JP5080284B2 - 骨疾患の予防及び／又は治療用医薬組成物、その組成物を含有する機能性食品、健康食品及び医薬製剤、並びに歯根−歯周組織形成促進剤 - Google Patents
骨疾患の予防及び／又は治療用医薬組成物、その組成物を含有する機能性食品、健康食品及び医薬製剤、並びに歯根−歯周組織形成促進剤 Download PDFInfo
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【技術分野】
【０００６】
本発明は、下記式（Ｉ）〜（Ｖ）で表されるβ−カルボリンアルカロイド化合物、又はこれらの類縁体を少なくとも１種以上含有する健康食品、機能性食品、骨疾患の予防及び／又は治療効果を有する医薬組成物、前記医薬組成物を有効成分として含有する医薬製剤、並びに歯根−歯周組織形成促進剤に関する。ここで、本明細書中、「類縁体」は、上記式（Ｉ）〜（Ｖ）で表される化合物の生理学的に許容される塩、水和物及び配糖体を含むものとする。
【０００７】
【化１】
【０００８】
【化２】
【０００９】
【化３】
【００１０】
【化４】
【００１１】
【化６】
【背景技術】
【００１２】
骨に関する疾患は、外傷性骨折や疲労骨折等に代表される外因性疾患と、骨多孔症、骨粗鬆症、高カルシウム血症、高副甲状腺ホルモン（以下、「PTH」ということがある。）血症、骨ページェット病、関節炎、リウマチ、乳ガンの骨転移、骨軟化症、悪性腫瘍その他の疾病に起因する骨組織の脆弱化、及び栄養障害による骨組織の脆弱化といった内因性の疾患とに大別される。
【００１３】
ヒトの骨は、骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収とを絶えず繰り返しつつ、恒常性を維持している。しかし、加齢や炎症等により、恒常性が維持できなくなり、骨吸収が過剰になると、骨粗鬆症や関節リウマチ等の病態が生じる。
【００１４】
こうした内因性の骨疾患の中でも、骨粗鬆症の患者数は高齢者数の増加につれて増加しつつある。また、食生活の変化と運動量の低下に伴って、カルシウムの摂取量の低下や骨組織への定着率の低下が生じ、骨組織の脆弱化が加速されているといわれている。
【００１５】
骨折は、骨組織のある部分の連絡が外力によって断たれた状態をいい、骨折部位に著明な疼痛を伴う。健常人の場合には、例えば、交通事故等によってかなり大きな外力がかからない限り骨折は起こらないが、骨量が低下して骨組織が弱くなると、歩いたり走ったりしている最中にころんだ等、さほど大きくない外力がかかっただけでも骨折が起こる。また、上記のような骨粗鬆症等の内因性の疾患に起因して骨量が低下している場合には、階段で躓いたり、咳込んだりしたときにかかるわずかな外力によっても骨折が生じるようになる。
【００１６】
骨折が起こった場合には、一般的には、ずれている骨の位置を牽引等によって修正し、ボルトやピンで固定できる場合には固定し、その後は患者の自然治癒力に委ねるという治療方法が採用されている。
【００１７】
一方、骨粗鬆症等の内因性の疾患では骨の石灰質と骨基質とがともに減少しているため自然治癒が遅れることが多く、高齢者の場合にはその間に骨折部位以外の関節が固まって動かなくなり、寝たきりになるといったケースも少なくない。
【００１８】
また、歯周病は３０歳を超えた日本人の８０％が罹患する国民病ともいえる病気であるが、かなりひどい状態にならないと痛みを感じない。このため、重篤な疾患となりやすい特徴をもつ病気としてとらえられる。進行した歯周病においては、咀嚼時に生じる痛みや不快感に起因する摂食障害、悪臭を伴う口臭などが生じる結果、栄養状態の不良やコミュニケーション障害などがもたらされる恐れがある。このような場合、歯科による専門的な治療法が施されるが、症状の進行を食い止めることができず抜歯に至ることが多い。一方で、健康な高齢者では残存歯の数が多いことが知られている。
【００１９】
近年では、ヒトだけではなく、柔らかな食物を与えられて家庭内で飼育されているイヌやネコなどのペットにおいても歯周病が蔓延しつつあり、問題視されている。
歯周病に罹患すると、歯周組織を構成するセメント質、歯根膜及び歯槽骨が破壊される。このため、ヒトの歯周病の治療は、従来、歯石や壊死セメント質等の炎症を惹起させる原因物質を除去し、組織の治癒を促すという方法で行われてきた。しかし、この方法では既に破壊されてしまった歯周組織の再生は困難であった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
したがって、骨折の治療、特に高齢者における骨折の治療の際に、治癒に要する期間を短縮することについては、要介護者数を減少させるという観点からも、強い社会的な要請がある。一方で、治療に薬剤を使用する場合には、こうした薬剤には、治療効果の高さのみならず、副作用が少ない等、安全性の高さも要求される。
【００２１】
また、歯周病の治療に際しては、症状の進行を食い止めて抜歯を回避し、栄養状態を良好に保つこと、及びコミュニケーションを支障なく行うことについては、年齢を問わず強い要請がある。とりわけ、高齢者では自らの歯でしっかりと咀嚼して食事を摂ることが、生活の質（Quality of life, 以下、「ＱＯＬ」ということがある）の低下を防ぐ上で重要であり、骨疾患の予防にもつながる。さらに、歯周病に罹患した場合、ヒト以外の動物では抜歯する以外に方法はなく、このことはペットのＱＯＬを著しく低下させる。
【００２２】
このような問題を解決し、歯を安定して維持するためには、歯周病の予防効果をもつ物質を見出し、実用レベルのものとすることが期待されている。
一方で、歯周病を治療するためには口腔内への治療剤の直接的な投与が不可欠である。このため、骨疾患の治療の場合と同様に、治療効果の高さと安全性の高さとが要求されることになる。
【００２３】
骨疾患の治療では、従来、カルシウム代謝に重要な役割を果たすビタミンＤの誘導体である活性型ビタミンＤ3、カルシトニン及びその誘導体、エストラジオールを初めとするホルモン剤、並びに各種のカルシウム製剤等が臨床的に使用されてきた。
【００２４】
しかし、こうした薬剤は、体内における吸収や代謝の関係から経口投与ができない場合もあり、また、受容体レベルの個人差が大きいために効果の予見性に欠けるといった問題もあった。このため、これらに代わる新たな治療剤が求められていた。
【００２５】
また、従来、和漢の生薬やハーブティーとして使用されてきた植物の葉、全草、根、果実等は、安全性の面では問題はないと考えられる。このため、こうした植物の中から、骨疾患に効果を示す化合物や組成物を見出すことができれば、治療効果と安全性という２つの面のバランスが取れた治療薬等を製造することができると考えられる。
【００２６】
例えば、多くの生薬に含まれているフラボノイドやアルカロイドの中から、こうした活性を有する化合物又は組成物を見出すことができれば、安全性の面における懸念はかなり小さなものとすることができる。また、ハーブティー等として、市場に供給されている植物に含まれるフラボノイドやアルカロイドの場合にも、同じことが言える。
【００２７】
こうしたフラボノイドとしては、例えば、代表的なフラボン類であるアピゲニンを挙げることができる。アルカロイドの中では、インドールアルカロイドがもっとも多くの化合物を含むが、ハルマンアルカロイド等を挙げることができる。こうした化合物には、鎮痙作用、臓器血流増加作用等の他、神経伝達物質の分解を阻止する作用や、鎮静作用等があることが知られている（非特許文献１〜４参照）。
【００２８】
ところで、骨疾患の患者数を減少させる最も有効な手段は、骨疾患の予防である。すなわち、健常人の場合には、骨量又は骨密度の低下を防止すること、ある程度骨量又は骨密度が低下しているが未発症の者（いわゆる、骨疾患患者予備軍）の場合には、骨量又は骨密度の低下を抑え、できる限り骨量又は骨密度を上昇させること、が有効な予防手段となり得る。
【００２９】
具体的には、その者がどの程度疾患の発症に近い段階にあるかによって、予防用医薬製剤を投与する、又は機能性食品等の摂取を行うといった予防策をとることになる。
【００３０】
以上のように、骨疾患においても、上述したようにすでに疾患を発症した患者に対する治療手段ばかりでなく、未発症者又は健常人が発症しないようにするための有効な予防手段に対する社会的な要請がある。
【００３１】
上述した歯周病の治療において、歯周組織の再生を図るために、幾つかの方法が開発されている。その１つは、歯周組織を外科的に切除した後に、吸収性又は非吸収性のメンブレンを用いて歯根膜由来の組織や細胞がセメント質の新生を図り、新しい結合組織性の付着を形成できるようにする、ＧＴＲ法と呼ばれる方法である。ここで使用するメンブレンは、外科的切除後に創面を覆う速度が最も早い歯肉の結合組織が歯根面に到達することを妨げるという役割を有している。
【００３２】
ＧＴＲ法は、深い垂直性骨欠損に対して、非常に有効な治療法であるが、外科的手術後に、疼痛や腫脹、歯肉の退縮が生じることがある。また、組織が再生するための空間を確保する上では非吸収性のメンブレンを使用することが好ましいが、その場合には、再度手術を行ってこのメンブレンを取り出さなければならない（非特許文献５参照）。
【００３３】
また、その他の方法として、歯周組織を外科的に切除した後に、エムドゲイン（登録商標）を創面にエムドゲインを塗布する。エムドゲイン（登録商標）はエナメルマトリックスデリバティブを主成分とする、生物由来の製剤である。エムドゲインによる歯周組織再生のメカニズムは、歯周組織の再生に関与する未分化間葉系細胞が歯根面に誘引され、付着・増殖後、セメント質、歯根膜及び歯槽骨を形成する細胞に分化することによるものとされている（非特許文献６参照）。
【００３４】
エムドゲインを用いた方法は、外科的手術後に、疼痛や腫脹、歯肉の退縮はＧＴＲ法よりも少なく、手術後のプラークコントロールが容易であり、露出膜が少ないという利点を有する。しかし、蕁麻疹や掻痒皮膚反応等の過敏症や、局所の炎症、口角炎等が、術後の併発症として報告されている。
したがって、外科的な手術をできる限り伴わず、また、過敏症等の原因になりにくい材料を用いる治療法の開発に対する、高い社会的要請がある。
［００３５］
非特許文献１：渡辺和夫他、和漢薬学会誌，２，２６８（１９８５）
非特許文献２：Ｄｈａｗｎ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒ．Ｒｅｓ．２００３，ｖｏｌ．１７（４），ｐｐ．４０１−４０３
非特許文献３：Ｄｈａｗｎ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．Ｆｉｔｏｔｅｒａｐｉａ．２００２，ｖｏｌ．７３（５），ｐｐ．３９７−３９９
非特許文献４：Ｗｏｌｆｍａｎ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｅｈａｖ．１９９４，ｖｏｌ．４７（１），ｐｐ １−４
非特許文献５：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｅｉｋａｇａｋｕ．ｃｏ．ｊｐ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｄｅｎｔａｌ／ｏｃａｒｅ／ｅｍｄｏ／ｐｄｆ／０５０７ｎｅｗ．ｐｄｆ
非特許文献６：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｇｏｒｅｔｅｘ．ｃｏ．ｊｐ／ｂｕｓｉｎｅｓｓ／ｍｅｄｉｃａｌ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ
課題を解決するための手段
［００３６］
本発明は、上記のような状況の下で、完成されたものである。すなわち、本発明の発明者らは、薬理効果の高さと安全性とに留意しつつ、古くから生薬又はハーブティー等として使用されてきた植物に含まれる成分を中心として、骨吸収抑制作用、骨形成促進作用及び歯根−歯周組織形成促進作用を有する化合物のスクリーニングを進めた結果、公知の化合物に従来全く知られていなかった活性があることを見出し、本発明を完成したものである。
［００３７］
スクリーニングの結果、破骨細胞の分化抑制、骨芽細胞の分化促進及び歯根−歯周組織形成促進という新たな活性があることが明らかになったのは、生薬由来のβ−カルボリンアルカロイド化合物のうち、下記の一般式で表されるものである。
【００４５】
すなわち、本願発明の第一の態様は、下記式（Ｉ）〜（III）で表されるいずれかの化合物であることが、破骨細胞の分化抑制作用及び骨芽細胞分化促進作用が高いことから、骨疾患の予防及び／又は治療のための骨芽細胞分化促進用としてさらに好ましい。これらは、ハルミン（Harmine）、ハルモール（Harmol）、又はハルマン（Harmane）と呼ばれる化合物である。
【００４６】
【化６】
【００４７】
【化７】
【００４８】
【化８】
【００４９】
また、本発明の第二の態様は、下記式（IV）又は（Ｖ）で表されるものであることが、破骨細胞の分化抑制作用及び骨芽細胞分化促進作用が高いことから、骨疾患の予防及び／又は治療のための骨芽細胞分化促進用としてさらに好ましい。これらは、ハルマリン（Harmaline）、又はハルマロール（Harmalol）と呼ばれる化合物である。
以上のハルマリン、ハルマロール、ハルミン、ハルモール及びハルマンを、以下、「ハルミン等」ということがある。
【００５０】
【化９】
【００５１】
【化１０】
［００５２］
こうした化合物は必要に応じて生理学的に許容される塩、水和物及び配糖体を用いることができるが、特に塩酸塩を使用することが、後述する健康食品、機能性食品又は医薬製剤の調製が容易であることから好ましい。
【００５３】
本発明の第三の態様は、下記の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれる少なくとも１種以上の植物器官から抽出されることを特徴とする、上記式（Ｉ）〜（Ｖ）からなる群から選ばれるいずれかの化合物；これらの生理学的に許容される塩；及びこれらの水和物；からなる群から選ばれる少なくとも１種以上のものを有効成分として含有する、骨疾患の予防及び／又は治療用医薬組成物：
（ａ）トケイソウ科に属する植物の地上部の全草、
（ｂ）ハマビシ科、マツブサ科、及びミカン科に属する植物の果実、
（ｃ）キントラノオ科に属する植物の樹皮、及び、
（ｄ）ヒメハギ科、サトイモ科、及びショウガ科に属する植物の根。
［００５４］
ここで、前記トケイソウ科に属する植物は、南米、東インド、米国東部等に分布する、パッシフローラ・カエルレア（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ ｃａｅｒｕｌｅａ Ｌ．、異名：パッシフローラ・ヴィオラケア（Ｐ．ｖｉｏｌａｃｅａ）、和名：トケイソウ）、パッシフローラ・インカナータ（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ ｉｎｃａｒｎａｔａ、和名：チャボトケイソウ）、パッシフローラ・アラーディーＰ．Ａｌｌａｒｄｉ（Ｐ．ｘ Ａｌｌａｒｄｉ）、パッシフローラ・アンティオクィエンシス（Ｐ．ａｎｔｉｏｑｕｉｅｎｓｉｓ）、パッシフローラ・’コンスタンス・エリオット’（Ｐ．Ｃｏｎｓｔａｎｃｅ Ｅｌｌｉｏｔ’）、パッシフローラ・カポニー・‘ジョン・イネス’（Ｐ．Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ’）、パッシフローラ・エディリス（Ｐ．ｅｄｕｌｉｓ、和名：クダモノトケイソウ）、パッシフローラ・エクソニエンシス（Ｐ．ｅｘｏｎｉｅｎｓｉｓ）、パッシフローラ・マニカタ（Ｐ．ｍａｎｉｃａｔａ）、パッシフローラ・モリッシマ（Ｐ．ｍｏｌｌｉｓｓｉｍａ）、パッシフローラ・クアドラグラリス（Ｐ．ｑｕａｄｒａｇｕｌａｒｉｓ、和名：オオミノトケイソウ）、パッシフローラ・ラケモサ（Ｐ．ｒａｃｅｍｏｓａ）、パッシフローラ・サングイネア（Ｐ．ｓａｎｇｕｉｎｅａ）、及びパッシフローラ・ヴィティフォリア（Ｐ．ｖｉｔｉｆｏｌｉａ）からなる群から選ばれる植物であることが、ハルミン等の含有量が多いことから好ましく、トケイソウ、チャボトケイソウ、及びクダモノトケイソウからなる群から選ばれる植物であることが、流通量が豊富で入手が容易なことからさらに好ましい。
［００５５］
前記ハマビシ科に属する植物は、南アジアから東欧にかけて分布するハマビシ科の多年年草であるハマビシ（Ｔｒｉｂｕｌｕｓ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ Ｌ．）、又は、西アジア、北インド、モンゴルの砂漠等に自生するペガナム・ハルマラ（Ｐｅｇｕｎｕｍ ｈａｒｍａｌａ Ｌ．）（以下、「ハマビシ等」ということがある。）であることが、ハルミン等の含有量が多いことから好ましい。
［００５６］
また、前記マツブサ科に属する植物は、本州の中部以北、北海道、朝鮮半島、中国大陸等に分布するつる性の落葉低木である、チョウセンゴミシ（Ｓｃｈｉｓａｎｄｒａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）であることが好ましい。前記ミカン科に属する植物は、中国の長江流域、華南、陝西等に分布する落葉低木である、ゴシュユ（Ｅｖｏｄｉａ ｒｕｔａｅｃａｒｐａ）であることが好ましい。これらの果実、又は成熟直前の未成熟果実に、ハルミン等が含有されていることによる。
［００５７］
また、前記キントラノオ科の植物は、アマゾンに自生するバニステリオプシス・カアピ（Ｂａｎｉｓｔｅｒｉｏｐｓｉｓ ｃａａｐｉ）又はバニステリオプシス・イネブリアンス（Ｂａｎｉｓｔｅｒｉｏｐｓｉｓ ｉｎｅｂｒｉａｎｓ）であることが、その樹皮中にハルミン等が比較的多く含有されていることによる。
［００５８］
前記ヒメハギ科に属する植物は、朝鮮半島、中国北部及びシベリアに分布する多年草である、イトヒメハギ（Ｐｏｌｙｇａｌａ ｔｅｎｕｉｆｏｌｉａ）であることが、この根に、ハルミン等が比較的多く含有されていることから好ましい。また、前記サトイモ科に属する植物は、日本各地、朝鮮半島、及び中国等に分布する多年草である、カラスビシャク（Ｐｉｎｅｌｌｉａ ｔｅｒｎａｔａ）であることが好ましい。この球茎にハルミン等が比較的多く含有されていることによる。さらに、前記ショウガ科に属する植物は、熱帯アジア原産であり、日本にも古い時代に渡来した多年草である、ショウガ（Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）であることが好ましい。この根茎に、ハルミン等が比較的多く含有されていることによる。
［００５９］
本発明の骨疾患の予防及び／又は治療のための骨芽細胞の分化促進用医薬組成物には、こうした化合物の中でも、上記式（ＩＩＩ）で表されるハルミン（Ｈａｒｍｉｎｅ）、上記式（ＩＶ）で表されるハルモール（Ｈａｒｍｏｌ）、上記式（Ｖ）で表されるハルマン（Ｈａｒｍａｎｅ）、上記式（ＶＩ）で表されるハルマリン（Ｈａｒｍａｒｉｎｅ）、及び上記式（ＶＩＩ）で表されるハルマロール（Ｈａｒｍａｌｏｌ）が含有されていることが、破骨細胞の分化抑制作用及び骨芽細胞の分化促進作用を有することから好ましく、ハルミン又はハルモールが含有されていることが、その作用の強さからさらに好ましい。
［００６０］
また、こうした化合物は必要に応じて生理学的に許容される塩または水和物を使用してもよい。これらの中でも、塩酸塩を使用することが製剤化の面から好ましい。
