CN101461904A - 一种治疗咽喉肿痛大便秘结的中药组合物的检验方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于中药制剂技术领域，特别是涉及一种治疗咽喉肿痛大便秘结的中药组合物的检验方法，以蚕砂、大黄、玄参、皂角子、赤芍、麦冬、连翘、板蓝根、地黄、金银花、白茅根、牡丹皮、青黛、川贝母、薄荷、甘草为制得有效成分的原料药制成的清热解毒，利咽止痛，用于肺胃蕴热所致咽喉肿痛，发热烦躁，大便秘结，小儿急性咽炎，急性扁桃腺炎等疾患的药物及其制备方法，本发明还公开了由蚕砂、大黄等十六味药材分别经提取、混合、制成的凝胶剂的处方、质量标准和质量检验方法，该剂型具有服用方便，携带便利，口感佳，儿童容易接受的优点，克服了丸剂及片剂等儿童服用困难的问题，该方显著优于清降丸。

Description

一种治疗咽喉肿痛大便秘结的中药组合物的检验方法

本申请是：申请日：2007.12.21.申请号：200710151196.4“一种治疗咽喉肿痛大便秘结的中药组合物及其制备方法“专利的分案申请。

技术领域

本发明属于中药制剂技术领域，特别是涉及本发明涉及一种清热解毒，利咽止痛，用于肺胃蕴热所致咽喉肿痛，发热烦躁，大便秘结，小儿急性咽炎，急性扁桃腺炎等疾患的药物及其制备方法，本发明还涉及该清降凝胶的处方、质量标准和质量检验方法。

背景技术

急性咽炎(acute pharyngitis)是咽粘膜，并波及粘膜下及淋巴组织的急性炎症，常继发于急性鼻炎或急性扁桃体之后或为上呼吸道感染之一部分。亦常为全身疾病的局部表现或为急性传染病之前驱症状。常因受凉，过度疲劳，烟酒过度等致全身及局部抵抗力下降，病原微生物乘虚而入而引发本病。营养不良，患慢性心、肾、关节疾病，生活及工作环境不佳，经常接触高温、粉尘、有害刺激气体等皆易罹本病，而且是许多疾病的诱因。患者不分年龄、性别、职业和地区，全年皆可发病，冬春季多发，一个人一年内可有数次发病，并可引起严重并发症。

我国小儿急性咽炎患病率为0.5-2.0％，有报道高达5.2％，并且因空气污染原因，近年来有增加的趋势。严重危害人类身心健康，因此患者来源广泛。病原微生物主要为溶血性链球菌，肺炎双球菌、流行性感冒杆菌及病毒。临床表现起病急、初起时咽部干燥、灼热、继之疼痛，吞咽时加重，并可放射至耳部。有时全身不适、关节酸痛、头痛、食欲不振，并有不同程度的发热。体温可升高至38℃，现代医学主要用抗生素类药物等，对咽喉干、痒、痛等症状起效快，但并不能修复改变咽部粘膜组织，也就是常说的“治标不治本”，当再次受到外界病毒、细菌或化学刺激后，极易再次感染。且抗生素对人体组织细胞破坏性强，同时抗生素还具有很强的抗药性，长期、反复使用会产生无效反应。抗生素虽取得一定疗效，但毒、副作用大。如应用漱口液，含服华素片、安吉含片等，这些药物长期使用会导致口腔内环境紊乱。

清降丸是一种经典中成药，卫生部标准WS₃-B-3679-98记载处方：蚕砂、大黄、青黛、玄参、皂角子、赤芍、板蓝根、麦冬、连翘、牡丹皮、地黄、甘草、白茅根、金银花、薄荷、川贝母

制法：以上十六味，粉碎成细粉，混匀，过筛。每100g粉加练蜜50g～60g并加适量的水制成小蜜丸或大蜜丸即得。

功能与主治：清热解毒，利咽止痛，用于肺胃蕴热所致咽喉肿痛，发热烦躁，大便秘结，小儿急性咽炎，急性扁桃腺炎等疾患的。

另有申请日2003.6.4，专利号ZL03129980.6“清降制剂药物及其制备方法”的专利记载处方：蚕砂20.84g大黄20.84g青黛10.42g玄参20.84g皂角子20.84g赤芍20.84g板蓝根20.84g麦冬20.84g连翘20.84g牡丹皮13.54g地黄20.84g甘草6.88g白毛根20.84g金银花20.84g薄荷脑0.052g川贝母2.60g

功能与主治：清热解毒，利咽止痛，用于肺胃蕴热所致咽喉肿痛，发热烦躁，大便秘结，小儿急性咽炎，急性扁桃腺炎等疾患的清降片剂药物及其制备方法。

清降丸、清降片是一种纯中药制剂，疗效显著，主要功能是清热解毒，利咽止痛，但传统的清降丸、清降片吞服体积大，口感差，吸收不完全，生物利用度不高，特别是不适合于儿童吞服，故研制出高效、低毒、清热解毒、利咽止痛为一体适合于儿童吞服的制剂，具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种组方合理，选药精良，生物利用度高，崩解快，分散好，口感适宜，吸收完全，疗效显著增加的一种用于清热解毒，利咽止痛的清降凝胶及其制备方法及该清降凝胶的质量标准和质量检验方法。

为了实现上述目的，进行了病因病机治法与配伍分析：急性咽炎是由于外邪侵袭，伤及咽部，以致气滞血瘀，经脉痹阻所引起咽部红肿疼痛疾患。以咽痛或吞咽痛，咽部稍红或鲜红、水肿、发热、咽干灼热、恶寒为主要表现。常因受凉，过度疲劳，烟酒过度等致全身及局部抵抗力下降，病原微生物乘虚而入而引发本病，营养不良，患慢性心、肾、关节疾病，生活及工作环境不佳，经常接触高温、粉尘、有害刺激气体等皆易罹本病，而且是许多疾病的诱因。由于邪热壅盛，蒸灼咽喉，故咽喉疼痛较剧，热盛伤津，故口渴多饮，邪犯肺金，肺气宣降失常，而且津液被煎炼成痰，贮于肺窍，则咳嗽，痰粘难出，里热盛于内，并充斥于外，因此发热。胃腑热盛，腑气不通，故大便干，舌质红，舌苔薄黄、脉数有力，皆为实热之象，故立法清热解毒，利咽止痛。旨在直捣病巢，恰中病机，热毒清，咽喉利，疼痛止而病愈。

急性咽炎中医基本病理为由于外邪侵袭，伤及咽部，以致气滞血瘀，经脉痹阻所引起咽部红肿疼痛。本方以蚕砂、大黄、皂角子、白茅根清泻肺胃之火、通腑泻热。蚕砂祛风除湿，和胃化浊；大黄泻热毒，破积滞；皂角子润燥通便，祛风消肿；白茅根清泻肺胃，疗肺热郁窒之咽痛腐烂诸证。连翘、板蓝根、青黛、金银花清热解毒，透肌解表，清热逐风。麦冬、地黄、赤芍、玄参凉血解毒，养阴润肺，益胃生津。薄荷疏风散热，疏散表邪，牡丹皮清热、凉血，行血滞，滞去而郁热自解，故亦退热。川贝母润肺散结，止嗽化痰。甘草和中缓急，散表邪，利咽喉，解毒，润肺，除胃积热，调和诸药。此方清上泄下、解表疏里、而以通腑泻热为主，使热毒得以清解，邪有出路，因而咽喉通利。诸药合用，共奏清热解毒，利咽止痛之功效，适用于以肺胃实热所引起的小儿急性咽炎。因此在原清降丸，国家药品标准收载的药物，收载号为：WS₃-B-3680-98的基础上筛选合适的用量配比改变剂型，改变工艺，制定标准，进行了急性毒性研究、长期毒性试验、主要药效学试验，最终本发明提供以下技术方案一种治疗咽喉肿痛大便秘结的中药组合物，其特征在于制得有效成分的原料药组成为：

