CN103893261B - 黄芩及骨碎补有效部位配伍组方治疗牙周炎的制剂 - Google Patents

Abstract

黄芩及骨碎补有效部位配伍组方治疗牙周炎的制剂，其原料组分按质量比包括为：含黄芩素80%以上的黄芩有效部位水提取物10‑15份和柚皮苷30.71%以上的骨碎补有效部位水提取物5‑10份制成“芩补固齿胶囊”全身给药；或者加入羟乙基纤维素，浓甘油，聚丙烯酸树脂等辅料，制成一种新型外用中药长效复方软膏“芩补固齿软膏”，注射器式给药方式在牙周袋局部易于操作。本发明对牙周炎有良好的治疗作用。本发明具有处方小、疗效显著、无任何毒副作用的特点。特别是在局部应用时，长期使用的抗炎效果与盐酸二甲胺四环素软膏(派丽奥)相似，但成骨效果明显优于派丽奥，是一种具有与西药相似的长效性和易用性的新剂型口腔中成药。

Description

黄芩及骨碎补有效部位配伍组方治疗牙周炎的制剂

技术领域

本发明涉及一种中成药的应用及其制剂，特别涉及一种黄芩及骨碎补有效部位配伍组方治疗牙周炎的制剂，可以采用牙周袋局部注射式给药或全身口服给药方式，用于治疗牙周炎。

背景技术

牙周炎是口腔领域发病率最高的疾病，也是口腔医疗领域的疑难病症，已成为成年人牙齿丧失的主要病因。同时它对许多全身性疾病，如风湿、心脏病、血液病、糖尿病等还有诱发的作用，被认为是继癌症、心脑血管疾病之后威胁人类身体健康的第三大杀手。牙周炎是一种慢性细菌感染性疾病，牙周组织破坏主要是由宿主的免疫保护和破坏机制不平衡所致，同时，由于其开放环境使得其炎症愈合和组织再生比较困难，因此牙周炎的治疗需要同时达到控制炎症、调节免疫、促进软硬牙周组织再生。药物治疗是牙周炎治疗的重要辅助手段，但单纯西药仅能针对部分症状如炎症等，且因易于产生耐药性及毒副作用而难以长期用药。

我国的中药一贯以成本低、副作用小、疗效显著而为世界医学所称道，尤其是其中的活性物质具有通过多靶点、多环节发挥多种效应的优势。祖国医学认为，按脏腑辨证牙齿属于肾的范畴。牙周炎的主要病因是胃肠积热、血气虚弱、肾元亏损以及口腔不洁等因素，主要病机是胃腑积热，阳明火炽，湿热熏蒸于上而形成牙宣，因此要以补肾虚、清胃热、活血解毒论治。很多中药已证实同时具有消炎杀菌、调节免疫力、平衡骨代谢的作用，可能适合于牙周炎的治疗，主要包括大黄、黄芩、黄芩、五倍子、骨碎补、淫羊藿、补骨脂、玄参及当归等。据此，一些中成药方剂可用于牙周炎的治疗，主要包括补肾固齿丸、妇科千金片、牛黄清胃丸、玉女煎、左归丸、右归丸、益肾清火方等，其中固齿丸、固齿膏也是以古方六味地黄丸为基础配制的。

但以上这些组方缺乏药理学研究的支持，且从制剂质量的角度上，这类药物的稳定性、可控性也很难实现。中药有效部位是指一味中药或者复方中药的提取物中，一类或几类化学成分的含量达到总提取物的50%以上，是一类或几类成分的混合体。近年来，利用中药有效部位和成分配伍组方，已近成为新近中成药研究及临床研发的特点。中药有效部位符合中医药应用的传统理论：整体观念和辩证论治，具有多成分、多靶点的特点；中药有效成分和有效部位是通过提取方法的改进获取的，可以视其为精制的中药，较传统的中药更为稳定和可控；疗效较传统中药更优，并且毒副作用也较低；同时也节省了药材。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于治疗牙周炎的中成药制剂，从黄芩、骨碎补单味药中，分别筛选出其有效部位和指标成分(有效成分)，进而将有效部位按最佳浓度和比例配伍组方为新药剂，可用于临床治疗牙周炎。

黄芩及骨碎补有效部位配伍组方治疗牙周炎的制剂，其原料组分按质量比包括为：

含黄芩素80%以上的黄芩有效部位水提取物 10-15份

柚皮苷30.71%以上的骨碎补有效部位水提取物 5-10份

黄芩及骨碎补有效部位配伍组方治疗牙周炎的制剂，其原料组分按质量比包括为：

黄芩为唇形科多年生草本植物，其味苦、性寒，具有清热解毒、除湿泻火、止血安胎之功效；黄芩中最主要的组成部分是黄酮类化合物，包括黄芩苷(baicalin)，黄芩素(baicalein)，汉黄芩苷(wogonoside)，汉黄芩素(wogonin)，7-甲氧基去甲基汉黄芩素，黄芩黄酮Ⅰ、II等。黄芩素是一种黄色针状结晶，它可以溶于甲醇、乙醇、丙酮、醋酸乙酯及热冰醋酸，微溶于氯仿。骨碎补为水龙骨科植物槲蕨的干燥根茎，功效为补肾强骨、续伤止痛等；骨碎补水提取物是水溶性有效部位，而柚皮苷是其中最主要的一种黄酮成分。

发明人首先通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、酶联免疫吸附法(ELIISA)和半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测人牙周膜细胞的碱性磷酸酶活性、Ⅰ型胶原蛋白的表达及OPG mRNA的表达证实，1.0mg/L的骨碎补水提液(含柚皮苷30.71%)对促进牙周膜细胞增殖及向成骨方向转化作用很强。发明人还通过hPDLCs/CMC-HPLC/MS在线联用法，筛选出黄芩的乙醇部位为有效部位，其活性成分为黄芩素，MTT法检测证实其可促进人牙周膜细胞的增殖，ALP检测证实其具有一定的成骨活性。

发明人进而建立了SD大鼠牙周炎模型，以黄芩有效部位(33mg/kg/d)、骨碎补有效部位(18mg/kg/d)的单味药或组方药灌胃干预治疗。同过检查各组大鼠的龈沟出血指数、牙周袋深度、牙齿松动度及牙槽骨吸收值，并进行术区显微CT扫描和组织病理学观察；EILISA法检测各组大鼠血清CRP水平的表达及龈沟液IL-1β、TNFα、IL-8、PGE2的表达水平；免疫组织化学法检测大鼠牙周组织中RANKL和OPG的表达水平。结果证实，与使用单味药相比，全身应用黄芩乙醇提取物与骨碎补水提取物配伍效果更佳，遂命名为“芩补固齿丸”(实施例1-6)。在小型猪牙周炎模型中，将黄芩乙醇提取物和骨碎补水提取物按11:6配伍组方全身给药，通过对牙周状况(BI、PD)、龈沟液量、龈沟液内因子(IL-8、IL-1β、PGE2)的水平、X线及CT影像(骨相对体积、骨小梁密度及骨小梁数目)、HE染色及免疫组化染色(TNF-α、IL-8及IL-1β)等指标的检测，也证实了“芩补固齿丸”(实施例1-6)对牙周炎有很好的全身治疗效果。

发明人还用碱性磷酸酶法检测了黄芩乙醇部位及骨碎补水提取液单独及组方局部应用时，对人牙周膜细胞的成骨作用，提示与使用单味药相比，黄芩乙醇提取物与骨碎补水提取物配伍效果更佳。进一步借鉴L₁₆(4)⁴正交表进行实验分组，通过不同浓度的黄芩、骨碎补有效部位配伍对LPS刺激下人牙周膜细胞产生PGE2的影响研究，证实了有2个浓度组的黄芩乙醇部位+骨碎补水部位配伍产生的PGE2较少；进一步选用SD大鼠牙周炎模型，应用2组药物进行牙周袋内局部治疗，并进行相关药物局部应用的疗效检测(方法同上)，最终证实1mg/L黄芩乙醇部位和1mg/L骨碎补水部位配伍的局部应用疗效最好。

发明人建立了以羟乙基纤维素，浓甘油，聚丙烯酸树脂为主要辅料制备的中药复方缓释凝胶系统，首先确定了缓释凝胶中各成分的处方比例，进而确定芩补配伍组方(1mg/L黄芩乙醇部位+1mg/L骨碎补水部位)缓释凝胶的最优释放浓度为4%，将其命名为“芩补固齿膏”(实施例7-12)。初步的毒理学研究证实，缓释原位凝胶制剂无明显毒副性，可长期应用。在小型猪牙周炎模型中，通过一系列药理学检测(方法同上)，证实了“芩补固齿膏”在牙周袋内局部应用时，具有明显的消炎和成骨作用；且与阳性对照药物派丽奥盐酸米诺环素软膏(盐酸二甲胺四环素)相比，长期应用的抗炎效果与派丽奥相似，且成骨效果明显优于派丽奥，可用于牙周炎的局部治疗。

最后，发明人选择了88例志愿者，在知情同意的基础上，进行了初步的临床试验研究。用基础治疗配合中药复方缓释凝胶的使用治疗中重度牙周炎，并且与阳性药物派丽奥及单纯牙周基础治疗做对比。结果证实，芩补软膏(实施例7)能使中药有效成分缓慢释放，并能较长时间地保持局部较高浓度，发挥其杀菌、抑菌的作用，能提高单纯机械治疗的效果，减少或延缓复发，可作为治疗慢性牙周炎的有效辅助手段。