［００６１］
本発明の第四の態様は、上述した式（Ｉ）〜（ＶＩＩ）で表される化合物、又は上記の通りのこれらの生理学的に許容される塩、若しくは水和物を、有効成分として含有する骨疾患の予防及び／又は治療のための骨芽細胞の分化促進用医薬製剤である。
［００６２］
ここで、前記骨疾患の予防及び／又は治療用医薬製剤中における前記有効成分の含量は、製剤の１用量当たり０．１〜１００ｍｇであることが好ましく、０．１〜５０ｍｇであることがより好ましく、０．３〜１０ｍｇであることが特に好ましい。
［００６３］
また、前記骨疾患の予防及び／又は治療用医薬製剤は、経口投与可能な剤形であることが好ましく、錠剤、散剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、トローチ剤、及び液剤からなる群から選ばれるものであることが好ましい。
［００６４］
ここで、前記骨疾患は、内因性骨疾患、外因性骨疾患、又は栄養障害のいずれに起因するものであってもよく、前記内因性骨疾患の場合には、骨多孔症、骨粗鬆症、高カルシウム血症、高ＰＴＨ血症、骨ページェット病、関節炎、関節リウマチ、乳癌の骨転移、骨軟化症、悪性腫瘍、及び栄養障害からなる群から選ばれる疾患に起因する骨組織の脆弱化に起因するものである場合に、本発明の骨疾患の予防及び／又は治療のための骨芽細胞の分化促進用医薬製剤を好適に使用することができる。また、前記外因性骨疾患の場合には、外傷性骨折又は疲労骨折等の場合に好適に使用することができる。特に、破骨細胞の分化が抑制されるのみならず骨芽細胞の分化が促進されるため、こうした骨疾患の発症を予防し、又は症状を緩和させる上で治療効果が高い。
なお、上述した骨疾患の予防及び／又は治療のための骨芽細胞の分化促進用医薬製剤は、ヒト及び動物の双方を適用の対象とすることができる。
【００６５】
本発明の第五の態様は、上述した各化合物、これらの生理学的に許容される塩、これらの生理学的に許容される水和物、及びこれらの配糖体からなる群から選ばれる１種以上を添加された機能性食品である。本発明の機能性食品は、トケイソウ科植物からの抽出物、ハマビシ科植物からの抽出物及びキントラノオ科に属する植物からの抽出物を含んでいてもよい。ここで、トケイソウ科植物、ハマビシ科植物及びキントラノオ科植物、及びこうした化合物の生理学的に許容される塩及び水和物は、上述したとおりである。
［００６６］
本発明の機能性食品はまた、骨芽細胞の分化促進による骨疾患の予防及び／又は治療を補助するために使用されるものであることが好ましい。ここで、前記化合物、それらの生理学的に許容される塩及び水和物からなる群から選ばれるものの含有量は、１００ｇ当たり０．１〜５ｍｇであることが好ましく、０．１〜３ｍｇであることがより好ましい。これらの含有量を０．３〜１ｍｇとすると、骨芽細胞の分化促進による骨疾患の予防及び／又は治療を補助する効果が最も高くなる。
なお、この機能性食品は、ヒト及び動物の双方を対象とすることができる。
【００６７】
本発明の第六の態様は、上述した各化合物、これらの生理学的に許容される塩、これらの生理学的に許容される水和物、及びこれらの配糖体からなる群から選ばれる１種以上が混合された健康食品である。本発明の健康食品は、トケイソウ科植物からの抽出物、ハマビシ科植物からの抽出物及びキントラノオ科に属する植物からの抽出物を含んでいてもよい。ここで、トケイソウ科植物、ハマビシ科植物及びキントラノオ科植物、及びこうした化合物の生理学的に許容される塩及び水和物は、上述したとおりである。
［００６８］
上記健康食品は、骨疾患の予防及び／又は治療を補助するために使用されるものであることが好ましい。前記化合物、それらの生理学的に許容される塩及び水和物からなる群から選ばれるものの含有量は、１００ｇ当たり０．１〜５ｍｇであることが好ましく、０．１〜３ｍｇであることがより好ましい。これらの含有量を０．３〜１ｍｇとすると、骨疾患の予防及び／又は治療を補助する効果が最も高くなる。
［００６９］
上述した化合物もしくはこれらの生理学的に許容される塩、若しくは水和物、又はトケイソウ科植物からの抽出物もしくはハマビシ科植物からの抽出物を、機能性食品や健康食品とすることにより、日常生活の中において破骨細胞の分化抑制と骨芽細胞の分化促進作用を有する素材を容易に摂取することができることになる。
なお、この健康食品は、ヒト及び動物の双方を対象とすることができる。
［００７０］
本発明の第七の態様は、上記式（Ｉ）の化合物で表される化合物、これらの生理学的に許容される塩、及びこれらの水和物からなる群から選ばれる少なくとも１種以上を有効成分として含有する歯根−歯周組織形成促進剤である。式中のＲ１、Ｒ２、Ｒ’１、Ｒ’2、及びＲ’3は上述したとおりである。ここで、Ｒ1は、水素原子、ＯＨ、ＯＭｅ及びＯＥｔからなる群から選ばれる官能基であり、ＣＯＲ’2は、Ｍｅ又はＥｔであり、ＣＯＯＲ’3は、水素原子、Ｍｅ及びＥｔからなる群から選ばれる官能基である、ことが好ましい。上記式（III）〜（Ｖ）で表される化合物、これらの生理学的に許容される塩、及びこれらの水和物からなる群から選ばれる少なくとも１種以上を有効成分として含有する、歯根−歯周組織形成促進剤であることが、さらに好ましい。
上記歯根−歯周組織形成促進剤もまた、ヒト及び動物の双方を適用の対象とすることができる。
【００７１】
本発明の第八の態様は、上記式（II）で表される化合物、これらの生理学的に許容される塩、及びこれらの水和物からなる群から選ばれる少なくとも１種以上を有効成分として含有する、歯根−歯周組織形成促進剤である。式中、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、及びＲ6は、上述したとおりである。また、Ｒ’1、Ｒ’2及びＲ’3も、上述したとおりである。
【００７２】
ここで、Ｒ1は、水素原子、ＯＨ、ＯＭｅ及びＯＥｔからなる群から選ばれる官能基であり、ＣＯＲ’2は、Ｍｅ又はＥｔであり、ＣＯＯＲ’3は、水素原子、Ｍｅ及びＥｔからなる群から選ばれる官能基である、ことが好ましく、上記式（VI）又は（VII）で表される化合物、これらの生理学的に許容される塩、及びこれらの水和物からなる群から選ばれる少なくとも１種以上のものを有効成分として含有するものであることがさらに好ましい。
上記歯根−歯周組織形成促進剤もまた、ヒト及び動物の双方を適用の対象とすることができる。
【００７３】
本発明の第九の態様は、下記の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選ばれるものの少なくとも１種以上を含む、歯根−歯周組織形成促進剤である。
（ａ）トケイソウ科に属する植物の地上部の全草
（ｂ）ハマビシ科、マツブサ科、及びミカン科に属する植物の果実
（ｃ）キントラノオ科に属する植物の樹皮、及び、
（ｄ）ヒメハギ科、サトイモ科、及びショウガ科に属する植物の根、及び
（ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）から抽出され、上述したいずれかの化合物、これらの生理学的に許容される塩、及びこれらの水和物。
【００７４】
ここで、前記トケイソウ科に属する植物は、トケイソウ(Passiflora caerulea L.)、チャボトケイソウ（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ ｉｎｃａｒｎａｔａ）、及びクダモノトケイソウ（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ ｅｄｕｌｉｓ）からなる群から選ばれるいずれかの植物であることが好ましい。
［００７５］
前記ハマビシ科に属する植物は、ハマビシ（Ｔｒｉｂｕｌｕｓ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ Ｌ．）又はペガナム・ハルマラ（Ｐｅｇｕｎｕｍ ｈａｒｍａｌａ Ｌ．）であることが好ましく、前記マツブサ科に属する植物がチョウセンゴミシ（Ｓｃｈｉｓａｎｄｒａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）であることが好ましく、及び前記ミカン科に属する植物がゴシュユ（Ｅｖｏｄｉａ ｒｕｔａｅｃａｒｐａ）であることが好ましい。
［００７６］
また、前記キントラノオ科に属する植物は、バニステリオプシス・カアピ（Ｂａｎｉｓｔｅｒｉｏｐｓｉｓ ｃａａｐｉ）又はバニステリオプシス・イネブリアンス（Ｂａｎｉｓｔｅｒｉｏｐｓｉｓ ｉｎｅｂｒｉａｎｓ）であることが好ましく、前記ヒメハギ科に属する植物がイトヒメハギ（Ｐｏｌｙｇａｌａ ｔｅｎｕｉｆｏｌｉａ）であり、前記サトイモ科に属する植物がカラスビシャク（Ｐｉｎｅｌｌｉａ ｔｅｒｎａｔａ）であることが好ましく、前記ショウガ科に属する植物がショウガ（Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）であることが好ましい。
上記抽出物を含有する歯根−歯周組織形成促進剤もまた、ヒト及び動物の双方を適用の対象とすることができる。
［００７７］
本発明によれば、優れた破骨細胞の分化抑制作用及び骨芽細胞分化促進作用を有する、ヒト又は動物用の機能性食品、健康食品、骨疾患の予防及び／又は治療のための骨芽細胞の分化促進用医薬組成物、並びに骨疾患の予防及び／又は治療のための骨芽細胞の分化促進用医薬製剤が提供される。
また、本発明によれば、優れた歯根−歯周組織形成促進作用を有する、ヒト又は動物用の歯根−歯周組織形成促進剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
［００７８］
［図１Ａ］図１Ａは、ＲＡＷ２６４細胞を用いた破骨細胞分化に対するハルミンの効果を示す図（全細胞数及びＴＲＡＰ活性の変化）である。
［図１Ｂ］図１Ｂは、ＲＡＷ２６４細胞を用いた破骨細胞分化に対するハルミンの効果を示す図（多核破骨細胞数の変化）である。
［図２Ａ］図２Ａは、マウス骨髄細胞を用いた破骨細胞分化に対するハルミンの効果を示す図（全細胞数及びＴＲＡＰ活性の変化）である。
［図２Ｂ］図２Ｂは、マウス骨髄細胞を用いた破骨細胞分化に対するハルミンの効果を示す図（多核破骨細胞数の変化）である。
［図３Ａ］図３Ａは、マウス骨髄細胞および骨芽細胞株を用いた共存培養による骨吸収収窩（ピット）形成に対するハルミンの効果を示す図（コントロール）である。
［図３Ｂ］図３Ｂは、マウス骨髄細胞および骨芽細胞株を用いた共存培養による骨吸収窩（ピット）形成に対するハルミンの効果を示す図（３μＭ）である。
［図３Ｃ］図３Ｃは、マウス骨髄細胞および骨芽細胞株を用いた共存培養による骨吸収窩（ピット）形成に対するハルミンの効果を示す図（１０μＭ）である。
［図４Ａ］図４Ａは、骨芽細胞分化に対するハルミンの効果を示す図（全細胞数及びＴＲＡＰ活性の変化）である。
［図４Ｂ］図４Ｂは、骨芽細胞分化に対するハルミンの効果を示す図（多核破骨細胞数の変化）である。
［図５］図５は、骨芽細胞によるカルシウムの石灰化に対するハルミンの効果を示す図である。
［図６］図６は、ハルミン含浸アガロースビーズを歯髄に埋入したときの歯根伸長促進、歯周組織の形成促進効果を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
［００７９］
以下に、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明の第一の実施形態に係る骨疾患の予防及び／又は治療のための骨芽細胞の分化促進用医薬組成物は、下記式（Ｉ）で表される化合物、これらの生理学的に許容される塩、及びこれらの水和物からなる群から選ばれる少なくとも１種以上を有効成分として含有するものである。
［００８０］
［化１５］
［００８１］
（式中、Ｒ５は、水素原子、ＯＨ，ＯＲ’１、ＣＯＲ’２、及びＣＯＯＲ’３からなる群から選ばれる官能基を表し、Ｒ６は、炭素数１〜１０の直鎖状、分枝状及び環状のアルキル基からなる群から選ばれる官能基を表す。ここで、Ｒ’１は炭素数１又は２のアルキル基を、Ｒ’２は、水素原子、炭素数１〜１０の直鎖状、分枝状及び環状のアルキル基からなる群から選ばれる官能基をそれぞれ表す。）
【００８２】
ここで、Ｒ5は、水素原子、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、ＣＯＨ、ＣＯＭｅ、ＣＯＥｔ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＭｅ及びＣＯＯＥｔからなる群から選ばれるいずれかの官能基であることが好ましく、水素原子、ＯＨ及びＯＭｅからなる群から選ばれるいずれかの官能基であり、Ｒ6は、メチル基又はエチル基であることが好ましく、メチル基であることが、破骨細胞分化抑制活性及び骨芽細胞分化促進活性が高いことから、さらに好ましい。
【００８３】
上記式（Ｉ）で表される化合物としては、下記式（III）で表されるハルミン、下記式（IV）で表されるハルモール、又は下記式（Ｖ）で表されるハルマンその他のβ−カルボリンアルカロイドを挙げることができ、これらの３つの化合物のいずれかであることが、破骨細胞分化抑制活性及び骨芽細胞分化促進活性の高さの点から、最も好ましい。
【００８４】
【化１６】
【００８５】
【化１７】
【００８６】
【化１８】
【００８７】
また、こうした化合物は必要に応じて生理学的に許容される塩、水和物及び配糖体を用いることができるが、特に塩酸塩を使用すると、より高い破骨細胞分化及び骨吸収の抑制、骨芽細胞分化及び骨形成促進という効果が発揮される。
［００８８］
本発明の第二の実施形態に係る骨疾患の予防及び／又は治療のための骨芽細胞の分化促進用医薬組成物は、下記式（ＩＩ）で表される化合物、これらの生理学的に許容される塩、及びこれらの水和物からなる群から選ばれる少なくとも１種以上を有効成分として含有するものである。
［００８９］
［化１９］
［００９０］
（式中、Ｒ１は、水素原子、ＯＨ、ＯＲ’１、ＣＯＲ’２及びＣＯＯＲ’３からなる群から選ばれる官能基を表し、Ｒ２は、水素原子、ＣＯＲ’２及びＣＯＯＲ’３からなる群から選ばれる官能基を表し、Ｒ３は、水素原子、ＣＯＲ’２及びＣＯＯＲ’３からなる群から選ばれる官能基を表し、Ｒ４は、炭素数１〜１０の直鎖状、分枝状及び環状のアルキル基からなる群から選ばれる官能基を表す。ここで、Ｒ’１は炭素数１又は２のアルキル基を、Ｒ’２は、水素原子、炭素数１〜１０の直鎖状、分枝状及び環状のアルキル基からなる群から選ばれる官能基を、また、Ｒ’３は水素原子、炭素数１〜１０の直鎖状、分枝状及び環状のアルキル基からなる群から選ばれる官能基をそれぞれ表す。）。
［００９１］
ここで、Ｒ１は、水素原子、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、ＣＯＨ、ＣＯＭｅ、ＣＯＥｔ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＭｅ及びＣＯＯＥｔからなる群から選ばれるいずれかの官能基であることが好ましく、水素原子、ＯＨ及びＯＭｅからなる群から選ばれるいずれかの官能基であることが、破骨細胞分化抑制活性及び骨芽細胞分化促進活性の点からさらに好ましい。
［００９２］
また、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ、水素原子、水酸基、及びアルコキシ基からなる群から選ばれるいずれかの官能基であることが好ましく、水素原子であることがさらに好ましい。Ｒ４は、水素原子、ＣＯＭｅ及びＣＯＯＭｅからなる群から選ばれるいずれかの官能基であることが好ましく、水素原子であることが、破骨細胞分化抑制活性及び骨芽細胞分化促進活性の点からさらに好ましい。
［００９３］
上記式（ＩＩ）で表される化合物としては、下記式（ＶＩ）で表されるハルマリン、下記式（ＶＩＩ）で表されるハルマロールその他のβ−カルボリンアルカロイドを挙げることができ、これら２つの化合物のいずれかであることが、破骨細胞分化抑制及び骨芽細胞分化促進活性が高いことから、最も好ましい。
【００９４】
【化２０】
【００９５】
【化２１】
【００９６】
また、生理学的に許容されるこれらの塩、これらの水和物、これらの配糖体は、上述のとおりである。
【００９７】
上述した各種のβ−カルボリンアルカロイド化合物は、単独で本発明の医薬組成物の製造に使用することもでき、必要に応じて２種以上を適宜組み合わせて使用してもよい。また、上述した化合物、これらの生理学的に許容される塩、これらの水和物、及びこれらの配糖体からなる群から選ばれる１種以上を含有する生薬、ハーブティー用の茶葉等を、単独で又は２種以上を適宜組み合わせて使用することもできる。
【００９８】
こうした生薬としては、例えば、世界各地の温帯から熱帯にかけて分布するハマビシ科の１年草ハマビシ（Tribulus terrestris）の果実から得られるシツリシを挙げることができる。また、ハーブティー等に用いられているものとしては、南米、東インド、米国東部等に分布するチャボトケイソウ（P. incanata）、クダモノトケイソウ（P. edulis）の地上部全草、特に、葉、蔓、幹の部分を挙げることができる。また、その他のものとして、アマゾンに自生するキントラノオ科に属するバニステリオプシス・カアピ（B. caapi）、マツブサ科に属するチョウセンゴミシ（Schisandra chinensis）、ミカン科に属するゴシュユ（Evodia rutaecarpa）、ヒメハギ科に属するイトヒメハギ（Polygala tenuifolia）、サトイモ科に属するカラスビシャク（Pinellia ternata）、ショウガ科に属するショウガ（Zingiber officinale）等を挙げることができる。
【００９９】
上述した式（Ｉ）〜（VII）で表される化合物及びそれらの類縁体は、公知の方法又はそれに準ずる方法によって製造し、入手してもよく、市販品を購入して使用してもよい。また、上記のβ−カルボリンアルカロイド化合物、生理学的に許容されるこれらの塩、これらの水和物、及びこれらの配糖体は、上述した植物材料から抽出、単離することによって入手することもできる。例えば、トケイソウ、チャボトケイソウ、クダモノトケイソウ等のトケイソウ科に属する植物材料からハルミンを単離する方法の一例を示す。
【０１００】
トケイソウの地上部を採取し、乾燥する。これを粉砕してエタノール、メタノール、酢酸エチル、その他の親水性の高い有機溶媒や水、またはこれらの混合溶媒を用いて抽出する。抽出は０℃〜１００℃で５分から２４時間行うことが好ましい。得られた抽出液をろ過した後に減圧濃縮により乾固して抽出物を得る。
【０１０１】
このように処理して、トケイソウ、チャボトケイソウ、又はクダモノトケイソウ科に属する植物からの抽出物を得ることができる。
【０１０２】
また、トケイソウに代えて、ハマビシやバニステリオプシス・カアピの樹皮、チョウセンゴミシ（Schisandra chinensis）の果実、ゴシュユ（Evodia rutaecarpa）の未成熟果実、イトヒメハギ（Polygala tenuifolia）の根、カラスビシャク（Pinellia ternata）の球茎、ショウガ（Zingiber officinale）の根茎を用いる場合にも、上述したと同様の手順で抽出することができる。
【０１０３】