蚕砂400   大黄400       玄参400    皂角子400   赤芍400  麦冬400

连翘400   板蓝根400     地黄400   金银花400   白茅根400

牡丹皮260 青黛200       川贝母200 薄荷200     甘草132；

其制备方法是：

以上十六味，大黄粉制成最粗粉与青黛、玄参、川贝母混合，加8倍量80％乙醇提取两次，每次1.5小时，合并醇提液，回收乙醇浓缩成膏，相对密度1.30～11.35，60℃；

牡丹皮制成最粗粉，与蚕砂、皂角子、赤芍、麦冬、连翘、金银花、板兰根、地黄、白茅根、薄荷、甘草混合，加10倍量水煎煮两次，每次1.5小时，收集挥发油，水提液分次滤过，合并滤液，浓缩至相对密度1.05～11.08，60℃；，放至室温，加乙醇使含醇量为70％，静置过夜，滤过，滤液回收乙醇，浓缩至相对密度1.25～11.35，60℃，的稠膏，依中国药典2000年版一部附录制剂通则制成制成素片或糖衣片或薄膜包衣片。

所述的治疗咽喉肿痛大便秘结的中药组合物，其特征在于所述的中药组合物是清降凝胶，它是由下述工艺步骤制备而成的：

1)处方：牡丹皮、蚕砂、皂角子、赤芍、麦冬、连翘、金银花、板兰根、地黄、白茅根、薄荷、甘草的水提物                  0.703kg

大黄、青黛、玄参、川贝母的醇提物                  0.37kg

连翘、牡丹皮、薄荷、金银花的提取挥发油            5.5ml

卡拉胶                                            0.3774kg

魔芋粉                                            0.3774kg

氯化钾                                            0.0943kg

蔗糖                                              3.774kg

柠檬酸                                            0.0566kg

甜蜜素                                            0.1132kg

防腐剂                                            0.0321kg

水                                                58.3kg

2)制备方法：按照权利要求1所述的制得有效成分的原料药组成投料：

大黄粉制成最粗粉与青黛、玄参、川贝母混合，加8倍量80％乙醇提取两次，每次1.5小时，合并醇提液，回收乙醇浓缩成膏，相对密度1.30～11.35，60℃；

牡丹皮制成最粗粉，与蚕砂、皂角子、赤芍、麦冬、连翘、金银花、板兰根、地黄、白茅根、薄荷、甘草混合，加10倍量水煎煮两次，每次1.5小时，收集挥发油，水提液分次滤过，合并滤液，浓缩至相对密度1.05～11.08，60℃；放至室温，加乙醇使含醇量为70％，静置过夜，滤过，滤液回收乙醇，浓缩至相对密度1.25～11.35，，60℃的稠膏，

将水提稠膏、醇提稠膏、柠檬酸、氯化钾、白砂糖、甜蜜素、防腐剂混合，加水搅拌溶解；与卡拉胶、魔芋粉水溶液混匀，在70℃水浴中加热溶解，加入挥发油、香精，加水至64.2Kg，混匀，分装，密封，巴氏灭菌后，即得。

所述的治疗咽喉肿痛大便秘结的中药组合物的制备方法制得的清降凝胶，其特征在于每杯含大黄素(C₁₅H₁₀O₅)、大黄酚(C₁₅H₁₀O₄)的总量不得少于0.50mg的定量指标。

所述的治疗咽喉肿痛大便秘结的中药组合物的制备方法制得的清降凝胶，其特征在于质量标准中设置了芍药、玄参、金银花、青黛、和大黄中大黄素、大黄酚含量测定的鉴别检验项目：

(1)其中所设置的芍药的鉴别检验方法是：取本品1杯，切成小块，置圆底烧瓶中，加100ml甲醇，水浴回流30min，滤过，水浴蒸干，残渣加水40ml使溶解，滤过，通过AB-8大孔树脂柱，内径10～112mm，长100mm，先以水100ml洗脱，弃去水洗液，再用30％乙醇溶液100ml洗脱，继用70％乙醇溶液80ml洗脱；30％乙醇洗脱液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取芍药苷对照品，加甲醇使溶解，制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2005年版一部附录VIB薄层色谱法试验，分别吸取上述两种溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇：甲酸＝45：5：10：0.2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与芍药苷对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

(2)其中所设置的玄参的鉴别检验方法是：取鉴别(1)的用70％乙醇洗脱液，水浴蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取玄参对照药材粉末2g，加甲醇10ml，浸泡1小时，超声处理15分钟，滤过，滤液作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VIB)试验，分别吸取上述两种溶液3μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇：冰醋酸：水＝7：1：2为展开剂，薄层板用展开剂预饱和15分钟，展开，取出，晾干，喷以香草醛硫酸试液，热风吹至斑点清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

(3)其中所设置的金银花的鉴别检验方法是：取鉴别(1)的供试品溶液，为供试品溶液；另取氯原酸对照品，加甲醇溶解，制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2005年版一部附录VIB薄层色谱法试验，分别吸取上述两种溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸丁酯：甲酸：水＝7：2.5：2.5为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

(4)其中所设置的青黛的鉴别检验方法是：取本品一杯，剪碎，置圆底烧瓶中，加入三氯甲烷20ml，水浴回流10分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；另取靛玉红对照品，加入三氯甲烷，制成每1ml各含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5~10ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯：三氯甲烷：丙酮＝5：4：1为展开剂，展开，取出，晾干；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的红色的斑点；

(5)其中所设置的大黄中的大黄素、大黄酚含量测定的方法是：照中国药典2005年版一部，附录VID高效液相色谱法测定，

色谱条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇：0.1％磷酸溶液＝85：15为流动相；流速1.0ml/min；检测波长254nm；柱温为室温；理论板数按大黄素峰计算应不低于2000；

对照品溶液的制备分别精密称取大黄素、大黄酚对照品适量，制成每1ml含6μg、10μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备取本品一杯，精密称定，切碎，置索氏提取器中，加甲醇加热回流3小时，放冷，转移至100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取25ml，置烧瓶中，挥去溶剂加8％盐酸溶液10ml，超声处理2分钟，再加三氯甲烷10ml，加热回流1小时，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10ml，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

进行了清降凝胶的药效学试验：依据清降凝胶的功能主治，主要药效学从祛风解毒、抗炎、解热、镇痛作用四方面进行了研究。

1.祛风解毒作用

1.1.体外抗病毒试验表明，清降凝胶在体外病毒攻击量为46.8TCID₅₀(即10^-3.6倍)时，清降凝胶对流感病毒FM1有明显的抑制作用。

1.2.抑菌试验显示，清降凝胶可明显降低小鼠致死量金黄色葡萄球菌感染的死亡率。对照组受试小鼠经腹腔注射浓度为15×10⁸金黄色葡萄球菌溶液0.5ml/只，48小时内动物全部死亡。清降凝胶受试组小鼠腹腔注射同剂量金黄色葡萄球菌溶液48小时内动物死亡数明显低于对照组。

2.抗炎作用

2.1. 3.2、1.6g/kg清降凝胶对二甲苯所致小鼠耳肿胀有明显的抑制作用。

2.2. 2.2g/kg清降凝胶可有效地抑制大鼠角叉菜胶性足肿胀，作用时间可持续4小时；1.1g/kg清降凝胶对角叉菜胶所致大鼠足肿胀也有明显的抑制作用，作用时间可持续3小时；0.55g/kg清降凝胶对角叉菜胶所致大鼠足肿胀也有一定的抑制作用，但只1小时有效。

