在10％(v/v)EDTA溶液(北京化工厂，北京，中国)中室温脱钙2周。此后，沿着牙齿长轴将标本包埋并沿矢状方向切片，检测苏木精-伊红(HE)(Servicebio，中国)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)(中国南京建成科技有限公司)和IHC染色。TRAP阳性多核(>3核)细胞被认为是破骨细胞。本实验中使用了抗CD68的抗体(美国Proteintech)。使用OympusBX53显微镜(日本奥林巴斯公司)扫描切片，并使用CaseViewer软件(匈牙利布达佩斯3DHISTECH有限公司)浏览。使用ImageJ软件(德国斯图加特Rawak软件公司)计数TRAP和CD68阳性细胞的数量。

6.CCK-8测定

使用细胞计数试剂盒(CCK-8；Solarbio，中国北京)分析RMC-CM对RAW264.7活性的影响。将RAW264.7细胞以3000个细胞/孔的密度接种到96孔板中，并在添加10％(v/v)FBS和1％(v/v)P/S的DMEM中培养24小时。除对照孔中的细胞外，所有细胞均用Pg-LPS(1μg/mL；美国加利福尼亚州圣地亚哥因维沃根)处理12小时并用PBS洗涤。将α-MEM(不含FBS和P/S)和倍比稀释的RMC-CM添加到对照孔和其他孔中，并进一步培养8小时。使用酶标仪读取器在450nm处进行测量，结果以孔与对照孔的比率表示。

7.酶联免疫吸附试验(ELISA)

RAW264.7细胞以3×10⁵细胞/孔的密度接种在6孔板中。用Pg-LPS(1μg/mL)处理过夜后，用PBS洗涤细胞。将浓度为0.25mg/mL的RMC-CM和hBMSC-CM以及等体积的α-MEM分别添加到孔中24小时。收集上清液，并根据说明使用ELISA试剂盒(中国武汉云克隆公司)测定TNF-α和IL-10的细胞因子水平。RAW264.7细胞用于RNA提取。

8.Transwell分析

使用带有8.0μm孔隙过滤器的Transwell培养皿(美国纽约康宁公司)进行迁移分析。简而言之，将RAW264.7细胞接种在6孔培养皿中24小时，并用Pg-LPS(1μg/mL)处理12小时。用PBS洗涤后，将2×10⁵个细胞接种在300μL低血清培养基(含0.5％FBS和1％PS的DMEM)中，接种到上室。将RMC-CM(0.25mg/ml)、hBMSC-CM(0.25mg/ml)和α-MEM分别添加到下室。进一步培养24小时后，将Transwell过滤器上的细胞在4％(v/v)PFA中固定，并用结晶紫染色液染色(Beyotime，上海，中国)。使用棉签去除过滤器上表面的细胞。随机选择五个区域，并以200倍放大倍数计数。

9.破骨细胞诱导

在96孔板(40)中以6000个细胞/孔的密度接种RAW264.7细胞，并用30ng/mL RANKL(中国上海Novoprotein)处理4h，用Pg-LPS(10ng/mL)处理12h。用PBS冲洗后，分别向孔中添加RANKL(30ng/mL)、RMC-CM(0.25mg/mL)、hBMSC-CM(0.25mg/mL)和α-MEM。每天更换上清液，直到破骨细胞形成。根据制造商的说明，使用TRAP染色试剂盒(Cosmo Bio，日本)对破骨细胞进行染色。

10.定量实时PCR(q-PCR)

从牙周组织和RAW264.7中提取总RNA。逆转录成cDNA。GAPDH购自桑根生物科技(中国上海)。引物序列如表1所示。

表一

11.统计分析

数据以平均值±标准差表示。组间比较采用单因素方差分析和事后检验。在p<0.05时，差异被认为是显著的。所有统计分析均使用Prism软件(美国加利福尼亚州GraphPad)进行。

