JP5523663B2 - 歯根−歯周組織形成促進用医薬組成物 - Google Patents

Description

本発明は、生薬成分由来のビフェニル化合物のうち、下記式（I）又は（II）で表されるビフェニル化合物、又は生理学的に許容されるこれらの塩若しくは水和物を少なくとも１種以上含有してなるヒト及び動物の歯周病予防又は治療用の医薬組成物、口腔衛生剤、並びに食品組成物に関する。

又は

歯周病は３０歳を超えた日本人の８０％が罹患する国民病ともいえる病気であるが、かなりひどい状態にならないと痛みを感じない。このため、重篤な疾患となりやすい特徴をもつ病気として捉えられる。進行した歯周病においては、咀嚼時に生じる痛みや不快感に起因する摂食障害、悪臭を伴う口臭などが生じる結果、栄養状態の不良やコミュニケーション障害などがもたらされる恐れがある。このような場合、歯科による専門的な治療法が施されるが、症状の進行を食い止めることができず抜歯に至ることが多い。一方で、健康な高齢者では残存歯の数が多いことが知られている。

近年では、ヒトだけではなく、柔らかな食物を与えられて家庭内で飼育されているイヌやネコなどのペットにおいても歯周病が蔓延しつつあり、問題視されている。
歯周病に罹患すると、歯周組織を構成するセメント質、歯根膜及び歯槽骨が破壊される（歯周炎）。このため、ヒトの歯周病の治療は、従来、歯石や壊死セメント質等の炎症を惹起させる原因物質を除去し、組織の治癒を促すという方法で行われてきた。しかし、この方法では既に破壊されてしまった歯周組織の再生は困難であった。

歯周病の治療に際しては、症状の進行を食い止めながら抜歯を回避し、栄養状態を良好に保つこと、及びコミュニケーションを支障なく行うことについては、年齢を問わず強い要請がある。とりわけ、高齢者では自らの歯でしっかりと咀嚼して食事を摂ることが、生活の質（Quality of life, 以下、「ＱＯＬ」ということがある。）の低下を防ぐ上で重要であり、骨疾患の予防にもつながる。さらに、歯周病に罹患した場合、ヒト以外の動物では抜歯する以外に治療方法はなく、こうした治療はペットのＱＯＬを著しく低下させる。

このような問題を解決し、歯を安定して維持するためには、歯周病の予防効果をもつ物質を見出し、実用レベルのものとすることが期待されている。
一方で、歯周病を治療するためには口腔内への治療剤の直接的な投与が不可欠である。このため、治療効果の高さと安全性の高さとが要求されることになる。

歯周病の治療において、歯周組織の再生を図るために、幾つかの方法が開発されている。その１つは、歯周組織を外科的に切除した後に、吸収性又は非吸収性のメンブレンを用いて歯根膜由来の組織や細胞がセメント質の新生を図り、新しい結合組織性の付着を形成できるようにする、ＧＴＲ法と呼ばれる方法である。ここで使用するメンブレンは、外科的切除後に創面を覆う速度が最も早い歯肉の結合組織が歯根面に到達することを妨げるという役割を有している。

ＧＴＲ法は、深い垂直性骨欠損に対して、非常に有効な治療法であるが、外科的手術後に、疼痛や腫脹、歯肉の退縮が生じることがある。また、組織が再生するための空間を確保する上では非吸収性のメンブレンを使用することが好ましいが、その場合には、再度外科手術を行ってこのメンブレンを取り出さなければならい。

また、他の方法として、歯周組織を外科的に切除した後に、エムドゲイン（登録商標）を創面に塗布するものがある。エムドゲイン（登録商標）はエナメルマトリックスデリバティブを主成分とする、生物由来の製剤である。エムドゲインによる歯周組織再生のメカニズムは、歯周組織の再生に関与する未分化間葉系細胞が歯根面に誘引され、付着・増殖後、セメント質、歯根膜及び歯槽骨を形成する細胞に分化することによるものとされている。