2.3. 2.2g/kg清降凝胶既可降低炎性渗出液的体积又可减少白细胞数；1.1g/kg清降凝胶可降低炎性渗出液的体积，但统计学意义不明显，却可明显减少白细胞数。

3.解热作用：2.2. 1.1g/kg清降凝胶粉末对干酵母所致大鼠发热均有明显的解热作用。

4.镇痛作用

4.1. 3.2、1.6g/kg清降凝胶可显著延长小鼠1min内首次舔后足的时间，即对热板所致小鼠疼痛有明显的抑制作用。

4.2.3.2、1.6g/kg清降凝胶可减少醋酸所致小鼠扭体反应的扭体次数。

实验结果显示：采用小鼠的试验有效剂量为1.6g/kg，相当于临床用量的12.5倍，(儿童人均体重25kg计算，1.5993g干膏与辅料/杯，2次/日，1杯/次)；采用大鼠的试验有效剂量为1.1g/kg，相当于临床用量的8.6倍，(儿童人均体重25kg计算，1.5993g干膏与辅料/杯，2次/日，1杯/次)。

清降凝胶具有一定的抗病毒、抗菌作用；清降凝胶可有效的抑制白细胞游走和肿胀，并具有抗渗出作用，表明其对急性炎症有显著的抑制作用；清降凝胶对干酵母所致大鼠发热有明显的解热作用，其镇痛作用也较明显。本药效学试验结果表明了本品具有清热解毒、利咽止痛作用，对小儿急性咽炎、急性扁桃体炎有一定的疗效。

清降凝胶的急性毒性试验：试验目的：观察一日内间隔一定时间多次给予空腹小鼠本品所产生的急性毒性反应，并测得其最大给药量。

以最大给药浓度(0.45g/ml、45％)、最大给药剂量40ml/kg，一日内以18.18g/kg间隔5h灌胃给予空腹小鼠清降凝胶粉末3次，观察14天，记录小鼠死亡及体表情况，给药后小鼠表现一切正常，无一死亡。清降凝胶最大给药剂量约为54.54g/kg，相当于临床儿童每日用量的426倍(儿童均体重按25kg计算)表明本品毒性低，临床用药安全。

清降凝胶的长期毒性试验：试验目的观察连续反复多次灌胃给予大鼠清降凝胶后可能产生的毒性反应及其恢复和发展情况，为临床上人用安全剂量提供参考佐证。

按20ml/kg每天2次灌胃给予大鼠5、3、1.5g/kg.次(10、6、3g/kg.日)清降凝胶1个月，观察大鼠外观行为、摄食、饮水状况、体重增长、血、肝、肾、凝血功能及多种脏器组织病理学。经与对照组比较，结果其一般表现、血、肝、肾、凝血功能均无差异。主要脏器肉眼未见异常，病理形态学检查未见明显、有规律的与药物相关病变。恢复期观察与之相同各项指标，与对照组比较也均无差异。结论：大鼠10g/kg/日清降凝胶相当于儿童每日用量大约78.16倍(按人均儿童体重25公斤计算)。大鼠长期给予清降凝胶无明显毒性及毒副作用产生。

我们研制出清降凝胶剂经过药效学试验、急性毒性试验、长期毒性试验，结果表明了本品具有清热解毒、利咽止痛作用，对小儿急性咽炎、急性扁桃体炎有一定的疗效。同时该剂型具有服用方便，携带便利，口感佳，儿童容易接受的优点，克服了丸剂及片剂等儿童服用困难的问题，该方显著优于清降丸。

本发明的技术关键在于上述16味中药的合理配比，及其传统的和高新的制备方法的结合，在制备过程中所采用的提取手段，使药物颗粒极度细化，形成颗粒体积较丸剂缩小数倍，便于吞服，依从性好，有利于人体对药物的吸收，进而提高生物利用度。

具体实施方式

实施例1：治疗咽喉肿痛大便秘结的中药组合物制备清降凝胶：

1)制剂处方：

2)制备方法：按照权利要求1所述的制得有效成分的原料药组成投料：

大黄粉制成最粗粉与青黛、玄参、川贝母混合，加8倍量80％乙醇提取两次，每次1.5小时，合并醇提液，回收乙醇浓缩成膏，相对密度1.30～1.35，60℃；

牡丹皮制成最粗粉，与蚕砂、皂角子、赤芍、麦冬、连翘、金银花、板兰根、地黄、白茅根、薄荷、甘草混合，加10倍量水煎煮两次，每次1.5小时，收集挥发油，水提液分次滤过，合并滤液，浓缩至相对密度1.05～1.08，60℃；放至室温，加乙醇使含醇量为70％，静置过夜，滤过，滤液回收乙醇，浓缩至相对密度1.25～1.35，60℃，的稠膏，

将水提稠膏、醇提稠膏、柠檬酸、氯化钾、白砂糖、甜蜜素、防腐剂混合，加水搅拌溶解；与卡拉胶、魔芋粉水溶液混匀，在70℃水浴中加热溶解，加入挥发油、香精，加水至64.2Kg，混匀，分装，密封，巴氏灭菌后，即得清降凝胶，清降凝胶17g/杯，1.4287g生药/杯，临床3岁以下每次半杯，3～7岁每次1杯，7～12岁每次1.5杯，均为一日两次，疗程为二周。

实施例2：清降凝胶质量标准

[处方]蚕砂400 大黄400 玄参400 皂角子400 赤芍400麦冬400 连翘400 板兰根400 地黄400 金银花400 白茅根400 牡丹皮260 青黛200 川贝母200 薄荷200 甘草132

[制法]以上十六味，大黄粉成最粗粉与青黛、玄参、川贝母混合，加8倍量80％乙醇提取两次，每次1.5小时，合并醇提液，回收乙醇浓缩成膏(相对密度1.30～1.35，60℃)。牡丹皮粉成最粗粉，与蚕砂、皂角子、赤芍、麦冬、连翘、金银花、板兰根、地黄、白茅根、薄荷、甘草混合，加10倍量水煎煮两次，每次1.5小时，收集挥发油，水提液分次滤过，合并滤液，浓缩至相对密度1.05～11.08(60℃)，放至室温，加乙醇使含醇量为70％，静置过夜，滤过，滤液回收乙醇，浓缩至相对密度1.25～11.35(60℃)的稠膏，与醇提稠膏、柠檬酸、氯化钾、白砂糖、甜蜜素混合，加水搅拌溶解；与卡拉胶、魔芋粉水溶液混匀，在70℃水浴中加热溶解，加入挥发油、香精，加水至64.2Kg，混匀，分装，密封，即得。

[性状]本品为棕色至棕褐色的半透明软固体状凝胶，气微香，味甜。

[鉴别](1)取本品1杯，切成小块，置圆底烧瓶中，加100ml甲醇，水浴回流30min，滤过，水浴蒸干，残渣加水40ml使溶解，滤过，通过AB-8大孔树脂柱(内径10～112mm，长100mm)，先以水100ml洗脱，弃去水洗液，再用30％乙醇溶液100ml洗脱，继用70％乙醇溶液80ml洗脱。30％乙醇洗脱液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取芍药苷对照品，加甲醇使溶解，制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VIB)试验，分别吸取上述两种溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇：甲酸(45：5：10：0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与芍药苷对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

(2)取鉴别(1)的用70％乙醇洗脱液，水浴蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取玄参对照药材粉末2g，加甲醇10ml，浸泡1小时，超声处理15分钟，滤过，滤液作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VIB)试验，分别吸取上述两种溶液3μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水(7：1：2)为展开剂，薄层板用展开剂预饱和15分钟，展开，取出，晾干，喷以香草醛硫酸试液，热风吹至斑点清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

