CN1326536C - 治疗和预防呼吸道病毒感染的药物组合物及其制备与用途 - Google Patents

Abstract

一种治疗和预防呼吸道病毒感染的药物组合物，由野菊花1-5份、柴胡1-10份、连翘1-10份、黄芩5-10份、金银花5-10份和苦杏仁4-8份制成，具有确切的抗病毒、抗菌、解热、抗炎、镇痛和止咳化痰作用，其抗病毒谱和药效作用强度优于双黄连口服液。

Description

治疗和预防呼吸道病毒感染的药物组合物及其制备与用途

技术领域

本发明属于治疗呼吸系统疾病的药物组合物及其制备方法与用途，具体为源于中药的具有治疗和预防呼吸道病毒感染作用的药物组合物及其可工业的制备方法与用途。

背景技术

呼吸道病毒感染的临床表现主要为：发热，头痛、身痛，咽喉肿痛、咳喘、肺部感染等上、中、下呼吸道炎症，因而理想的治疗呼吸道病毒感染的药物应该具有解热、抗炎、镇痛、止咳的作用。然而发病的主要病因是肌体感染了病毒，所以，这种理性的治疗呼吸道病毒感染的药物必须具有抗病毒作用。呼吸道病毒感染的主要病毒为：流感病毒、副流感病毒、合胞病毒、腺病毒。所以，评价抗呼吸道病毒感染药物，不但要看它是否具有解热、抗炎、镇痛、止咳的作用及其作用的强弱，更重要的是看它是否具有抗流感病毒、副流感病毒、合胞病毒、腺病毒的抗病毒谱及其作用的强弱。

治疗呼吸系统疾病、具有抗呼吸道病毒作用的专利(申请)已有多件。CN 03100188.2药物没有抗炎、镇痛作用，其抗病毒谱较窄，只抗流感病毒甲、乙型。CN 03118301.8中仅提出具有“抗病毒”作用，没有公开具体抗哪些病毒。CN 01129177.X仅具有解热、抗炎作用。CN 00100617.7没有具体的抗病毒药理实验依据，仅有几例临床治疗病例，而且这些病例缺少支持：所治病例，没有病毒感染的诊断学依据；没有实验数据支持；所治病例，没有统计学处理。CN 200410155101.2的组方不具有止咳作用。CN 02128077.0说明书中仅有组方、制法，没有公开抗病毒药效学数据，“中药不传之秘在于量”，量的规律是组方的基本规律之一，在不同的量变规律指导下，几百味常用中药，可以演变出数千万首汤方。而该专利的申请说明中恰恰没有提到组方的计量问题。CN 94115927.2主要用于风寒感冒，未提到抗病毒的药理作用。CN 03113857.8专利说明书第4页：“本发明颗粒剂对流感病毒感染的小鼠肺病变与肺指数没有表现出明显的作用，体外对呼吸系统10株致病菌作用不明显”。CN 96110520.8说明书第3页仅提及“长于抗流感病毒”，但未见具体的实验数据支持。

发明内容

本发明要解决的技术问题是筛选研究治疗和预防呼吸道病毒感染的药物组合物，具体为同时具有确切的抗病毒、抗菌、解热、抗炎、镇痛和止咳化痰作用的源于中药的药物组合物，其抗病毒谱和药效作用强度应优于目前市场具有抗病毒优势的的双黄连口服液。本发明包括研究该药物组合物组方中起到核心和关键作用的“药团”。本发明还要研究该处方的合理制备工艺与用途。

为解决上述问题，本发明提供如下技术方案。

一种治疗和预防呼吸道病毒感染的药物组合物，其特征在于主要是由下列重量份计原料药制成：野菊花1-5份，柴胡1-10份，连翘1-10份。其优选的原料药用量按重量份计为：野菊花5份，柴胡10份，连翘10份。

一种治疗和预防呼吸道病毒感染的药物组合物，其特征在于基本由下列重量份的原料药制成：野菊花1-5份，柴胡1-10份，连翘1-10份，黄芩5-10份，金银花5-10份，苦杏仁4-8份。其优选原料药用量按重量份计为：野菊花5-8份，柴胡6-10份，连翘6-10份，黄芩5-8份，金银花5-8份，苦杏仁4-6份。其更优选原料药用量按重量份计为：野菊花5份，柴胡10份，连翘10份，黄芩5份，金银花5份，苦杏仁4份。