12.结果

12.1RMC-CM抑制实验性牙周炎模型牙槽骨丧失

首先，验证RMC-CM对牙槽骨丢失的影响情况。在1周和2周采集的组织使用microCT进行扫描，并通过Mimics的3D重建图测量CEJ-ABC距离。图2是RMC-CM在实验性牙周炎模型中减少牙槽骨丧失作用的实验结果。图2中，A(i)是一周时，对照组、α-MEM组、hBMSC-CM组和RMC-CM组上颌磨牙的矢状面3D视图，A(ii)是2周时，对照组、α-MEM组、hBMSC-CM组和RMC-CM组上颌磨牙的矢状面3D视图。B(i)、B(ii)分别为1周、2周时的，通过HE染色观察结扎部位的CEJ–ABC距离图像；箭头对应于结扎部位的CEJ–ABC距离，图中，1为第一磨牙远牙根、2为第二磨牙近中颊根；B为牙槽骨；G为牙龈上皮。比例尺，0.2毫米。C(i)、C(ii)分别为1周、2周时测量矢状面三维视图的CEJ-ABC距离。D(i)、D(ii)分别为1周、2周时测量HE染色切片的CEJ-ABC距离。C组和D组的所有数据均表示为平均值±标准差**与对照组相比，p<0.01，****p<0.0001，####与hBMSC-CM组相比，p<0.0001。在对照组中，发现牙槽骨吸收随时间增加，这证明建模是成功的，如图2A、图2C所示。通过比较1周和2周的结果，我们发现与PBS和α-MEM相比，RMC-CM显著减少了牙槽骨丢失，RMC-CM组和hBMSC-CM组之间没有发现显著差异如图2A、图2C所示。为了确认结果，还用HE对采集的组织切片进行染色，如图2B所示，并测量切片的CEJ-ABC距离，如图2D所示。结果与Micro-CT一致；然而，在2周时，RMC-CM组和hBMSC-CM组之间存在显著差异，差异显示RM-CM组的骨吸收量比hBMSC-CM组的少，说明RM-CM组的减少骨吸收的效果比hBMSC-CM组好。用HE染色评估RMC-CM在体内的生物安全性，结果如图8所示。根据图8，在胸腺、肝脏、脾脏和肾脏中未发现组织学异常，表明RMC-CM在小鼠中应用是安全的。

12.2RMC-CM抑制实验性牙周炎模型中巨噬细胞浸润和破骨细胞活化

为了确定减少牙槽骨吸收的机制，我们使用TRAP对切片进行破骨细胞活化分析。结果如图3所示，图3是RMC-CM对实验性牙周炎模型破骨细胞抑制的结果。其中，A(i)、A(ii)分别是1周、2周时，牙周炎区域的TRAP染色切片，箭头表示破骨细胞。比例尺，0.05毫米。B(i)、B(ii)分别是1周、2周时，针对CD68的IHC染色切片，箭头表示巨噬细胞。比例尺，0.05毫米。C(i)、C(ii)分别是1周和2周时的破骨细胞总数。D(i)、D(ii)分别是1周和2周时CD68阳性细胞数。所有数据均以平均值±标准差表示。*与对照组相比，p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。TRAP染色(图3A)和统计分析(图3C)表明，RMC-CM组的破骨细胞数量显著低于对照组和α-MEM组，RMC-CM组和hBMSC-CM组之间无显著差异。由于破骨细胞可由单核细胞-巨噬细胞谱系和组织巨噬细胞产生，因此对CD68进行IHC染色，以探索RMC-CM组破骨细胞活化下调的机制(图3B)。因此，在牙槽骨吸收的炎症区域发现巨噬细胞浸润。与对照组相比，RMC-CM组在2周时的巨噬细胞数量显著减少，如图3D所示。总的来说，巨噬细胞浸润和破骨细胞激活发生在牙槽骨丢失期间，有代表性的数据证实，它们在牙周炎发展过程中与牙槽骨丢失表现出相似的趋势。