(3)取鉴别(1)的供试品溶液，为供试品溶液。另取氯原酸对照品，加甲醇溶解，制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VIB)试验，分别吸取上述两种溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸丁酯-甲酸-水(7：2.5：2.5)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

(4)取本品一杯，剪碎，置圆底烧瓶中，加入三氯甲烷20ml，水浴回流10分钟，滤过，滤液作为供试品溶液。另取靛玉红对照品，加入三氯甲烷，制成每1ml各含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5～10ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-三氯甲烷-丙酮(5：4：1)为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的红色的斑点。

[检查]pH值取本品二杯，置带塞锥形瓶中，水浴加热使溶解，70℃水浴保温下，照pH值测定法(中国药典2005年版一部附录VII G)测定，本品pH应为5～7。

本品的微生物限度检查照微生物限度检查法(中国药典2005年版一部附录XIIIC)检查，应符合规定。细菌计数采用常规法；霉菌及酵母菌计数采用常规法；控制菌检查采用常规方法。

供试品溶液制备：取本品10g，置锥形瓶中，加入45℃pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液100ml，在45℃水浴中振摇使溶解，即为1：10的供试液。

培养基稀释法：取1：10的供试液1ml，分别置5个平皿中(0.2ml/皿)

本品应符合凝胶剂项下各有关其他规定(中国药典2005年版一部，附录IC)。

[含量测定]照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部，附录VI D)测定。

色谱条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.1％磷酸溶液(85：15)为流动相；流速1.0ml/min；检测波长254nm；柱温为室温。理论板数按大黄素峰计算应不低于2000。

对照品溶液的制备分别精密称取大黄素、大黄酚对照品适量，制成每1ml含6μg、10μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备取本品一杯，精密称定，切碎，置索氏提取器中，加甲醇加热回流3小时，放冷，转移至100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取25ml，置烧瓶中，挥去溶剂加8％盐酸溶液10ml，超声处理2分钟，再加三氯甲烷10ml，加热回流1小时，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10ml，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品每杯含大黄素(C₁₅H₁₀O₅)、大黄酚(C₁₅H₁₀O₄)的总量不得少于0.50mg。

[功能与主治]清热解毒，利咽止痛。用于肺胃蕴热证所致咽喉肿痛，发热烦燥，大便秘结。小儿急性咽炎、急性扁桃腺炎见以上证候者。

[用法与用量]口服，3岁以下小儿，3岁以下小儿每次口服0.5杯，3岁～7岁小儿每次口服1杯，7岁～12岁每次口服1.5杯，一日2次。

[规格]每杯内容物17g。

[贮藏]密封，置阴凉处。

实施例3：清降凝胶的质量标准草案起草说明

本品是由蚕沙、大黄等十六味药材分别经提取、混合、制成的凝胶剂。现将清降凝胶质量标准草案中有关问题说明如下：

本标准[性状]项下凝胶凝胶呈凝胶状，脱离包装容器后，能基本保持原有的形态，组织柔软适中，富有弹性，细腻、均匀，无明显絮状物。

本标准[鉴别]项下

(1)系方中赤芍的薄层鉴别试验，以芍药苷为对照品，按处方比例制成缺赤芍的阴性样品，按供试品溶液制备方法操作，制得阴性对照液。供试品制备方法采用甲醇直接提取，干扰很大，未见芍药苷斑点，采用大孔吸附树脂处理则达到了预期效果。且30％提取液同时可作为金银花鉴别的供试品；70％洗脱液可作为玄参鉴别的供试品。按正文操作，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的蓝紫色斑点，阴性对照品虽亦有一斑点，但为黄色斑点，本鉴别呈阳性鉴别反应。

(2)系方中玄参的薄层鉴别试验，以玄参对照药材为对照品，按处方比例制成缺玄参的阴性样品，按供试品溶液制备方法操作，制得阴性对照液。按正文操作，玄参对照药材有两个红色主斑点，供试品色谱中，在与玄参对照药材色谱第一个主斑点相应的位置上显相同颜色的红色斑点，阴性对照品无对应斑点，本鉴别呈阳性鉴别反应。

(3)系方中金银花的薄层鉴别试验，以氯原酸为对照品，按处方比例制成缺金银花的阴性样品，按供试品溶液制备方法操作，制得阴性对照液。按正文操作，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点，阴性对照品无对应斑点，本鉴别呈阳性鉴别反应。见照片3。

(4)系方中青黛的薄层鉴别试验，以靛玉红为对照品。青黛中含有靛玉红、靛蓝，80％乙醇提取物中靛蓝是有的，靛蓝与靛玉红比较，量较低，且靛蓝不稳定，故选择靛玉红作为对照品。按处方比例制成缺青黛的阴性样品，按供试品溶液制备方法操作，制得阴性对照液。按正文操作，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点，阴性对照品无对应斑点。如果薄层色谱展开不理想，黄色斑点会干扰判定，虽经改变展开系统，效果不理想。放置半小时后，靛玉红的紫红色斑点会更加清晰。[检查]1、pH取本品二杯，置带塞锥形瓶中，水浴加热使溶解，70℃水浴保温下，照pH值测定法(中国药典2005年版一部附录VIIG)测定，测定三批样品的pH，结果见表1。

表1 PH测定结果

 

批号	060401	060402	060403
				pH	6.3	6.2	6.2

根据三批样品pH测定结果，规定本品本品pH应为5～7。

2、装量差异：照凝胶剂项下(中国药典2005年版一部，附录IQ)规定，按照中国药典2005年版一部，附录XIIC最低装量检查法测定三批样品的装量。本品每杯标示量17g，平均装量不少于标示装量，每个容器装量不少于标示装量的93％。结果见表2。

表2 装量差异检查

 

批号	060401	060402	060403
				1	17.0567	16.8879	16.7867
2	17.3524	16.6787	17.1545
				3	17.2345	16.6545	16.2332
4	17.7867	16.5687	16.5845
				5	17.4512	17.5645	17.1243
6	17.0124	16.9786	16.4989
				7	17.3131	16.5634	17.0676
8	17.2367	16..4334	16.8524
				9	17.3465	17.2341	17.0945
10	17.4323	17.5678	17.3687
				平均装量	17.3223	16.9132	16.8765

结果表明，本品装量差异符合药典附录XIIC最低装量检查法的有关规定。3、微生物限度检查：本品微生物限度检查方法验证试验依据《中国药典2005年版》微生物限度检查方法进行检查。

(1)批号：060401、060402、060403

(2)仪器：架盘天平；IV霉菌培养；SKP-01电热恒温培养箱DSHZ-300A；水浴恒温振荡器

(3)培养基：营养肉汤培养基、改良马丁培养基、营养琼脂培养基、玫瑰红钠培养基、胆盐乳糖培养基、4-甲基伞形酮葡萄苷培养基(MUG)、甘露醇氯化钠琼脂培养基、pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液、0.9％氯化钠溶液、靛基质试液。胆盐乳糖发酵培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基。四硫磺酸钠亮绿培养基、胆盐硫乳琼脂培养基。

(4)细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证：验证用菌种：大肠埃希菌[CMCC(B)44102]；枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]；金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]；白色念珠菌[CMCC(F)98001]；黑曲霉菌[CMCC(F)98003](来源于中检所)

菌液制备：取经35℃培养18～24小时的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌与枯草芽孢杆菌肉汤液体培养物2-3白金耳加入9ml 0.9％氯化钠溶液中，10倍稀释至10^-4～10^-8约为50～100cfu/ml，做活菌计数备用。

取经25℃培养18～24小时的白色念珠菌液体培养物，2-3白金耳加入9ml 0.9％氯化钠溶液中，10倍稀释至10^-4～10^-8约为50～100cfu/ml，做活菌计数备用。