以上のようにして抽出された抽出物は、そのまま使用することもできるが、必要に応じてさらに精製してハルミンを単離することもできる。例えば、抽出物をシリカゲルクロマトグラフィーによって分画し、さらに高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって分取してハルミン及びその類縁化合物を得ることができる。
【０１０４】
具体的には、前処理をした試料を、SHISEIDO CAPCELLPAK C18 (200 x 4.6 mm i.d., 粒径５μｍ)を用いて、アイソクラティックな溶離液（メタノール：トリフロロ酢酸：水＝60.0：0.1：39.9）を、流速1.0ｍL/分で分離し、各画分を分取することにより、ハルミン等を得ることができる。
【０１０５】
以上のようにして得られた上記式（Ｉ）〜（III）で表される化合物、又は生理学的に許容される塩、若しくは水和物は、以下のようにして医薬製剤とすることができる。
【０１０６】
ハルミンを単独で医薬製剤とする場合には、上述したように得られた結晶を常法に従って処理し、後述する賦形剤等と混合すればよい。
【０１０７】
また、ハルミンと他のβ−カルボリンアルカロイド、とりわけ、ハルマンアルカロイドとを組み合わせて使用する場合には、ハルミン１に対して他のハルマンアルカロイドを０．１〜１０の割合として適宜混合し、この混合物をハルミン単独の場合と同様にして医薬製剤とすればよい。
【０１０８】
上述した化合物単独、又は二種以上の混合物を有効成分とする医薬製剤としては、注射剤、坐剤、エアゾール剤、経皮吸収剤その他の非経口剤、錠剤、散剤、カプセル剤、丸剤、トローチ剤、液剤その他の経口剤等を挙げることができる。ここで、上記の錠剤には、糖衣錠、コーティング錠、バッカル錠が含まれ、カプセル剤には、硬カプセル剤、軟カプセル剤の双方が含まれる。また、顆粒剤には、コーティングされた顆粒剤も含まれる。また、上記の液剤には、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤等が含まれ、シロップ剤にはドライシロップも含まれる。
なお、上述した各製剤には、徐放化されていないものばかりでなく、徐放化されたものも含まれる。
【０１０９】
こうした製剤は、公知の製剤学的製法に従い、製剤の製造に際して薬理学的に許容され得る日本薬局方に記載の担体、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤等を用いて製造することができる。
【０１１０】
こうした担体や賦形剤としては、例えば、乳糖、ブドウ糖、白糖、マンニトール、馬鈴薯デンプン、トウモロコシデンプン、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、結晶セルロース、カンゾウ末、ゲンチアナ末等を挙げることができる。
【０１１１】
結合剤としては、例えば、デンプン、トラガントゴム、ゼラチン、シロップ、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース等を挙げることができる。
【０１１２】
崩壊剤としては、例えば、デンプン、寒天、ゼラチン末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、アルギン酸ナトリウムなど、滑沢剤としては例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、水素添加植物油、マクロゴール等を使用することができる。
【０１１３】
着色剤、医薬品に添加することが許容されているものであれば使用することができ、特に限定されない。また、これら以外に、矯味剤、矯臭剤等も、必要に応じて適宜使用することができる。
［０１１４］
錠剤又は顆粒剤とする場合には、必要に応じて、白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、精製セラック、ゼラチン、グリセリン、ソルビトール、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、フタル酸セルロースアセテート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルメタクリレート、メタアクリル酸重合体等を用いてコーティングしても良く、複数層でコーティングすることもできる。
［０１１５］
さらに、顆粒剤や粉剤をエチルセルロースやゼラチンのようなカプセルに詰めてカプセル剤とすることもできる。
［０１１６］
上記の化合物、又はそれらの生理学的に許容される塩、若しくは水和物を用いて、注射剤を調製する場合は、必要に応じて、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤などを添加することもできる。
［０１１７］
上述したような骨疾患予防及び／又は治療のための骨芽細胞の分化促進剤を患者に投与する場合には、投与量は、患者の症状の重篤さ、年齢、体重、及び健康状態等の諸条件によって異なる。一般的には、成人１日当たり１ｍｇ／ｋｇ〜２，０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１ｍｇ／ｋｇ〜１，０００ｍｇ／ｋｇ程度を、経口又は非経口的に、１日１回若しくはそれ以上の回数にわたって投与すればよい。上記のような諸条件に応じて、投与の回数及び量を適宜増減すればよい。
［０１１８］
ハルミン単独、またはハルミンと他のハルマンアルカロイド化合物、例えば、ハルモールとを含有する医薬組成物が有効成分として製剤中に含まれる場合には、当該組成物中におけるハルミンの含有量は、０．１〜１００ｍｇであることが好ましく、より好ましくは０．１〜５０ｍｇ、さらに好ましくは０．３〜１０ｍｇである。
［０１１９］
有効成分であるハルミンや他のハルマンアルカロイド化合物の含有量が下限値未満では骨吸形成促進作用が十分に発揮されず、逆に上限値を越えて添加しても、添加量に見合う効果が発揮されない。また、上限値を越えると、投与時に細胞毒性が発揮されることがあり、生体に対して望ましくない副作用を惹起するおそれがあることによる。
［０１２０］
上述した本発明の組成物を必要に応じて適宜添加することにより、骨芽細胞の分化促進による骨疾患の予防及び／又は治療効果を有する機能性食品、若しくは健康食品を提供することができる。
［０１２１］
本明細書において「機能性食品」とは、その食品自体が本来含有している栄養素によって、その食品を摂取した者に供与できる以上の利益を与え得る成分を含有する食品をいう。
［０１２２］
また、本明細書において「健康食品」とは、一般に、健康の保持・増進に資する食品として販売・利用されるものの総称であり、日頃不足しがちな栄養成分の摂取を補助するサプリメントも含む。
［０１２３］
上述した組成物は、例えば、パン、クッキー及びビスケット、米飯添加用麦及び雑穀、うどん、そば、パスタその他の麺類、チーズ、ヨーグルトその他の乳製品、ジャム、マヨネーズ、味噌、醤油その他の大豆製品、茶、コーヒー及びココア、清涼飲料、果実飲料その他の非アルコール性飲料、薬用酒その他のアルコール性飲料、キャンディー（飴）、チョコレートその他のスナック菓子、チューインガム、せんべい、羊羮その他の大豆を原料とする菓子等に添加して、機能性食品とすることができる。
［０１２４］
なお、上記のヨーグルト、醤油、飲料等に添加する場合には、これらの中で本発明の組成物が結晶化して沈殿しないようにするために、溶解助剤や安定化剤を適宜加えることもできる。
［０１２５］
また、本発明の組成物を単独で、又は２種以上を混合し、常法に従って粉剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤とすることにより、健康食品とすることができる。さらに、ペット用の飲料やペットフードにこれらを添加することもできる。
［０１２６］
ここで、本発明の組成物を粉末とするためには、生成過程で得られた抽出物を濃縮し、凍結乾燥、スプレードライ、真空乾燥等の方法を用いて乾燥させ、サンプルミル、ブレンダー、ミキサー等によって乾燥固体を粉砕すればよい。また、必要に応じて、コーンスターチ、馬鈴薯デンプン、デキストリン、シクロデキストリン、牡蠣殻粉末などを添加してもよい。
［０１２７］
また、上記のようにして得た粉末に、適宜、上述した結合剤を加えて打錠し、錠剤とすることもできる。錠剤とした後に、上述した白糖又はゼラチン等のコーティング剤を用いて、糖衣錠としてもよく、他のコーティング剤を用いて腸溶剤等にすることもできる。
【０１２８】
さらに、上述のようにして得た粉末を常法に従って顆粒とし、顆粒剤を製造することもできる。また、上記の粉末や顆粒を上述したカプセルに適当量充填することによって、カプセル剤とすることもできる。
【０１２９】
本発明の第三の実施形態に係る歯根−歯周組織形成促進剤は、下記式（Ｉ）で表される化合物、これらの生理学的に許容される塩、及びこれらの水和物からなる群から選ばれる少なくとも１種以上を有効成分として含有するものである。
【０１３０】
【化２２】
【０１３１】
（式中、Ｒ5は、水素原子、ＯＨ，ＯＲ’1、ＣＯＲ’2、及びＣＯＯＲ’3からなる群から選ばれる官能基を表し、Ｒ6は、炭素数１〜10の直鎖状、分枝状及び環状のアルキル基からなる群から選ばれる官能基を表す。ここで、Ｒ’1は炭素数１又は２のアルキル基を、Ｒ’2は、水素原子、炭素数１〜10の直鎖状、分枝状及び環状のアルキル基からなる群から選ばれる官能基を、Ｒ’3は水素原子、炭素数１〜10の直鎖状、分枝状及び環状のアルキル基からなる群から選ばれる官能基をそれぞれ表す。）
【０１３２】
ここで、Ｒ5は、水素原子、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、ＣＯＨ、ＣＯＭｅ、ＣＯＥｔ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＭｅ及びＣＯＯＥｔからなる群から選ばれるいずれかの官能基であることが好ましく、水素原子、ＯＨ及びＯＭｅからなる群から選ばれるいずれかの官能基であり、Ｒ6は、メチル基又はエチル基であることが好ましく、メチル基であることが、歯根−歯周組織形成促進活性が高いことから、さらに好ましい。
【０１３３】
上記式（Ｉ）で表される化合物としては、下記式（III）で表されるハルミン、下記式（IV）で表されるハルモール、又は下記式（Ｖ）で表されるハルマンその他のβ−カルボリンアルカロイドを挙げることができ、これらの３つの化合物のいずれかであることが、歯根−歯周組織形成促進活性が高いことから、最も好ましい。
【０１３４】
【化２３】
【０１３５】
【化２４】
【０１３６】
【化２５】
【０１３７】
また、こうした化合物は必要に応じて生理学的に許容される塩、水和物及び配糖体を用いることができるが、特に塩酸塩を使用すると、より高い歯根−歯周組織形成促進活性という効果が発揮される。
【０１３８】
本発明の第四の実施形態に係る歯根−歯周組織形成促進剤は、下記式（II）で表される化合物、これらの生理学的に許容される塩、及びこれらの水和物からなる群から選ばれる少なくとも１種以上を有効成分として含有するものである。
【０１３９】
【化２６】
【０１４０】
（式中、Ｒ1は、水素原子、ＯＨ、ＯＲ’1、ＣＯＲ’2及びＣＯＯＲ’3からなる群から選ばれる官能基を表し、Ｒ2は、水素原子、ＣＯＲ’2及びＣＯＯＲ’3からなる群から選ばれる官能基を表し、Ｒ3は、水素原子、ＣＯＲ’2及びＣＯＯＲ’3からなる群から選ばれる官能基を表し、Ｒ4は、炭素数１〜10の直鎖状、分枝状及び環状のアルキル基からなる群から選ばれる官能基を表す。ここで、Ｒ’1は炭素数１又は２のアルキル基を、Ｒ’2は、水素原子、炭素数１〜10の直鎖状、分枝状及び環状のアルキル基からなる群から選ばれる官能基を、また、Ｒ’3は水素原子、炭素数１〜10の直鎖状、分枝状及び環状のアルキル基からなる群から選ばれる官能基をそれぞれ表す。）。
【０１４１】
ここで、Ｒ1は、水素原子、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、ＣＯＨ、ＣＯＭｅ、ＣＯＥｔ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＭｅ及びＣＯＯＥｔからなる群から選ばれるいずれかの官能基であることが好ましく、水素原子、ＯＨ及びＯＭｅからなる群から選ばれるいずれかの官能基であることが、歯根−歯周組織形成促進活性が高いという点からさらに好ましい。
【０１４２】
また、Ｒ2及びＲ3は、それぞれ、水素原子、水酸基、及びアルコキシ基からなる群から選ばれるいずれかの官能基であることが好ましく、水素原子であることがさらに好ましい。Ｒ4は、水素原子、ＣＯＭｅ及びＣＯＯＭｅからなる群から選ばれるいずれかの官能基であることが好ましく、水素原子であると、さらに高い歯根−歯周組織形成促進活性が発揮される。
【０１４３】
上記式（II）で表される化合物としては、下記式（VI）で表されるハルマリン、下記式（VII）で表されるハルマロールその他のβ−カルボリンアルカロイドを挙げることができ、これら２つの化合物のいずれかであることが、歯根−歯周組織形成促進活性が高いことから、最も好ましい。
【０１４４】
【化２７】
【０１４５】
【化２８】
【０１４６】
また、生理学的に許容されるこれらの塩、これらの水和物、これらの配糖体は、上述のとおりである。
【０１４７】
上述した各種のβ−カルボリンアルカロイド化合物は、単独で本発明の医薬製剤の製造に使用することもでき、必要に応じて２種以上を適宜組み合わせて使用してもよい。また、上述した化合物、これらの生理学的に許容される塩、これらの水和物、及びこれらの配糖体からなる群から選ばれる１種以上を含有する生薬、ハーブティー用の茶葉等を、単独で又は２種以上を適宜組み合わせて使用することもできる。
【０１４８】
こうした生薬としては使用できるものとしては、例えば、シツリシ、チャボトケイソウ（P. incanata）、クダモノトケイソウ（P. edulis）の地上部全草、特に、葉、蔓、幹の部分、バニステリオプシス・カアピ（B. caapi）、チョウセンゴミシ（Schisandra chinensis）、ゴシュユ（Evodia rutaecarpa）、イトヒメハギ（Polygala tenuifolia）、カラスビシャク（Pinellia ternata）、ショウガ（Zingiber officinale）等、上述したものを挙げることができる。
【０１４９】
上述した式（Ｉ）〜（VII）で表される化合物及びそれらの類縁体の製造方法等は、上述したとおりである。また、上記のβ−カルボリンアルカロイド化合物、生理学的に許容されるこれらの塩、水和物、及び配糖体も、上述したようにして入手することもできる。
【０１５０】
以上のようにして得られた上記式（Ｉ）〜（III）で表される化合物、又は生理学的に許容される塩、若しくは水和物は、以下のようにして医薬組成物とすることができる。
【０１５１】
ハルミンを単独で医薬製剤とする場合には、上述したように得られた結晶を常法に従って処理し、後述するようにして製造することができる。また、ハルミンと他のβ−カルボリンアルカロイド、とりわけ、ハルマンアルカロイドとを組み合わせて使用する場合には、ハルミン１に対して他のハルマンアルカロイドを０．１〜１０の割合として適宜混合し、この混合物をハルミン単独の場合と同様にして医薬製剤とすればよい。
【０１５２】
上述した化合物若しくは植物からの抽出物を適当量添加することによって、歯根−歯周組織の維持や形成を促進する効果、すなわち、歯周病の予防・治療効果を有する歯磨き粉や練歯磨き、含嗽剤等を製造することができる。
【０１５３】
また、上述した化合物若しくは植物からの抽出物を、上記のようなパン、クッキー、ビスケット等や、茶、コーヒー及びココア、清涼飲料、果実飲料その他の非アルコール性飲料、キャンディー（飴）やチョコレートその他の菓子類、チューインガム等に添加して、歯周病予防効果のある機能性食品とすることができる。
【０１５４】
また、本発明の組成物を単独で、又は２種以上を混合し、常法に従って粉剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤とすることにより、健康食品とすることができる。さらに、これらを添加することによって、歯周病予防効果を有するペット用の飲料やペットフードを調製することができる。ここで、本発明の抽出物や化合物を粉末とする方法は、上述したとおりである。
【０１５５】
ハルミンをゲル状の製剤（アガロースビーズ）を製造する場合を例に取って説明する。
ハルミンを所定の濃度となるように所定の緩衝液を用いて希釈し、ハルミン溶液を調製する。また、アガロースビーズをリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、上記のハルミン溶液を所定の量で加えて、所定の時間、所定の温度でインキュベートし、ハルミンをアガロースビーズに吸収させ、ゲル状の製剤とする。
【０１５６】
ここで、ハルミンの濃度は、１〜３０μＭ程度とすることができる。また、所定の緩衝液としては、ダルベッコ変法リン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ、大日本製薬（株）製）等を、また、アガロースビーズとしては、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌアガロースビーズ（ＢｉｏＲａｄ社製）を使用することができる。さらに、インキュベート時間と温度は、３０〜７５分間、２０〜３７℃の範囲で行うことができる。
【０１５７】
上述したような歯根−歯周組織形成促進剤を、患者又は患畜に投与する場合には、投与量は、彼らの症状の重篤さ、年齢、体重、及び患部の状態等の諸条件によって異なる。一般的には、局所に投与することが好ましい。
【０１５８】
有効成分であるハルミンや他のハルマンアルカロイド化合物の含有量が下限値未満では歯根−歯周組織形成促進作用が十分に発揮されない。逆に上限値を越えて添加しても、添加量に見合う効果が発揮されないばかりでなく、投与時に細胞毒性が発揮されることがあり、生体に対して望ましくない副作用を惹起するおそれがあることによる。
【０１５９】
上述した本発明の組成物を必要に応じて適宜添加することにより、歯根−歯周組織形成促進剤を提供することができる。
【実施例】
【０１６０】
以下に、実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例に何等限定されるものではない。
【０１６１】
（実施例１） RAW264細胞を用いた破骨細胞分化の検討
（１−１）試薬等
ハルミンは、和光純薬工業（株）より購入した。RAW264細胞（マウス単球／マクロファージ系細胞株、cell番号RCB0535、以下、「MφRAW264」ということがある。）は、RIKEN Cell Bankより購入した。また、α−MEMは、INVITROGEN社（カタログ番号11900-024）より購入した。96ウェルマイクロプレート及び100mmφディッシュは、Nunc社（カタログ番号161093、同172958）より購入した。
【０１６２】
ｐ−ニトロフェニルリン酸、ナフトールAS-MXリン酸、ファストレッドバイオレットLB塩はSIGMA社より購入した。酒石酸、クエン酸、酢酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、ホルマリン、及びエタノールは、和光純薬工業（株）より購入した。