エムドゲインを用いた方法は、外科的手術後に、疼痛や腫脹、歯肉の退縮はＧＴＲ法よりも少なく、手術後のプラークコントロールが容易であり、露出膜が少ないという利点を有する。しかし、蕁麻疹や掻痒皮膚反応等の過敏症や、局所の炎症、口角炎等が、術後の併発症として報告されている。
したがって、外科的な手術をできる限り伴わず、また、過敏症等の原因になりにくい材料を用いる治療法の開発に対する、高い社会的要請がある。

本発明は、上記のような状況の下で、完成されたものである。
すなわち、本発明の発明者らは、安全性の高さに留意しつつ、古くから生薬として使用されてきた植物に含まれる成分を中心として、歯根−歯周組織形成促進作用を有する化合物のスクリーニングを進めた結果、公知の生薬由来のビフェニル化合物に、従来、歯根−歯周組織形成促進という全く知られていなかった活性が存在することを見出した。

こうした活性を有することが明らかになった化合物としては、ホノキオール（Honokiol）、マグノロール（Magnolol）等が挙げられる。これらの化合物の生理活性については、ＯＨラジカル活性阻害作用及び脂質過酸化抑制作用があることが知られている（特許文献１参照）。

また、コウボクのエタノール抽出物には、in vitroにおける酸性ホスファターゼ活性抑制作用があること、及びホノキオール又はマグノロール自体にも、酸性ホスファターゼ活性抑制作用があることも知られている（特許文献２参照）。

さらに、ホオノキの樹皮、根皮、幹材及び葉の希エタノールエキス又は熱水抽出エキスには、コラゲナーゼ活性抑制作用があることが知られている（特許文献３参照）。

しかし、上記のようなビフェニル化合物が歯根−歯周組織形成を促進することについては、これまで報告されたものはない。また、これらの化合物は、生薬として長く使用されてきていることから、安全性が高いことも証明されている。

特開平１１−２０９２７６ 特開平１０−３３８６３１ 特開平０５−５１３１６

本発明の発明者らは、以上のような状況の下で見出した、上記のような化合物の歯根−歯周組織形成促進作用を利用して、本発明を完成したものである。

すなわち、本発明は、少なくとも１種以上の、下記式（Ｉ）又は（II）で表される化合物、これらの生理学的に許容される塩、及びこれらの水和物からなる群から選ばれる、歯根−歯周組織形成促進用医薬組成物である。

又は、

さらに、上述した化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩若しくは水和物を２種以上混合して歯根−歯周組織形成促進作用を有する組成物とする場合には、上記式（Ｉ）又は（II）で表される化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩若しくはこれらの水和物を含有するものとすることが好ましい。

また、上述した医薬組成物は、本発明はさらにまた、マグノリア属に属する高木の幹又は枝の樹皮から抽出され、上記式（Ｉ）又は（II）で表される化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩、若しくはこれらの生理学的に許容される水和物のいずれかを含む、歯根−歯周組織形成促進作用を有するものであることが好ましい。

ここで、上記マグノリア属（モクレン科）に属する高木は、Magnolia officinalis（マグノリア・オフィシナリス、和名：カラホウ）, Magnolia officinalis var. biloba（マグノリア・オフィシナリス・バル・ビロバ、和名：凹葉厚朴）, Magnolia hypoleuca（マグノリア・ヒポレウカ、英名：Japanese big-leaf magnolia）, Magnolia macrophylla（マグノリア・マクロフィラ）, Magnolia obovata（マグノリア・オボヴァタ、和名：ホウノキ、英名：Japanese big-leaf magnolia）, Magnolia salicifola（マグノリア・サリキフォリア、英名: Willow-leaved magnolia）, Magnolia stellata（マグノリア・ステラタ、英名: Star magnolia）, Magnolia virginiana（マグノリア・ヴァージニアナ、和名：ヒメタイサンボク、英名；Sweet bay）, Magnolia delavayi（マグノリア・ドラヴェゥーイー）, Magnolia kobus（マグノリア・コブス）, Magnolia sieboldii（マグノリア・シーボルディー、和名：オオバヤマレンゲ）, 及びMagnolia wilsonii（マグノリア・ウィルソニー）からなる群から選ばれるものであることが、上述した化合物が含有されているという点から、好ましい。