取经培养一周的黑曲霉斜面培养物，加0.9％氯化钠溶液3ml，洗下霉菌孢子，取0.1ml加入9ml0.9％氯化钠溶液中，10倍稀释至10^-5～10^-8约为50～100cfu/ml，做活菌计数备用。

操作方法：供试液制备：取本品10g，置锥形瓶中，加入45℃pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，在45℃水浴中振摇使溶，即为1∶10的供试液。

回收率测定：(1)菌液组：分别取菌液1ml，采用常规法制备平皿分别倾注相应培养基，待凝固后，置规定温度培养24-72小时，观察结果并计数，结果见表1。

(2)供试品对照组：取供试液1ml，分别按菌液组方法，测定供试品本底的菌数，测定结果见表1。

(3)试验组：取供试液1ml，按供试品对照组同法操作，同时每个平皿加入50～100cfu相应试验菌1ml，立即倾注培养基，待凝固后，置规定温度培养24-72小时，观察结果并计数。结果见表3。

表3 微生物限度检查方法验证结果

 

菌种	大肠埃希菌	枯草芽孢菌	金黄色葡萄球菌	白色念珠菌	黑曲霉菌
						代数	3	3	3	3	3
稀释级10-11	6	6	7	5	5
						菌液组(CFU/ml)	88	69	90	89	87
试验组(CFU/ml)	73	60	79	86	80
						供试品组(CFU/ml)	0	0	0	0	0
回收率(％)	83	87	88	97	92

从上表可知，细菌的回收率均大于70％，真菌的回收率也均大于70％，可采用常规法计数。

(5)控制菌检查：按照《中国药典2005年版》微生物限度检查法验证试验进行控制菌的验证试验。

菌液制备：接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至10ml营养肉汤培养基中，于35～37℃培养18～24小时，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化纳溶液9ml，采用10倍递增稀释法，使菌数约为10～100cfu/ml的菌悬液。

大肠埃希菌：供试液的制备：同上述操作方法项下供试液的制备。

验证方法：试验组：大肠埃希菌取供试液10ml，加入胆盐乳糖培养基100ml中，作为供试品组，再重复2份，其中1份加入大肠埃希菌10-100个作为试验组，另1份加入与供试液等量的稀释剂作为阴性对照组，35～37℃培养18～24小时，取上述培养液0.2ml，加入含5ml的4-甲基伞形酮葡萄苷培养基(MUG)试管中，于35～37℃培养5～24小时，观察结果，观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，观察结果，见表2。

阴性菌对照组：另取胆盐乳糖培养基100ml，按试验组同法操作，加入金黄色葡萄球菌10-100个作为阴性对照菌组，于35～37℃培养18～24小时，以下操作与试验组同法，结果见表4。

表4大肠埃希菌检查[CMCC(B)44102]

 

	加菌量	BL	MUG	I	甘露醇高盐	EMB	革兰染色	Lac	IMViC	结果
											供试品		混	—	—						—
试验组	88	产气	+	+						+
											阴性对照菌组	90	混	—	—	—					—
阴性对照		清	—	—						—

(6)结论：根据上述验证试验结果，确定本品的微生物限度检查的细菌计数采用常规法；霉菌及酵母菌计数采用常规法；控制菌检查采用常规方法。4、重金属、砷盐检查：(1)重金属检查取本品三批各一杯，按中国药典2005年版一部，附录IXE“重金属检查法”项下第二法检测本品重金属含量。

结果：本品重金属含量低于百万分之十，符合药典规定，故未列入正文。

(2)砷盐检查取本品三批各一杯，按中国药典2005年版一部，附录IX F“砷盐检查法”项下第一法(古蔡氏法)检测砷盐含量。结果：砷盐含量低于百万分之二，符合药典规定，故未列入正文。

本标准[含量测定]项下系方中大黄中大黄素、大黄酚的含量测定方法。中国药典20005年版一部大黄含量测定项下共测定5种成分，大黄素、大黄酚、大黄酸、大黄素甲醚、芦荟大黄素。大黄素、大黄酚是两种含量最高，色谱分离度好，且各种制剂常测的成分，故本品含量测定项选择大黄素、大黄酚进行测定。参照中国药典20005年版一部大黄含量测定项下方法，重点对供试品溶液的制备的影响因素进行了考察。

1、仪器与试药LC-10ATvp高效液相色谱仪；色谱工作站，浙江大学智能信息工程研究所；大黄素、大黄酚(供含量测定用，批0737-200511)中国药品生物制品检定所；所用试剂均为色谱纯或分析纯。

2、最大波长选择在200～400nm范围内对对照品溶液进行紫外吸收的测定，结果表明，大黄素、大黄酚在254nm处有最大吸收。故确定检测波长为254nm，与药典测定波长相同。大黄素大黄酚含量测定紫外吸收光谱谱图见参考资料图1。

3、色谱条件的选择药典方法流动相为甲醇-0.1％磷酸溶液(85：15)，本品供试品分离度很好，分析时间适中，故流动相确定为甲醇-0.1％磷酸溶液(85：15)。见参考资料图2。

4、供试品溶液制备方法的考察：中国药典2005年版一部大黄含量测定供试品制备方法，采用甲醇回流提取，盐酸水解，氯仿提取水解液的制备路线。由于本品为复方制剂，为使甲醇提取完全，采用索氏回流提取方法，仍选择测定游离的和结合的大黄素、大黄酚含量，故沿用盐酸水解、氯仿提取的制备路线。重点考察盐酸的加量及氯仿提取的溶剂量。

对照品溶液的制备同正文。

阴性供试品溶液的制备取除去大黄的其他味药材，按制法项下及供试品溶液制备方法操作，制得阴性对照液。清降凝胶供试品、对照品、阴性对照品及甲醇高效液相色谱谱图。

5、线性关系考察

分别精密注入大黄素、大黄酚对照品溶液(大黄素5.187μg/ml，大黄酚9.811μg/ml)2.5、5.0、7.5、10.0、15.0、20μl，测定以注样量(μg)为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制大黄素、大黄酚标准曲线，大黄素、大黄酚标准曲线结果见表5。

表5 大黄素、大黄酚标准曲线试验结果

 

注样体积(μl)	大黄素注样量(×10-3μg)	大黄素积分值	大黄酚注样量(×10-3μg)	大黄酚积分值
					2.5	14.5245	33387.199	24.5275	69667.203
5	29.0850	63952.000	49.0550	141971.203
					7.5	43.6275	96404.797	73.5825	217366.406
10	58.1700	128969.602	98.1100	284448.000
					15	87.2550	200729.594	147.165	433475.188
20	116.3400	265404.813	196.2200	571190.375

大黄素回归方程Y＝-2378.998+2301756.551X，r＝0.9997，大黄素在0.015～0.116μg间呈良好的线性关系。

大黄酚回归方程Y＝-870.638+2927568.042X，r＝0.9999，大黄酚在0.025～0.196μg间呈良好的线性关系。

6、溶液稳定性试验结果：取同一供试品溶液，依正文方法每隔2小时测定一次，测定8小时后，于24小时再测定一次，试验结果见表6。

表6 稳定性试验结果

 

测定时间(小时)	大黄素积分值	大黄酚积分值
			0	145430.406	339955.188
2	145904.000	343692.813
			4	144864.000	347360.000
6	147324.797	346416.000
			8	149588.406	351395.188
24	143072.000	328614.406
			平均值	146030.602	342905.599
RSD(％)	1.5	2.3

结果表明，样品在24小时内稳定。

7、精密度试验：取同一供试品溶液，重复注样6次，结果见表7。

8、重现性试验：依正文方法，对同一批号样品进行6次测定，结果见表8。结果表明本法重现性良好。

表7 精密度试验结果

 