MTT（3-(4,5-Dimethyl-2-thizaolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium Bromide）試薬は和光純薬工業（株）より購入した。セルカウンティングキット−８は、同仁化学（株）より購入した。
【０１６３】
（１−２）破骨細胞の初期分化試験
RAW264細胞をα−MEMに縣濁して96ウェルマイクロプレートに３×103cells/wellとなるようにまき、各濃度の試験サンプルと破骨細胞分化誘導因子（RANKL）を50ng/mlとなるように加えて、37℃、５％CO2インキュベータ中にて３日間培養した。培養後、10％ホルマリン溶液で細胞を固定し、100％エタノールにて再固定した。
【０１６４】
ディッシュを乾燥後、破骨細胞のマーカー酵素である酒石酸耐性酸ホスファターゼ（以下、「TRAP」ということがある。）の活性を測定し、TRAP染色を行った。TRAP活性の測定には、3.7mMのp−ニトロフェニルリン酸を基質として含み、10mM酒石酸および50mMクエン酸を含有するpH4.6の緩衝液を使用した。この緩衝液を、上記96ウェルマイクロプレートの各ウェルに100μlずつ入れ、37℃で30分間反応させた後、100μlの0.1Ｎ水酸化ナトリウムを加えて反応を停止させ、その後、プレートリーダーにて405nmの吸光度を測定し、その吸光度をTRAP活性とした。
【０１６５】
TRAP染色には、0.1mg/mlナフトールAS-MXリン酸、0.6mg/mlファストレッドバイオレットLB塩を含み50mM酢酸ナトリウムおよび10mM酒石酸を含有するpH4.5緩衝液を使用した。この緩衝液を上記96ウェルマイクロプレートの各ウェルに50μlずつ入れ、37℃にて、30分から１時間反応させて染色した。
細胞毒性は、上述した条件でRAW264細胞を培養した後、セルカウンティングキット−８又はMTTを用いて、定法に従って測定した。
【０１６６】
細胞内のTRAP活性の測定とTRAP染色とを指標として、ハルミンによる破骨細胞への分化に対する活性の評価を行った。結果を図１A及び１Bに示す。
図1Aより、ハルミンの添加量が約３倍ずつ増加すると、RAW264細胞の全細胞数は低下傾向にあった。一方、TRAP活性は、明確な濃度依存的な低下を示した。
以上より、ハルミンは、RAW264細胞の全細胞数には影響をほとんど与えずに、破骨細胞のマーカー酵素であるTRAPの活性を抑制していることから破骨細胞の初期分化を抑制することが示された。また、図1Bより、ハルミンの添加量の増加につれて、多核破骨細胞の数が減少しており、ハルミンが濃度依存的に破骨細胞の分化を抑制することが示された。
【０１６７】
（実施例２）マウス骨髄細胞を用いた破骨細胞分化の検討
（２−１）試薬等
４週齢の雄ddyマウスは、中部科学資材（株）より購入した。また、26G注射針と2.5ml注射筒とは、テルモより購入した。骨細胞分化誘導因子（RANKL）はPEPRO TECH INC社（カタログ番号310-01）より、また、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF、カタログ番号300-25）は、PEPRO TECH INC社より購入した。他の試薬は、実施例１と同じものを使用した。
【０１６８】
（２−２）破骨細胞分化試験
4週齢雄ddyマウスの大腿骨を採取し、26G注射針と2.5ml注射筒を用いて大腿骨にα−MEMを注入して骨髄細胞を取り出した。骨髄細胞は50ng/mlのM-CSFを含むα−MEMに懸濁し、37℃にて、５％CO2インキュベータ中にて3日間培養した。その後、上記96ウェルマイクロプレートの各ウェルに５×104cells/wellとなるようにまき、さらに各濃度の試験サンプルとRANKL（100ng/ml）及びM-CSF（50ng/ml）を含むα−MEMを用いて、37℃、５％CO2インキュベータ中にて３日間培養した。
【０１６９】
実施例１と同様に細胞を固定してTRAP活性を測定した後にTRAP染色を行った。また、セルカウンティングキット−８を用いて添付のプロトコールにしたがって測定した。
実施例１と同様に細胞内のTRAP活性の測定とTRAP染色とを指標として、ハルミンによる破骨細胞への分化に対する活性の評価を行った。結果を図2A及び2Bに示す。
【０１７０】
図2A及び2Bから明らかなように、ハルミンによる全細胞数の減少よりも、TRAP活性の低下が大きくなっていた。一方、TRAPの活性の抑制と比較すると、多核破骨細胞の数が顕著に減少しており、破骨細胞の初期分化よりも、破骨細胞分化の後期の過程を抑制することが示された。
【０１７１】
（実施例３）マウス骨髄細胞および骨芽細胞株を用いた共存培養による破骨細胞分化
（３−１）材料等
４週齢雄ddyマウス、26G注射針、2.5ml注射筒、α−MEMは、実施例１及び２と同様のものを使用した。また、骨芽細胞株のUAMS-32細胞は、昭和大学歯学部高見正道博士より分与していただいた。ビタミンＤ3およびPGE2は和光純薬工業（株）より購入した。トルイジンブルーは、SIGMA社より購入した。象牙切片は、象牙を約0.7mmの厚さに切断し、この象牙シートから穴あけポンチを用いて直径4mmの切片を作製し、エタノールにて消毒後乾燥して調整した。
【０１７２】
（３−２）共存培養による破骨細胞分化
ddyマウスの大腿骨を採取し、26G注射針と2.5ml注射筒を用いて、大腿骨にα−MEMを注入して骨髄細胞を取り出した。
骨髄細胞を２×105cells/well、UAMS-32細胞を１×104cells/well、となるように96ウェルマイクロプレートの各ウェルにまき、各濃度の試験サンプルとビタミンＤ3（10nM）及びPGE2（１μM）を含むα−MEMで、37℃、５％CO2インキュベータ中にて、５日間培養した。実施例１と同様に細胞を固定してTRAP活性を測定した後に、TRAP染色を行った。
【０１７３】
また、象牙切片上において上記と同じ条件でこれらの細胞を培養した後、象牙切片上の破骨細胞によって溶かされた部分（骨吸収窩、以下、「ピット」ということがある。）がどの程度形成されているかを１％トルイジンブルー染色液で染色した。結果を図3A〜3Cに示す。
【０１７４】
コントロール（図3A参照）では形成された破骨細胞によって溶かされた骨片上の穴（ピット）が青紫色に多数染色されている。一方、ハルミンで処理することによってピットの形成が顕著に抑制されていること、及び、この抑制は濃度依存的なものであった（同3B及び3C参照）。
以上より、ハルミンには、破骨細胞分化を抑制して骨吸収を抑制する作用があることが示された。
【０１７５】
（実施例４）骨芽細胞分化に対するハルミンの効果
（４−１）試薬等
マウス前骨芽細胞株であるMC3T3-E1細胞は、RIKEN Cell Bankより購入した。アスコルビン酸、β−グリセロリン酸、塩化マグネシウムは、SIGMA社より購入した。
【０１７６】
ｐ−ニトロフェニルリン酸、ナフトールAS-MXリン酸、ファストブルーBB塩及びアリザリンレッドＳはSIGMA社より購入した。オステオカルシン量を測定するためのEIAキットは、Biomedical Technologies Inc.より購入した。フォン・コッサ（von Kossa）染色用の硝酸銀及びチオ硫酸ナトリウムは和光純薬工業（株）より購入した。
その他の試薬は、実施例１〜３で使用したものと同じものを使用した。
【０１７７】
（４−２）骨芽細胞分化及び骨芽細胞によるカルシウムの石灰化に対するハルミンの効果
マウス前骨芽細胞株であるMC3T3-E1細胞をα−MEMに縣濁して96ウェルマイクロプレートの各ウェルに、４×103cells/wellとなるようにまき、37℃、５％CO2インキュベータ中にて２日間前培養した。前培養開始３日目に、各濃度の試験サンプルと、50μg/mlアスコルビン酸及び10mMのβ−グリセロリン酸を含むα−MEMに培地を交換して７日間から14日間培養し、３日後に培地交換をした。また、本培養中も、３〜４日ごとに培地を交換した。
【０１７８】
培養終了後、実施例１と同様に、メタノールで細胞を固定してディッシュを乾燥後、骨芽細胞の初期の分化マーカー酵素であるアルカリホスファターゼ（ALP）の活性を測定するとともに、ALP染色を行った。
【０１７９】
ALP活性の測定には、6.7mMのp−ニトロフェニルリン酸を基質として含み、２mMの塩化マグネシウムおよび100mMのトリス−塩酸を含有するpH8.5の緩衝液を使用した。この緩衝液を各ウェルに100μlずつ入れて、37℃にて、30分反応させた後に、100μlの0.1Ｎ水酸化ナトリウムを加えて反応を停止させた。プレートリーダーにて405nmの吸光度を測定し、その吸光度をALP活性とした。
【０１８０】
ALP染色は0.1mg/mlナフトールAS-MXリン酸、0.6mg/mlのファストブルーBB塩を含み２mMの塩化マグネシウム及び100mMのトリス−塩酸を含有するpH8.5の緩衝液を、各ウェルに50μlずつ入れて、室温にて30分から１時間反応させて染色した。
【０１８１】
また、細胞毒性は上記と同じ条件で培養後、セルカウンティングキット−８又はMTTを用いて定法により測定した。培養液中のオステオカルシン濃度は、上記と同じ条件で、14日間培養した後に、培養上清を上記のELISAキットを用いてプロトコールに従って測定した。
骨芽細胞の石灰化は、アリザリンレッドＳ染色およびvon Kossa染色にて確認した。
【０１８２】
骨芽細胞分化に対するハルミンの効果を図4A及び4Bに示す。図4A及び4Bから明らかなように、ハルミンの添加により、濃度依存的に全細胞数は減少する傾向が見られたが、骨芽細胞分化の初期のマーカー酵素であるALPの活性は著しく上昇していた。このため、ハルミンは、骨芽細胞の初期分化を促進することが示された
【０１８３】
また、骨芽細胞によるカルシウムの石灰化に対するハルミンの効果を、図５に示す。図５に示されるように、コントロールではvon Kossa染色及びアリザリンレッドＳ染色のいずれの染色によっても、染色はほとんどされなかった。一方、ハルミンで処理を行うと、いずれの染色法によっても顕著に染色が認められ、ハルミンは骨芽細胞分化を促進してカルシウムの石灰化も亢進させることが示された。また、これらの染色を行ったときの染色の濃さにより、ハルミンによるこのカルシウムの石灰化の亢進は、濃度依存的な傾向があることが示された。
【０１８４】
以上より、ハルミンは破骨細胞分化を抑制することで骨吸収を抑制し、他方、骨芽細胞分化を促進して骨形成を促進すると考えられる。したがって、骨減少性の多くの疾患、例えば、骨粗鬆症、関節リウマチ、歯周病、ページェット病、がんの骨転移等の予防に有用であり、また、これらに対して治療を行う際に、ほとんど副作用がなく、高い治療効果を発揮することが期待できる。
【０１８５】
（骨疾患の予防及び／又は治療用医薬製剤例）
次に、本発明の組成物を含有する製剤例を示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０１８６】
（製剤例１ 錠剤）
【０１８７】
上記の成分をそれぞれ秤量し、均一に混合した後に圧縮打錠して重量300mgの錠剤を製造することができる。
【０１８８】
（製剤例２ 硬カプセル剤）
【０１８９】
上記の成分をそれぞれ秤量し、均一に混合した後、硬カプセルに300mgずつ充填することにより、硬カプセル剤を製造することができる。ここで、組成物１は、ハルミンと乳糖とを１：１で混合したものである。なお、製剤例３〜６で使用する組成物１は上記と同じものである。
【０１９０】
（製剤例３ 軟カプセル剤）
【０１９１】
上記の成分をそれぞれ秤量し、均一に混合した後、軟カプセルに100mgずつ充填することにより、軟カプセル剤を製造することができる。
【０１９２】
（製剤例４ 顆粒剤）
【０１９３】
上記の成分をそれぞれ秤量し、均一に混合した後、常法に従って顆粒剤を製造することができる。
【０１９４】
（製剤例５ シロップ剤）
【０１９５】
上記の成分をそれぞれ秤量し、糖及びサッカリンを注射用蒸留水60ｍLに溶解した後、グリセリン及びエタノールに溶解された組成物２及び調味料の溶液を加える。この混合物に精製水を加えて、最終容量を100ｍLにすることにより、経口投与用のシロップ剤を製造することができる。
【０１９６】
（製剤例６ 顆粒剤）
【０１９７】
上記の成分をそれぞれ秤量し、組成物３を常法によって珪酸カルシウムに吸着させて微粒子とし、散剤を製造することができる。
【０１９８】
（実施例５）歯根−歯周組織形成促進効果の検討
（５−１）試薬等
リン酸緩衝生理食塩水（Phosphate buffered saline, 以下「PBS」ということがある。）、ダルベッコ変法リン酸緩衝生理食塩水（Dulbecco’s physiological saline, 以下「D-PBS」ということがある。）は、大日本製薬（株）より購入した。Affi-Gelアガロースビーズ（アフィゲルヘパリン カタログ番号：15306173）は、BioRad社より購入した。1.5mlエッペンドルフチューブ及びその他の試薬は、実施例１と同じものを使用した。
生後５日齢のC57BL/6マウスは、三協ラボラトリーより購入した。また、ホストマウスとしては、成体マウスの器官において、腎臓及び前眼房は免疫応答の非常に少ない組織であることが知られており、前記移植培養実験においては特にヌードマウスを用いる必要はないため、三協ラボラトリーより購入した生後10〜15週齢のC57BL/6マウス（雌）を２匹一群として使用した。
【０１９９】
（５−２）ハルミン含浸ヘパリン含有吸収性ビーズの調製
ハルミンを含浸させたアガロースビーズを、以下のようにして調製した。ハルミンを10μM（終濃度）の濃度となるように、D-PBSを用いて希釈した。また、上記のアガロースビーズを、PBSを用いて洗浄した。
洗浄後のアガロースビーズ４粒を1.5ml角底エッペンドルフ型チューブに入れ、上記のように調製したハルミン溶液を100μlの量で添加し、室温で45分間、インキュベートすることにより、ハルミンをアガロースビーズに含浸させた。以上のようにして、ハルミン含浸ヘパリン含有吸収性ビーズ（以下、「ハルミン含浸アガロースビーズ」ということがある）を調製した。
また、上記のアガロースビーズ４粒を1.5mlエッペンドルフチューブに入れ、D-PBSを100μlの量で添加してPBS含浸アガロースビーズを調製し、陰性対照に使用した。
【０２００】
（５−２）歯根−歯周組織形成促進効果の確認
（５−２−１）歯髄への埋入
歯根-歯周組織形成直前の、生後５日齢のC57BL/6マウスを、エーテル麻酔後に断頭屠殺した。下顎を摘出後、下顎第１臼歯を歯小嚢ごと摘出した。上記（５−１）で調製したハルミン含浸アガロースビーズを一粒、摘出歯（下顎第１臼歯）の歯髄に埋入した。
また、陰性対照として、上記のように調製したD-PBS含浸アガロースビーズを一粒、摘出歯（下顎第１臼歯）の歯髄に埋入した。
【０２０１】
（５−２−２）移植培養
ハルミン含浸アガロースビーズを埋入した摘出歯、及び、D-PBS含浸アガロースビーズを埋入した摘出歯を、ホストマウスの腎臓皮膜下に移植した。ホストマウスは、12時間点灯、室温25℃の条件下におき、水と飼料は自由に摂取させて３週間飼育した。
上記の摘出歯の移植３週間後、ホストマウスを頸骨脱臼にて屠殺し、腎臓を摘出して、培養後の摘出歯（移植歯）を回収した。回収した培養後の移植歯における歯根-歯周組織形成（伸長）および歯根膜、骨を、実体顕微鏡下にて観察し、マイクロCTにて断層撮影後、３Ｄ構築した。前記移植培養後の移植歯の観察結果を、図６に示す。
【０２０２】
図６の結果から、D-PBSのみを使用した陰性対照群（図６下、「PBS」と表示）では、わずかな歯根の伸長と周囲に骨の形成が観察された。一方、ハルミン含浸アガロースビーズを使用した実験群（図６上、「ハルミン」と表示）では、陰性対照群と比較して、顕著に歯根の伸長が促進された。
【０２０３】
また、ハルミン含浸アガロースビーズが歯髄に埋入され、歯根伸長が促進された全移植歯サンプルでは、形成された歯根の周囲に骨の形成が観察された。このため、これを軟Ｘ線写真撮影し、内部に歯根伸長が確認されたかどうかを検討した。この結果、形成された骨内部の移植歯牙に、歯根の伸長が認められた（図６参照）。
【０２０４】
また、形成された歯根と周囲の骨との間には、歯周靭帯様の構造が観察された。なお、図６中、斜線を付した部分は形成された骨を示す。また、「側面」及び「全体」の３Ｄ構築画像中の斜線が付されていない部分、及び「断面」の白い部分は歯を示す。さらに、「断面」の画像中、白い矢印が示す部分が歯根膜領域を示す。
【０２０５】
これらの結果から、ハルミンを有効成分とする歯根-歯周組織形成促進剤は、優れた歯根形成（伸長）促進作用を有し、かつ、形成された歯根を支持する、歯周靭帯や歯槽骨等の周囲組織の形成促進作用をも有していることが示された。したがって、ハルミンを有効成分として含有する歯根-歯周組織形成促進剤は、歯根の形成促進、及び、歯根を支持する歯周靭帯や歯槽骨等の周囲組織の形成促進を行う上で、非常に有効であることが示された。
【０２０６】
以上より、本発明の歯根-歯周組織形成促進剤は、とくに歯周組織の維持や形成促進が望まれる様々な場面において、広く応用の可能性が期待されるものであり、例えば、以下のような用途において、特に有用であると考えられる。
（１）歯科領域において、歯磨剤や含嗽剤などに添加することにより、歯根-歯周組織の維持や形成を促進することができる。
（２）食品一般として、食品や飲料等に微量添加することにより歯周病予防効果のあるガムや飴作成に応用できる。
（３）ペット関連製品として、食品や飲料等に微量添加することにより歯周病予防効果のあるペットフードや飲料の作成に応用できる。
【産業上の利用可能性】
【０２０７】
本発明によれば、本発明の化合物（Ｉ）〜（VII）、生理学的に許容されるこれらの塩、これらの水和物、これらの配糖体及びこれらを含む抽出物からなる群から選ばれる１種以上を含む医薬組成物、健康食品、機能性食品及び医薬製剤は、医薬及び食品の分野において有用である。
【０００６】
本発明は、下記式（Ｉ）〜（Ｖ）で表されるβ−カルボリンアルカロイド化合物、又はこれらの類縁体を少なくとも１種以上含有する健康食品、機能性食品、骨疾患の予防及び／又は治療効果を有する医薬組成物、前記医薬組成物を有効成分として含有する医薬製剤、並びに歯根−歯周組織形成促進剤に関する。ここで、本明細書中、「類縁体」は、上記式（Ｉ）〜（Ｖ）で表される化合物の生理学的に許容される塩、水和物及び配糖体を含むものとする。
【０００７】
【化１】
【０００８】
【化２】
【０００９】
【化３】
【００１０】
【化４】
【００１１】
【化６】
【背景技術】
【００１２】
骨に関する疾患は、外傷性骨折や疲労骨折等に代表される外因性疾患と、骨多孔症、骨粗鬆症、高カルシウム血症、高副甲状腺ホルモン（以下、「PTH」ということがある。）血症、骨ページェット病、関節炎、リウマチ、乳ガンの骨転移、骨軟化症、悪性腫瘍その他の疾病に起因する骨組織の脆弱化、及び栄養障害による骨組織の脆弱化といった内因性の疾患とに大別される。
【００１３】
ヒトの骨は、骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収とを絶えず繰り返しつつ、恒常性を維持している。しかし、加齢や炎症等により、恒常性が維持できなくなり、骨吸収が過剰になると、骨粗鬆症や関節リウマチ等の病態が生じる。