また、これらのマグノリア属（モクレン科）に属する高木のうち、Magnolia officinalis, Magnolia officinalis var. biloba（, Magnolia hypoleuca, Magnolia obovata, Magnolia salicifola, Magnolia stellata, Magnolia virginiana）, 及びMagnolia sieboldiiからなる群から選ばれるものであることが、上述した化合物の含有量の面からさらに好ましい。

上述した化合物やこれらの塩若しくは植物からの抽出物を、歯磨き粉や練歯磨き、含嗽剤等に適当量を添加することによって、歯根−歯周組織の維持や形成を促進する効果を有する医薬組成物とすることができる。

本発明はまた、上述した化合物、それらの生理学的に許容される塩及び水和物からなる群から選ばれる、歯根−歯周組織形成促進用医薬製剤である。
上記医薬製剤は、下記式（Ｉ）又は（II）で表される化合物、それらの生理学的に許容される塩及びそれらの水和物からなる群から選ばれるものが、Magnolia officinalis（マグノリア・オフィシナリス）, Magnolia officinalis var. biloba（マグノリア・オフィシナリス・バル・ビロバ）, Magnolia hypoleuca（マグノリア・ヒポレウカ）, Magnolia macrophylla（マグノリア・マクロフィラ）, Magnolia obovata（マグノリア・オボヴァタ）, Magnolia salicifola（マグノリア・サリキフォリア）, Magnolia stellata（マグノリア・ステラタ）, Magnolia virginiana（マグノリア・ヴァージニアナ）, Magnolia delavayi（マグノリア・ドラヴェゥーイー）, Magnolia kobus（マグノリア・コブス）, Magnolia sieboldii（マグノリア・シーボルディー）, 及びMagnolia wilsonii（マグノリア・ウィルソニー）からなる群から選ばれる植物から抽出されたものであることが好ましい。

本願発明の歯根−歯周組織形成促進用医薬製剤はまた、上記式（Ｉ）又は（II）で表される化合物、これらの生理学的に許容される塩、及びこれらの水和物からなる群から選ばれる成分を、成人１日あたり１ｍｇ／ｋｇ〜２，０００ｍｇ／ｋｇの投与量で投与することが好ましい。また、前記投与量が、成人１日当たり１ｍｇ／ｋｇ〜１，０００ｍｇ／ｋｇであることがさらに好ましい。

ここで、前記医薬製剤は、経口投与可能な剤形又は患部に直接投与する剤形であることが、治療効果の面から好ましい。経口投与可能な剤形とする場合には、錠剤、散剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、トローチ剤、及び液剤からなる群から選ばれるものとすることが好ましい。患部に直接投与する剤形とする場合には、マイクロカプセル剤、ゲル剤、及びリポソーム剤とすることが好ましい。外用剤として、軟膏剤、クリーム剤、貼付剤、スプレー剤、注射剤等を挙げることができ、上述したＧＴＲ法で用いるのと同様の膜（シート）状の製剤も挙げることができる。
なお、上述した歯周病の予防及び／又は治療用組成物は、ヒト及び動物の双方を適用の対象とすることができる。

本発明はまた、歯根−歯周組織形成促進作用を有する、下記式（Ｉ）又は（II）で表される化合物、それらの生理学的に許容される塩及び水和物からなる群から選ばれるものを含んでなる、機能性食品である。

機能性食品に添加するものとしては、こうした化合物の生理学的に許容される塩及び水和物からなる群から選ばれるものであることが好ましく、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩及びこれらの一水和物又は二水和物からなる群から選ばれるものであることがさらに好ましい。

本発明はさらにまた、上述したマグノリア属に属する高木の幹又は枝の樹皮から抽出され、上記式（Ｉ）又は（II）で表される化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩、若しくはこれらの生理学的に許容される水和物のいずれかを含む抽出物を含む、機能性食品であることが好ましい。こうした化合物等を含む機能性食品を摂取することによって、歯周病の予防が可能となることによる。ここで、上記マグノリア属（モクレン科）に属する高木は、上述した通りである。

本発明の機能性食品はまた、歯周病の予防及び／又は治療を補助するために使用されるものであることが好ましい。ここで、前記化合物、それらの生理学的に許容される塩及び水和物からなる群から選ばれるものの含有量は、１００ｇ当たり０．１〜５ｍｇであることが好ましく、０．１〜３ｍｇであることがより好ましい。これらの含有量を０．３〜１ｍｇとすると、歯周病の予防及び／又は治療を補助する効果が最も高くなる。