本发明利用中医中药进行牙周炎治疗，遵循整体观念、辨证论治的原则，将黄芩乙醇提 取物及骨碎补水提取物配伍，确定了指标成分(有效成分)及最佳组方，通过临床研究及药理学实验，证实其能对牙周炎产生多维、多模式、多靶位、高效的治疗效果。研究结果证明，该中药组方是一种可用于临床治疗牙周炎的药物。在本研究之前，对以上两种中药有效部位的配伍组方、最佳浓度和配比、药理作用以及治疗牙周病临床用途等方面未见有任何文献资料报道。

本发明具有处方小、制备方法简单、加工成本低、疗效显著、无任何毒副作用的特点，是一种具有与西药相似的长效性和易用性的新剂型口腔中成药，具有广泛的临床应用前景。

附图说明

图1黄芩与骨碎补复方制剂外观，(A)实施例5(芩补胶囊)；(B)实施例7(芩补软膏)。

图2人牙周膜细胞(hPDLCs)的培养和鉴定：(A)原代培养1周；(B)原代培养4周；(C)HE染色，光镜下观察；(D)波形蛋白染色阳性；(E)角蛋白染色阴性。

图3MTT法检测柚皮苷对hPDLCs增殖的影响：不同浓度组柚皮苷在不同时间点对hPDLCs增殖的影响。(1.0mg/L组对细胞的增殖作用最为显著(p<0.01)，并随时间呈正相关)。

图4柚皮苷对hPDLCs碱性磷酸酶活性及Ⅰ型胶原蛋白表达的影响：(A)不同浓度组柚皮苷对hPDLCs碱性磷酸酶活性的影响:1.0mg/L组ALP活性高于其他各组(p<0.01)；(B)不同浓度组柚皮苷对hPDLCsⅠ型胶原蛋白表达的影响：1.0mg/L组的Ⅰ型胶原蛋白表达量要高于其他浓度组(p<0.01)。

图5柚皮苷对hPDLCs OPG mRNA表达的影响：(A)1.0mg/L柚皮苷对hPDLCs OPGmRNA表达相对量的影响：OPGmRNA相对量较加药前有明显的差异，并且随着时间的延长而逐渐增强；(B)柚皮苷干预牙周膜细胞后各组β-actin、OPG电泳图：OPG、β-actin的扩增产物分别为342bp、179bp。注：各泳道从右到左依次为：Bio Marker I；β-actin对照组(0、1、3、5、7、9天)；柚皮苷组(0、1、3、5、7、9天)。

图6hPDLCs/CMC-HPLC/MS在线联用示意图：Position A：hPDLCs/CMC一维流路：M1(流动相1)-P1(色谱泵1)-S1(复杂样品)-DUV(紫外检测器)-C1(hPDLCs/CMC柱)-EC1(富集柱1)-W1(废液1)；HPLC/MS二维流路：M2(流动相2)-P2(色谱泵2)-EC2(富集柱2)-C2(C18柱)-DMS(MS检测器)-W2(废液2)。Position B：hPDLCs/CMC一维流路：M1(流动相1)-P1(色谱泵1)-S1(复杂样品)-DUV(紫外检测器)-C1(hPDLCs/CMC柱)-EC2(富集柱2)-W1(废液1)；HPLC/MS二维流路：M2(流动相2)-P2(色谱泵2)-EC1(富集柱1)-C2(C18柱)-DMS(MS检测器)-W2(废液2)。

图7hPDLCs/CMC-HPLC/MS在线联用法筛选中药黄芩的有效成分：A辛伐他汀在hPDLCs/CMC-online-HPLC/MS系统上分析的二维色谱图(A辛伐他汀在hPDLCs/CMC上的色谱图；B hPDLCs/CMC上保留组分R1富集后在HPLC/MS上的色谱图；S辛伐他汀直接经HPLC/MS分析的色谱图；R0辛伐他汀在hPDLCs/CMC上的不保留组分；R1辛伐他汀在hPDLCs/CMC上的保留色谱峰；R1-1R1在HPLC/MS分析后的主要色谱峰)；B黄芩素在hPDLCs/CMC-online-HPLC/MS系统上分析的二维色谱图(A黄芩素在hPDLCs/CMC上的色谱图；B hPDLCs/CMC上保留组分R1富集后在HPLC/MS上的色谱图；S黄芩素直接经HPLC/MS分析的色谱图；R0黄芩素在hPDLCs/CMC上的不保留组分；R1黄芩素在hPDLCs/CMC上的保留色谱峰；R1-1R1在HPLC/MS分析后的主要色谱峰)。

图8黄芩素、汉黄芩素及辛伐他汀对hPDLCs增殖、Von Kossa染色和基质钙化的影响：(1)黄芩素和辛伐他汀对hPDLCs增殖的影响(MTT法)；(2)汉黄芩素和辛伐他汀对hPDLCs增殖的影响(MTT法)；(3)黄芩素和汉黄芩素对hPDLCs诱导钙化结节的影响(Von Kossa染色法)；(4)黄芩素、汉黄芩素及辛伐他汀对hPDLCs基质钙化功能的影响。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001比对照组。

图9治疗4周后各组大鼠颌骨组织病理切片(10×)。

图10治疗4周、12周后小型猪各组牙周状况。A1：芩补组4周，B1：芩补组4周X线片，C1：芩补组4周CT片；A2：牙周炎组4周，B2：牙周炎组4周X线片，C2：牙周炎组4周CT片；A3：芩补组12周，B3：芩补组12周X线片，C3：芩补组12周CT片；A4：牙周炎组12周，B4：牙周炎组12周X线片，C4：牙周炎组12周CT片。

图11各组小型猪治疗4周、12周后组织病理切片(4×)。A1：正常组4周，B1：牙周炎组4周，C1：芩补组4周；A2：正常组4周，B2：牙周炎组4周，C2：芩补组4周。

图12中药有效部位原位缓释凝胶的制备流程图。

图13 2%、4%芩补缓释凝胶体外释放情况。

图14大鼠唇粘膜HE染色镜下观察(x400)。A芩补组；B空白凝胶组；C空白对照组。

图15局部药物治疗1个月及3个月后的X光片及CT影像。

图16局部药物治疗1个月及3个后各组HE染色镜下观察。A1芩补缓释凝胶1个月组；B1派丽奥1个月组；C1空白凝胶1个月组；A2芩补缓释凝胶3个月组；B2派丽奥3个月组；C2空白凝胶3个月组。

具体实施方式

实施例1

本实施例的原料重量组成成份为：15份黄芩乙醇提取物(黄芩素80%)及8份骨碎补水提取物(柚皮苷30.71%)；明胶1份，甘油2份。

实施例2

本实施例的原料重量组成成份为：14份黄芩乙醇提取物(黄芩素80%)及9份骨碎补水提取物(柚皮苷30.71%)；明胶1份，甘油2份。

实施例3

本实施例的原料重量组成成份为：13份黄芩乙醇提取物(黄芩素80%)及10份骨碎补水提取物(柚皮苷30.71%)；明胶1份，甘油2份。

实施例4

本实施例的原料重量组成成份为：12份黄芩乙醇提取物(黄芩素80%)及5份骨碎补水提取物(柚皮苷30.71%)；明胶1份，甘油2份。

实施例5

本实施例的原料重量组成成份为：11份黄芩乙醇提取物(黄芩素80%)及6份骨碎补水提取物(柚皮苷30.71%)；明胶1份，甘油2份。

实施例6

本实施例的原料重量组成成份为：10份黄芩乙醇提取物(黄芩素80%)及7份骨碎补水提取物(柚皮苷30.71%)；明胶1份，甘油2份。

以上实施例的制备方法，包括以下步骤：

1、将骨碎补原料粉碎，水煎三次，水煎液直接用大孔树脂进行提取和分离，70%的酒精冲洗，浓缩，上喷雾干燥器，测定柚皮苷浓度为30.71%；

2、乙醇回流法提取黄芩乙醇提取物，即将黄芩原料取经纤维素酶解反应后，加50倍乙醇回流提取2次，合并提取液，滤过，减压蒸馏至粉末，干燥，得到含黄芩素的粗提取物，再经双蒸水溶解过滤得到成品，测定黄芩素浓度为80%；

3、将(1)与(2)制备的细粉混合均匀，加入占混合药粉重量16%的72%乙醇，制成软材，在制粒机中用20目筛网制粒，在干燥室中以62℃的温度烘2小时，过20目筛整粒，混合均匀；

4、取明胶1份，甘油2份，纯净水2份，50℃加热，充分搅拌，抽真空1小时，上机器，经注射器化成胶皮，将(3)原料加入成型，经转笼定型，除湿、烘干即得内服药。

本发明实施例1-6采用水煎法联用大孔树脂法提取和分离骨碎补的有效部位，其有效成分(指标成分)为柚皮苷；用乙醇回流法提取和分离黄芩的有效部位，其有效成分(指标成分) 为黄芩素。黄芩和骨碎有效部位可配伍组方，制成“芩补固齿胶囊”(实施例1-6)，全身给药，即口服。

实施例7

本实施例的原料重量组成成份为：1份黄芩乙醇提取物(黄芩素80%)及1份骨碎补水提取物(柚皮苷30.71%)，挥干后定量为3g；22.5g三乙酸甘油酯，2.5g聚丙烯酸树脂Eudragit RS，0.15g羟乙基纤维素，21.85g甘油。

实施例8

本实施例的原料重量组成成份为：1份黄芩乙醇提取物(黄芩素80%)及2份骨碎补水提取物(柚皮苷30.71%)，挥干后定量为3g；22.5g三乙酸甘油酯，2.5g聚丙烯酸树脂Eudragit RS，0.15g羟乙基纤维素，21.85g甘油。