前述治疗和预防呼吸道病毒感染的药物组合物的制备方法，包括如下步骤：

1)称取处方量原料药野菊花、柴胡、连翘、黄芩、金银花、苦杏仁，备用；

2)取野菊花、柴胡、连翘、金银花，用超临界法或水蒸汽法提取挥发油，得挥发油，备用；

3)取步骤2)中提取挥发油后的药渣和黄芩、苦杏仁，用水和/或C1-C5直链或支链醇提取，浓缩醇提取液后，得到醇提取物；

4)取步骤2)中挥发油用饱和水溶液法、超声波法、研磨法或者胶体磨法，使β-环糊精对精制挥发油进行包合，得挥发油包合物；

5)取步骤4)中挥发油包合物、步骤3)中醇提取物与药学上适用载体混合，制成本发明药物组合物。

所述治疗和预防呼吸道病毒感染和药物组合物的制备方法中，步骤2)中野菊花、柴胡和连翘用超临界法提取挥发油的条件为萃取压力15-35MPa，萃取温度30-60℃，分离罐I压力2-25MPa，解析温度30-60℃，分离罐II压力2-25MPa，解析温度30-60℃，萃取1-5小时；步骤2)中金银花用CO₂超临界提取挥发油的条件为萃取压力10-25MPa，萃取温度30-60℃，分离罐I压力2-25MPa，解析温度30-55℃，分离罐II压力2-25MPa，解析温度30-60℃，用45-100％乙醇作为夹带剂，萃取0.5-5小时；步骤2)中野菊花、柴胡和连翘用常规水蒸汽蒸馏法提取挥发油时，药材浸泡至少2小时，回流2-3小时后再蒸馏1～2小时；步骤3)中提取挥发油后的药渣和黄芩、苦杏仁，用水和/或C₁-C₅直链或支链醇提取，C₁-C₅直链或支链醇选自乙醇、甲醇、正丁醇。

该制备方法中，优选野菊花、柴胡和连翘用超临界法提取挥发油的条件为萃取压力25MPa，萃取温度40℃，分离罐I压力6MPa，解析温度40℃，分离罐II压力5MPa，解析温度40℃，萃取2.5小时；金银花用CO₂超临界提取挥发油的条件为萃取压力20MPa，萃取温度45℃，分离罐I压力6MPa，解析温度40℃，分离罐II压力5MPa，解析温度40℃，用95％乙醇作为夹带剂，萃取1小时；所得超临界萃取物干燥后，与硅藻土混合后，用挥发油提取器提取挥发油，得精制挥发油；用常规饱和水溶液法，使β-环糊精对精制挥发油进行包合，得挥发油包合物；提取挥发油后的药渣和黄芩、苦杏仁，用55-95％乙醇提取。该制备方法中优选提取挥发油后的药渣和黄芩、苦杏仁，用65-70％乙醇提取，乙醇提取液浓缩后，得醇提物；将挥发油包合物、醇提物与常规口服药用辅料混合。常规口服药用辅料除可溶性淀粉、淀粉、β-环糊精外，还有崩解剂如：羟丙纤维素，羧甲基淀粉钠，交联聚维酮，交联羧甲基纤维素钠；填充剂如：乳糖，微晶纤维素，糊精，淀粉，磷酸钙；粘合剂如：预胶化淀粉，聚维酮，羧甲基纤维素钠，羟丙甲纤维素；润滑剂如：滑石粉，硬脂酸镁，微粉硅胶，氢化植物油；润湿剂如：十二烷基硫酸钠，吐温80；骨架材料如：羟丙甲纤维素，乙基纤维素等。

本发明包括治疗呼吸系统疾病药物组合物在制备治疗和预防呼吸道病毒感染、抗炎、解热、镇痛药物中的应用。

本发明药物组合物同时具有确切的抗病毒、抗菌、解热、抗炎、镇痛和止咳化痰作用，其抗病毒谱和药效作用强度优于目前市场具有抗病毒优势的的双黄连口服液。抗病毒试验表明，本发明药物组合物和对照药双黄连口服液对流感病毒甲₃型(A₃)、副流感病毒1型(HVJ)、呼吸道合胞病毒(RSV)均显示出有显著的抑制作用，其中本发明药物组合物对副流感病毒抑制作用较强，且对腺病毒3型(ADV₃)有一定的抑制作用，双黄连口服液对各病毒的抑制强度稍弱一些，对腺病毒3型(ADV₃)无抑制作用。体内试验显示，本发明药物组合物大、中剂量组对流感病毒感染小鼠引起的肺炎均有明显的抑制作用，肺指数值明显降低、体重增加，病理检查结果显示，肺部病变明显减轻。本发明药物组合物在体外对所试的6种细菌56种菌株均有不同程度的抑制作用，对金黄色葡萄球菌和变形杆菌的抑制作用本发明药物组合物强于双黄连口服液，其余细菌的抑制作用强度基本相同。