试验序号	大黄素积分值	大黄酚积分值
			1	152668.797	356396.813
2	146844.797	333456.000
			3	152150.406	342995.188
4	152851.203	338630.406
			5	157379.203	347680.000
6	148982.406	347641.594
			平均值	151812.802	344466.667
RSD(％)	2.4	2.3

表8 重现性试验结果

 

试验序号	大黄素含量(mg/杯)	大黄酚含量(mg/杯)
			1	0.270	0.520
2	0.266	0.538
			3	0.272	0.505
4	0.260	0.520
			5	0.263	0.532
6	0.274	0.500
			平均值	0.268	0.519
RSD(％)	2.0	2.8

9、准确度试验：采用加样回收法。

供试品溶液制备：取已知含量本品(大黄素0.228mg/杯，大黄酚0.456mg/杯)1杯，精密称定，分别精密加入大黄素、大黄酚对照品甲醇溶液1ml、0.9ml(每ml分别含大黄素0.240mg、大黄酚0.450mg)，按供试品溶液制备方法操作，制得准确度试验供试品溶液，供试品进样5μl，对照品进样10μl。依正文方法测定，大黄素、大黄酚准确度试验结果见表9、10。

表9 大黄素准确度试验结果

 

试验序号	取样量(g)	供试品中含有量(mg)	对照品加入量(mg)	测定结果(mg)	回收率(％)	RSD(％)
							1	17.5928	0.236	0.240	0.476	100.0
2	17.4521	0.234	0.240	0.469	97.9
							3	17.6254	0.236	0.240	0.470	97.5	1.5
4	16.2513	0.218	0.216	0.425	95.8
							5	16.7529	0.225	0.216	0.433	96.3
6	16.6512	0.223	0.216	0.433	97.2

10、样品含量测定：按正文方法测定样品三批，结果见表11。

根据三批样品的测定结果，考虑到生产中不同批次药材含量的波动，取平均值的80％为限度，暂定本品每杯含大黄素、大黄酚的总量不少于0.50mg。

表10 大黄酚准确度试验结果

 

试验序号	取样量(g)	供i试品中含有量(mg)	对照品加入量(mg)	测定结果(mg)	回收率(％)	RSD(％)
							1	17.5928	0.472	0.450	0.921	99.9
2	17.4521	0.468	0.450	0.901	96.2
							3	17.6254	0.473	0.450	0.913	97.8	1.9
4	16.2513	0.436	0.405	0.834	98.3
							5	16.7529	0.449	0.405	0.837	95.8
6	16.6512	0.447	0.405	0.853	100.2

表11 样品中大黄素、大黄酚含量测定结果

 

样品批号	大黄素含量(mg/杯)	大黄酚含量(mg/杯)	大黄素、大黄酚总量(mg/杯)
				060401	0.23	0.46	0.69
060402	0.27	0.52	0.79
				060403	0.20	0.38	0.58
平均含量	0.23	0.45	0.68

实施例4：生产工艺研究资料：

一、剂型选择：清降丸制法为蚕沙等十六味药材粉碎成细粉后，加炼蜜及水制成水蜜丸或大蜜丸。由于清降丸为儿童用药，丸剂味苦，且服用量较大，儿童服用困难。凝胶剂即凝胶是儿童普遍欢迎的一种食品，我们将清降丸改变成清降凝胶，制剂富有弹性、爽口，儿童喜欢服用，可有效发挥药物疗效。目前同类品种已有尔合依凝胶(对乙酰氨基酚凝胶(97)卫药准字X—62号，口服，江苏同泰药业有限公司)上市。

二、提取工艺研究：

(一)药材的鉴定与前处理：处方中十六味药材除皂角子外均应符合中国药典20005年版一部各药材项下相应有关规定。大黄、牡丹皮分别粉成最粗粉。

(二)提取工艺设计：凝胶剂是指药材提取物与适量基质制成的具有凝胶性的半固体或稠后液体制剂，故本品中药材需进行提取，制成提取物后应用。

处方中连翘、牡丹皮、薄荷、金银花中含有挥发油，故工艺设计为上述四味与蚕沙、皂角子、赤芍、麦冬、板蓝根、地黄、甘草、白茅根进行水煎提取，同时收集挥发油。大黄、青黛、玄参、川贝母根据其含有效成分的理化性质采用醇提取工艺。

(三)提取工艺技术条件的研究：

1.挥发油的提取工艺时间的考察：根据连翘、牡丹皮、薄荷、金银花药材中所含的化学成分，参考相关文献，应进行挥发油的提取。方法如下：

取处方量连翘、牡丹皮、薄荷、金银花药材，牡丹皮粉成最粗粉，加药材重量(g)8倍量(ml)水，连接挥发油提取器、回流冷凝管，置电热套中缓缓加热至沸腾，读取不同时间挥发油提取量，油量不再增加时停止加热，结果见表1。

表1 挥发油提取时间考察结果

3与2小时比较，挥发油量增加非常缓慢，故确定挥发油提取收油时间为3小时。

因为上述四味药材也采用水煎提取，故可与其他八味水提药材混合后，水煎，同时收取挥发油。

2.水提工艺考察

根据处方中药材有效成分的理化性质及相关文献，蚕沙、皂角子、赤芍、麦冬、板蓝根、地黄、甘草、白茅根及连翘、牡丹皮、薄荷、金银花采用水煎方法，加水量、水煎时间及水煎次数，采用正交试验优化选择，采用四因素三水平正交表，表头设计见表2。以赤芍中芍药苷的提取率为考察指标，芍药苷含量采用高效液相色谱法进行测定，实验方法如下：

取1/8处方量12味药材，加水量、水煎时间及水煎次数按正交表设计操作，9组实验提取液水浴浓缩至干，减压干燥，称重，计算收率。分别精密称取1/250量，加50％乙醇溶解，定量转移至50ml量瓶中，加50％乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。另精密称取芍药苷对照品，加甲醇溶解，制成每1ml含0.05mg的溶液，作为对照品溶液。

测定法精密吸取供试品溶液、对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部，附录VID)试验，以甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(15∶85)为流动相；检测波长为230nm，测定，计算。正交试验设计及结果分析结果见表3、4。

通过下式计算提取物中芍药苷的百分含量。

A供：供试品面积积分值 A_对：对照品面积积分值

V：供试品定容体积(ml) v：供试品注样体积(μl)

W：芍药生药量(mg)     V_对：对照品注样体积(μl)

表2 水煎工艺四因素三水平正交表表头

方差分析表明A、B、C均为不显著因子，但直观分析结果表明，加水量、提取次数对芍药苷的提取虽然无显著性差异，但加10倍量水芍药苷提取多于8倍、6倍选用加10倍量水提取；提取3次芍药苷提取量多于2次、1次，但考虑到提取2次，已将绝大部分有效成分提出，选择提取2次，每次1.5小时。

表3 方差分析表

F_{1-0.10(2，2)}＝9.16   F_{1-0.05(2，2)}＝19.16  F_{1-0.01(2，2)}＝99.17

表4 正交试验设计及结果分析(×10^-2)

3.醇沉浓度的选择：本品12味药材水煎出膏率约31.4％，出膏量较大直接投料经试制有固形物析出，需采用乙醇沉淀法进行精制，以保证凝胶透明，无固形物析出。取三个常用的醇沉浓度，以出膏量及芍药苷的含量为考察指标，芍药苷含量采用高效液相色谱法进行测定，实验方法如下：