また、上述した化合物若しくは植物からの抽出物を、上記のようなパン、クッキー、ビスケット等や、茶、コーヒー及びココア、清涼飲料、果実飲料その他の非アルコール性飲料、キャンディー（飴）やチョコレートその他の菓子類、チューインガム等に添加して、歯周病予防効果のある機能性食品とすることができる。

また、上述した本発明の組成物を、単独で、又は２種以上を混合し、常法に従って粉剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤とすることにより、歯根−歯周組織形成促進作用を有する健康食品とすることができる。

さらに、これらを添加することによって、歯周病予防効果を有するペット用の飲料やペットフードを調製することができる。ここで、上述した抽出物や化合物を粉末とする方法は、すでに述べた通りである。

上述した各種のビフェニル化合物は、単独で本発明の医薬組成物、医薬製剤、機能性食品又は健康食品の製造に使用してもよく、必要に応じて２種以上を適宜組み合わせて使用してもよい。また、これらの化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩、水和物を含有する生薬を、単独で又は２種以上を適宜組み合わせて、医薬組成物、医薬製剤、機能性食品又は健康食品に使用することもできる。

上述した、式（I）で表されるホノキオール、式（II）で表されるマグノロール等のビフェニルフェニル化合物は、公知の方法又はそれに準ずる方法によって製造し、入手してもよく、市販品を購入して使用してもよい。

また、上記のビフェニル化合物は、植物材料から抽出、単離することによって入手することもできる。こうした植物材料としては、生薬類を挙げることができ、具体的には、中国産又は日本産のMagnolia officinalis, Magnolia officinalis var. biloba, Magnolia hypoleuca, Magnolia obovataから得られる、唐厚朴又は和厚朴等を挙げることができる。植物材料として生薬を用いて、ホノキオールを単離する方法の１例を、以下に示す。

細切したモクレン（Magnoliaceae）科のホオノキ（Magnolia obotava）の幹皮、枝皮に含水メタノール又は含水エタノールを加えて抽出物を得る。得られた抽出物水に溶解したのち、石油エーテル、ベンゼン等の低極性溶媒を用いて脱脂する。ついで、ブタノールで抽出することにより、ブタノール相にホノキオール及びその類縁化合物が抽出される。ここで、ホノキオール及びその類縁化合物には、ホノキオールの生理学的に許容される塩、若しくは水和物が含まれる。

以上のようにして抽出されたホノキオール及びその類縁化合物は、粗精製物のまま使用することもできるが、必要に応じてさらに精製して精製標品を得ることもできる。この精製は常法によって行うことができる。例えば、シリカゲルを固定相とし、クロロホルム／メタノールを移動相とし、移動相中のメタノール含量を順次上げるステップグラジエントカラムクロマトグラフィーによって、ホノキオール及びその類縁化合物をそれぞれ溶出させ、精製し、白色粉末等として得ることができる。

また、上述したように得られたホオノキオールの結晶を常法に従って処理し、後述する賦形剤等と混合し、医薬組成物としてもよい。

上述したマグノロールその他の上記式（Ｉ）又は（II）で表される化合物、又は生理学的に許容される塩、若しくは水和物も、ホオノキオールと同様にして抽出、精製することができる。

以上のようにして得られた化合物、又は生理学的に許容される塩、若しくは水和物は、以下のようにして医薬組成物とすることができる。

これらの医薬組成物を有効成分とする医薬製剤としては、経口剤及び患部に直接投与する剤形のもの等を挙げることができる。経口剤としては、錠剤、散剤、カプセル剤、丸剤、トローチ剤、及び各種の液剤を挙げることができ、上記の錠剤には、糖衣錠、コーティング錠、バッカル錠等が含まれ、カプセル剤には、硬カプセル剤、軟カプセル剤の双方が含まれる。また、顆粒剤には、コーティングされた顆粒剤も含まれる。上記の液剤には、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤等が含まれ、シロップ剤にはドライシロップも含まれる。
また、直接投与する剤形のものとしては、ゲル剤、マイクロカプセル剤、リポソーム剤等を挙げることができる。