【００１４】
こうした内因性の骨疾患の中でも、骨粗鬆症の患者数は高齢者数の増加につれて増加しつつある。また、食生活の変化と運動量の低下に伴って、カルシウムの摂取量の低下や骨組織への定着率の低下が生じ、骨組織の脆弱化が加速されているといわれている。
【００１５】
骨折は、骨組織のある部分の連絡が外力によって断たれた状態をいい、骨折部位に著明な疼痛を伴う。健常人の場合には、例えば、交通事故等によってかなり大きな外力がかからない限り骨折は起こらないが、骨量が低下して骨組織が弱くなると、歩いたり走ったりしている最中にころんだ等、さほど大きくない外力がかかっただけでも骨折が起こる。また、上記のような骨粗鬆症等の内因性の疾患に起因して骨量が低下している場合には、階段で躓いたり、咳込んだりしたときにかかるわずかな外力によっても骨折が生じるようになる。
【００１６】
骨折が起こった場合には、一般的には、ずれている骨の位置を牽引等によって修正し、ボルトやピンで固定できる場合には固定し、その後は患者の自然治癒力に委ねるという治療方法が採用されている。
【００１７】
一方、骨粗鬆症等の内因性の疾患では骨の石灰質と骨基質とがともに減少しているため自然治癒が遅れることが多く、高齢者の場合にはその間に骨折部位以外の関節が固まって動かなくなり、寝たきりになるといったケースも少なくない。
【００１８】
また、歯周病は３０歳を超えた日本人の８０％が罹患する国民病ともいえる病気であるが、かなりひどい状態にならないと痛みを感じない。このため、重篤な疾患となりやすい特徴をもつ病気としてとらえられる。進行した歯周病においては、咀嚼時に生じる痛みや不快感に起因する摂食障害、悪臭を伴う口臭などが生じる結果、栄養状態の不良やコミュニケーション障害などがもたらされる恐れがある。このような場合、歯科による専門的な治療法が施されるが、症状の進行を食い止めることができず抜歯に至ることが多い。一方で、健康な高齢者では残存歯の数が多いことが知られている。
【００１９】
近年では、ヒトだけではなく、柔らかな食物を与えられて家庭内で飼育されているイヌやネコなどのペットにおいても歯周病が蔓延しつつあり、問題視されている。
歯周病に罹患すると、歯周組織を構成するセメント質、歯根膜及び歯槽骨が破壊される。このため、ヒトの歯周病の治療は、従来、歯石や壊死セメント質等の炎症を惹起させる原因物質を除去し、組織の治癒を促すという方法で行われてきた。しかし、この方法では既に破壊されてしまった歯周組織の再生は困難であった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
したがって、骨折の治療、特に高齢者における骨折の治療の際に、治癒に要する期間を短縮することについては、要介護者数を減少させるという観点からも、強い社会的な要請がある。一方で、治療に薬剤を使用する場合には、こうした薬剤には、治療効果の高さのみならず、副作用が少ない等、安全性の高さも要求される。
【００２１】
また、歯周病の治療に際しては、症状の進行を食い止めて抜歯を回避し、栄養状態を良好に保つこと、及びコミュニケーションを支障なく行うことについては、年齢を問わず強い要請がある。とりわけ、高齢者では自らの歯でしっかりと咀嚼して食事を摂ることが、生活の質（Quality of life, 以下、「ＱＯＬ」ということがある）の低下を防ぐ上で重要であり、骨疾患の予防にもつながる。さらに、歯周病に罹患した場合、ヒト以外の動物では抜歯する以外に方法はなく、このことはペットのＱＯＬを著しく低下させる。
【００２２】
このような問題を解決し、歯を安定して維持するためには、歯周病の予防効果をもつ物質を見出し、実用レベルのものとすることが期待されている。
一方で、歯周病を治療するためには口腔内への治療剤の直接的な投与が不可欠である。このため、骨疾患の治療の場合と同様に、治療効果の高さと安全性の高さとが要求されることになる。
【００２３】
骨疾患の治療では、従来、カルシウム代謝に重要な役割を果たすビタミンＤの誘導体である活性型ビタミンＤ3、カルシトニン及びその誘導体、エストラジオールを初めとするホルモン剤、並びに各種のカルシウム製剤等が臨床的に使用されてきた。
【００２４】
しかし、こうした薬剤は、体内における吸収や代謝の関係から経口投与ができない場合もあり、また、受容体レベルの個人差が大きいために効果の予見性に欠けるといった問題もあった。このため、これらに代わる新たな治療剤が求められていた。
【００２５】
また、従来、和漢の生薬やハーブティーとして使用されてきた植物の葉、全草、根、果実等は、安全性の面では問題はないと考えられる。このため、こうした植物の中から、骨疾患に効果を示す化合物や組成物を見出すことができれば、治療効果と安全性という２つの面のバランスが取れた治療薬等を製造することができると考えられる。
【００２６】
例えば、多くの生薬に含まれているフラボノイドやアルカロイドの中から、こうした活性を有する化合物又は組成物を見出すことができれば、安全性の面における懸念はかなり小さなものとすることができる。また、ハーブティー等として、市場に供給されている植物に含まれるフラボノイドやアルカロイドの場合にも、同じことが言える。
【００２７】
こうしたフラボノイドとしては、例えば、代表的なフラボン類であるアピゲニンを挙げることができる。アルカロイドの中では、インドールアルカロイドがもっとも多くの化合物を含むが、ハルマンアルカロイド等を挙げることができる。こうした化合物には、鎮痙作用、臓器血流増加作用等の他、神経伝達物質の分解を阻止する作用や、鎮静作用等があることが知られている（非特許文献１〜４参照）。
【００２８】
ところで、骨疾患の患者数を減少させる最も有効な手段は、骨疾患の予防である。すなわち、健常人の場合には、骨量又は骨密度の低下を防止すること、ある程度骨量又は骨密度が低下しているが未発症の者（いわゆる、骨疾患患者予備軍）の場合には、骨量又は骨密度の低下を抑え、できる限り骨量又は骨密度を上昇させること、が有効な予防手段となり得る。
【００２９】
具体的には、その者がどの程度疾患の発症に近い段階にあるかによって、予防用医薬製剤を投与する、又は機能性食品等の摂取を行うといった予防策をとることになる。
【００３０】
以上のように、骨疾患においても、上述したようにすでに疾患を発症した患者に対する治療手段ばかりでなく、未発症者又は健常人が発症しないようにするための有効な予防手段に対する社会的な要請がある。
【００３１】
上述した歯周病の治療において、歯周組織の再生を図るために、幾つかの方法が開発されている。その１つは、歯周組織を外科的に切除した後に、吸収性又は非吸収性のメンブレンを用いて歯根膜由来の組織や細胞がセメント質の新生を図り、新しい結合組織性の付着を形成できるようにする、ＧＴＲ法と呼ばれる方法である。ここで使用するメンブレンは、外科的切除後に創面を覆う速度が最も早い歯肉の結合組織が歯根面に到達することを妨げるという役割を有している。
【００３２】
ＧＴＲ法は、深い垂直性骨欠損に対して、非常に有効な治療法であるが、外科的手術後に、疼痛や腫脹、歯肉の退縮が生じることがある。また、組織が再生するための空間を確保する上では非吸収性のメンブレンを使用することが好ましいが、その場合には、再度手術を行ってこのメンブレンを取り出さなければならない（非特許文献５参照）。
【００３３】
また、その他の方法として、歯周組織を外科的に切除した後に、エムドゲイン（登録商標）を創面にエムドゲインを塗布する。エムドゲイン（登録商標）はエナメルマトリックスデリバティブを主成分とする、生物由来の製剤である。エムドゲインによる歯周組織再生のメカニズムは、歯周組織の再生に関与する未分化間葉系細胞が歯根面に誘引され、付着・増殖後、セメント質、歯根膜及び歯槽骨を形成する細胞に分化することによるものとされている（非特許文献６参照）。
【００３４】
エムドゲインを用いた方法は、外科的手術後に、疼痛や腫脹、歯肉の退縮はＧＴＲ法よりも少なく、手術後のプラークコントロールが容易であり、露出膜が少ないという利点を有する。しかし、蕁麻疹や掻痒皮膚反応等の過敏症や、局所の炎症、口角炎等が、術後の併発症として報告されている。
したがって、外科的な手術をできる限り伴わず、また、過敏症等の原因になりにくい材料を用いる治療法の開発に対する、高い社会的要請がある。
［００３５］
非特許文献１：渡辺和夫他、和漢薬学会誌，２，２６８（１９８５）
非特許文献２：Ｄｈａｗｎ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒ．Ｒｅｓ．２００３，ｖｏｌ．１７（４），ｐｐ．４０１−４０３
非特許文献３：Ｄｈａｗｎ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．Ｆｉｔｏｔｅｒａｐｉａ．２００２，ｖｏｌ．７３（５），ｐｐ．３９７−３９９
非特許文献４：Ｗｏｌｆｍａｎ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｅｈａｖ．１９９４，ｖｏｌ．４７（１），ｐｐ １−４
非特許文献５：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｅｉｋａｇａｋｕ．ｃｏ．ｊｐ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｄｅｎｔａｌ／ｏｃａｒｅ／ｅｍｄｏ／ｐｄｆ／０５０７ｎｅｗ．ｐｄｆ
非特許文献６：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｇｏｒｅｔｅｘ．ｃｏ．ｊｐ／ｂｕｓｉｎｅｓｓ／ｍｅｄｉｃａｌ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ
課題を解決するための手段
［００３６］
本発明は、上記のような状況の下で、完成されたものである。すなわち、本発明の発明者らは、薬理効果の高さと安全性とに留意しつつ、古くから生薬又はハーブティー等として使用されてきた植物に含まれる成分を中心として、骨吸収抑制作用、骨形成促進作用及び歯根−歯周組織形成促進作用を有する化合物のスクリーニングを進めた結果、公知の化合物に従来全く知られていなかった活性があることを見出し、本発明を完成したものである。
［００３７］
スクリーニングの結果、破骨細胞の分化抑制、骨芽細胞の分化促進及び歯根−歯周組織形成促進という新たな活性があることが明らかになったのは、生薬由来のβ−カルボリンアルカロイド化合物のうち、下記の一般式で表されるものである。
【００４５】
すなわち、本願発明の第一の態様は、下記式（Ｉ）〜（III）で表されるいずれかの化合物であることが、破骨細胞の分化抑制作用及び骨芽細胞分化促進作用が高いことから、骨疾患の予防及び／又は治療のための骨芽細胞分化促進用としてさらに好ましい。これらは、ハルミン（Harmine）、ハルモール（Harmol）、又はハルマン（Harmane）と呼ばれる化合物である。
【００４６】
【化６】
【００４７】
【化７】
【００４８】
【化８】
【００４９】
また、本発明の第二の態様は、下記式（IV）又は（Ｖ）で表されるものであることが、破骨細胞の分化抑制作用及び骨芽細胞分化促進作用が高いことから、骨疾患の予防及び／又は治療のための骨芽細胞分化促進用としてさらに好ましい。これらは、ハルマリン（Harmaline）、又はハルマロール（Harmalol）と呼ばれる化合物である。
以上のハルマリン、ハルマロール、ハルミン、ハルモール及びハルマンを、以下、「ハルミン等」ということがある。
【００５０】
【化９】
【００５１】
【化１０】
［００５２］
こうした化合物は必要に応じて生理学的に許容される塩、水和物及び配糖体を用いることができるが、特に塩酸塩を使用することが、後述する健康食品、機能性食品又は医薬製剤の調製が容易であることから好ましい。
【００５３】
本発明の第三の態様は、下記の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれる少なくとも１種以上の植物器官から抽出されることを特徴とする、上記式（Ｉ）〜（Ｖ）からなる群から選ばれるいずれかの化合物；これらの生理学的に許容される塩；及びこれらの水和物；からなる群から選ばれる少なくとも１種以上のものを有効成分として含有する、骨疾患の予防及び／又は治療用医薬組成物：
（ａ）トケイソウ科に属する植物の地上部の全草、
（ｂ）ハマビシ科、マツブサ科、及びミカン科に属する植物の果実、
（ｃ）キントラノオ科に属する植物の樹皮、及び、
（ｄ）ヒメハギ科、サトイモ科、及びショウガ科に属する植物の根。
［００５４］
ここで、前記トケイソウ科に属する植物は、南米、東インド、米国東部等に分布する、パッシフローラ・カエルレア（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ ｃａｅｒｕｌｅａ Ｌ．、異名：パッシフローラ・ヴィオラケア（Ｐ．ｖｉｏｌａｃｅａ）、和名：トケイソウ）、パッシフローラ・インカナータ（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ ｉｎｃａｒｎａｔａ、和名：チャボトケイソウ）、パッシフローラ・アラーディーＰ．Ａｌｌａｒｄｉ（Ｐ．ｘ Ａｌｌａｒｄｉ）、パッシフローラ・アンティオクィエンシス（Ｐ．ａｎｔｉｏｑｕｉｅｎｓｉｓ）、パッシフローラ・’コンスタンス・エリオット’（Ｐ．Ｃｏｎｓｔａｎｃｅ Ｅｌｌｉｏｔ’）、パッシフローラ・カポニー・‘ジョン・イネス’（Ｐ．Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ’）、パッシフローラ・エディリス（Ｐ．ｅｄｕｌｉｓ、和名：クダモノトケイソウ）、パッシフローラ・エクソニエンシス（Ｐ．ｅｘｏｎｉｅｎｓｉｓ）、パッシフローラ・マニカタ（Ｐ．ｍａｎｉｃａｔａ）、パッシフローラ・モリッシマ（Ｐ．ｍｏｌｌｉｓｓｉｍａ）、パッシフローラ・クアドラグラリス（Ｐ．ｑｕａｄｒａｇｕｌａｒｉｓ、和名：オオミノトケイソウ）、パッシフローラ・ラケモサ（Ｐ．ｒａｃｅｍｏｓａ）、パッシフローラ・サングイネア（Ｐ．ｓａｎｇｕｉｎｅａ）、及びパッシフローラ・ヴィティフォリア（Ｐ．ｖｉｔｉｆｏｌｉａ）からなる群から選ばれる植物であることが、ハルミン等の含有量が多いことから好ましく、トケイソウ、チャボトケイソウ、及びクダモノトケイソウからなる群から選ばれる植物であることが、流通量が豊富で入手が容易なことからさらに好ましい。
［００５５］
前記ハマビシ科に属する植物は、南アジアから東欧にかけて分布するハマビシ科の多年年草であるハマビシ（Ｔｒｉｂｕｌｕｓ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ Ｌ．）、又は、西アジア、北インド、モンゴルの砂漠等に自生するペガナム・ハルマラ（Ｐｅｇｕｎｕｍ ｈａｒｍａｌａ Ｌ．）（以下、「ハマビシ等」ということがある。）であることが、ハルミン等の含有量が多いことから好ましい。
［００５６］
また、前記マツブサ科に属する植物は、本州の中部以北、北海道、朝鮮半島、中国大陸等に分布するつる性の落葉低木である、チョウセンゴミシ（Ｓｃｈｉｓａｎｄｒａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）であることが好ましい。前記ミカン科に属する植物は、中国の長江流域、華南、陝西等に分布する落葉低木である、ゴシュユ（Ｅｖｏｄｉａ ｒｕｔａｅｃａｒｐａ）であることが好ましい。これらの果実、又は成熟直前の未成熟果実に、ハルミン等が含有されていることによる。
［００５７］
また、前記キントラノオ科の植物は、アマゾンに自生するバニステリオプシス・カアピ（Ｂａｎｉｓｔｅｒｉｏｐｓｉｓ ｃａａｐｉ）又はバニステリオプシス・イネブリアンス（Ｂａｎｉｓｔｅｒｉｏｐｓｉｓ ｉｎｅｂｒｉａｎｓ）であることが、その樹皮中にハルミン等が比較的多く含有されていることによる。
［００５８］
前記ヒメハギ科に属する植物は、朝鮮半島、中国北部及びシベリアに分布する多年草である、イトヒメハギ（Ｐｏｌｙｇａｌａ ｔｅｎｕｉｆｏｌｉａ）であることが、この根に、ハルミン等が比較的多く含有されていることから好ましい。また、前記サトイモ科に属する植物は、日本各地、朝鮮半島、及び中国等に分布する多年草である、カラスビシャク（Ｐｉｎｅｌｌｉａ ｔｅｒｎａｔａ）であることが好ましい。この球茎にハルミン等が比較的多く含有されていることによる。さらに、前記ショウガ科に属する植物は、熱帯アジア原産であり、日本にも古い時代に渡来した多年草である、ショウガ（Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）であることが好ましい。この根茎に、ハルミン等が比較的多く含有されていることによる。
［００５９］
本発明の骨疾患の予防及び／又は治療のための骨芽細胞の分化促進用医薬組成物には、こうした化合物の中でも、上記式（ＩＩＩ）で表されるハルミン（Ｈａｒｍｉｎｅ）、上記式（ＩＶ）で表されるハルモール（Ｈａｒｍｏｌ）、上記式（Ｖ）で表されるハルマン（Ｈａｒｍａｎｅ）、上記式（ＶＩ）で表されるハルマリン（Ｈａｒｍａｒｉｎｅ）、及び上記式（ＶＩＩ）で表されるハルマロール（Ｈａｒｍａｌｏｌ）が含有されていることが、破骨細胞の分化抑制作用及び骨芽細胞の分化促進作用を有することから好ましく、ハルミン又はハルモールが含有されていることが、その作用の強さからさらに好ましい。
［００６０］
また、こうした化合物は必要に応じて生理学的に許容される塩または水和物を使用してもよい。これらの中でも、塩酸塩を使用することが製剤化の面から好ましい。
［００６１］
本発明の第四の態様は、上述した式（Ｉ）〜（ＶＩＩ）で表される化合物、又は上記の通りのこれらの生理学的に許容される塩、若しくは水和物を、有効成分として含有する骨疾患の予防及び／又は治療のための骨芽細胞の分化促進用医薬製剤である。
［００６２］
ここで、前記骨疾患の予防及び／又は治療用医薬製剤中における前記有効成分の含量は、製剤の１用量当たり０．１〜１００ｍｇであることが好ましく、０．１〜５０ｍｇであることがより好ましく、０．３〜１０ｍｇであることが特に好ましい。
［００６３］
また、前記骨疾患の予防及び／又は治療用医薬製剤は、経口投与可能な剤形であることが好ましく、錠剤、散剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、トローチ剤、及び液剤からなる群から選ばれるものであることが好ましい。
［００６４］
ここで、前記骨疾患は、内因性骨疾患、外因性骨疾患、又は栄養障害のいずれに起因するものであってもよく、前記内因性骨疾患の場合には、骨多孔症、骨粗鬆症、高カルシウム血症、高ＰＴＨ血症、骨ページェット病、関節炎、関節リウマチ、乳癌の骨転移、骨軟化症、悪性腫瘍、及び栄養障害からなる群から選ばれる疾患に起因する骨組織の脆弱化に起因するものである場合に、本発明の骨疾患の予防及び／又は治療のための骨芽細胞の分化促進用医薬製剤を好適に使用することができる。また、前記外因性骨疾患の場合には、外傷性骨折又は疲労骨折等の場合に好適に使用することができる。特に、破骨細胞の分化が抑制されるのみならず骨芽細胞の分化が促進されるため、こうした骨疾患の発症を予防し、又は症状を緩和させる上で治療効果が高い。
なお、上述した骨疾患の予防及び／又は治療のための骨芽細胞の分化促進用医薬製剤は、ヒト及び動物の双方を適用の対象とすることができる。
【００６５】