呼吸道病毒感染的临床表现主要为：发热，头痛、身痛，咽喉肿痛、咳喘、肺部感染等上、中、下呼吸道炎症，因而理想的治疗呼吸道病毒感染的药物应该具有解热、抗炎、镇痛、止咳的作用。然而发病的主要病因是肌体感染了病毒，所以，这种理性的治疗呼吸道病毒感染的药物必须具有抗病毒作用。呼吸道病毒感染的主要病毒为：流感病毒、副流感病毒、合胞病毒、腺病毒。所以，评价抗呼吸道病毒感染药物，不但要看它是否具有解热、抗炎、镇痛、止咳的作用及其作用的强弱，更重要的是看它是否具有抗流感病毒、副流感病毒、合胞病毒、腺病毒的抗病毒谱及其作用的强弱。

本发明研发的药物组合物(称为“野柴翘清毒颗粒”)，在解热、抗炎、镇痛、止咳的作用及其作用的强度方面，优于目前国内临床疗效肯定的“双黄连口服液”。“野柴翘清毒颗粒”之所以具有治疗呼吸道病毒感染的独特药效作用，是因为它有独特的组方。它有独特的组方体现在：它的组方中有一个起到核心和关键作用的“药团”，这个“药团”就是“野柴翘”药团。实验证明：打散“野柴翘”药团、或者不以“野柴翘”药团的一定比例量与方中的其它药物配伍，在解热、抗炎、镇痛、止咳，抗流感病毒、副流感病毒、合胞病毒、腺病毒的抗病毒谱及其作用都劣于本发明的“野柴翘清毒颗粒”组方。由此，该药物也被我们以它的独特药团命名为“野柴翘清毒颗粒”。

中药组方用药的时候，常常有两味或者两味以上药物固定搭配使用的特点，用以增强组方的药效，这种固定搭配使用的药物被称之为“药对”。本发明在组方研究过程中发现，“野菊花-柴胡-连翘”在本组方中具有“药对”的固定搭配使用特点，因为这一固定搭配是由三味药物组成，故被称之为“药团”。“野菊花-柴胡-连翘”药团(以下简称“野柴翘”药团)的存在和变化是影响该组方抗病毒谱和抗病毒作用的的核心和关键。药效学实验显示“野菊花-柴胡-连翘”对该组方的抗病毒谱和抗病毒作用影响较大。

本发明药物组合物制备方法中，挥发油的提取可用常规水蒸汽蒸馏法或超临界法提取，两种方法各有优势。

本发明使用常规水蒸汽蒸馏法提取柴胡、连翘、野菊花和金银花的挥发油，增长蒸馏时间会使提取罐中的水量减少，减少过多会使药材糊化；浸泡时间越长越好。本发明采用提取工艺为：浸泡至少2小时，回流3小时后再蒸馏1～2小时。

本发明药物组合物制备过程中，提取挥发油后的柴胡、连翘、野菊花及金银花的药渣，加上黄芩、苦杏仁，用水和/或C₁-C₅直链或支链醇提取，浓缩得到提取物。C₁-C₅直链或支链醇可选乙醇、甲醇、正丁醇、……，优选乙醇。提取挥发油后的药渣和黄芩、苦杏仁，用水提取，下文简称水提法，用乙醇提取，下文简称醇提法。本发明对水提法和醇提法进行比较，以优选研究中产生的各自最佳条件组合。

黄芩、苦杏仁，加入超临界提过挥发油的药渣，分别进行醇提和水提；黄芩、苦杏仁，加入水蒸汽蒸馏法提取挥发油后的药渣，分别进行醇提和水提。采用水蒸气蒸馏法提取挥发油过程中产生的药液可以浓缩后加入总提液中备用。

醇提法：65％的乙醇提取3次，分别均加入5倍量醇，提取时间每次都是1hr，药材粉碎到黄豆粒大，提取前先浸泡过夜。

水提法：每次分别用18倍量水、12倍量水，提取2次，提取时间分别为1hr，药材粉碎至黄豆粒大或用原饮片均可，提取前先浸泡1小时。

各种实验样品液的制备

(1)全方醇提组：投药200g(按处方比例取用各味药材)，采用“醇提法”提取，定容为200m水溶液1。

(2)全方水提组：投药200g(按处方比例取用各味药材)，采用“水提法”提取，定容为200ml水溶液。

(3)(醇提+水蒸馏油)组：投药154g(按处方比例取用连翘51.3g、柴胡51.3g、野菊花25.7g、金银花25.7g)，水蒸汽蒸馏提取挥发油，得水油混合物约5ml；水母液浓缩后约得50ml；取用苦杏仁20.5g、黄芩25.7g，加入上四味药物水蒸汽蒸馏后的药渣，采用“醇提法”提取，得药液约130ml；加入吐温80 2ml(大约20滴)；将此四种液体合并，定容为200ml，超声30分钟即得。