なお、上述した各製剤には、徐放化されていないものばかりでなく、徐放化されたものも含まれる。

こうした製剤は、公知の製剤学的製法に従い、製剤の製造に際して薬理学的に許容され得る日本薬局方に記載の担体、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤等を用いて製造することができる。

こうした担体や賦形剤としては、例えば、乳糖、ブドウ糖、白糖、マンニトール、馬鈴薯デンプン、トウモロコシデンプン、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、結晶セルロース、カンゾウ末、ゲンチアナ末等を挙げることができる。

結合剤としては、例えば、デンプン、トラガントゴム、ゼラチン、シロップ、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース等を挙げることができる。

崩壊剤としては、例えば、デンプン、寒天、ゼラチン末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、アルギン酸ナトリウムなど、滑沢剤としては例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、水素添加植物油、マクロゴール等を使用することができる。

着色剤は、医薬品に添加することが許容されているものであれば使用することができ、特に限定されない。また、これら以外に、矯味剤、矯臭剤等も、必要に応じて適宜使用することができる。

ここで、本発明の組成物を粉末とするためには、生成過程で得られた抽出物を濃縮し、凍結乾燥、スプレードライ、真空乾燥等の方法を用いて乾燥させ、サンプルミル、ブレンダー、ミキサー等によって乾燥固体を粉砕すればよい。また、必要に応じて、コーンスターチ、馬鈴薯デンプン、デキストリン、シクロデキストリン、牡蠣殻粉末などを添加してもよい。

また、上記のようにして得た粉末に、適宜、上述した結合剤を加えて打錠し、錠剤とすることもできる。錠剤とした後に、上述した白糖又はゼラチン等のコーティング剤を用いて、糖衣錠としてもよく、他のコーティング剤を用いて腸溶剤等にすることもできる。

さらに、上述のようにして得た粉末を常法に従って顆粒とし、顆粒剤を製造することもできる。また、上記の粉末や顆粒を上述したエチルセルロースやゼラチンのようなカプセルに適当量充填することによって、カプセル剤とすることもできる。

錠剤又は顆粒剤とする場合には、必要に応じて、白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、精製セラック、ゼラチン、グリセリン、ソルビトール、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、フタル酸セルロースアセテート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルメタクリレート、メタアクリル酸重合体等を用いてコーティングしても良く、複数層でコーティングすることもできる。

上記の化合物、又はそれらの生理学的に許容される塩、若しくは水和物を用いて、液剤を調製する場合は、必要に応じて、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤などを添加することもできる。

以下に、ホノキオールを含有するゲル状の製剤（アガロースビーズ）を製造する場合を例に取って説明する。
まず、ホノキオールを所定の濃度となるように所定の緩衝液を用いて希釈し、ホノキオール溶液を調製する。また、アガロースビーズをリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、上記のホノキオール溶液を所定の量で加えて、所定の時間、所定の温度でインキュベートし、ホノキオールをアガロースビーズに吸収させ、ゲル状の製剤とする。

ここで、ホノキオールの濃度は、１〜３０μＭ程度とすることができる。また、所定の緩衝液としては、ダルベッコ変法リン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ、大日本製薬（株）製）等を、また、アガロースビーズとしては、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌアガロースビーズ（ＢｉｏＲａｄ社製）を使用することができる。さらに、インキュベート時間と温度は、３０〜７５分間、２０〜３７℃の範囲で行うことができる。

上述したような歯根−歯周組織形成促進用医薬製剤を、患者又は患畜に投与する場合には、投与量は、彼らの症状の重篤さ、年齢、体重、及び患部の状態等の諸条件によって異なる。

有効成分であるホノキオールや他のビフェニル化合物の含有量が下限値未満では歯根−歯周組織形成促進作用が十分に発揮されない。逆に上限値を越えて添加しても、添加量に見合う効果が発揮されないばかりでなく、投与時に細胞毒性が発揮されることがあり、生体に対して望ましくない副作用を惹起するおそれがあることによる。