取1/8处方量药材，10倍量水煎3次，每次1小时，滤过，合并滤液，浓缩至相对密度1.05～1.08(50℃)的清膏，放冷后平均分成4份。其中一份减压干燥(80℃，0.05Mpa)，称重。另外3份分别加入乙醇，使含醇量分别为60％、70％、80％，静置，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，水浴浓缩至干，减压干燥(80℃，0.05Mpa)，称重。沉淀分别烘干后称重。分别精密称量含醇量60％、70％、80％三个样品，加50％乙醇溶解，定量转移至50ml量瓶中，加50％乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，进行芍药苷含量测定。结果见表5。结果表明，以含醇量为70％的醇沉效果最好。

表5 醇沉试验结果

 

含醇量	60％	70％	80％	未醇沉
					沉淀重(g)	11.25	14.5	17.5
滤液蒸干固体重(g)	30.0	26.75	23.75
					总重量(g)	41.25	41.25	41.25	41.25
芍药苷含量(％)	0.60	0.90	0.82

4.醇提工艺考察

根据处方中药材有效成分的理化性质，参考清降片的提取工艺，大黄、青黛、玄参、川贝母采用醇提取。乙醇浓度、加醇量、提取时间及提取次数，采用正交试验优化选择。采用四因素三水平正交表，表头设计见表6。以大黄中大黄素、大黄酚的提取率为考察指标，大黄素、大黄酚的含量采用高效液相色谱法进行测定，实验方法如下：

取1/10处方量四味药材，乙醇浓度、加醇量、提取时间及提取次数按正交表设计操作，取9组实验提取液分别取相当于大黄150mg量，转移至50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。另精密称取大黄素、大黄酚对照品，加甲醇溶解，制成每1ml分别含大黄素5μg、大黄酚10μg的混合溶液，作为对照品溶液。

测定法精密吸取供试品溶液10μl，对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部，附录VI D)试验，以甲醇-0.1％磷酸溶液(85：15)为流动相，检测波长为254nm，测定，计算。

通过下式计算提取液中大黄素、大黄酚的含量。大黄素正交试验设计及结果分析结果见表7、8，大黄酚正交试验设计及结果分析结果见表9、10。

A供：供试品面积积分值  A_对：对照品面积积分值

V：供试品定容体积(ml)  v：供试品注样体积(μl)

W：大黄生药量(mg)      V_对：对照品注样体积(μl)

表6 醇提工艺四因素三水平正交表表头

表7 大黄素正交试验设计及结果分析(×10^-2)

表8 大黄素方差分析表(×10^-2)

F_{1-0.10(2，2)}＝9.16  F_{1-0.05(2，2)}＝19.16  F_{1-0.01(2，2)}＝99.17

从表中大黄素的直观或方差分析均表明A为为显著因子，C、D、B均为不显著因子，即乙醇浓度对大黄素有较大影响。最优组合A₃B₂C₃D₂或A₂B₂C₃D₂。从表中大黄酚的方差分析均表明A、B、C、D均为不显著因子，但直观分析结果表明，乙醇浓度60％、80％大黄酚提取率接近、提取3次比提取2次、1次为好、提取时间1.5小时与2小时接近，均高于1小时。优组合A2B₂C₃D₂或A₃B₂C₃D₂。故选择8倍量60％或80％乙醇提取3次，每次1.5小时。提取大黄素60％乙醇比80％乙醇高一些，提取大黄酚二者接近，综合考虑其他药物如青黛、玄参、皂角子(清降片二味的提取溶剂为80％乙醇)，故确定8倍量80％乙醇提取3次，每次1.5小时。

表9 大黄酚正交试验设计及结果分析(×10^-2)

表10 方差分析表(×10^-2)

F_{1-0.10(2，2)}＝9.16  F_{1-0.05(2，2)}＝19.16  F_{1-0.01(2，2)}＝99.17

80％醇提取次数的验证

提取溶剂、加量及提取时间，按正交实验优化结果进行试验，提取三次，根据三次的出膏量及大黄素、大黄酚的提取量决定提取次数。大黄素、大黄酚含量测定方法同醇提取工艺的考察。

试验方法：取1/2处方量大黄、青黛、玄参、川贝母，加8倍量80％乙醇，提取三次，每次1.5小时。分别收集提取液，滤过，回收溶剂，水浴蒸干，减压干燥(0.05Mp，80℃)，称重。

对照品溶液的制备同醇提取工艺。

供试品溶液的制备分别精密称取三次提取物20mg，置圆底烧瓶中。加8％盐酸溶液10ml，再加三氯甲烷10ml，加热回流1小时。放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10ml，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液10ul与供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

表11 80％醇提取次数的考察试验结果

 

	出膏量(g)	出膏率(％)	大黄素、大黄酚总量(％)	大黄素、大黄酚(mg/杯)
					第一次	75.4	54.6	0.73	0.78
第二次	40.0	28.9	0.19	0.20
					第三次	22.9	16.5	0.04	0.04

结论：第一次、第二次提取出膏量的和占三次总量的83.5％，第一次、第二次大黄素、大黄酚的提取总量占三次提取总量的95.8％，提取二次已将绝大部分有效成分提出，故确定提取次数为二次，以节省溶剂和能源。

三、制剂成型性研究

清降凝胶中连翘、金银花、牡丹皮、薄荷挥发油提取工艺、水提工艺、醇沉工艺及醇提工艺经正交试验优化选择，工艺条件稳定可行，现进行制剂处方设计及成型工艺研究。

(一)制剂处方设计

本品为凝胶剂，凝胶剂系指药材提取物与适宜基质制成的、具凝胶特性的半固体或绸厚液体制剂。按基质不同，凝胶剂可分为水性凝胶与油性凝胶。

本品药材提取物极性较大，适宜使用水性凝胶基质。水性凝胶基质一般由水、甘油、丙二醇与纤维素衍生物、卡波母和海藻酸盐、西黄耆胶、明胶、淀粉等构成。

卡拉胶是从红藻类海藻中提取的天然多糖胶体，结构上由半乳糖和3、6内醚半乳糖以及硫酸酯的钙、钠、钾、镁等盐类组成的链状聚合物。属于海藻酸盐类。

卡拉胶可与刺槐豆胶、魔芋胶、黄原胶等发挥效果明显的协同作用，混合使用可明显改变其凝胶特性，提高卡拉胶的黏度及强度，使凝胶趋向于富有弹性且泌水现象减轻。

卡拉胶的安全性已被联合国粮农组织和世界卫生组织所确认。卡拉胶在食品工业和医药工业得到广泛应用。

(二)辅料的种类的确定：根据K—卡拉胶的胶体化学特性、溶解性、胶凝性、增稠性、协同性等确定辅料的种类。

溶解性：可以在冷水中溶解，在70℃以上热水中溶解速度提高，水为凝胶剂的基质。

胶凝性：在钾离子存在下能生成热可逆凝胶，可加入氯化钾促进生成热可逆凝胶。

增稠性：浓度低时形成低黏度的溶胶，接近牛顿流体，浓度升高形成高粘度溶胶，则呈非牛顿流体。

协同性：与刺槐豆胶、魔芋胶、黄原胶等胶体产生协同作用，能提高凝胶的弹性和保水性，确定加入魔芋胶以提高凝胶的弹性和保水性。

健康价值：卡拉胶具有可溶性膳食纤维的基本特性，在体内降解后的卡拉胶能与血纤维蛋白形成可溶性的络合物。可被大肠细菌酵解成CO₂、H₂、沼气及甲酸、乙酸、丙酸等短链脂肪酸，成为益生菌的能量源

(三)辅料及加量的正交试验考查：根据凝胶剂的辅料特点，结合查阅的相关文献，确定卡拉胶、魔芋粉、氯化钾、水为主要基质，是凝胶剂成型的决定因素。其余辅料中还包括白砂糖、甜味剂、防腐剂、香精。采用正交试验优化选择上述主要基质的加量。采用四因素三水平正交表，表头设计见表12。A为卡拉胶加量(一杯量)，B为魔芋粉加量，C为氯化钾加量，D为凝胶重量。加水量为凝胶重量减去其他辅料量。以凝胶剂的弹性和口感、泌水性(保水性)为考查指标，对上述考察指标进行分级、赋分，赋分标准见表13，成型工艺正交试验设计及结果分析结果见表14、15、16、17。