实施例9

本实施例的原料重量组成成份为：2份黄芩乙醇提取物(黄芩素80%)及1份骨碎补水提取物(柚皮苷30.71%)，挥干后定量为3g；22.5g三乙酸甘油酯，2.5g聚丙烯酸树脂Eudragit RS，0.15g羟乙基纤维素，21.85g甘油。

实施例10

本实施例的原料重量组成成份为：1份黄芩乙醇提取物(黄芩素80%)及1份骨碎补水提取物(柚皮苷30.71%)，挥干后定量为3g；20g三乙酸甘油酯，5g聚丙烯酸树脂EudragitRS，0.15g羟乙基纤维素，21.85g甘油。

实施例11

本实施例的原料重量组成成份为：1份黄芩乙醇提取物(黄芩素80%)及2份骨碎补水提取物(柚皮苷30.71%)，挥干后定量为3g；20g三乙酸甘油酯，5g聚丙烯酸树脂EudragitRS，0.15g羟乙基纤维素，21.85g甘油。

实施例12

本实施例的原料重量组成成份为：2份黄芩乙醇提取物(黄芩素80%)及1份骨碎补水提取物(柚皮苷30.71%)，挥干后定量为3g；20g三乙酸甘油酯，5g聚丙烯酸树脂EudragitRS，0.15g羟乙基纤维素，21.85g甘油。

以上实施例的制备方法，包括以下步骤：

1、将骨碎补原料粉碎，水煎三次，水煎液直接用大孔树脂进行提取和分离，70%的酒精冲洗，浓缩，上喷雾干燥器，双蒸水溶解，测定柚皮苷浓度为30.71%；

2、乙醇回流法提取黄芩乙醇提取物，即将黄芩原料取经纤维素酶解反应后，加50倍乙醇回流提取2次，合并提取液，滤过，减压蒸馏至粉末，干燥，得到含黄芩素的粗提取物，再经双蒸水溶解过滤得到成品，测定黄芩素浓度为80%；

3、取处方量的甘油加热至90-100℃，恒温，搅拌下加入处方量羟乙基纤维素，高速搅拌至羟乙基纤维素完全溶解；

4、取处方量的甘油三乙酸酯加热至45-50℃，恒温，在搅拌下加入处方量聚丙烯酸树脂Eudragit RS搅拌至完全溶解；

5、将上述(3)溶液的温度降至45-50℃，按黄芩素柚皮苷质量比加入处方量黄芩骨碎补水提取物，低速搅拌至药物完全溶解；

6、将第(4)步中得到的溶液在低速搅拌下加入到上述(5)药物溶液中，45-50℃保温条件下搅拌至均质即得外用药。

本发明实施例7-12通过加入羟乙基纤维素，浓甘油，聚丙烯酸树脂等辅料，制成一种新型外用中药长效复方软膏“芩补固齿软膏”，牙周袋内局部用药，即外用药。

临床试验

1、受试药物：黄芩骨碎补缓释凝胶制剂(实施例7，简称芩补软膏)(图1-B)

2、试验目的：评价实施例7中药复方牙周缓释凝胶制剂辅助治疗牙周炎的疗效和安全性。

3、试验设计

3.1试验适应症：用于慢性牙周炎患者接受洁治、刮治根面平整后的辅助治疗。

3.2试验设计原则：采用随机单盲、平行对照的试验方法，进行临床对比验证；为保证试验结束时，试验例数至少达到每组20例，计划试验组20+20例，对照组20+20例，共计80对；试验组为黄芩骨碎补缓释凝胶，对照组为盐酸米诺环素软膏和空白组；因治疗其他疾病而使用的药物应相应记录。

3.3受试者选择

3.3.1诊断标准：慢性牙周炎(根据1999年新建的国际牙周病疾病分类标准)；中度及中度以上的病损，选择观察牙的牙周袋探诊深度(PD)至少有一个位点≥5mm，但≤10mm。

3.3.2入选标准：中度及中度以上慢性牙周炎患者；口内预留牙≥10颗；PD：5-10m，BOP(+)；年龄25-65岁，性别不限；自愿参加本研究，服从治疗方案，来院随访；签署知情同意书；以上如任何一个答案为“否”，则不能参加试验。

3.3.3排除标准：实验前3月内使用过抗菌药物；实验前6月内接受过牙周治疗；女性妊娠或哺乳，或者拟生育者；有严重心、肝、肾、内分泌及血液疾病；有药物过敏史者；以上如任何一个答案为“是”，则不能参加试验。

3.3.4退出标准：试验中发现不符合病例标准者；资料不全者；未遵从医嘱用药者；自动退出者；因药物过敏或不良反应而终止试验者(不列入观察病例统计，但应计入不良反应病例中评价)；出现严重不良事件并紧急揭盲者；失访者；其他。

3.4给药方案：首诊时进行牙周检查，筛选病人，龈上洁治术之后，基线检查，确定病人个观察牙位，进行临床检查及龈沟液检查，血尿常规检查、肝肾功能及心电图检查。然后给予基础治疗(即洁治、刮治、根面平整)，随后牙周袋内注入实验药物，指导病人口腔卫生，试验组与对照组同方法。复诊安排：用药前、用药1周、用药2周、用药3周、用药四周、用药3个月、用药6个月、用药9个月、用药12个月。医生应定期对受试者进行随访，督促其正确执行医嘱。每位受试者只能参加一次研究。

3.5观察指标

3.5.1主诉症状指标：包括牙龈出血、牙龈红肿、牙松动等。临床意义判定：1无；2有轻微异常；3中等异常；4严重异常。

3.5.2临床指标：取不同象限的观察牙位，每个观察牙记录6个位点；牙周袋探诊深度(PD,mm)：使用标准化牙周探针，所得数据四舍五入；附着水平测定(CAL,mm)：釉牙骨质界至牙周袋底的距离；出血指数(BI)：记录颊侧三个位点及舌侧一个位点；菌斑指数(PLI)：菌斑染色后记录各牙面菌斑染色面积；根分叉病变、松动度、牙槽骨吸收。

3.5.3龈沟液检查：Waterman40#滤纸，裁剪成10mm×2mm大小，放入1.5mlEP管中，高压蒸汽灭菌，恒温烤箱烤干，称重，编号记录，备用。将无菌滤纸条沿颊侧牙面轻轻插入龈沟或牙周袋，遇阻力停滞30秒，30秒后取出立即置入无菌EP管中(注意滤纸条沾血则弃去不用)，在尽可能短的时间内再次称重并记录，计算出龈沟液重量，-70℃冻存备用。龈沟液中IL-8含量的检测(ELISA法)；龈沟液中IL-1β、PGE2含量的检测(ELISA法)；测量步骤同IL-8含量的检测步骤，得到数据后，通过绘制标准曲线求出样本中IL-1、PEG2的浓度。

3.5.4实验室检查：心电图检查；血常规检查、尿常规检查；肝肾功能检查(ALT、AST、BUN、CR)；分别在基线(首诊)时和用药结束时检测。

3.5.5影像学检查：x线片；CBCT扫描。

3.5.6数据统计分析：ELISA结果采用试剂公司提供的Curve Expert1.3软件包，绘制标准曲线，对数据统计分析两两比较采用配对t检验，多个样本比较的方差分析LSD检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。计量资料采用均数±标准差进行统计描述，采用t检验或方差分析(ANOVA)或Wilcoxon秩和检验进行比较。计数资料采用频数(构成比)进行统计描述，

采用X²检验或非参数检验。等级资料用秩和检验或Ridit分析。

组别	男女比例	平均年龄	纳入牙数
				芩补组	1:0.9	44.4岁	162
派丽奥组	3:2	43.9岁	153
				空白组	1:1	47.0岁	159

4、病例资料：

病例均衡性分析：

5、试验结果

5.1安全性分析：本实验使用药物为芩补缓释凝胶(实施例7)、派丽奥等两种药物。实际使用药物人数为62人，失访18人，但将62人全部纳入安全性分析集。到试验终止，无一例发生过敏、特异质反应等不良事件，治疗前、治疗中及治疗后的安全性指标检查(血常规、尿常规、心电图、肝功能、肾功能)均未见明显异常，说明药物安全性较好，且组间无差异。

5.2疗效评价

基线期、治疗后6个月、治疗后12个月牙周检查指标的变化

5.3典型病例资料

病例一：赵××，男，32岁，陕西省延安市宝塔办公务员，以下前牙松动2年为主诉就诊于西安交通大学口腔医院牙周粘膜科，初步检查发现42牙牙龈退缩约5mm，PD为6mm-9mm，松动Ⅲ度，深覆牙合，正中牙合接触上颌腭侧牙龈，X线显示牙槽骨水 平性吸收达根尖部，遂建议拔除，患者不愿拔除，考虑暂时给予牙周基础治疗及松牙固定等保守治疗，患者同意。余牙牙周情况根据1999年新建的国际牙周病疾病分类标准诊断为慢性牙周炎，严重程度属于中度；符合纳入标准，患者知情同意以后，给予龈上洁治并进行口腔卫生宣教，一周后设立基线期，按照随机分组原则纳入芩补组(实施例7)，编号芩补1号。基线期开始给予全口龈下刮治及根面平整术，术后3%双氧水冲洗，牙周袋内上芩补软膏，每周一次，连续四次。上药结束后一月复查，发现牙龈炎症明显消退，此次复查未对牙周袋进行探查。其后第三月、第六个月、第九个月、十二个月复查，行全口牙周探诊检查，如有牙周袋尚≥4mm，给予二次刮治，重复第一疗程上药过程。一年观察期后，主诉牙基础治疗后牙龈退缩约7mm，PD约3mm-4mm，松牙固定良好，仍可形式功能。余牙PD、BI、CA均明显下降，CBCT检查发现牙槽骨密度增加，高度变化不明显。