本発明の第五の態様は、上述した各化合物、これらの生理学的に許容される塩、これらの生理学的に許容される水和物、及びこれらの配糖体からなる群から選ばれる１種以上を添加された機能性食品である。本発明の機能性食品は、トケイソウ科植物からの抽出物、ハマビシ科植物からの抽出物及びキントラノオ科に属する植物からの抽出物を含んでいてもよい。ここで、トケイソウ科植物、ハマビシ科植物及びキントラノオ科植物、及びこうした化合物の生理学的に許容される塩及び水和物は、上述したとおりである。
［００６６］
本発明の機能性食品はまた、骨芽細胞の分化促進による骨疾患の予防及び／又は治療を補助するために使用されるものであることが好ましい。ここで、前記化合物、それらの生理学的に許容される塩及び水和物からなる群から選ばれるものの含有量は、１００ｇ当たり０．１〜５ｍｇであることが好ましく、０．１〜３ｍｇであることがより好ましい。これらの含有量を０．３〜１ｍｇとすると、骨芽細胞の分化促進による骨疾患の予防及び／又は治療を補助する効果が最も高くなる。
なお、この機能性食品は、ヒト及び動物の双方を対象とすることができる。
【００６７】
本発明の第六の態様は、上述した各化合物、これらの生理学的に許容される塩、これらの生理学的に許容される水和物、及びこれらの配糖体からなる群から選ばれる１種以上が混合された健康食品である。本発明の健康食品は、トケイソウ科植物からの抽出物、ハマビシ科植物からの抽出物及びキントラノオ科に属する植物からの抽出物を含んでいてもよい。ここで、トケイソウ科植物、ハマビシ科植物及びキントラノオ科植物、及びこうした化合物の生理学的に許容される塩及び水和物は、上述したとおりである。
［００６８］
上記健康食品は、骨疾患の予防及び／又は治療を補助するために使用されるものであることが好ましい。前記化合物、それらの生理学的に許容される塩及び水和物からなる群から選ばれるものの含有量は、１００ｇ当たり０．１〜５ｍｇであることが好ましく、０．１〜３ｍｇであることがより好ましい。これらの含有量を０．３〜１ｍｇとすると、骨疾患の予防及び／又は治療を補助する効果が最も高くなる。
［００６９］
上述した化合物もしくはこれらの生理学的に許容される塩、若しくは水和物、又はトケイソウ科植物からの抽出物もしくはハマビシ科植物からの抽出物を、機能性食品や健康食品とすることにより、日常生活の中において破骨細胞の分化抑制と骨芽細胞の分化促進作用を有する素材を容易に摂取することができることになる。
なお、この健康食品は、ヒト及び動物の双方を対象とすることができる。
［００７０］
本発明の第七の態様は、上記式（Ｉ）の化合物で表される化合物、これらの生理学的に許容される塩、及びこれらの水和物からなる群から選ばれる少なくとも１種以上を有効成分として含有する歯根−歯周組織形成促進剤である。式中のＲ１、Ｒ２、Ｒ’１、Ｒ’2、及びＲ’3は上述したとおりである。ここで、Ｒ1は、水素原子、ＯＨ、ＯＭｅ及びＯＥｔからなる群から選ばれる官能基であり、ＣＯＲ’2は、Ｍｅ又はＥｔであり、ＣＯＯＲ’3は、水素原子、Ｍｅ及びＥｔからなる群から選ばれる官能基である、ことが好ましい。上記式（III）〜（Ｖ）で表される化合物、これらの生理学的に許容される塩、及びこれらの水和物からなる群から選ばれる少なくとも１種以上を有効成分として含有する、歯根−歯周組織形成促進剤であることが、さらに好ましい。
上記歯根−歯周組織形成促進剤もまた、ヒト及び動物の双方を適用の対象とすることができる。
【００７１】
本発明の第八の態様は、上記式（II）で表される化合物、これらの生理学的に許容される塩、及びこれらの水和物からなる群から選ばれる少なくとも１種以上を有効成分として含有する、歯根−歯周組織形成促進剤である。式中、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、及びＲ6は、上述したとおりである。また、Ｒ’1、Ｒ’2及びＲ’3も、上述したとおりである。
【００７２】
ここで、Ｒ1は、水素原子、ＯＨ、ＯＭｅ及びＯＥｔからなる群から選ばれる官能基であり、ＣＯＲ’2は、Ｍｅ又はＥｔであり、ＣＯＯＲ’3は、水素原子、Ｍｅ及びＥｔからなる群から選ばれる官能基である、ことが好ましく、上記式（VI）又は（VII）で表される化合物、これらの生理学的に許容される塩、及びこれらの水和物からなる群から選ばれる少なくとも１種以上のものを有効成分として含有するものであることがさらに好ましい。
上記歯根−歯周組織形成促進剤もまた、ヒト及び動物の双方を適用の対象とすることができる。
【００７３】
本発明の第九の態様は、下記の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選ばれるものの少なくとも１種以上を含む、歯根−歯周組織形成促進剤である。
（ａ）トケイソウ科に属する植物の地上部の全草
（ｂ）ハマビシ科、マツブサ科、及びミカン科に属する植物の果実
（ｃ）キントラノオ科に属する植物の樹皮、及び、
（ｄ）ヒメハギ科、サトイモ科、及びショウガ科に属する植物の根、及び
（ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）から抽出され、上述したいずれかの化合物、これらの生理学的に許容される塩、及びこれらの水和物。
【００７４】
ここで、前記トケイソウ科に属する植物は、トケイソウ(Passiflora caerulea L.)、チャボトケイソウ（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ ｉｎｃａｒｎａｔａ）、及びクダモノトケイソウ（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ ｅｄｕｌｉｓ）からなる群から選ばれるいずれかの植物であることが好ましい。
［００７５］
前記ハマビシ科に属する植物は、ハマビシ（Ｔｒｉｂｕｌｕｓ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ Ｌ．）又はペガナム・ハルマラ（Ｐｅｇｕｎｕｍ ｈａｒｍａｌａ Ｌ．）であることが好ましく、前記マツブサ科に属する植物がチョウセンゴミシ（Ｓｃｈｉｓａｎｄｒａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）であることが好ましく、及び前記ミカン科に属する植物がゴシュユ（Ｅｖｏｄｉａ ｒｕｔａｅｃａｒｐａ）であることが好ましい。
［００７６］
また、前記キントラノオ科に属する植物は、バニステリオプシス・カアピ（Ｂａｎｉｓｔｅｒｉｏｐｓｉｓ ｃａａｐｉ）又はバニステリオプシス・イネブリアンス（Ｂａｎｉｓｔｅｒｉｏｐｓｉｓ ｉｎｅｂｒｉａｎｓ）であることが好ましく、前記ヒメハギ科に属する植物がイトヒメハギ（Ｐｏｌｙｇａｌａ ｔｅｎｕｉｆｏｌｉａ）であり、前記サトイモ科に属する植物がカラスビシャク（Ｐｉｎｅｌｌｉａ ｔｅｒｎａｔａ）であることが好ましく、前記ショウガ科に属する植物がショウガ（Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）であることが好ましい。
上記抽出物を含有する歯根−歯周組織形成促進剤もまた、ヒト及び動物の双方を適用の対象とすることができる。
［００７７］
本発明によれば、優れた破骨細胞の分化抑制作用及び骨芽細胞分化促進作用を有する、ヒト又は動物用の機能性食品、健康食品、骨疾患の予防及び／又は治療のための骨芽細胞の分化促進用医薬組成物、並びに骨疾患の予防及び／又は治療のための骨芽細胞の分化促進用医薬製剤が提供される。
また、本発明によれば、優れた歯根−歯周組織形成促進作用を有する、ヒト又は動物用の歯根−歯周組織形成促進剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
［００７８］
［図１Ａ］図１Ａは、ＲＡＷ２６４細胞を用いた破骨細胞分化に対するハルミンの効果を示す図（全細胞数及びＴＲＡＰ活性の変化）である。
［図１Ｂ］図１Ｂは、ＲＡＷ２６４細胞を用いた破骨細胞分化に対するハルミンの効果を示す図（多核破骨細胞数の変化）である。
［図２Ａ］図２Ａは、マウス骨髄細胞を用いた破骨細胞分化に対するハルミンの効果を示す図（全細胞数及びＴＲＡＰ活性の変化）である。
［図２Ｂ］図２Ｂは、マウス骨髄細胞を用いた破骨細胞分化に対するハルミンの効果を示す図（多核破骨細胞数の変化）である。
［図３Ａ］図３Ａは、マウス骨髄細胞および骨芽細胞株を用いた共存培養による骨吸収収窩（ピット）形成に対するハルミンの効果を示す図（コントロール）である。
［図３Ｂ］図３Ｂは、マウス骨髄細胞および骨芽細胞株を用いた共存培養による骨吸収窩（ピット）形成に対するハルミンの効果を示す図（３μＭ）である。
［図３Ｃ］図３Ｃは、マウス骨髄細胞および骨芽細胞株を用いた共存培養による骨吸収窩（ピット）形成に対するハルミンの効果を示す図（１０μＭ）である。
［図４Ａ］図４Ａは、骨芽細胞分化に対するハルミンの効果を示す図（全細胞数及びＴＲＡＰ活性の変化）である。
［図４Ｂ］図４Ｂは、骨芽細胞分化に対するハルミンの効果を示す図（多核破骨細胞数の変化）である。
［図５］図５は、骨芽細胞によるカルシウムの石灰化に対するハルミンの効果を示す図である。
［図６］図６は、ハルミン含浸アガロースビーズを歯髄に埋入したときの歯根伸長促進、歯周組織の形成促進効果を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
［００７９］
以下に、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明の第一の実施形態に係る骨疾患の予防及び／又は治療のための骨芽細胞の分化促進用医薬組成物は、下記式（Ｉ）で表される化合物、これらの生理学的に許容される塩、及びこれらの水和物からなる群から選ばれる少なくとも１種以上を有効成分として含有するものである。
［００８０］
［化１５］
［００８１］
（式中、Ｒ５は、水素原子、ＯＨ，ＯＲ’１、ＣＯＲ’２、及びＣＯＯＲ’３からなる群から選ばれる官能基を表し、Ｒ６は、炭素数１〜１０の直鎖状、分枝状及び環状のアルキル基からなる群から選ばれる官能基を表す。ここで、Ｒ’１は炭素数１又は２のアルキル基を、Ｒ’２は、水素原子、炭素数１〜１０の直鎖状、分枝状及び環状のアルキル基からなる群から選ばれる官能基をそれぞれ表す。）
【００８２】
ここで、Ｒ5は、水素原子、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、ＣＯＨ、ＣＯＭｅ、ＣＯＥｔ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＭｅ及びＣＯＯＥｔからなる群から選ばれるいずれかの官能基であることが好ましく、水素原子、ＯＨ及びＯＭｅからなる群から選ばれるいずれかの官能基であり、Ｒ6は、メチル基又はエチル基であることが好ましく、メチル基であることが、破骨細胞分化抑制活性及び骨芽細胞分化促進活性が高いことから、さらに好ましい。
【００８３】
上記式（Ｉ）で表される化合物としては、下記式（III）で表されるハルミン、下記式（IV）で表されるハルモール、又は下記式（Ｖ）で表されるハルマンその他のβ−カルボリンアルカロイドを挙げることができ、これらの３つの化合物のいずれかであることが、破骨細胞分化抑制活性及び骨芽細胞分化促進活性の高さの点から、最も好ましい。
【００８４】
【化１６】
【００８５】
【化１７】
【００８６】
【化１８】
【００８７】
また、こうした化合物は必要に応じて生理学的に許容される塩、水和物及び配糖体を用いることができるが、特に塩酸塩を使用すると、より高い破骨細胞分化及び骨吸収の抑制、骨芽細胞分化及び骨形成促進という効果が発揮される。
［００８８］
本発明の第二の実施形態に係る骨疾患の予防及び／又は治療のための骨芽細胞の分化促進用医薬組成物は、下記式（ＩＩ）で表される化合物、これらの生理学的に許容される塩、及びこれらの水和物からなる群から選ばれる少なくとも１種以上を有効成分として含有するものである。
［００８９］
［化１９］
［００９０］
（式中、Ｒ１は、水素原子、ＯＨ、ＯＲ’１、ＣＯＲ’２及びＣＯＯＲ’３からなる群から選ばれる官能基を表し、Ｒ２は、水素原子、ＣＯＲ’２及びＣＯＯＲ’３からなる群から選ばれる官能基を表し、Ｒ３は、水素原子、ＣＯＲ’２及びＣＯＯＲ’３からなる群から選ばれる官能基を表し、Ｒ４は、炭素数１〜１０の直鎖状、分枝状及び環状のアルキル基からなる群から選ばれる官能基を表す。ここで、Ｒ’１は炭素数１又は２のアルキル基を、Ｒ’２は、水素原子、炭素数１〜１０の直鎖状、分枝状及び環状のアルキル基からなる群から選ばれる官能基を、また、Ｒ’３は水素原子、炭素数１〜１０の直鎖状、分枝状及び環状のアルキル基からなる群から選ばれる官能基をそれぞれ表す。）。
［００９１］
ここで、Ｒ１は、水素原子、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、ＣＯＨ、ＣＯＭｅ、ＣＯＥｔ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＭｅ及びＣＯＯＥｔからなる群から選ばれるいずれかの官能基であることが好ましく、水素原子、ＯＨ及びＯＭｅからなる群から選ばれるいずれかの官能基であることが、破骨細胞分化抑制活性及び骨芽細胞分化促進活性の点からさらに好ましい。
［００９２］
また、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ、水素原子、水酸基、及びアルコキシ基からなる群から選ばれるいずれかの官能基であることが好ましく、水素原子であることがさらに好ましい。Ｒ４は、水素原子、ＣＯＭｅ及びＣＯＯＭｅからなる群から選ばれるいずれかの官能基であることが好ましく、水素原子であることが、破骨細胞分化抑制活性及び骨芽細胞分化促進活性の点からさらに好ましい。
［００９３］
上記式（ＩＩ）で表される化合物としては、下記式（ＶＩ）で表されるハルマリン、下記式（ＶＩＩ）で表されるハルマロールその他のβ−カルボリンアルカロイドを挙げることができ、これら２つの化合物のいずれかであることが、破骨細胞分化抑制及び骨芽細胞分化促進活性が高いことから、最も好ましい。
【００９４】
【化２０】
【００９５】
【化２１】
【００９６】
また、生理学的に許容されるこれらの塩、これらの水和物、これらの配糖体は、上述のとおりである。
【００９７】
上述した各種のβ−カルボリンアルカロイド化合物は、単独で本発明の医薬組成物の製造に使用することもでき、必要に応じて２種以上を適宜組み合わせて使用してもよい。また、上述した化合物、これらの生理学的に許容される塩、これらの水和物、及びこれらの配糖体からなる群から選ばれる１種以上を含有する生薬、ハーブティー用の茶葉等を、単独で又は２種以上を適宜組み合わせて使用することもできる。
【００９８】
こうした生薬としては、例えば、世界各地の温帯から熱帯にかけて分布するハマビシ科の１年草ハマビシ（Tribulus terrestris）の果実から得られるシツリシを挙げることができる。また、ハーブティー等に用いられているものとしては、南米、東インド、米国東部等に分布するチャボトケイソウ（P. incanata）、クダモノトケイソウ（P. edulis）の地上部全草、特に、葉、蔓、幹の部分を挙げることができる。また、その他のものとして、アマゾンに自生するキントラノオ科に属するバニステリオプシス・カアピ（B. caapi）、マツブサ科に属するチョウセンゴミシ（Schisandra chinensis）、ミカン科に属するゴシュユ（Evodia rutaecarpa）、ヒメハギ科に属するイトヒメハギ（Polygala tenuifolia）、サトイモ科に属するカラスビシャク（Pinellia ternata）、ショウガ科に属するショウガ（Zingiber officinale）等を挙げることができる。
【００９９】
上述した式（Ｉ）〜（VII）で表される化合物及びそれらの類縁体は、公知の方法又はそれに準ずる方法によって製造し、入手してもよく、市販品を購入して使用してもよい。また、上記のβ−カルボリンアルカロイド化合物、生理学的に許容されるこれらの塩、これらの水和物、及びこれらの配糖体は、上述した植物材料から抽出、単離することによって入手することもできる。例えば、トケイソウ、チャボトケイソウ、クダモノトケイソウ等のトケイソウ科に属する植物材料からハルミンを単離する方法の一例を示す。
【０１００】
トケイソウの地上部を採取し、乾燥する。これを粉砕してエタノール、メタノール、酢酸エチル、その他の親水性の高い有機溶媒や水、またはこれらの混合溶媒を用いて抽出する。抽出は０℃〜１００℃で５分から２４時間行うことが好ましい。得られた抽出液をろ過した後に減圧濃縮により乾固して抽出物を得る。
【０１０１】
このように処理して、トケイソウ、チャボトケイソウ、又はクダモノトケイソウ科に属する植物からの抽出物を得ることができる。
【０１０２】
また、トケイソウに代えて、ハマビシやバニステリオプシス・カアピの樹皮、チョウセンゴミシ（Schisandra chinensis）の果実、ゴシュユ（Evodia rutaecarpa）の未成熟果実、イトヒメハギ（Polygala tenuifolia）の根、カラスビシャク（Pinellia ternata）の球茎、ショウガ（Zingiber officinale）の根茎を用いる場合にも、上述したと同様の手順で抽出することができる。
【０１０３】
以上のようにして抽出された抽出物は、そのまま使用することもできるが、必要に応じてさらに精製してハルミンを単離することもできる。例えば、抽出物をシリカゲルクロマトグラフィーによって分画し、さらに高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって分取してハルミン及びその類縁化合物を得ることができる。
【０１０４】
具体的には、前処理をした試料を、SHISEIDO CAPCELLPAK C18 (200 x 4.6 mm i.d., 粒径５μｍ)を用いて、アイソクラティックな溶離液（メタノール：トリフロロ酢酸：水＝60.0：0.1：39.9）を、流速1.0ｍL/分で分離し、各画分を分取することにより、ハルミン等を得ることができる。
【０１０５】
以上のようにして得られた上記式（Ｉ）〜（III）で表される化合物、又は生理学的に許容される塩、若しくは水和物は、以下のようにして医薬製剤とすることができる。
【０１０６】
ハルミンを単独で医薬製剤とする場合には、上述したように得られた結晶を常法に従って処理し、後述する賦形剤等と混合すればよい。
【０１０７】
また、ハルミンと他のβ−カルボリンアルカロイド、とりわけ、ハルマンアルカロイドとを組み合わせて使用する場合には、ハルミン１に対して他のハルマンアルカロイドを０．１〜１０の割合として適宜混合し、この混合物をハルミン単独の場合と同様にして医薬製剤とすればよい。
【０１０８】
上述した化合物単独、又は二種以上の混合物を有効成分とする医薬製剤としては、注射剤、坐剤、エアゾール剤、経皮吸収剤その他の非経口剤、錠剤、散剤、カプセル剤、丸剤、トローチ剤、液剤その他の経口剤等を挙げることができる。ここで、上記の錠剤には、糖衣錠、コーティング錠、バッカル錠が含まれ、カプセル剤には、硬カプセル剤、軟カプセル剤の双方が含まれる。また、顆粒剤には、コーティングされた顆粒剤も含まれる。また、上記の液剤には、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤等が含まれ、シロップ剤にはドライシロップも含まれる。