12.3RMC-CM在实验性牙周炎模型中减轻牙龈组织炎症水平

在证实RMC-CM可以抑制牙槽骨吸收并减少破骨细胞的形成后，继续验证RMC-CM对牙龈上皮炎症的影响。IHC结果显示，牙周炎区域存在巨噬细胞浸润，验证与巨噬细胞相关的基因表达。图4是RMC-CM对牙周炎模型牙龈组织炎症相关mRNA表达的影响结果图。其中，A(i)、A(ii)分别是1周、2周的TNF-α结果；B(i)、B(ii)分别是1周、2周的IL-10结果；C(i)、C(ii)分别是1周、2周的iNOS结果，D(i)、D(ii)分别是1周、2周的)CD206。所有数据均以平均值±标准差表示。*与对照组相比，p<0.05，**p<0.01，**p<0.0001####，与hBMSC-CM组相比，p<0.0001。根据图4的结果显示，在1周时，四组之间没有显著差异(图4A i、B i、C i、D i)。然而，在2周时，治疗组中TNF-α和iNOS的mRNA表达显著低于对照组，RMC-CM组和hBMSC-CM组之间没有发现显著差异(图4A ii)(图4C ii)；IL-10的表达显著高于其他三组(图4B ii)，CD206的表达显著高于对照组，RMC-CM组和hBMSC-CM组之间无显著差异(图4D ii)。TNF-α和iNOS是M1巨噬细胞释放的促炎细胞因子，IL-10是M2巨噬细胞释放的抗炎细胞因子，CD206是M2巨噬细胞相关的标志物。这些结果表明，RMC-CM可以通过调节M1和M2的比例来减轻牙龈组织的炎症水平。

12.4RMC-CM增强LPS刺激的RAW 264.7细胞的活力

还在体外验证了RMC-CM对LPS刺激的RAW 264.7的影响。为了确定RMC-CM对细胞活力的细胞毒性，进行了CCK-8测定。在浓度为0.25mg/mL时，RMC-CM可降低Pg-LPS对RAW26.7的负面影响(图5a)。为了验证0.25mg/mL是否为最佳浓度，使用qPCR测定TNF-α和IL-10的mRNA表达。与对照组相比，不同浓度的RMC-CM可显著下调和上调TNF-α和IL-10的表达。此外，在0.25mg/mL的RMC-CM浓度下，TNF-α和IL-10表达的平均值低于或高于其他浓度下的平均值(图5B，C)。因此，0.25mg/mL RMC-CM不影响LPS刺激的RAW264.7的活性。体外研究中使用的浓度是安全有效的。

12.5RMC-CM在LPS刺激的RAW 264.7细胞中下调促炎反应并上调抗炎反应

为了验证RMC-CM是否能够在体外调节LPS刺激的RAW 264.7中的促炎和抗炎反应，首先使用ELISA测试了Pg-LPS刺激的RAW 264.7细胞的产生。

图5是RMC-CM对LPS诱导的RAW 264.7细胞中的作用的结果示意图。其中，图5中，A是RMC-CM对LPS诱导的RAW 264.7细胞活力的影响结果。LPS刺激的RAW 264.7细胞在RMC-CM的两倍稀释系列中培养8小时。通过CCK-8分析测试细胞活力，结果以实验组相对于对照组的存活细胞百分比表示。图5中，B、C是不同浓度的RMC-CM对LPS刺激的RAW 264.7细胞中TNF-α和IL-10基因表达的影响。图5中，D、E是RMC-CM对TNF-α和IL-10产生的影响。分别用α-MEM、hBMSC-CM和RMC-CM在Pg LPS(1μg/mL)存在下处理细胞24小时。此后，收集培养上清并通过ELISA进行分析。图5中，F、G、H、I、J、K、L分别是RMC-CM对IL-10，Arg-1，CD206，TNF-α，iNOS，IL-6和IL-1β基因表达的影响。所有数据均以平均值±标准差表示。*与对照组相比，p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，***p<0.0001。