病例二：李××，女，63岁，陕西省西安市人，退休工人，以牙龈出血2月，加重1周为主诉就诊于西安交通大学口腔医院牙周粘膜科，初步检查发现口腔卫生较差，牙石(+++)，色素(++)，软垢指数3。牙龈退缩约3mm-5mm，PD为4mm-9mm，全口多个牙松动，X线显示牙槽骨水平性吸收达Ⅱ-Ⅲ度，根据1999年新建的国际牙周病疾病分类标准诊断为慢性牙周炎，严重程度属于中度到重度；符合纳入标准，患者知情同意以后，给予龈上洁治并进行口腔卫生宣教，一周后设立基线期，按照随机分组原则纳入芩补组，编号芩补2号。基线期开始给予全口龈下刮治及根面平整术，术后3%双氧水冲洗，牙周袋内上芩补软膏(实施例7)，每周一次，连续四次。上药结束后一月复查，发现牙龈炎症明显消退，牙龈出血症状消失，但患者口腔卫生控制欠佳，遂对其再次进行口腔卫生宣教并嘱咐按时复查，此次复查未对牙周袋进行探查。其后第三月、第六个月、第九个月、十二个月复查，行全口牙周探诊检查，个别牙牙周袋尚≥4mm，给予二次刮治，重复第一疗程上药过程。一年观察期后，全口牙PD、BI、CA均明显下降，CBCT检查发现牙槽骨密度增加，高度变化不明显。

病例三：王××，男，56岁，陕西省西安市人，民营企业老板，以右上后牙松动，不能咀嚼为主诉就诊于西安交通大学口腔医院牙周粘膜科，初步检查发现患者对刃牙合，全口牙重度磨耗，牙冠呈短圆柱形。主诉牙14牙松动Ⅲ度，PD约5mm-8mm，X线示14牙牙槽骨弧形吸收达根尖部，遂建议拔除。余牙牙周情况根据1999年新建的国际牙周病疾病分类标准诊断为慢性牙周炎，严重程度属于重度；符合纳入标准，患者知情同意以后，给予龈上洁治并进行口腔卫生宣教，一周后设立基线期，按照随机分组原则纳入芩补组，编号芩补3号。基线期开始给予全口龈下刮治及根面平整术，术后3%双氧水冲洗，牙周袋内上芩补软膏(实施例7)，每周一次，连续四次。上药结束后一月复查，发现牙龈炎症明显消退，此次复查未对牙周袋进行探查。其后第三月复查行全口牙周状况检查，结果见牙龈炎症仍明显，PD有降低，但效果不明显，考虑与患者咬合关系异常有关，遂调整咬合(患者为对刃牙合，不能完全调整为正中牙合，尽量调整)，第六个月、第九个月、十二个月复查，行全口牙周探诊检查，仍有部分牙牙周袋≥4mm，重复第一疗程上药过程。一年观察期后，除主诉牙拔除外，余牙PD、BI、CA均明显下降，CBCT检查未见明显变化。

病例四：李××，女，27岁，陕西省榆林市人，现居住地西安，无业。以左上前牙咬合不适一月就诊，初步检查发现22牙牙冠完整，舌侧窝见一发育沟延伸至根面，PD约9mm，松动Ⅲ度，正中牙合及前伸牙合有早接触，X线显示22牙牙槽骨弧形吸收达根尖部，诊断为畸形舌侧沟，慢性牙周炎，建议患者拔除该牙，择期修复，患者拒绝拔牙，要求试行牙周基础治疗；患者全口口腔卫生一般，牙石(+)，色素 (+)，软垢指数2。牙龈退缩约1mm-2mm，PD为3mm-7mm，全口多个牙松动，X线显示牙槽骨水平性吸收达Ⅰ-Ⅱ度，根据1999年新建的国际牙周病疾病分类标准诊断为慢性牙周炎，严重程度属于中度到中度；符合纳入标准，患者知情同意以后，给予龈上洁治并进行口腔卫生宣教，一周后设立基线期，按照随机分组原则纳入芩补组，编号芩补4号。基线期开始给予全口龈下刮治及根面平整术，术后3%双氧水冲洗，牙周袋内上芩补软膏(实施例7)，每周一次，连续四次，择期对22牙行调牙合治疗。上药结束后一月复查，发现22牙不适症状消失，炎症消退明显，仍有探诊出血，此次复查未对牙周袋进行探查。其后第三月、第六个月、第九个月、十二个月复查，行全口牙周探诊检查，个别牙牙周袋尚≥4mm，给予二次刮治，重复第一疗程上药过程。一年观察期后，全口牙PD、BI、CA均明显下降，CBCT检查发现牙槽骨密度增加，高度变化不明显。

病例五：刘××，男，36岁，陕西省西安市人，现居住西安市高新区。以刷牙牙龈出血一月就诊，初步检查发现患者全口口腔卫生欠佳，牙石(+-++)，色素(+)，软垢指数2。牙龈退缩约1mm-2mm，PD为3mm-7mm，X线显示牙槽骨水平性吸收达Ⅰ-Ⅱ度，根据1999年新建的国际牙周病疾病分类标准诊断为慢性牙周炎，严重程度属于中度到中度；符合纳入标准，患者知情同意以后，给予龈上洁治并进行口腔卫生宣教，一周后设立基线期，按照随机分组原则纳入芩补组，编号芩补5号。基线期开始给予全口龈下刮治及根面平整术，术后3%双氧水冲洗，牙周袋内上芩补软膏(实施例7)，每周一次，连续四次。上药结束后一月复查出血症状消失，炎症消退明显，此次复查未对牙周袋进行探查。其后第三月、第六个月、第九个月、十二个月复查，行全口牙周探诊检查，全口牙PD、BI、CA均明显下降，CBCT检查发现牙槽骨密度增加，高度变化不明显。

基础实验

1.骨碎补有效成分柚皮苷对人牙周膜细胞(hPDLCs)功能调节的实验研究

1)hPDLCs的原代培养和鉴定

(1)选取12～18岁青少年因正畸治疗需要拔除的前磨牙，用无菌手术刀片刮取牙根中1/3的牙周膜组织，剪碎，加入含0.2%Ⅰ型胶原酶消化30min，加入含20%FBS的DMEM培养液，置在CO2培养箱中(5%CO2、37℃、饱和湿度)培养。1周可见有细胞从组织块中爬出，并呈贴壁生长；4周后，细胞生长密集并有一定的方向性。原代培养的细胞贴壁生长铺满瓶底约60%～80%时即传代(图2A-B)。

(2)将培养的第4代hPDLCs接种于置有盖玻片的六孔培养板中，4%多聚甲醛室温下固定10～15分钟，HE染色；ABC法染色，进行抗角蛋白和抗波形蛋白染色，光镜下观察胞质着色情况。可见波形蛋白染色阳性，细胞胞浆呈棕黄色着色，角蛋白染色阴性(图2C-E)。说明所培养的细胞是来源于外胚层间充质，而非上皮的。因此根据取材部位以及细胞形态学观察可以确定该细胞是hPDLCs。

2)柚皮苷对hPDLCs功能的影响

(1)MTT法检测柚皮苷对hPDLCs增殖的影响：取第4代hPDLCs，接种于96孔板。按照药物作用时间不同分为药物作用后1、3、5、7、9天组。在相应的时间点给每孔加入MTT溶液20μl，每孔加入200μlDMSO。在波长490nm下用酶联免疫测试仪测量各孔光吸收值(Absorbencyvalue，A490)。结果显示100、10、1.0、0.1mg/L柚皮苷均可促进细胞增殖，尤以1.0mg/L增殖效果最佳，且与药物作用时间呈正相关；而在不同时间段下，柚皮苷各浓度组的药物对hPDLCs的增殖效果有所不同(F=205.005，p<0.01)(图3)。

(2)柚皮苷对hPDLCs碱性磷酸酶活性的影响：取第5代hPDLCs，接种于18孔板，每孔分别加入2ml不同浓度药物培养液。孵育5天后，收集细胞培养上清液，按照试剂盒使用 说明进行操作，在波长520nm下用酶联免疫测试仪测定各管吸光度(A520)值，再换算出各个样本碱性磷酸酶的活性。结果显示，不同浓度的药物作用下细胞ALP活性值有所不同(F=36.664，p＜0.01)，且1.0mg/L时的ALP活性要高于其它浓度组和对照组(图4A)。

(3)柚皮苷对hPDLCsⅠ型胶原蛋白表达的影响：收集细胞培养上清液，按照人Ⅰ型胶原蛋白酶联免疫分析试剂盒的操作步骤进行，在波长450nm处用酶联免疫测试仪测量各孔的吸光度。结果发现不同浓度药物作用下的细胞Ⅰ型胶原蛋白表达量有所不同(F=392.384，p＜0.01)，1.0mg/L浓度组的Ⅰ型胶原蛋白表达量要高于其他浓度组(图4B)。