なお、上述した各製剤には、徐放化されていないものばかりでなく、徐放化されたものも含まれる。
【０１０９】
こうした製剤は、公知の製剤学的製法に従い、製剤の製造に際して薬理学的に許容され得る日本薬局方に記載の担体、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤等を用いて製造することができる。
【０１１０】
こうした担体や賦形剤としては、例えば、乳糖、ブドウ糖、白糖、マンニトール、馬鈴薯デンプン、トウモロコシデンプン、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、結晶セルロース、カンゾウ末、ゲンチアナ末等を挙げることができる。
【０１１１】
結合剤としては、例えば、デンプン、トラガントゴム、ゼラチン、シロップ、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース等を挙げることができる。
【０１１２】
崩壊剤としては、例えば、デンプン、寒天、ゼラチン末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、アルギン酸ナトリウムなど、滑沢剤としては例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、水素添加植物油、マクロゴール等を使用することができる。
【０１１３】
着色剤、医薬品に添加することが許容されているものであれば使用することができ、特に限定されない。また、これら以外に、矯味剤、矯臭剤等も、必要に応じて適宜使用することができる。
［０１１４］
錠剤又は顆粒剤とする場合には、必要に応じて、白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、精製セラック、ゼラチン、グリセリン、ソルビトール、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、フタル酸セルロースアセテート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルメタクリレート、メタアクリル酸重合体等を用いてコーティングしても良く、複数層でコーティングすることもできる。
［０１１５］
さらに、顆粒剤や粉剤をエチルセルロースやゼラチンのようなカプセルに詰めてカプセル剤とすることもできる。
［０１１６］
上記の化合物、又はそれらの生理学的に許容される塩、若しくは水和物を用いて、注射剤を調製する場合は、必要に応じて、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤などを添加することもできる。
［０１１７］
上述したような骨疾患予防及び／又は治療のための骨芽細胞の分化促進剤を患者に投与する場合には、投与量は、患者の症状の重篤さ、年齢、体重、及び健康状態等の諸条件によって異なる。一般的には、成人１日当たり１ｍｇ／ｋｇ〜２，０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１ｍｇ／ｋｇ〜１，０００ｍｇ／ｋｇ程度を、経口又は非経口的に、１日１回若しくはそれ以上の回数にわたって投与すればよい。上記のような諸条件に応じて、投与の回数及び量を適宜増減すればよい。
［０１１８］
ハルミン単独、またはハルミンと他のハルマンアルカロイド化合物、例えば、ハルモールとを含有する医薬組成物が有効成分として製剤中に含まれる場合には、当該組成物中におけるハルミンの含有量は、０．１〜１００ｍｇであることが好ましく、より好ましくは０．１〜５０ｍｇ、さらに好ましくは０．３〜１０ｍｇである。
［０１１９］
有効成分であるハルミンや他のハルマンアルカロイド化合物の含有量が下限値未満では骨吸形成促進作用が十分に発揮されず、逆に上限値を越えて添加しても、添加量に見合う効果が発揮されない。また、上限値を越えると、投与時に細胞毒性が発揮されることがあり、生体に対して望ましくない副作用を惹起するおそれがあることによる。
［０１２０］
上述した本発明の組成物を必要に応じて適宜添加することにより、骨芽細胞の分化促進による骨疾患の予防及び／又は治療効果を有する機能性食品、若しくは健康食品を提供することができる。
［０１２１］
本明細書において「機能性食品」とは、その食品自体が本来含有している栄養素によって、その食品を摂取した者に供与できる以上の利益を与え得る成分を含有する食品をいう。
［０１２２］
また、本明細書において「健康食品」とは、一般に、健康の保持・増進に資する食品として販売・利用されるものの総称であり、日頃不足しがちな栄養成分の摂取を補助するサプリメントも含む。
［０１２３］
上述した組成物は、例えば、パン、クッキー及びビスケット、米飯添加用麦及び雑穀、うどん、そば、パスタその他の麺類、チーズ、ヨーグルトその他の乳製品、ジャム、マヨネーズ、味噌、醤油その他の大豆製品、茶、コーヒー及びココア、清涼飲料、果実飲料その他の非アルコール性飲料、薬用酒その他のアルコール性飲料、キャンディー（飴）、チョコレートその他のスナック菓子、チューインガム、せんべい、羊羮その他の大豆を原料とする菓子等に添加して、機能性食品とすることができる。
［０１２４］
なお、上記のヨーグルト、醤油、飲料等に添加する場合には、これらの中で本発明の組成物が結晶化して沈殿しないようにするために、溶解助剤や安定化剤を適宜加えることもできる。
［０１２５］
また、本発明の組成物を単独で、又は２種以上を混合し、常法に従って粉剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤とすることにより、健康食品とすることができる。さらに、ペット用の飲料やペットフードにこれらを添加することもできる。
［０１２６］
ここで、本発明の組成物を粉末とするためには、生成過程で得られた抽出物を濃縮し、凍結乾燥、スプレードライ、真空乾燥等の方法を用いて乾燥させ、サンプルミル、ブレンダー、ミキサー等によって乾燥固体を粉砕すればよい。また、必要に応じて、コーンスターチ、馬鈴薯デンプン、デキストリン、シクロデキストリン、牡蠣殻粉末などを添加してもよい。
［０１２７］
また、上記のようにして得た粉末に、適宜、上述した結合剤を加えて打錠し、錠剤とすることもできる。錠剤とした後に、上述した白糖又はゼラチン等のコーティング剤を用いて、糖衣錠としてもよく、他のコーティング剤を用いて腸溶剤等にすることもできる。
【０１２８】
さらに、上述のようにして得た粉末を常法に従って顆粒とし、顆粒剤を製造することもできる。また、上記の粉末や顆粒を上述したカプセルに適当量充填することによって、カプセル剤とすることもできる。
【０１２９】
本発明の第三の実施形態に係る歯根−歯周組織形成促進剤は、下記式（Ｉ）で表される化合物、これらの生理学的に許容される塩、及びこれらの水和物からなる群から選ばれる少なくとも１種以上を有効成分として含有するものである。
【０１３０】
【化２２】
【０１３１】
（式中、Ｒ5は、水素原子、ＯＨ，ＯＲ’1、ＣＯＲ’2、及びＣＯＯＲ’3からなる群から選ばれる官能基を表し、Ｒ6は、炭素数１〜10の直鎖状、分枝状及び環状のアルキル基からなる群から選ばれる官能基を表す。ここで、Ｒ’1は炭素数１又は２のアルキル基を、Ｒ’2は、水素原子、炭素数１〜10の直鎖状、分枝状及び環状のアルキル基からなる群から選ばれる官能基を、Ｒ’3は水素原子、炭素数１〜10の直鎖状、分枝状及び環状のアルキル基からなる群から選ばれる官能基をそれぞれ表す。）
【０１３２】
ここで、Ｒ5は、水素原子、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、ＣＯＨ、ＣＯＭｅ、ＣＯＥｔ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＭｅ及びＣＯＯＥｔからなる群から選ばれるいずれかの官能基であることが好ましく、水素原子、ＯＨ及びＯＭｅからなる群から選ばれるいずれかの官能基であり、Ｒ6は、メチル基又はエチル基であることが好ましく、メチル基であることが、歯根−歯周組織形成促進活性が高いことから、さらに好ましい。
【０１３３】
上記式（Ｉ）で表される化合物としては、下記式（III）で表されるハルミン、下記式（IV）で表されるハルモール、又は下記式（Ｖ）で表されるハルマンその他のβ−カルボリンアルカロイドを挙げることができ、これらの３つの化合物のいずれかであることが、歯根−歯周組織形成促進活性が高いことから、最も好ましい。
【０１３４】
【化２３】
【０１３５】
【化２４】
【０１３６】
【化２５】
【０１３７】
また、こうした化合物は必要に応じて生理学的に許容される塩、水和物及び配糖体を用いることができるが、特に塩酸塩を使用すると、より高い歯根−歯周組織形成促進活性という効果が発揮される。
【０１３８】
本発明の第四の実施形態に係る歯根−歯周組織形成促進剤は、下記式（II）で表される化合物、これらの生理学的に許容される塩、及びこれらの水和物からなる群から選ばれる少なくとも１種以上を有効成分として含有するものである。
【０１３９】
【化２６】
【０１４０】
（式中、Ｒ1は、水素原子、ＯＨ、ＯＲ’1、ＣＯＲ’2及びＣＯＯＲ’3からなる群から選ばれる官能基を表し、Ｒ2は、水素原子、ＣＯＲ’2及びＣＯＯＲ’3からなる群から選ばれる官能基を表し、Ｒ3は、水素原子、ＣＯＲ’2及びＣＯＯＲ’3からなる群から選ばれる官能基を表し、Ｒ4は、炭素数１〜10の直鎖状、分枝状及び環状のアルキル基からなる群から選ばれる官能基を表す。ここで、Ｒ’1は炭素数１又は２のアルキル基を、Ｒ’2は、水素原子、炭素数１〜10の直鎖状、分枝状及び環状のアルキル基からなる群から選ばれる官能基を、また、Ｒ’3は水素原子、炭素数１〜10の直鎖状、分枝状及び環状のアルキル基からなる群から選ばれる官能基をそれぞれ表す。）。
【０１４１】
ここで、Ｒ1は、水素原子、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、ＣＯＨ、ＣＯＭｅ、ＣＯＥｔ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＭｅ及びＣＯＯＥｔからなる群から選ばれるいずれかの官能基であることが好ましく、水素原子、ＯＨ及びＯＭｅからなる群から選ばれるいずれかの官能基であることが、歯根−歯周組織形成促進活性が高いという点からさらに好ましい。
【０１４２】
また、Ｒ2及びＲ3は、それぞれ、水素原子、水酸基、及びアルコキシ基からなる群から選ばれるいずれかの官能基であることが好ましく、水素原子であることがさらに好ましい。Ｒ4は、水素原子、ＣＯＭｅ及びＣＯＯＭｅからなる群から選ばれるいずれかの官能基であることが好ましく、水素原子であると、さらに高い歯根−歯周組織形成促進活性が発揮される。
【０１４３】
上記式（II）で表される化合物としては、下記式（VI）で表されるハルマリン、下記式（VII）で表されるハルマロールその他のβ−カルボリンアルカロイドを挙げることができ、これら２つの化合物のいずれかであることが、歯根−歯周組織形成促進活性が高いことから、最も好ましい。
【０１４４】
【化２７】
【０１４５】
【化２８】
【０１４６】
また、生理学的に許容されるこれらの塩、これらの水和物、これらの配糖体は、上述のとおりである。
【０１４７】
上述した各種のβ−カルボリンアルカロイド化合物は、単独で本発明の医薬製剤の製造に使用することもでき、必要に応じて２種以上を適宜組み合わせて使用してもよい。また、上述した化合物、これらの生理学的に許容される塩、これらの水和物、及びこれらの配糖体からなる群から選ばれる１種以上を含有する生薬、ハーブティー用の茶葉等を、単独で又は２種以上を適宜組み合わせて使用することもできる。
【０１４８】
こうした生薬としては使用できるものとしては、例えば、シツリシ、チャボトケイソウ（P. incanata）、クダモノトケイソウ（P. edulis）の地上部全草、特に、葉、蔓、幹の部分、バニステリオプシス・カアピ（B. caapi）、チョウセンゴミシ（Schisandra chinensis）、ゴシュユ（Evodia rutaecarpa）、イトヒメハギ（Polygala tenuifolia）、カラスビシャク（Pinellia ternata）、ショウガ（Zingiber officinale）等、上述したものを挙げることができる。
【０１４９】
上述した式（Ｉ）〜（VII）で表される化合物及びそれらの類縁体の製造方法等は、上述したとおりである。また、上記のβ−カルボリンアルカロイド化合物、生理学的に許容されるこれらの塩、水和物、及び配糖体も、上述したようにして入手することもできる。
【０１５０】
以上のようにして得られた上記式（Ｉ）〜（III）で表される化合物、又は生理学的に許容される塩、若しくは水和物は、以下のようにして医薬組成物とすることができる。
【０１５１】
ハルミンを単独で医薬製剤とする場合には、上述したように得られた結晶を常法に従って処理し、後述するようにして製造することができる。また、ハルミンと他のβ−カルボリンアルカロイド、とりわけ、ハルマンアルカロイドとを組み合わせて使用する場合には、ハルミン１に対して他のハルマンアルカロイドを０．１〜１０の割合として適宜混合し、この混合物をハルミン単独の場合と同様にして医薬製剤とすればよい。
【０１５２】
上述した化合物若しくは植物からの抽出物を適当量添加することによって、歯根−歯周組織の維持や形成を促進する効果、すなわち、歯周病の予防・治療効果を有する歯磨き粉や練歯磨き、含嗽剤等を製造することができる。
【０１５３】
また、上述した化合物若しくは植物からの抽出物を、上記のようなパン、クッキー、ビスケット等や、茶、コーヒー及びココア、清涼飲料、果実飲料その他の非アルコール性飲料、キャンディー（飴）やチョコレートその他の菓子類、チューインガム等に添加して、歯周病予防効果のある機能性食品とすることができる。
【０１５４】
また、本発明の組成物を単独で、又は２種以上を混合し、常法に従って粉剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤とすることにより、健康食品とすることができる。さらに、これらを添加することによって、歯周病予防効果を有するペット用の飲料やペットフードを調製することができる。ここで、本発明の抽出物や化合物を粉末とする方法は、上述したとおりである。
【０１５５】
ハルミンをゲル状の製剤（アガロースビーズ）を製造する場合を例に取って説明する。
ハルミンを所定の濃度となるように所定の緩衝液を用いて希釈し、ハルミン溶液を調製する。また、アガロースビーズをリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、上記のハルミン溶液を所定の量で加えて、所定の時間、所定の温度でインキュベートし、ハルミンをアガロースビーズに吸収させ、ゲル状の製剤とする。
【０１５６】
ここで、ハルミンの濃度は、１〜３０μＭ程度とすることができる。また、所定の緩衝液としては、ダルベッコ変法リン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ、大日本製薬（株）製）等を、また、アガロースビーズとしては、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌアガロースビーズ（ＢｉｏＲａｄ社製）を使用することができる。さらに、インキュベート時間と温度は、３０〜７５分間、２０〜３７℃の範囲で行うことができる。
【０１５７】
上述したような歯根−歯周組織形成促進剤を、患者又は患畜に投与する場合には、投与量は、彼らの症状の重篤さ、年齢、体重、及び患部の状態等の諸条件によって異なる。一般的には、局所に投与することが好ましい。
【０１５８】
有効成分であるハルミンや他のハルマンアルカロイド化合物の含有量が下限値未満では歯根−歯周組織形成促進作用が十分に発揮されない。逆に上限値を越えて添加しても、添加量に見合う効果が発揮されないばかりでなく、投与時に細胞毒性が発揮されることがあり、生体に対して望ましくない副作用を惹起するおそれがあることによる。
【０１５９】
上述した本発明の組成物を必要に応じて適宜添加することにより、歯根−歯周組織形成促進剤を提供することができる。
【実施例】
【０１６０】
以下に、実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例に何等限定されるものではない。
【０１６１】
（実施例１） RAW264細胞を用いた破骨細胞分化の検討
（１−１）試薬等
ハルミンは、和光純薬工業（株）より購入した。RAW264細胞（マウス単球／マクロファージ系細胞株、cell番号RCB0535、以下、「MφRAW264」ということがある。）は、RIKEN Cell Bankより購入した。また、α−MEMは、INVITROGEN社（カタログ番号11900-024）より購入した。96ウェルマイクロプレート及び100mmφディッシュは、Nunc社（カタログ番号161093、同172958）より購入した。
【０１６２】
ｐ−ニトロフェニルリン酸、ナフトールAS-MXリン酸、ファストレッドバイオレットLB塩はSIGMA社より購入した。酒石酸、クエン酸、酢酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、ホルマリン、及びエタノールは、和光純薬工業（株）より購入した。
MTT（3-(4,5-Dimethyl-2-thizaolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium Bromide）試薬は和光純薬工業（株）より購入した。セルカウンティングキット−８は、同仁化学（株）より購入した。
【０１６３】
（１−２）破骨細胞の初期分化試験
RAW264細胞をα−MEMに縣濁して96ウェルマイクロプレートに３×103cells/wellとなるようにまき、各濃度の試験サンプルと破骨細胞分化誘導因子（RANKL）を50ng/mlとなるように加えて、37℃、５％CO2インキュベータ中にて３日間培養した。培養後、10％ホルマリン溶液で細胞を固定し、100％エタノールにて再固定した。
【０１６４】
ディッシュを乾燥後、破骨細胞のマーカー酵素である酒石酸耐性酸ホスファターゼ（以下、「TRAP」ということがある。）の活性を測定し、TRAP染色を行った。TRAP活性の測定には、3.7mMのp−ニトロフェニルリン酸を基質として含み、10mM酒石酸および50mMクエン酸を含有するpH4.6の緩衝液を使用した。この緩衝液を、上記96ウェルマイクロプレートの各ウェルに100μlずつ入れ、37℃で30分間反応させた後、100μlの0.1Ｎ水酸化ナトリウムを加えて反応を停止させ、その後、プレートリーダーにて405nmの吸光度を測定し、その吸光度をTRAP活性とした。
【０１６５】
TRAP染色には、0.1mg/mlナフトールAS-MXリン酸、0.6mg/mlファストレッドバイオレットLB塩を含み50mM酢酸ナトリウムおよび10mM酒石酸を含有するpH4.5緩衝液を使用した。この緩衝液を上記96ウェルマイクロプレートの各ウェルに50μlずつ入れ、37℃にて、30分から１時間反応させて染色した。