实验发现RMC-CM组的TNF-α浓度显著低于α-MEM组，IL-10浓度显著高于α-MEM组，RMC-CM组和hBMSC-CM组之间无显著差异(图5D，E)。α-MEM、hBMSC-CM和RMC-CM组中的细胞在α-MEM、hBMSC-CM和RMC-CM中培养前用Pg-LPS处理。使用qPCR检测TNF-α和IL-10的mRNA表达也验证了上述结果(图5F，G)，这些结果与体内研究结果一致。RMC-CM组中IL-6和IL-1β的表达显著低于α-MEM组，RMC-CM组和hBMSC-CM组之间没有发现显著差异(图5K，L)。Arg-1在RMC-CM组中的表达显著高于α-MEM组，在RMC-CM组和hBMSC-CM组之间没有发现显著差异(图5g)。然而，RMC-CM组中CD206的表达在三组之间没有差异(图5h)，并且iNOS的表达在RMC-CM组中显著高于α-MEM组，RMC-CM组和hBMSC-CM组之间没有发现显著差异(图5j)。这些结果表明，RMC-CM可通过上调IL-10和Arg-1的分泌或表达，下调TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌或表达，从而减弱抗炎反应。因为M1巨噬细胞的特点是产生大量促炎细胞因子(如IL-1β)和M2巨噬细胞的主要特征是高表达IL-10和低表达TNF-α和IL-1β因此，在LPS刺激的RAW 264.7细胞中，RMC-CM作用的潜在机制与M2极化表型的上调有关。

12.6RMC-CM抑制破骨细胞生成

验证RMC-CM对破骨细胞激活的影响，首先使用Transwell分析法在体外研究了RMC-CM对LPS刺激的RAW 264.7迁移的影响。图6是RMC-CM对破骨细胞活化的影响结果。其中，图6中A是LPS刺激RAW 264.7细胞迁移的Transwell图。比例尺，0.1毫米。图6中B是TRAP阳性细胞的面积结果。比例尺，0.5毫米。图6中C是TRAP阳性多核细胞。比例尺，0.05毫米。图6中D是各组中迁移的LPS刺激的RAW 264.7细胞总数。(图6中E是TRAP阳性细胞面积的测量结果。图6中F是各组TRAP阳性多核细胞总数。图6中G-J分别是是RMC-CM对破骨细胞相关基因表达的影响。破骨细胞激活后第1天检测到c-Fos和NFATc1。破骨细胞激活3天后检测TRAP和CatK。所有数据均以平均值±标准差表示。***与对照组相比，p<0.001，****p<0.0001##与hBMSC-CM组相比，p<0.01，####p<0.0001。孵育24小时后，发现LPS刺激的RAW 264.7迁移显著(图6A，D)。破骨细胞诱导后，RMC-CM组TRAP阳性多核细胞的面积(图6b，E)和数量(图6c，F)明显少于其他两组。为了验证TRAP阳性多核细胞是否为破骨细胞，使用qPCR检测破骨细胞相关基因的表达。发现新形成的多核细胞代表破骨细胞相关标记物(图6G、H、I、J)。c-Fos和NFATc1参与早期破骨细胞分化，而TRAP和CatK参与终末破骨细胞分化。总的来说，结果表明RMC-CM在体外可以显著抑制破骨细胞的激活。

实验结果可以确定RMC-CM具有治疗牙周炎的效果，可作为抑制牙周炎的药物用途。在实验性牙周炎模型中证明RMC-CM可减少牙槽骨吸收和破骨细胞活化。巨噬细胞分泌的炎性细胞因子和巨噬细胞相关标志物的显著变化表明，RMC-CM可能通过上调M2的比例来减轻牙龈组织的炎症水平。RMC-CM的作用，如增强细胞生存能力、促进抗炎细胞因子的分泌、促进M2标记物的表达和抑制破骨细胞生成，在体外得到了进一步验证。