(4)柚皮苷对hPDLCs OPG mRNA表达的影响：将细胞接种于7只培养瓶中培养24h，分组干预hPDLCs(对照组：100μg/ml LPS，干预1瓶细胞；柚皮苷组：1.0mg/L，干预6瓶细胞)，实验分别培养0、1、3、5、7、9天收获细胞，用BIOZOL常规提取hPDLCs的总RNA，按照反转录试剂盒使用说明，获得cDNA。PCR反应后的产物在琼脂糖凝胶中电泳，在自动凝胶成像仪上观察结果，用image-pro plus6.0图像分析软件进行图像灰度分析。结果可见，OPG、β-actin的扩增产物分别为342bp、179bp。RT-PCR结果显示：加柚皮苷前OPG mRNA可见有少量的表达，加入1.0mg/L柚皮苷1天后，其OPG表达明显上调，OPG目的基因条带灰度和β-actin参照基因条带灰度的比值较加药前有明显的差异，并且随着时间的延长而逐渐增强，在第9天达到最高(图5)。

2.hPDLCs/CMC-HPLC/MS在线联用法筛选中药黄芩中治疗牙周炎的有效部位和有效成分

1)人牙周膜细胞的细胞膜色谱柱及高效液相质谱联用系统(hPDLCs/CMC-online-HPLC/MS)的建立(图6)

(1)人牙周膜细胞的细胞膜色谱柱系统(hPDLCs/CMC)：牙周膜细胞的培养和鉴定同前。选择4-6代hPDLCs细胞总量不低于1×10⁷个，4℃条件下超声破膜30min，12000rpm高速离心20min，得细胞膜悬液。取经过预处理后的大孔硅胶0.05g，动态加入细胞膜悬液，4℃放置过夜，即得细胞膜固定相悬液。取色谱柱管(10mm×2mm I.D.)，将固定相悬液混匀后注入装柱机运行，以超纯水为流动相，即得细胞膜色谱柱。

(2)hPDLCs/CMC-online-HPLC/MS联用系统的建立：hPDLCs/CMC模型(第一维)：流动相(M1)为超纯水，流速0.2mL/min，柱温37℃，检测波长：238nm(辛伐他汀)；345nm(黄芩)。HPLC/MS系统(第二维)：流动相(M2)：辛伐他汀为0.2%冰醋酸：乙腈(20：80)；黄芩为乙腈：0.5%冰醋酸-1.2%三乙胺水溶液(40：60)；电喷雾离子源(ESI)，N2(纯度99.99%)作为载气，流速1.5L/min，检测器电压1.5KV，质荷比扫描范围：50-1000m/z，扫描方式：正离子模式，加热模块温度200℃，曲行脱溶剂装置温度250℃。

VP-ODS富集柱：第一根富集柱(EC1)与第二根富集柱(EC2)并行连接在10通阀上，EC1和EC2可分别交替处于第一维或第二维系统中，并联的2个富集柱能够交替进行富集、洗脱，以实现一维被洗脱物的在线富集。采用一个十通切换阀将hPDLCs/CMC和HPLC/MS系统进行连接，建立了hPDLCs/CMC-online-HPLC/MS在线联用系统。

2)应用hPDLCs/CMC-online-HPLC/MS系统筛选黄芩有效部位和有效成分(图7)

(1)药物各部位提取物的样品制备：中药材黄芩来自易圣堂大药房，以辛伐他汀分散片的提取液作为阳性模型药物；干燥的中药材用粉碎机粉碎，用200ml甲醇-水(70：30，V/V)溶液超声提取，用色谱醇甲醇复溶。取甲醇总提取物，挥干后加入超纯水使其溶解，依次加入极性不同的有机溶剂(石油醚、乙醇、氯仿、乙酸乙酯)，超声提取，分别收集上层和下层提取液，以及最终剩余的水溶部位提取液，即可得到极性不同的5种部位的提取液，挥干后用色谱纯甲醇复溶。

(2)应用hPDLCs/CMC系统筛选黄芩有效部位：将hPDLCs/CMC色谱系统用流动相平衡2-3h，待基线平稳后，吸取各供试品溶液5uL注入色谱系统进行分析测定，并记录色谱图。以所选取的模型药物辛伐他汀为对照，考察各供试品溶液在hPDLCs/CMC系统中的保留特性，结果发现黄芩总提取物在通过hPDLCs/CMC系统后有和辛伐他汀类似的比较明显的色谱峰；且黄芩的乙醇部位有和辛伐他汀相似的明显色谱峰出现。

(3)应用hPDLCs/CMC-online-HPLC/MS系统筛选黄芩有效成分：色谱系统用流动相平衡约2h后，待基线平稳后，将试品进样1uL，在一维细胞膜色谱“识别”的同时，将保留组分富集于富集柱(EC1或EC2)上，并交替切换进入二维反相色谱进行“分离和鉴定”。黄芩乙醇提取物的活性成分经质谱鉴定其为黄芩素。

3)黄芩有效成分黄芩素的生物学功能检测

(1)MTT法检测各黄芩活性成分黄芩素对hPDLCs增殖的影响：将黄芩素的储备液稀释为多个浓度梯度组；在1、3、5、7、9天细胞的吸光度(A490)值。结果显示，和未加药物的阴性对照组相比较，hPDLCs在药物浓度为0.15mg/L、0.6mg/L时都可以促进人牙周膜细胞的增殖，且与作用时间呈正相关(图8,1-2)。

(2)黄芩活性成分黄芩素对hPDLCs碱性磷酸酶活性的影响：方法同前，将黄芩素的储备液稀释为：0.15mg/L和0.6mg/L共2个浓度梯度组；在21天用Von Kossa染色法检测钙结节形成的情况，结果显示，0.15mg/L黄芩素作用下，钙结节形成最多(图8-3)；在21天用检测钙基质形成的情况，结果显示，0.15mg/L黄芩素作用下，钙基质形成最多(图8-4)。

3.全身应用黄芩和骨碎补有效部位组方治疗牙周炎的初步研究

1)稳定的SD大鼠牙周炎模型的建立

(1)采用清洁级雄性SD大鼠，水合氯醛腹腔注射麻醉，用4-0丝线结扎双侧上颌第二磨牙颈部，从结扎当天起饲软食、高糖水(葡萄糖100g/L)，连续8周。

(2)建模第4周和第8周末进行如下检查：大体观察，即观察各组动物的活动状态、饮食、饮水及毛色变化；龈沟出血指数(SBI)，即，用牙周探针检查是否出血；牙周袋深度(PD)，即用牙周探针探诊实验牙近中颊、颊、远中颊3个点牙周袋深度，取均值；牙齿松动度(TM)，即检查牙齿松动度并分级；牙槽骨吸收值(FR)，即取上颌骨，1%亚甲蓝水溶液染色，确定不同牙位釉牙骨质界到牙槽嵴顶的长度，取均值；显微CT扫描，检查指标包括骨体积(BV/TV)，即骨小梁体积与样本体积比；骨表面积体积比(BS/BV)，即骨小梁表面积与骨体积之比；骨小梁厚度(Tb Th)，单位μm；骨小梁间隙(Tb Sp)，单位μm；骨小梁数目(Tb N)，单位mm-1；牙周组织病理学观察。

(3)结果显示，8周可建立稳定的SD大鼠牙周炎模型。建模4周时，各建模大鼠与正常组相比，龈沟出血指数、牙周袋深度及牙齿松动度都显著增加(P<0.05)，但是情况并不稳定，组间、组内差异较大。8周末时，各项统计指标之间已无统计学差异(P>0.05)；显微CT显示建模8周后建模牙根分叉区牙槽骨吸收至根中1/2。

2)全身应用黄芩及骨碎补有效部位单味药、复方药治疗SD大鼠牙周炎的一般疗效：

(1)动物分组：将60只大鼠编号，随机分组，每组12只。正常组：正常喂养，不做处理，8周后用蒸馏水灌胃，灌胃4周处死观察；牙周炎组：建模8周后停止牙周刺激并用蒸馏水灌胃，灌胃4周处死观察；黄芩组：建模8周后停止牙周刺激并灌胃黄芩乙醇提取物溶液(33mg/kg/d)，灌胃4周处死观察；骨碎补组：建模8周后停止牙周刺激并灌胃骨碎补水提取物溶液(18mg/kg/d)，灌胃4周处死观察；芩补组，建模8周后停止牙周刺激，并灌胃黄芩乙醇提取物溶液(33mg/kg/d)及骨碎补水提取物溶液(18mg/kg/d)，灌胃4周后处死观察。

(2)大体观察、临床指标检查、显微CT扫描及组织病理学观察：方法同前。结果显示，治疗4周后可见芩补组牙龈色形质已基本恢复到正常水平，牙周袋深度也小于0.5mm，与其他各组相比差异具有显著性(P<0.05)；牙周炎组中多数牙齿位点还可探到点状出血，PD≥1.5mm，存在1度以上的牙齿松动。比较治疗4周后的各组牙槽骨吸收值可见：牙周炎组的骨吸收值近3mm，芩补组平均骨吸收值分别为1.02±0.23mm，与其他各组相比差异具有显著性(P<0.05)。

表3-1各组大鼠牙龈出血指数(SBI)

表3-2各组大鼠牙周袋探诊深度

表3-3各组大鼠牙齿松动度(TM)