上述した本発明の組成物を必要に応じて適宜添加することにより、歯根−歯周組織形成促進用医薬製剤を提供することができる。

上述したような骨疾患予防及び／又は治療剤を患者に投与する場合には、投与量は、患者の症状の重篤さ、年齢、体重、及び健康状態等の諸条件によって異なる。一般的には、成人１日当たり１mg/kg〜2,000mg/kg、好ましくは１mg/kg〜1,000mg/kg程度を、経口又は非経口的に、１日１回若しくはそれ以上の回数にわたって投与すればよい。上記のような諸条件に応じて、投与の回数及び量を適宜増減すればよい。

ホノキオール単独、またはホノキオールと他のビフェニル化合物、例えば、マグノロールとを含有する医薬組成物が有効成分として製剤中に含まれる場合には、当該組成物中におけるホノキオールの含有量は、0.1〜100mgであることが好ましく、より好ましくは0.1〜50mg、さらに好ましくは0.3〜10mgである。

有効成分であるホノキオールや他のビフェニル化合物の含有量が下限値未満では骨吸収抑制作用が十分に発揮されず、逆に上限値を越えて添加しても、添加量に見合う効果が発揮されない。また、上限値を越えると、投与時に細胞毒性が発揮されることがあり、生体に対して望ましくない副作用を惹起するおそれがあることによる。

本発明の組成物は、例えば、パン、クッキー及びビスケット、米飯添加用麦及び雑穀、うどん、そば、パスタその他の麺類、チーズ、ヨーグルトその他の乳製品、ジャム、マヨネーズ、味噌、醤油その他の大豆製品、茶、コーヒー及びココア、清涼飲料、果実飲料その他の非アルコール性飲料、薬用酒その他のアルコール性飲料、キャンディー、チョコレートその他のスナック菓子、チューインガム、せんべい、羊羹その他の大豆を原料とする菓子等に添加して、機能性食品又は健康食品とすることができる。

なお、上記のヨーグルト、醤油、飲料等に添加する場合には、これらの中で本発明の組成物が結晶化して沈殿しないようにするために、溶解助剤や安定化剤を適宜加えることもできる。

本発明によれば、優れた歯根−歯周組織形成促進作用を有する、歯周病の予防及び／又は治療用医薬組成物、医薬製剤、機能性食品及び健康食品が提供される。

以下に、本発明について、実施例を挙げてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（実施例１）歯根−歯周組織形成促進効果の検討
（１−１）試薬等
ダルベッコ変法リン酸緩衝生理食塩水（Dulbecco’ phosphate buffered saline, 以下「D-PBS」ということがある。）は、大日本製薬（株）より購入した。Affi-Gelアガロースビーズ（アフィゲルヘパリン カタログ番号：15306173）は、BioRad社より購入した。生後５日齢のC57BL/6マウスは、三協ラボラトリーより購入した。また、ホストマウスとしては、成体マウスの器官において、腎臓及び前眼房は免疫応答の非常に少ない組織であることが知られており、前記移植培養実験においては特にヌードマウスを用いる必要はないため、三協ラボラトリーより購入した生後10〜15週齢のC57BL/6マウス（雌）を２匹一群として使用した。

（１−２）ホノキオール含浸ヘパリン含有吸収性ビーズの調製
ホノキオールを含浸させたアガロースビーズを、以下のようにして調製した。ホノキオールを10μMの濃度となるように、D-PBSを用いて希釈した。また、上記のアガロースビーズを、D-PBSを用いて洗浄した。
洗浄後のアガロースビーズ4粒を1.5ｍｌチューブに入れ、上記のように調製したホノキオール溶液を100μlの量で添加し、室温で45分間、インキュベートすることにより、ホノキオールをアガロースビーズに含浸させた。以上のようにして、ホノキオール含浸ヘパリン含有吸収性ビーズ（以下、「ホノキオール含浸アガロースビーズ」ということがある）を調製した。
また、上記のアガロースビーズロースビーズ4粒を1.5ｍｌチューブに入れ、D-PBSを100μlの量で添加してD-PBS含浸アガロースビーズを調製し、陰性対照に使用した。