RMCs是一种从生长鹿茸末端5厘米处收集的鹿茸干细胞(ASCs)，是鹿茸快速生长的基础。ASCs可以促进距离1mm处伤口愈合，而不需要直接进入受伤组织，这表明旁分泌效应可能在其作用中发挥关键作用。本实施例中，hBMSCs被选为阳性对照，原因如下：1、RMC-CM和hBMSC-CM对于大鼠都属于跨物种CM，比较结果相对令人信服；2、hBMSCs对组织再生的影响已在其他研究中得到证实，之前也有报道过hBMSCs和RMCs之间增殖和矿化基因的比较。尽管hBMSCs存在于许多组织中，但它们在体内的总数很少。细胞治疗方案通常需要大量MSCs；因此，细胞在植入前需要在体外扩增数周。此外，患者年龄也会影响hBMSCs的活力。体外培养的hBMSCs的衰老导致衰老和年龄相关疾病。相比之下，从鹿茸增殖区的最外层获得数亿个RMCs相对容易，每年都可以再生；3、hBMSC-CM已用于人类牙槽骨再生的临床研究，并在再生医学中显示出显著的成骨潜力。在本实施例中，RMC-CM存在在一些测试中的效果仅略高于hBMSC-CM，证明RMC-CM的有效性和应用潜力。

在本方案中，RMC-CM可减少牙槽骨丢失和破骨细胞激活。3D图像的测量还显示，RMC-CM组在2周时的CEJ-ABC距离小于1周时的CEJ-ABC距离，这表明可能已经发生了牙槽骨再生。

本实施例证明了RMC-CM对炎症环境的调节作用。CD68的IHC染色显示牙周炎区域有巨噬细胞浸润。巨噬细胞在先天免疫中很重要，并且不是同质性的。巨噬细胞的表型异质性与局部微环境相对应。M1型巨噬细胞，主要由细菌LPS、IFN-γ,TNF-α,和GMCSF诱导，其特点是高表达IL-1β,IL-6、IL-12和IL-23。M2型巨噬细胞，主要由IL-4、IL-10、IL-13、糖皮质激素、免疫复合物和LPS诱导，其主要特征是高表达IL-10、TGF-β,血管内皮生长因子(VEGF)，低表达IL-12、TNF-α,和IL-1β,。此外，iNOS是M1巨噬细胞的标记物，CD206和Arg-1是M2巨噬细胞的标记物。在本实施例中，体内结果显示，RMC-CM在2周时显著下调TNF-α和iNOS的表达，并上调CD206和IL-10的表达。体外实验结果进一步证实了IL-10和Arg-1的高表达，以及TNF-α、IL-6和IL-1β的低表达。所有结果表明RMC-CM在上调M2极化表型中起作用。然而，CD206和iNOS在体外的表达与体内的表达并不一致。首先，据报道CD206在体内第21天大量表达，然而LPS刺激RAW264.7细胞在体外仅用RMC-CM处理24小时。因此，与其他组相比，CD206的表达没有差异。其次，体外iNOS表达上调也被发现。据报道，iNOS不仅是M1巨噬细胞的标志物，而且在MSCs介导的免疫抑制机制中起关键作用。体外iNOS的上调与RMC-CM的免疫抑制活性有关。

综上所述，RMC-CM通过降低破骨细胞的活性和改变M1和M2的比例，显著减少实验性牙周炎小鼠的牙槽骨吸收和牙龈组织炎症。表明RMC-CM在牙周炎治疗中的潜力。

需要说明的是，本实施例中仅以小鼠作为实验对象，本发明的结论也适用于其它生物物种，不再一一列举。另外，本实施例中的具体参数、对象也可以跟进需要灵活选择更换，在此不一一提供实验验证过程及结果，本领域技术人员也可以在本发明技术方案的基础上选择更换调整，但是不影响本发明实施方案的结果。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (7)

1.鹿茸间充质干细胞条件培养基在制备抑制牙龈组织的炎症药物的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：鹿茸间充质干细胞条件培养基减少牙槽骨吸收。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：鹿茸间充质干细胞条件培养基降低破骨细胞的分化。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：鹿茸间充质干细胞条件培养基通过上调M2巨噬细胞的比例降低牙龈组织炎症水平。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：鹿茸间充质干细胞条件培养基下调TNF-α和iNOS的表达、上调IL-10和CD206的表达。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：在体外，鹿茸间充质干细胞条件培养基下调细胞中TNF-α、IL-6和IL-1β的表达，并上调IL-10的表达，抑制破骨细胞生成。

7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：鹿茸间充质干细胞条件培养基促进细胞迁移。