表3-4治疗4周各组骨吸收测量值

注：*表示治疗4周后与牙周炎组比较差异有统计学意义，P＜0.05

#表示与其他各组相比差异有统计学意义，P＜0.05

治疗4周后的显微CT重建图证实各组大鼠的骨吸收水平都较建模8周时有明显改善。芩补组显微CT近远中向剖面重建图显示：此两组大鼠第二磨牙颊侧根分叉区虽也能见到一定程度的骨质吸收，但程度明显较其余各组要轻，已接近正常组水平；骨碎补组、黄芩组的近远中向剖面图可见根分叉区有一定的骨吸收水平，但程度较牙周炎组明显减轻，并能清楚的看到各组的新生骨嵴；大鼠上颌骨的显微CT骨小梁相关参数扫描分析(表3-5)显示：建模8周后各组大鼠较正常组相比，骨小梁数目、厚度、骨表面积体积比、骨体积显著下降(P<0.05)，骨小梁间隙显著增加(P<0.05)。治疗8周后，各组骨小梁数目、厚度都有所增加，其中芩补组各项骨小梁参数水平都明显优于其他各组(P<0.05)；黄芩组、骨碎补组与牙周炎组相比较也有明显改善(P<0.05)。

表3-5大鼠实验性牙周炎颌骨显微CT扫描骨小梁参数

注：*表示治疗4周后，与牙周炎组相比P<0.05

#表示与其他各组相比P<0.05

治疗4周后，牙周炎组牙周组织中仍有大量炎症细胞浸润，牙周膜纤维束紊乱，沟内上皮网状性变，牙槽嵴吸收至根尖1/3，牙槽嵴顶参差不齐，可见骨吸收陷窝内多个核的破骨细胞。各用药组大鼠牙周组织炎症细胞数量明显减少，芩补组牙槽骨高度已与正常组无明显差异，新生骨沿线可见到大量成骨细胞，形成的骨已接近成熟(图9)。

(3)全身应用单味药、复方药对SD大鼠牙周炎骨吸收相关因子的作用：

A.方法：分组同前。血清免疫学检测：各组治疗4周后，腹腔麻醉，腹主动脉取血。采用ELISA试剂盒检测实验动物血清中CRP的表达水平。龈沟液免疫学检查：大鼠建模4周、建模8周以及治疗后4周采集SD大鼠龈沟液。采用ELISA试剂盒检测实验动物龈沟液中IL-1β、TNFα、IL-8、PGE2的表达水平。免疫组织化学检查：根据免疫组化染色试剂盒说明测定各组实验动物牙周组织中OPG、RANKL蛋白的表达，基本步骤如试剂盒说明。统计学分析：使用SPSS13.0对实验结果行方差齐性检验后进行One-Way ANOVA检验或the Kruskal–Wallistest检验。

B.结果：通过ILISA酶联免疫法检测治疗4周后各组血清CRP水平，正常组大鼠血清CRP平均浓度为342.65±100.54ng/ml，牙周炎组血清CRP平均浓度为1000.54±124.56ng/ml，两者之间有显著差异(P<0.05)。芩补组血清CRP水平较牙周炎组显著下降(P<0.01)，黄芩组血清CRP水平与牙周炎组相比差异也具有显著性(P<0.05)。

表3-6治疗4周后各组大鼠血清CRP平均水平(ng/ml)

注：*表示与牙周炎组相比差异有统计学意义，P＜0.05

治疗4周后，各组动物的炎症因子水平都有所降低，比较各组大鼠龈沟液IL-1β表达水平可见与牙周炎组有显著性差异的是黄芩组和芩补组(P<0.05)；龈沟液TNF-α水平与牙周炎组相比有显著差异的是芩补组(P<0.05)；各用药组龈沟液IL-8水平与牙周炎组相比有显著差异的是黄芩组和芩补组(P<0.05)；各组龈沟液PGE2水平比较显示与牙周炎组有显著差异的是芩补组(P<0.05)。综合龈沟液各细胞因子水平可见：芩补组各种炎症因子水平都较牙周炎组显著下降(P<0.05)，具有明显的抗炎优势。

表3-7治疗4周后各组大鼠龈沟液IL-1β、TNF-α、IL-8、PGE₂平均水平(pg/ml)

注：*表示与牙周炎组相比差异有统计学意义，P＜0.05

光学显微镜下可见：RANKL及OPG阳性均为棕黄色着色，定位于胞浆中。正常组大鼠牙周组织中的RANKL及OPG均呈弱阳性表达，均匀分布于牙槽骨表面的成骨细胞及牙周膜细胞当中。牙周炎组牙周组织中OPG呈弱阳性表达，与正常组的灰度值相比差异无统计学意义(P>0.05)，RANKL呈强阳性表达。芩补组牙周组织中OPG呈强阳性表达，其灰度值与其他各组相比具有显著性差异(P<0.05)，此组的RANKL表达水平与正常组相比差异无统计学意义(P>0.05)。黄芩组、骨碎补中RANKL表达水平低于牙周炎组(P<0.05)但高于芩补组(P<0.05)，黄芩组及骨碎补组OPG表达水平高于牙周炎组(P<0.05)但低于芩补组(P<0.05)。

表3-8各组阳性强度的图像分析结果(平均灰度差值)

注：*表示与正常组相比有统计学差异，P＜0.05

#表示与其他各组相比有统计学差异，P＜0.05

3)稳定的小型猪牙周炎模型的建立

(1)小型猪臀部肌肉注射氯胺酮、力月西加速眠新诱导麻醉，3.5%戊巴比妥钠维持麻醉。以每只小型猪双侧上下颌第三前磨牙、第四前磨牙、第一磨牙为建模实验牙。于每只小型猪的P3、P4、M1颊侧做沟内切口，骨膜分离器充分翻开粘骨膜瓣，清晰暴露术区牙颊侧根分叉区的牙槽骨。低俗裂钻去除釉牙骨质界至根方约6mm，近远中向5mm，深5mm的牙槽骨骨量，去骨过程中持续使用无菌生理盐水冲洗术区，冷却去骨区。彻底刮除暴露于根面上的牙周膜，用生理盐水冲洗创口至无明显鲜血渗出。然后将加热软化的牙胶填入骨缺损区，4#丝线加金属丝结扎牙颈部，使结扎丝尽可能放入龈沟内，粘骨膜瓣复位悬吊缝合。

(2)观察指标：大体观察，观察各组动物的活动状态、饮食、饮水及毛色变化；口腔内检查，包括龈沟出血指数(SBI)，牙周袋深度(PD)，附着丧失(AL)；影像学检查，拍摄建模动物术区根尖片及CBCT片，观察术区牙槽骨吸收和改建情况；牙周组织病理学观察，包埋组织块，使用平推式切片机制作颊舌向4-5μm厚的切片。

(3)结果显示，采用局部去骨+金属丝线结扎+饲软食的方法8周可成功建立小型猪牙周炎模型。建模前小型猪牙龈色粉红、质韧，无牙龈退缩或探诊出血，仅在龈缘区有少量菌斑牙石，建模8周后可见术区牙龈红肿，质软，有明显的牙龈增生；牙面堆积大量牙石，牙颈部可见大量软垢，探诊出血甚至自发性出血，牙周袋深度平均值达(6.30±0.21)mm。这些临床表现可以作为确定小型猪牙周炎模型建立成功的标志之一。

4)全身应用黄芩及骨碎补有效部位复方药治疗小型猪牙周炎的一般疗效观察：

(1)动物分组：将6只小型猪随机分为3组，每两只为一组；正常组：正常喂养，不做处理，分别于12周及30周末处死；牙周炎组：建模8周，从第9周开始去除局部刺激物，每周进行牙周基础治疗，分别于治疗4周及12周后每组各处死1只；芩补组：牙周结扎8周，从第9周开始去除局部刺激物，每天饲以黄芩乙醇提取物(33mg/kg/d)和骨碎补水提取物(18mg/kg/d)制成的芩补胶囊(图1-A)；每周进行牙周基础治疗，分别于治疗4周及12周后每组各处死1只。

(2)大体观察、临床指标检查、显微CT扫描及组织病理学观察：方法同前。结果显示，治 疗4周后，芩补组逐渐恢复正常，而牙周炎组与其他各组比较有明显的皮毛疏松不顺、无光泽的表现。治疗12周后，芩补组已与正常组无明显差异，牙周炎组与其他各组相比仍显示出明显的皮毛无光泽的表现。

治疗4周后牙周检查可见：各组动物牙龈炎症状况都有所好转(图10A1-A4)，牙周炎组探诊后出血溢出龈缘或沿龈缘扩展，牙周袋平均深度为4.21±0.35mm，芩补组牙周探诊深度平均值为2.99±0.48mm，探诊后显示点状出血或沿龈缘扩展，与牙周炎组相比差异具有显著性(P<0.05)。治疗12周后，芩补组的牙周袋深度及龈沟出血指数与正常组已无明显差异(P>0.05)，与牙周炎组3.98±0.56mm的牙周袋深度相比，差异有统计学意义(P<0.05)。

表3-9各组小型猪牙龈出血指数(SBI)

表3-10各组小型猪探诊深度

表3-11各组小型猪附着丧失水平

注：&表示与建模前相比差异有显著性，P＜0.05；

*表示与牙周炎组相比差异有显著性，P＜0.05

X线影像显示正常组牙槽骨致密，牙槽嵴顶无吸收；建模8周后，实验牙根分叉区可见牙胶所形成的高密度影。治疗4周后，根分叉区的刺激物已被清除，牙周炎组根分叉区可见明显的楔状阴影；芩补组根分叉区的骨密度和高度增加，可见模糊的新生骨小梁影响。治疗12周后，各组根分叉区的骨密度和高度都有所增加，芩补组的根分叉已能见到正常的骨小梁结构，骨密度接近正常水平(图10B1-C4)。