（１−３）歯根−歯周組織形成促進効果の確認
（１−３−１）歯髄への埋入
歯根-歯周組織形成直前の、生後５日齢のC57BL/6マウスを、エーテル麻酔後に断頭屠殺した。下顎を摘出後、下顎第１臼歯を歯小嚢ごと摘出した。上記（５−１）で調製したホノキオール含浸アガロースビーズを一粒、摘出歯（下顎第１臼歯）の歯髄に埋入した。
また、陰性対照として、上記のように調製したD-PBS含浸アガロースビーズを一粒、摘出歯（下顎第１臼歯）の歯髄に埋入した。

（１−３−２）移植培養
ホノキオール含浸アガロースビーズを埋入した摘出歯、及び、D-PBS含浸アガロースビーズを埋入した摘出歯を、ホストマウスの腎臓皮膜下に移植した。ホストマウスは、１２時間点灯、室温２５℃の条件下におき、水と飼料は自由に摂取させて３週間飼育した。
上記の摘出歯の移植３週間後、ホストマウスを頸骨脱臼にて屠殺し、腎臓を摘出して、培養後の摘出歯（移植歯）を回収した。
回収した培養後の移植歯における歯根-歯周組織形成（伸長）および歯根膜、骨を、実体顕微鏡下にて観察し、マイクロCTにて断層撮影後、３Ｄ構築した。
前記移植培養後の移植歯の観察結果を、図１に示す。図1では、形成された歯を白色で、歯根膜を黒色で、骨を斜線で、それぞれ示した。

図１の結果から、D-PBSのみを使用した陰性対照群（図１Ａ及び１Ｂ、「PBS」と表示）では、わずかな歯根の伸長と周囲に骨の形成が観察された。一方、ホノキオール含浸アガロースビーズを使用した実験群（図１Ｃ及び１Ｄ、「ホノキオール」と表示）では、陰性対照群と比較して、顕著に歯根の伸長が促進されていることが示された。

また、ホノキオール含浸アガロースビーズが歯髄に埋入され、歯根伸長が促進された全移植歯サンプルでは、形成された歯根の周囲に骨の形成が観察された。このため、これを軟X線写真撮影し、内部に歯根伸長が確認されたかどうかを検討した。
この結果、形成された骨内部の移植歯牙に、歯根の伸長が認められた（図１Ｄ）。

また、形成された歯根と周囲の骨との間には、歯周靭帯様の構造が観察された。なお、図１中、斜線を付した部分は形成された骨を示す。また、「側面」及び「全体」の３Ｄ構築画像中の斜線が付されていない部分、及び断面」の白い部分は歯を示す。
さらに、図１Ｃに示す「断面」の画像中、黒で示した部分が歯根膜領域を示す。

これらの結果から、ホノキオールを有効成分とする歯根-歯周組織形成促進剤は、優れた歯根形成（伸長）促進作用を有し、かつ、形成された歯根を支持する、歯周靭帯や歯槽骨等の周囲組織の形成促進作用をも有していることが示された。したがって、ホノキオールを有効成分として含有する歯根-歯周組織形成促進剤は、歯根の形成促進、及び、歯根を支持する歯周靭帯や歯槽骨等の周囲組織の形成促進を行う上で、非常に有効であることが示された。

以上より、本発明の歯根-歯周組織形成促進剤は、とくに歯周組織の維持や形成促進が望まれる様々な場面において、広く応用の可能性が期待されるものであり、例えば、以下のような用途において、特に有用であると考えられる。
（１）歯科領域において、歯磨剤や含嗽剤などに添加することにより、歯根-歯周組織の維持や形成を促進することができる。
（２）食品一般として、食品や飲料等に微量添加することにより歯周病予防・改善効果のあるガムや飴作成に応用できる。
（３）ペット関連製品として、食品や飲料等に微量添加することにより歯周病予防・改善効果のあるペットフードや飲料の作成に応用できる。

上記式（Ｉ）で表される化合物を有効成分として含有する医薬組成物、医薬製剤、健康食品、機能性食品等の分野において有用である。

図１Ａは、D-PBSのみを使用した陰性対照群を歯髄に埋入したときの歯根伸長促進、歯周組織の形成促進効果を示す側面図である。 図１Ｂは、D-PBSのみを使用した陰性対照群を歯髄に埋入したときの歯根伸長促進、歯周組織の形成促進効果を示す断面図である。 図１Ｃは、ホノキオール含浸アガロースビーズを歯髄に埋入したときの歯根伸長促進、歯周組織の形成促進効果を示す側面図である。 図１Ｄは、ホノキオール含浸アガロースビーズを歯髄に埋入したときの歯根伸長促進、歯周組織の形成促進効果を示す断面図である。