表12 成型工艺四因素三水平正交表表头

表13 凝胶剂的弹性、口感、保水性分级及赋分标准

 

赋分	弹性及口感	保水性
			1	弹性硬或软，口感滑腻	差
2	弹性较硬或较软	较差
			3	弹性适中，口感适中	较好
4	弹性适中，口感较順滑	好
			5	弹性适中，口感滑腻	很好

表15 弹性及口感方差分析表

F_{1-0.10(2，2)}＝9.16  F_{1-0.05(2，2)}＝19.16  F_{1-0.01(2，2)}＝99.17

表14 正交试验设计及弹性及口感结果分析

表16 正交试验设计及保水性结果分析

表17 保水性方差分析表

F_{1-0.10(2，2)}＝9.16 F_{1-0.05(2，2)}＝19.16 F_{1-0.01(2，2)}＝99.17

从表中弹性、口感的直观或方差分析均表明A、B均为为显著因子，D为不显著因子，即卡拉胶、魔芋粉的加量对清降凝胶的弹性、口感有较大影响，加水量次之。最优组合A₁B₂C₃D₃或A₁B₃C₃D₃。

从表中保水性的直观及方差分析均表明A、B均为显著因子，D为不显著因子，即卡拉胶、魔芋粉的加量对清降凝胶的保水性有较大影响。最优组合A₂B₁C₃ D₃或A₂B₁C₃D₂。

综合以上两个试验结果，为降低卡拉胶的用量，卡拉胶、魔芋粉的加量采用水平2的量、氯化钾的加量均采用水平2的量，考虑到凝胶剂的直径需大于3.5cm，故需确定加水后每杯重量为17g。本品提取物苦，故蔗糖的加量采用1g，还需加入少量甜蜜素进行矫味，甜蜜素与蔗糖一起配合使用时，其甜度可达80倍以上；单独使用时，其甜度为10g相当于蔗糖500g。山梨酸甲防腐剂加量0.5g/kg、香精的加量按照使用说明。

采用正交试验确定的辅料配比进行样品制备，样品的弹性、口感、保水性均很理想。

制剂处方：

(三)制剂成型工艺

蚕沙等12味水提物稠膏与醇提取物稠膏、挥发油提取液、柠檬酸、氯化钾、白砂糖、甜蜜素、防腐剂混合，加水溶解；与卡拉胶水溶液混匀，加入挥发油、香精，在70℃水浴中加热混匀，分装，密封，巴氏灭菌后，即得。

Claims (2)

1、一种治疗咽喉肿痛大便秘结的中药组合物的检验方法，包括其是由下述工艺步骤制备而成的：

A、处方：

牡丹皮、蚕砂、皂角子、赤芍、麦冬、

连翘、金银花、板兰根、地黄、

白茅根、薄荷、甘草的水提物                  0.703kg

大黄、青黛、玄参、川贝母的醇提物            0.37kg

连翘、牡丹皮、薄荷、金银花的提取挥发油      5.5ml

卡拉胶                                      0.3774kg

魔芋粉                                      0.3774kg

氯化钾                                      0.0943kg

蔗糖                                        3.774kg

柠檬酸                                      0.0566kg

甜蜜素                                      0.1132kg

防腐剂                                      0.0321kg

水                                          58.3kg

B、制备方法：按照权利要求1所述的制得有效成分的原料药组成投料：

大黄粉制成最粗粉与青黛、玄参、川贝母混合，加8倍量80％乙醇提取两次，每次1.5小时，合并醇提液，回收乙醇浓缩成膏，相对密度1.30～11.35，60℃；

牡丹皮制成最粗粉，与蚕砂、皂角子、赤芍、麦冬、连翘、金银花、板兰根、地黄、白茅根、薄荷、甘草混合，加10倍量水煎煮两次，每次1.5小时，收集挥发油，水提液分次滤过，合并滤液，浓缩至相对密度1.05～1.08，60℃；放至室温，加乙醇使含醇量为70％，静置过夜，滤过，滤液回收乙醇，浓缩至相对密度1.25～11.35，60℃的稠膏；

将水提稠膏、醇提稠膏、柠檬酸、氯化钾、白砂糖、甜蜜素、防腐剂混合，加水搅拌溶解；与卡拉胶、魔芋粉水溶液混匀，在70℃水浴中加热溶解，加入挥发油、香精，加水至64.2Kg，混匀，分装，密封，巴氏灭菌后，即得清降凝胶，其特征在于所述的清降凝胶，每杯含大黄素(C₁₅H₁₀O₅)、大黄酚(C₁₅H₁₀O₄)的总量不得少于0.50mg的定量指标。

2、如权利要求1所述的治疗咽喉肿痛大便秘结的中药组合物的检验方法，其特征在于质量标准中设置了芍药、玄参、金银花、青黛、和大黄中大黄素、大黄酚含量测定的鉴别检验项目：

(1)其中所设置的芍药的鉴别检验方法是：取本品1杯，切成小块，置圆底烧瓶中，加100ml甲醇，水浴回流30min，滤过，水浴蒸干，残渣加水40ml使溶解，滤过，通过AB-8大孔树脂柱，内径10～112mm，长100mm，先以水100ml洗脱，弃去水洗液，再用30％乙醇溶液100ml洗脱，继用70％乙醇溶液80ml洗脱；30％乙醇洗脱液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取芍药苷对照品，加甲醇使溶解，制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2005年版一部附录VIB薄层色谱法试验，分别吸取上述两种溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇：甲酸＝45：5：10：0.2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10c/o硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与芍药苷对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

(2)其中所设置的玄参的鉴别检验方法是：取鉴别(1)的用70％乙醇洗脱液，水浴蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取玄参对照药材粉末2g，加甲醇10ml，浸泡1小时，超声处理15分钟，滤过，滤液作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VIB)试验，分别吸取上述两种溶液3μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇：冰醋酸：水＝7：1：2为展开剂，薄层板用展开剂预饱和15分钟，展开，取出，晾干，喷以香草醛硫酸试液，热风吹至斑点清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

(3)其中所设置的金银花的鉴别检验方法是：取鉴别(1)的供试品溶液，为供试品溶液；另取氯原酸对照品，加甲醇溶解，制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2005年版一部附录VIB薄层色谱法试验，分别吸取上述两种溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸丁酯：甲酸：水＝7：2.5：2.5为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

(4)其中所设置的青黛的鉴别检验方法是：取本品一杯，剪碎，置圆底烧瓶中，加入三氯甲烷20ml，水浴回流10分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；另取靛玉红对照品，加入三氯甲烷，制成每1ml各含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5~10ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯：三氯甲烷：丙酮＝5：4：1为展开剂，展开，取出，晾干；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的红色的斑点；

(5)其中所设置的大黄中的大黄素、大黄酚含量测定的方法是：照中国药典2005年版一部，附录VI D高效液相色谱法测定，

色谱条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇：0.1％磷酸溶液＝85：15为流动相；流速1.0ml/min；检测波长254nm；柱温为室温；理论板数按大黄素峰计算应不低于2000；

对照品溶液的制备分别精密称取大黄素、大黄酚对照品适量，制成每1ml含6μg、10μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备取本品一杯，精密称定，切碎，置索氏提取器中，加甲醇加热回流3小时，放冷，转移至100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取25ml，置烧瓶中，挥去溶剂加8％盐酸溶液10ml，超声处理2分钟，再加三氯甲烷10ml，加热回流1小时，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10ml，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。