正常组切片见小型猪牙周膜细胞排列整齐，方向与牙周膜纤维束方向平行，牙周膜间隙无增宽，未见根分叉区有骨吸收现象。治疗4周后，牙周炎组根分叉区可见大量的炎症细胞浸润，牙周膜纤维排列紊乱，牙槽嵴表面呈蚕食状吸收，骨吸收边缘可见到大量多个核的破骨细胞；芩补组牙周组织炎症细胞仅局限于上皮钉突或上皮下方，毛细血管增生扩张，可见到新生上皮组织或掉落于牙周膜间隙中的上皮组织增生，并可见到少量新骨形成和新骨边缘成骨细胞。治疗12周后，牙周炎组根分叉区仍可见到大量炎症细胞浸润，血管扩张充血；芩补组可见到大量新生骨形成，新生骨几乎已长满根分叉区，牙槽嵴顶基本恢复至正常高度水平，骨小梁结构趋近成熟；芩补组上皮下方可以见到少量炎症细胞浸润，矿化程度明显强于牙周炎组(图11)。

(3)全身应用复方药对小型猪牙周炎骨吸收相关因子的作用：

检测方法同前。通过EILISA酶联免疫法检测治疗前、建模8周、治疗4周和治疗12周后各组血清CRP水平，正常组小型猪血清CRP平均浓度为100.54±30.68ng/ml，牙周炎组血清CRP平均浓度为3635.76±50.97ng/ml，两者之间有显著差异(P<0.01)。治疗4周后， 芩补组血清CRP水平较牙周炎组显著下降(P<0.05)。治疗12周后，芩补组血清CRP水平与牙周炎组相比差异具有显著性(P<0.05)。

表3-12建模前及建模8周小型猪血清CRP平均水平(ng/ml)

表3-13治疗4周及治疗8周各组小型猪血清CRP平均水平(ng/ml)

注：*表示与牙周炎组相比差异有显著性，P＜0.05

通过EILISA酶联免疫法检测各组小型猪建模前、建模8周、治疗4周和治疗12周后龈沟液IL-1β、TNF-α、IL-8、PGE2的表达水平。各组动物炎症因子水平在建模8周后都较建模前显著增高(P<0.05)。治疗4周后，芩补组龈沟液TNF-α、IL-8、PGE2水平都较牙周炎组显著下降。治疗12周后，芩补组龈沟液IL-1β、TNF-α、IL-8、PGE2的表达水平较牙周炎组显著下降(P<0.05)。实验结果可见：牙周基础治疗也可明显下调炎症因子表达水平，芩补组有一定抗炎治疗作用。

表3-13建模前及建模8周小型猪龈沟液IL-1β、TNF-α、IL-8、PGE₂平均水平(pg/ml)

表3-14治疗4周后各组小型猪龈沟液IL-1β、TNF-α、IL-8、PGE₂平均水平(pg/ml)

表3-15治疗12周后各组小型猪龈沟液IL-1β、TNF-α、IL-8、PGE₂平均水平(pg/ml)

注：*表示治疗组与牙周炎组相比差异有统计学意义，P＜0.05，

小型猪牙周组织中RANKL及OPG表达于牙槽骨及牙周膜细胞中，呈黄色、棕黄色着色。正常组牙周组织中RANKL、OPG均呈弱阳性表达，治疗4周后，牙周炎组OPG弱阳性表达，与正常组灰度值无统计学差异(P>0.05)，RANKL呈强阳性表达(P<0.05)；芩补组OPG表达水平高于牙周炎组(P<0.05)，RANKL表达水平低于牙周炎组(P<0.05)。治疗12周后，各组OPG表达水平较治疗4周显著增高(P<0.05)，RANKL表达水平较治疗4周显著下降(P<0.05)；两两比较结果显示：牙周炎组OPG表达水平最低(P<0.05)，RANKL表达水平最高(P<0.05)。

表3-16各组阳性强度的图像分析结果(平均灰度差值)

注：*表示与正常组相比差异有显著性，P＜0.05，

#表示同时期与牙周炎组相比差异有显著性，P＜0.05，

4.局部应用黄芩和骨碎补有效部位复方缓释凝胶制剂治疗牙周炎的初步研究

1)确定局部应用基于黄芩和骨碎补有效部位的中药复方最佳组方

(1)碱性磷酸酶法检测局部应用单味及中药复方对hPDLCs成骨作用的影响：人牙周膜细胞的原代培养及鉴定同前。分组：黄芩乙醇提取物组：黄芩素(100mg/L、10mg/L、1.0mg/L、0.lmg/L、0.01mg/L)；骨碎补水提取物组：柚皮苷(10mg/L、1mg/L、0.1mg/L)；黄芩骨碎补组，即1.0mg/L黄芩乙醇提取物+骨碎补水提取物(10mg/L、1mg/L、0.1mg/L)，0.1mg/L黄芩乙醇提取物+骨碎补水提取物(10mg/L、1mg/L、0.1mg/L)，0.01mg/L黄芩乙醇提取物+骨碎补水提取物(10mg/L、1mg/L、0.1mg/L)；另设空白对照组。

各组在标准环境下继续孵育5天后，用无菌EP管收集细胞培养上清液；分别加入酚标准应用液、缓冲液及基质液；再加入显色剂，用紫外分光光度仪，在520nm波长下，测定各管吸光度(A520)值。结果显示，中药复方不同浓度组方对细胞的碱性磷酸酶活性不同，但普遍高于单味药物对细胞的碱性磷酸酶活性，其中ALP活性值最高的组方为黄芩-黄芩素1mg/l与骨碎补-柚皮苷1mg/l，将其与对照组及单味药组比较，有显著性差异。

表4-1不同浓度单味及复方药物组方对人牙周膜细胞ALP活性的影响结果

*与对照组相比，差异有统计学意义，p<0.05；**p<0.01

(2)局部应用黄芩、骨碎补有效部位配伍对LPS刺激下人牙周膜细胞产生PGE2的影响：人牙周膜细胞的原代培养及鉴定同前。分组借鉴L₁₆(4)⁴正交表进行实验分组。

表4-2骨碎补和黄芩有效部位浓度表

取对数生长期的第6代人牙周膜细胞，接种于96孔板，吸去上清液，分别加入各组药物+1μg/mlLPS200μl，同时设空白对照组，按照试剂盒的操作步骤进行ELISA检测。结果显示2个配伍组，分别为第8、11三组效果较明显，可作为后续动物用药的依据。

表4-3骨碎补和黄芩有效部位配伍组对LPS刺激下人牙周膜细胞产生PGE₂结果汇总表

(3)局部应用2组较佳有效部位配伍组在实验性牙周炎SD大鼠中疗效观察：SD大鼠牙周炎模型建立方法同前。各实验组每组12只SD大鼠，模型对照组及空白对照组各10只。于双侧上颌第二磨牙腭侧牙龈沟底按组别分别注射各组药物50μl，每隔1天注射一次，共4次。用药1周后，取大鼠龈沟液，唾液；同时取血液样本。行Micro CT三维测量分析及组织学染色观察，方法同前。

大鼠龈沟液，唾液，血液样本中PGE2、IL-1β、TNF-α、CRP的ELISA实验结果 其中1-2组分别指第8、11组配伍组，3组指模型对照组，4组指正常对照组。结果 显示，龈沟液和血液中PGE2的ELISA检测结果，第2组最低；样本IL-1β的ELISA检测结果，见第2组IL-1β量最低；样本TNF-α的ELISA检测结果，是第2组TNF-α量最低；样本CRP的ELISA检测结果，也是第2组CRP量最低。

表4-4龈沟液、唾液和血中的PGE₂统计分析结果

表4-5龈沟液、唾液中IL-1β统计分析结果

表4-6龈沟液、唾液中TNF-α统计分析结果

表4-7血液中CRP统计分析结果

*与模型对照组相比，p<0.05。

选择双侧上颌第二磨牙根分叉根方0.7mm，大小为1.1×1.7×1.1mm3的区域为我们的分析区域，并使用VIVID软件，分析了骨的参数，包括BV/TV、BS/BV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp及Tb.Pf，并使用One-Way ANOVA分析七个组间的参数间差异。分析结果见第2组有最明显的效果。

表4-8骨参数的分析

与模型对照组(第4组)相比，*指p<0.05,**指p<0.01

在HE染色和PGE2和MCP染色分析中，观察到了新骨形成和沿着牙槽骨表面线性排列的成骨细胞。同时比较了根分叉以下2mm²内PGE2和MCP-1的量，结果显示第2组有效果。

表4-9PGE₂和MCP-1免疫组化含量比较

*与模型对照组相比，P<0.05。

2)筛选局部应用中药复方缓释凝胶的最适浓度

(1)缓释原位凝胶的制备及处方浓度筛选：选择丙烯酸树脂(Eudragit RS PO)为主要的缓释材料，制备溶剂敏感性原位凝胶(图12)。最终确定了缓释凝胶中各成分的处方比例，得出羟乙基纤维素占总凝胶成分的0.3%，Eudragit RSPO占总凝胶成分的5-10%，其中药物加甘油加羟乙基纤维素与三乙酸甘油酯加Eudragit RS PO质量比为1:1时，为最优处方。进而分别制备了2%、4%、6%浓度的黄芩骨碎补缓释凝胶。

表4-10药物提取物缓释凝胶处方组成表

(2)缓释原位凝胶制剂学评价：黄芩乙醇提取物与骨碎补水提取物按黄芩素与柚皮苷质量比1:1制备的缓释凝胶，外观为深褐色乳膏状，偏骨碎补的颜色，具有一定的稠度，成非自由流动的流体状态。PH值检测为7.2～7.4，符合2010版中国药典规定的凝胶制剂PH值不超过8.0的要求。通过对不同浓度药物缓释凝胶离心稳定性、流动性、冷冻加热实验考查， 结果见下表。