Claims (7)

1. 少なくとも１種以上の単離又は製造された、下記式（Ｉ）又は（II）で表される化合物、これらの生理学的に許容される塩、及びこれらの水和物からなる群から選ばれるものを有効成分として含む、歯根−歯周組織形成促進用医薬組成物(ただし、Zizyphi fructus抽出物を含有する医薬組成物を除く)。
   又は
   
2. 前記式（Ｉ）又は（II）で表される化合物、これらの生理学的に許容される塩、及びこれらの水和物からなる群から選ばれる成分の含有量が、前記組成物中で０．１〜１００ｍｇであることを特徴とする、請求項１に記載の歯根−歯周組織形成促進用医薬組成物。
3. 前記式（Ｉ）又は（II）で表される化合物、それらの生理学的に許容される塩及びそれらの水和物からなる群から選ばれるものが、Magnolia officinalis（マグノリア・オフィシナリス）, Magnolia officinalis var. biloba（マグノリア・オフィシナリス・バル・ビロバ）, Magnolia hypoleuca（マグノリア・ヒポレウカ）, Magnolia macrophylla（マグノリア・マクロフィラ）, Magnolia obovata（マグノリア・オボヴァタ）, Magnolia salicifola（マグノリア・サリキフォリア）, Magnolia stellata（マグノリア・ステラタ）, Magnolia virginiana（マグノリア・ヴァージニアナ）, Magnolia delavayi（マグノリア・ドラヴェゥーイー）, Magnolia kobus（マグノリア・コブス）, Magnolia sieboldii（マグノリア・シーボルディー）, 及びMagnolia wilsonii（マグノリア・ウィルソニー）からなる群から選ばれる植物から単離された、歯根−歯周組織形成促進作用を有するものであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の歯根−歯周組織形成促進用医薬組成物。
4. 単離又は製造された、下記式（Ｉ）又は（II）で表される化合物、それらの生理学的に許容される塩及びそれらの水和物からなる群から選ばれるいずれかを有効成分として含む、歯根−歯周組織形成促進用医薬製剤(ただし、Zizyphi fructus抽出物を含有する医薬製剤を除く)。
   又は
   
5. 前記式（Ｉ）又は（II）で表される化合物、それらの生理学的に許容される塩及びそれらの水和物からなる群から選ばれるものが、Magnolia officinalis（マグノリア・オフィシナリス）, Magnolia officinalis var. biloba（マグノリア・オフィシナリス・バル・ビロバ）, Magnolia hypoleuca（マグノリア・ヒポレウカ）, Magnolia macrophylla（マグノリア・マクロフィラ）, Magnolia obovata（マグノリア・オボヴァタ）, Magnolia salicifola（マグノリア・サリキフォリア）, Magnolia stellata（マグノリア・ステラタ）, Magnolia virginiana（マグノリア・ヴァージニアナ）, Magnolia delavayi（マグノリア・ドラヴェゥーイー）, Magnolia kobus（マグノリア・コブス）, Magnolia sieboldii（マグノリア・シーボルディー）, 及びMagnolia wilsonii（マグノリア・ウィルソニー）からなる群から選ばれる植物から単離されたものであることを特徴とする、請求項４に記載の歯根−歯周組織形成促進用医薬製剤。
6. 前記式（Ｉ）又は（II）で表される化合物、これらの生理学的に許容される塩、及びこれらの水和物からなる群から選ばれる成分を、成人１日あたり１ｍｇ／ｋｇ〜２，０００ｍｇ／ｋｇの投与量で投与することを特徴とする、請求項４又は５に記載の歯根−歯周組織形成促進用医薬製剤。
7. 前記投与量が、成人１日当たり１ｍｇ／ｋｇ〜１，０００ｍｇ／ｋｇである、請求項６に記載の歯根−歯周組織形成促進用医薬製剤。