細胞毒性は、上述した条件でRAW264細胞を培養した後、セルカウンティングキット−８又はMTTを用いて、定法に従って測定した。
【０１６６】
細胞内のTRAP活性の測定とTRAP染色とを指標として、ハルミンによる破骨細胞への分化に対する活性の評価を行った。結果を図１A及び１Bに示す。
図1Aより、ハルミンの添加量が約３倍ずつ増加すると、RAW264細胞の全細胞数は低下傾向にあった。一方、TRAP活性は、明確な濃度依存的な低下を示した。
以上より、ハルミンは、RAW264細胞の全細胞数には影響をほとんど与えずに、破骨細胞のマーカー酵素であるTRAPの活性を抑制していることから破骨細胞の初期分化を抑制することが示された。また、図1Bより、ハルミンの添加量の増加につれて、多核破骨細胞の数が減少しており、ハルミンが濃度依存的に破骨細胞の分化を抑制することが示された。
【０１６７】
（実施例２）マウス骨髄細胞を用いた破骨細胞分化の検討
（２−１）試薬等
４週齢の雄ddyマウスは、中部科学資材（株）より購入した。また、26G注射針と2.5ml注射筒とは、テルモより購入した。骨細胞分化誘導因子（RANKL）はPEPRO TECH INC社（カタログ番号310-01）より、また、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF、カタログ番号300-25）は、PEPRO TECH INC社より購入した。他の試薬は、実施例１と同じものを使用した。
【０１６８】
（２−２）破骨細胞分化試験
4週齢雄ddyマウスの大腿骨を採取し、26G注射針と2.5ml注射筒を用いて大腿骨にα−MEMを注入して骨髄細胞を取り出した。骨髄細胞は50ng/mlのM-CSFを含むα−MEMに懸濁し、37℃にて、５％CO2インキュベータ中にて3日間培養した。その後、上記96ウェルマイクロプレートの各ウェルに５×104cells/wellとなるようにまき、さらに各濃度の試験サンプルとRANKL（100ng/ml）及びM-CSF（50ng/ml）を含むα−MEMを用いて、37℃、５％CO2インキュベータ中にて３日間培養した。
【０１６９】
実施例１と同様に細胞を固定してTRAP活性を測定した後にTRAP染色を行った。また、セルカウンティングキット−８を用いて添付のプロトコールにしたがって測定した。
実施例１と同様に細胞内のTRAP活性の測定とTRAP染色とを指標として、ハルミンによる破骨細胞への分化に対する活性の評価を行った。結果を図2A及び2Bに示す。
【０１７０】
図2A及び2Bから明らかなように、ハルミンによる全細胞数の減少よりも、TRAP活性の低下が大きくなっていた。一方、TRAPの活性の抑制と比較すると、多核破骨細胞の数が顕著に減少しており、破骨細胞の初期分化よりも、破骨細胞分化の後期の過程を抑制することが示された。
【０１７１】
（実施例３）マウス骨髄細胞および骨芽細胞株を用いた共存培養による破骨細胞分化
（３−１）材料等
４週齢雄ddyマウス、26G注射針、2.5ml注射筒、α−MEMは、実施例１及び２と同様のものを使用した。また、骨芽細胞株のUAMS-32細胞は、昭和大学歯学部高見正道博士より分与していただいた。ビタミンＤ3およびPGE2は和光純薬工業（株）より購入した。トルイジンブルーは、SIGMA社より購入した。象牙切片は、象牙を約0.7mmの厚さに切断し、この象牙シートから穴あけポンチを用いて直径4mmの切片を作製し、エタノールにて消毒後乾燥して調整した。
【０１７２】
（３−２）共存培養による破骨細胞分化
ddyマウスの大腿骨を採取し、26G注射針と2.5ml注射筒を用いて、大腿骨にα−MEMを注入して骨髄細胞を取り出した。
骨髄細胞を２×105cells/well、UAMS-32細胞を１×104cells/well、となるように96ウェルマイクロプレートの各ウェルにまき、各濃度の試験サンプルとビタミンＤ3（10nM）及びPGE2（１μM）を含むα−MEMで、37℃、５％CO2インキュベータ中にて、５日間培養した。実施例１と同様に細胞を固定してTRAP活性を測定した後に、TRAP染色を行った。
【０１７３】
また、象牙切片上において上記と同じ条件でこれらの細胞を培養した後、象牙切片上の破骨細胞によって溶かされた部分（骨吸収窩、以下、「ピット」ということがある。）がどの程度形成されているかを１％トルイジンブルー染色液で染色した。結果を図3A〜3Cに示す。
【０１７４】
コントロール（図3A参照）では形成された破骨細胞によって溶かされた骨片上の穴（ピット）が青紫色に多数染色されている。一方、ハルミンで処理することによってピットの形成が顕著に抑制されていること、及び、この抑制は濃度依存的なものであった（同3B及び3C参照）。
以上より、ハルミンには、破骨細胞分化を抑制して骨吸収を抑制する作用があることが示された。
【０１７５】
（実施例４）骨芽細胞分化に対するハルミンの効果
（４−１）試薬等
マウス前骨芽細胞株であるMC3T3-E1細胞は、RIKEN Cell Bankより購入した。アスコルビン酸、β−グリセロリン酸、塩化マグネシウムは、SIGMA社より購入した。
【０１７６】
ｐ−ニトロフェニルリン酸、ナフトールAS-MXリン酸、ファストブルーBB塩及びアリザリンレッドＳはSIGMA社より購入した。オステオカルシン量を測定するためのEIAキットは、Biomedical Technologies Inc.より購入した。フォン・コッサ（von Kossa）染色用の硝酸銀及びチオ硫酸ナトリウムは和光純薬工業（株）より購入した。
その他の試薬は、実施例１〜３で使用したものと同じものを使用した。
【０１７７】
（４−２）骨芽細胞分化及び骨芽細胞によるカルシウムの石灰化に対するハルミンの効果
マウス前骨芽細胞株であるMC3T3-E1細胞をα−MEMに縣濁して96ウェルマイクロプレートの各ウェルに、４×103cells/wellとなるようにまき、37℃、５％CO2インキュベータ中にて２日間前培養した。前培養開始３日目に、各濃度の試験サンプルと、50μg/mlアスコルビン酸及び10mMのβ−グリセロリン酸を含むα−MEMに培地を交換して７日間から14日間培養し、３日後に培地交換をした。また、本培養中も、３〜４日ごとに培地を交換した。
【０１７８】
培養終了後、実施例１と同様に、メタノールで細胞を固定してディッシュを乾燥後、骨芽細胞の初期の分化マーカー酵素であるアルカリホスファターゼ（ALP）の活性を測定するとともに、ALP染色を行った。
【０１７９】
ALP活性の測定には、6.7mMのp−ニトロフェニルリン酸を基質として含み、２mMの塩化マグネシウムおよび100mMのトリス−塩酸を含有するpH8.5の緩衝液を使用した。この緩衝液を各ウェルに100μlずつ入れて、37℃にて、30分反応させた後に、100μlの0.1Ｎ水酸化ナトリウムを加えて反応を停止させた。プレートリーダーにて405nmの吸光度を測定し、その吸光度をALP活性とした。
【０１８０】
ALP染色は0.1mg/mlナフトールAS-MXリン酸、0.6mg/mlのファストブルーBB塩を含み２mMの塩化マグネシウム及び100mMのトリス−塩酸を含有するpH8.5の緩衝液を、各ウェルに50μlずつ入れて、室温にて30分から１時間反応させて染色した。
【０１８１】
また、細胞毒性は上記と同じ条件で培養後、セルカウンティングキット−８又はMTTを用いて定法により測定した。培養液中のオステオカルシン濃度は、上記と同じ条件で、14日間培養した後に、培養上清を上記のELISAキットを用いてプロトコールに従って測定した。
骨芽細胞の石灰化は、アリザリンレッドＳ染色およびvon Kossa染色にて確認した。
【０１８２】
骨芽細胞分化に対するハルミンの効果を図4A及び4Bに示す。図4A及び4Bから明らかなように、ハルミンの添加により、濃度依存的に全細胞数は減少する傾向が見られたが、骨芽細胞分化の初期のマーカー酵素であるALPの活性は著しく上昇していた。このため、ハルミンは、骨芽細胞の初期分化を促進することが示された
【０１８３】
また、骨芽細胞によるカルシウムの石灰化に対するハルミンの効果を、図５に示す。図５に示されるように、コントロールではvon Kossa染色及びアリザリンレッドＳ染色のいずれの染色によっても、染色はほとんどされなかった。一方、ハルミンで処理を行うと、いずれの染色法によっても顕著に染色が認められ、ハルミンは骨芽細胞分化を促進してカルシウムの石灰化も亢進させることが示された。また、これらの染色を行ったときの染色の濃さにより、ハルミンによるこのカルシウムの石灰化の亢進は、濃度依存的な傾向があることが示された。
【０１８４】
以上より、ハルミンは破骨細胞分化を抑制することで骨吸収を抑制し、他方、骨芽細胞分化を促進して骨形成を促進すると考えられる。したがって、骨減少性の多くの疾患、例えば、骨粗鬆症、関節リウマチ、歯周病、ページェット病、がんの骨転移等の予防に有用であり、また、これらに対して治療を行う際に、ほとんど副作用がなく、高い治療効果を発揮することが期待できる。
【０１８５】
（骨疾患の予防及び／又は治療用医薬製剤例）
次に、本発明の組成物を含有する製剤例を示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０１８６】
（製剤例１ 錠剤）
【０１８７】
上記の成分をそれぞれ秤量し、均一に混合した後に圧縮打錠して重量300mgの錠剤を製造することができる。
【０１８８】
（製剤例２ 硬カプセル剤）
【０１８９】
上記の成分をそれぞれ秤量し、均一に混合した後、硬カプセルに300mgずつ充填することにより、硬カプセル剤を製造することができる。ここで、組成物１は、ハルミンと乳糖とを１：１で混合したものである。なお、製剤例３〜６で使用する組成物１は上記と同じものである。
【０１９０】
（製剤例３ 軟カプセル剤）
【０１９１】
上記の成分をそれぞれ秤量し、均一に混合した後、軟カプセルに100mgずつ充填することにより、軟カプセル剤を製造することができる。
【０１９２】
（製剤例４ 顆粒剤）
【０１９３】
上記の成分をそれぞれ秤量し、均一に混合した後、常法に従って顆粒剤を製造することができる。
【０１９４】
（製剤例５ シロップ剤）
【０１９５】
上記の成分をそれぞれ秤量し、糖及びサッカリンを注射用蒸留水60ｍLに溶解した後、グリセリン及びエタノールに溶解された組成物２及び調味料の溶液を加える。この混合物に精製水を加えて、最終容量を100ｍLにすることにより、経口投与用のシロップ剤を製造することができる。
【０１９６】
（製剤例６ 顆粒剤）
【０１９７】
上記の成分をそれぞれ秤量し、組成物３を常法によって珪酸カルシウムに吸着させて微粒子とし、散剤を製造することができる。
【０１９８】
（実施例５）歯根−歯周組織形成促進効果の検討
（５−１）試薬等
リン酸緩衝生理食塩水（Phosphate buffered saline, 以下「PBS」ということがある。）、ダルベッコ変法リン酸緩衝生理食塩水（Dulbecco’s physiological saline, 以下「D-PBS」ということがある。）は、大日本製薬（株）より購入した。Affi-Gelアガロースビーズ（アフィゲルヘパリン カタログ番号：15306173）は、BioRad社より購入した。1.5mlエッペンドルフチューブ及びその他の試薬は、実施例１と同じものを使用した。
生後５日齢のC57BL/6マウスは、三協ラボラトリーより購入した。また、ホストマウスとしては、成体マウスの器官において、腎臓及び前眼房は免疫応答の非常に少ない組織であることが知られており、前記移植培養実験においては特にヌードマウスを用いる必要はないため、三協ラボラトリーより購入した生後10〜15週齢のC57BL/6マウス（雌）を２匹一群として使用した。
【０１９９】
（５−２）ハルミン含浸ヘパリン含有吸収性ビーズの調製
ハルミンを含浸させたアガロースビーズを、以下のようにして調製した。ハルミンを10μM（終濃度）の濃度となるように、D-PBSを用いて希釈した。また、上記のアガロースビーズを、PBSを用いて洗浄した。
洗浄後のアガロースビーズ４粒を1.5ml角底エッペンドルフ型チューブに入れ、上記のように調製したハルミン溶液を100μlの量で添加し、室温で45分間、インキュベートすることにより、ハルミンをアガロースビーズに含浸させた。以上のようにして、ハルミン含浸ヘパリン含有吸収性ビーズ（以下、「ハルミン含浸アガロースビーズ」ということがある）を調製した。
また、上記のアガロースビーズ４粒を1.5mlエッペンドルフチューブに入れ、D-PBSを100μlの量で添加してPBS含浸アガロースビーズを調製し、陰性対照に使用した。
【０２００】
（５−２）歯根−歯周組織形成促進効果の確認
（５−２−１）歯髄への埋入
歯根-歯周組織形成直前の、生後５日齢のC57BL/6マウスを、エーテル麻酔後に断頭屠殺した。下顎を摘出後、下顎第１臼歯を歯小嚢ごと摘出した。上記（５−１）で調製したハルミン含浸アガロースビーズを一粒、摘出歯（下顎第１臼歯）の歯髄に埋入した。
また、陰性対照として、上記のように調製したD-PBS含浸アガロースビーズを一粒、摘出歯（下顎第１臼歯）の歯髄に埋入した。
【０２０１】
（５−２−２）移植培養
ハルミン含浸アガロースビーズを埋入した摘出歯、及び、D-PBS含浸アガロースビーズを埋入した摘出歯を、ホストマウスの腎臓皮膜下に移植した。ホストマウスは、12時間点灯、室温25℃の条件下におき、水と飼料は自由に摂取させて３週間飼育した。
上記の摘出歯の移植３週間後、ホストマウスを頸骨脱臼にて屠殺し、腎臓を摘出して、培養後の摘出歯（移植歯）を回収した。回収した培養後の移植歯における歯根-歯周組織形成（伸長）および歯根膜、骨を、実体顕微鏡下にて観察し、マイクロCTにて断層撮影後、３Ｄ構築した。前記移植培養後の移植歯の観察結果を、図６に示す。
【０２０２】
図６の結果から、D-PBSのみを使用した陰性対照群（図６下、「PBS」と表示）では、わずかな歯根の伸長と周囲に骨の形成が観察された。一方、ハルミン含浸アガロースビーズを使用した実験群（図６上、「ハルミン」と表示）では、陰性対照群と比較して、顕著に歯根の伸長が促進された。
【０２０３】
また、ハルミン含浸アガロースビーズが歯髄に埋入され、歯根伸長が促進された全移植歯サンプルでは、形成された歯根の周囲に骨の形成が観察された。このため、これを軟Ｘ線写真撮影し、内部に歯根伸長が確認されたかどうかを検討した。この結果、形成された骨内部の移植歯牙に、歯根の伸長が認められた（図６参照）。
【０２０４】
また、形成された歯根と周囲の骨との間には、歯周靭帯様の構造が観察された。なお、図６中、斜線を付した部分は形成された骨を示す。また、「側面」及び「全体」の３Ｄ構築画像中の斜線が付されていない部分、及び「断面」の白い部分は歯を示す。さらに、「断面」の画像中、白い矢印が示す部分が歯根膜領域を示す。
【０２０５】
これらの結果から、ハルミンを有効成分とする歯根-歯周組織形成促進剤は、優れた歯根形成（伸長）促進作用を有し、かつ、形成された歯根を支持する、歯周靭帯や歯槽骨等の周囲組織の形成促進作用をも有していることが示された。したがって、ハルミンを有効成分として含有する歯根-歯周組織形成促進剤は、歯根の形成促進、及び、歯根を支持する歯周靭帯や歯槽骨等の周囲組織の形成促進を行う上で、非常に有効であることが示された。
【０２０６】
以上より、本発明の歯根-歯周組織形成促進剤は、とくに歯周組織の維持や形成促進が望まれる様々な場面において、広く応用の可能性が期待されるものであり、例えば、以下のような用途において、特に有用であると考えられる。
（１）歯科領域において、歯磨剤や含嗽剤などに添加することにより、歯根-歯周組織の維持や形成を促進することができる。
（２）食品一般として、食品や飲料等に微量添加することにより歯周病予防効果のあるガムや飴作成に応用できる。
（３）ペット関連製品として、食品や飲料等に微量添加することにより歯周病予防効果のあるペットフードや飲料の作成に応用できる。
【産業上の利用可能性】
【０２０７】
本発明によれば、本発明の化合物（Ｉ）〜（VII）、生理学的に許容されるこれらの塩、これらの水和物、これらの配糖体及びこれらを含む抽出物からなる群から選ばれる１種以上を含む医薬組成物、健康食品、機能性食品及び医薬製剤は、医薬及び食品の分野において有用である。
Claims (8)
- 下記式（I）〜（III）で表される化合物、これらの生理学的に許容される塩、及びこれらの水和物からなる群から選ばれる少なくとも１種以上を有効成分として含有する、骨疾患の予防及び／又は治療のための骨芽細胞の分化促進用医薬組成物。
- 下記式（IV）又は（Ｖ）で表される化合物、これらの生理学的に許容される塩、及びこれらの水和物からなる群から選ばれる少なくとも１種以上のものを有効成分として含有する、骨疾患の予防及び／又は治療のための骨芽細胞の分化促進用医薬組成物。
- 下記の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれる少なくとも１種以上の植物器官から抽出されることを特徴とする、上記式（Ｉ）〜（Ｖ）からなる群から選ばれるいずれかの化合物；これらの生理学的に許容される塩；及びこれらの水和物；からなる群から選ばれる少なくとも１種以上のものを有効成分として含有する、骨疾患の予防及び／又は治療のための骨芽細胞分化促進用医薬組成物：
（ａ）トケイソウ科に属する植物の地上部の全草、
（ｂ）ハマビシ科、マツブサ科、及びミカン科に属する植物の果実、
（ｃ）キントラノオ科に属する植物の樹皮、及び、
（ｄ）ヒメハギ科、サトイモ科、及びショウガ科に属する植物の根。 - 前記トケイソウ科に属する植物が、トケイソウ(Passiflora caerulea L.)、チャボトケイソウ(Passiflora incarnata)、及びクダモノトケイソウ(Passiflora edulis)からなる群から選ばれるいずれかの植物であることを特徴とする、請求項３に記載の骨疾患の予防及び／又は治療のための骨芽細胞の分化促進用医薬組成物。
- 前記ハマビシ科に属する植物が、ハマビシ(Tribulus terrestris L.)又はペガナム・ハルマラ（Pegunum harmala L.）であり、前記マツブサ科に属する植物がチョウセンゴミシ（Schisandra chinensis）であり、及び前記ミカン科に属する植物がゴシュユ（Evodia rutaecarpa）であることを特徴とする、請求項３に記載の骨疾患の予防及び／又は治療のための骨芽細胞の分化促進用医薬組成物。
- 前記キントラノオ科に属する植物が、バニステリオプシス・カアピ（Banisteriopsis caapi）又はバニステリオプシス・イネブリアンス（Banisteriopsis inebrians）であることを特徴とする、請求項３に記載の骨疾患の予防及び／又は治療のための骨芽細胞の分化促進用医薬組成物。
- 前記ヒメハギ科に属する植物がイトヒメハギ（Polygala tenuifolia）であり、前記サトイモ科に属する植物がカラスビシャク（Pinellia ternata）であり、前記ショウガ科に属する植物がショウガ（Zingiber officinale）であることを特徴とする、請求項３に記載の骨疾患の予防及び／又は治療のための骨芽細胞の分化促進用医薬組成物。
- 請求項１〜７のいずれかに記載の医薬組成物を有効成分とする骨疾患の予防及び／又は治療のための骨芽細胞の分化促進用医薬製剤。
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