表4-112%、4%、6%三种不同浓度的中药复方缓释凝胶稳定性考察结果

取不同处方进行体外释放，每种处方平行3组，计算各时间点的平均值。以时间对累计释放率作图(图13)，观察不同浓度芩补缓释凝胶中检测指标黄芩素7天累积释放率情况，由图可看出2%浓度的芩补缓释凝胶中黄芩素在前两天有突释现象，两天释放率达到60%且累计释放率不足80%，4%浓度的7天累积释放率稍高，基本达到80%，分析可能与黄芩素易于降解有关。故最终芩补缓释凝胶最终选择4%浓度的作为最优处方(图13)。

(3)缓释原位凝胶制剂的毒理学研究：

(1)急性毒理实验：将30只昆明小鼠分成3组(4%芩补缓释凝胶组、空白凝胶组、空白对照组)，每组10只。禁食12到24小时后按0.4ml/20g给予小鼠最大浓度(100%)最大容积灌胃，一日内给予两次，连续观察7天。结果显示，除两只因灌胃操作致死外(均尸解证实)，其余均活动正常无不良反应，精神状态佳，毛色有光泽，粪便未见异常。体重增长基本一致，各实验组与对照组比较无统计学差异。

表4-12中药复方缓释凝胶对小鼠体重(g)增长的影响

7天后处死小鼠对各器官大体解剖检察，无明显外形改变，未见充血，出血，水肿等变化。小鼠对中药复方缓释剂的最大耐受量为25g/kg，按公斤体重计算，相当于50kg成人一次用量(假设32颗牙齿均用药，每颗牙齿放置0.1ml的中药复方缓释凝胶)的312倍。说明中药复方缓释凝胶安全性较大。

(2)局部粘膜刺激实验：选30只SD大鼠随机分为四组分别为4%浓度芩补缓释凝胶组、空白凝胶组、对照组，每组各10只，实验前用水合氯醛将大鼠麻醉，固定，把其下唇粘膜用美容线缝合成盲袋，然后将缓释凝胶缓慢注入盲袋内，并涂抹其下牙龈粘膜，使药物与粘膜至少接触4小时(若药物露出则4小时内分次上药)，观察动物给药后24小时全身状况及局部粘膜变化，连续观察7天，处死动物，取口腔局部粘膜，观察粘膜有无水肿充血等变化，并作组织病理学检查。

结果显示，各组72小时内均未出现红斑及水肿，7天内粘膜完整，无溃疡及糜烂，病理切片观察基底细胞排列整齐，形态正常，上皮下无明显水肿。体重增长基本一致，各实验组与对照组比较无统计学差异(图14)。

表4-13复方中药缓释凝胶局部粘膜刺激对SD大鼠体重(g)的影响

(3)慢性毒理实验：选60只SD大鼠(120g±10g)将其分为黄芩乙醇提取物及骨碎补水提取 物高、中、低剂量组；空白凝胶组；对照组每组各10只。成人按50kg算，全口临床用药剂量约为3.2ml/50kg。高剂量组为临床用药剂量所含生药的150倍，中剂量组为临床用药剂量所含生药的100倍，低剂量组为临床用药剂量所含生药的5倍。按1ml/100g剂量灌胃。空白凝胶组按临床剂量的100倍给予即每100g老鼠给予0.6ml空白凝胶。每天定时灌胃，连续灌胃3个月，每周称重一次，以便根据体重变化调整灌胃剂量。进行外观体征、行为活动、进食情况、粪便及体重变化等一般观察。待实验结束后处死动物，腹主动脉取血进行血常规及生化指标的检测，每只大鼠对其心、肝、脾、肺、肾5个实质脏器先大体观察，然后取同一部位常规固定，包埋，切片，HE染色，镜下观察。

结果显示，药物组、空白凝胶组、对照组在90天实验期内活动均正常，行为未见异常，毛发光泽，未见粪便异常，无一只死亡；体重增长变化基本一致，各组雌雄大鼠发育良好；血常规、生化指标检查未见显著性差异，部分中小剂量组在生化指标数值上略高于对照组，但无显著性差异，且在正常值范围内，不能说明这些指标的改变与受试药物毒性有直接的关系。

表4-14灌胃90天大鼠体重(g)变化表

表4-15灌胃90天后对各组大鼠血常规检查的影响

T检验与对照组比较，P＞0.05

表4-16灌胃90天后对各组大鼠肝肾功能的影响

T检验与对照组比较，P＞0.05

3)局部应用中药复方缓释凝胶对小型猪实验性牙周炎的治疗作用

(1)小型猪实验性牙周炎模型的建立方法同前。选取4头小型猪双侧上下颌第三前磨牙、第四前磨牙、第一磨牙为实验牙，共48颗牙，按区根据统计学随机分为芩补组、派丽奥组及空白凝胶组，每组16颗牙齿。按实验分组在牙周袋内注入相应的药物，包括芩补缓释凝胶，派丽奥，空白凝胶，以注满牙周袋为宜，约0.1ml，每周上药一次，连续上药1个月，3个月。龈沟液的获取及龈沟液内因子检测方法同前，影像学及组织学观察方法同前。

(2)小型猪建模局部应用药物治疗前后牙周检查结果、龈沟液及影响学变化：治疗1个月后，实验组牙龈炎症略有好转，龈出血指数，龈沟液量变化与对照组比较减小有显著性差异(P＜0.05)，但各实验组之间没有明显差异，以派丽奥组出血指数最小，说明派丽奥有一定的消炎效果。但附着丧失以芩补缓释凝胶组最少与空白凝胶组有显著性差异(P＜0.05)，x线示根分叉区低密度影减轻。

局部治疗3个月后，芩补组牙龈炎症、龈沟液量明显减轻，牙周袋深度平均值较建模后明显变浅，牙颈部仅见少量菌斑堆积；派丽奥组牙龈炎症明显减轻，但牙周袋深度较芩补组高。对照组牙龈红肿，探诊出血明显，牙周袋深度和附着丧失程度无明显变化，牙颈部可见菌斑堆积。X-ray和CT显示治疗3个月后芩补组较治疗1个月后根分叉区的密度影增高，牙槽骨高度升高。治疗3个月后进行Micro-CT扫描发现芩补组骨相对体积、骨小梁厚度、骨小梁数目明显高于建模后，有显著性差异(P＜0.05)。组间进行比较芩补组成骨作用最好与派丽奥组有显著性差异(P＜0.05)，派丽奥组同对照组比较没有差异性，说明芩补组在成骨作用方面有明显优势(图15)。

表4-17建模前、建模后、治疗1个月、治疗3个月后牙周检查指标的变化

表4-18建模前、建模后、治疗1个月、3个月后龈沟液量的变化

表4-19建模前、建模后、治疗1个月、3个月后龈沟液中炎性因子的水平变化

(3)组织学及免疫组织化学检测结果：治疗1个月后镜下观察，芩补缓释凝胶组可见骨基质形成，骨矿化结节，但也可见少量的破骨细胞存在于骨陷窝中；派丽奥组，蓝染区为炎症细胞所在处，同对照组及建模后比炎症减轻，但未见骨基质的形成；空白凝胶组可见大量的炎症细胞浸润，牙周膜纤维排列紊乱，牙槽骨有不同程度的破坏，破骨细胞位于骨吸收陷窝内(图16)。

局部治疗3个月后镜下观察，芩补缓释凝胶组牙周膜厚度均匀，有更多的骨基质及骨矿化结节形成，未见明显的破骨细胞存在；派丽奥组炎症较治疗一个月后减轻，仅见上皮略有增生，炎症细胞明显减少，但仍未见明显的新骨形成；空白凝胶组根分叉处可见明显的骨缺损，牙周膜丧失，上皮增生，伸长，大量的炎症细胞浸润。

局部治疗1个月后IL-8、IL-1β和PGE2水平与建模后比较均降低，有显著性差异(P＜0.05)，与对照组相比，派丽奥组、芩补缓释凝胶组有显著性差异，以派丽奥水平最低，说明派丽奥消炎效果最好，其次为芩补缓释凝胶组。局部治疗3个月后，芩补缓释凝胶组与派丽奥组之间差异不明显，无统计学意义，说明芩补缓释凝胶组的长期消炎效果同派丽奥。TNF-α、IL-1β、IL-8免疫组化染色结果显示建模后成强阳性表达，局部治疗1个月后、3个月后各用药组与对照组比较表达量减少，以芩补缓释凝胶组表达最弱。

表4-20IL-1β、IL-8和TNF-α阳性细胞的吸光度值

Claims (4)

1.黄芩及骨碎补有效部位配伍组方治疗牙周炎的制剂，其特征在于，其有效药用组分按质量比为：

含黄芩素80％以上的黄芩有效部位水提取物 10-15份

柚皮苷30.71％以上的骨碎补有效部位水提取物 5-10份。

2.根据权利要求1所述的黄芩及骨碎补有效部位配伍组方治疗牙周炎的制剂，其特征在于，其组分按质量比为：

3.黄芩及骨碎补有效部位配伍组方治疗牙周炎的制剂，其特征在于，其组分按质量比为：

4.根据权利要求3所述的黄芩及骨碎补有效部位配伍组方治疗牙周炎的制剂，其特征在于，其组分按质量比为：

1份含黄芩素80％黄芩乙醇提取物及2份柚皮苷30.71％骨碎补水提取物，挥干后定量为3g；22.5g三乙酸甘油酯，2.5g聚丙烯酸树脂Eudragit RS，0.15g羟乙基纤维素，21.85g甘油。