(4)(水提+水蒸馏油)组：药154g(按处方比例取用连翘51.3g、柴胡51.3g、野菊花25.7g、金银花25.7g)，水蒸汽蒸馏提取挥发油，得水油混合物约5ml；水母液浓缩后约得50ml；取用苦杏仁20.5g、黄芩25.7g，加入上四味药物水蒸汽蒸馏后的药渣，采用“水提法”提取，得药液约130ml；加入吐温80 2ml(大约20滴)；将此四种液体合并，定容为200ml，超声30分钟即得。

(5)(醇提+超全油)组：药154g(按处方比例取用连翘51.3g、柴胡51.3g、野菊花25.7g、金银花25.7g)，用3.1.5确定的最佳超临界萃取工艺提取挥发油，得萃取物(我们称之为“超全油”)约5ml；取用苦杏仁20.5g、黄芩25.7g，加入上四味药物超临界萃取后的药渣，采用“醇提法”提取，得药液约130ml；加入吐温80 2ml(大约20滴)；将此三种液体合并，定容为200ml，超声30分钟即得。

(6)(醇提+超精油)组：药154g(按处方比例取用连翘51.3g、柴胡51.3g野菊花25.7g、金银花25.7g)，用3.1.5确定的最佳超临界萃取工艺提取挥发油，得萃取物(我们称之为“超全油”)约5ml，将萃取物用硅藻土拌样后按药典法提取挥发油(我们称之为“超精油”)约0.25ml；取用苦杏仁20.5g、黄芩25.7g，加入上四味药物超临界萃取后的药渣，采用“醇提法”提取，得药液约130ml；加入吐温80 2ml(大约20滴)；将此超精油、药液、吐温80合并，定容为200ml，超声30分钟即得。

(7)(水提+超全油)组：药154g(按处方比例取用连翘51.3g、柴胡51.3g、野菊花25.7g、金银花25.7g)，用3.1.5确定的最佳超临界萃取工艺提取挥发油，得萃取物(我们称之为“超全油”)约5ml；取用苦杏仁20.5g、黄芩25.7g，加入上四味药物超临界萃取后的药渣，采用“水提法”提取，得药液约130ml；加入吐温80 2ml(大约20滴)；将此三种液体合并，定容为200ml，超声30分钟即得。

(8)(水提+超精油)组：药150g(按处方比例取用连翘51.3g、柴胡51.3g、野菊花25.7g、金银花25.7g)，用3.1.5确定的最佳超临界萃取工艺提取挥发油，得萃取物(我们称之为“超全油”)约5ml，将萃取物用硅藻土拌样后按药典法提取挥发油(我们称之为“超精油”)约0.25ml；取用苦杏仁20.5g、黄芩25.7g，加入上四味药物超临界萃取后的药渣，采用“水提法”提取，得药液约130ml；加入吐温80 2ml(大约20滴)；将此超精油、药液、吐温80合并，定容为200ml，超声30分钟即得。

(9)(水+吐温80)组：水190ml，加入吐温80 2ml(大约20滴)，定容为200ml，超声30分钟即得。

各组样品的药效实验结果：以抗炎作用(二甲苯致炎小鼠耳廓肿胀率)及解热作用为指标，实验方法同上，以上制备的各组样品进行比较研究，以筛选较优与最佳提取方案，抗炎实验各组的给药剂量均为14g生药/kg；解热实验各组的给药剂量均为10g生药/kg。本实验工作安排表及实验结果详见表1。

表1、挥发油提取研究的实验结果

组别	抗炎mm-2	解热
			(1)全方醇提组(2)全方水提组(3)(醇提+水蒸馏油)组(4)(水提+水蒸馏)组(5)(醇提+超全油)组(6)(醇提+超精油)组(7)(水提+超全油)组(8)(水提+超精油)组(9)(水+吐温80)组：	84.58±18.1589.55±11.9378.18±15.2183.64±18.3269.55±9.0756.67±9.1375.91±10.2071.25±9.32147.58±10.33	0.79±0.290.83±0.270.63±0.280.71±0.210.41±0.170.38±0.190.58±0.260.63±0.211.43±0.28

上述实验结果表明：吐温80对药效没有影响；(1)-(8)的提取方法制备的药物组合物均具有抗炎、解热作用，其中可达到较好的提取方法是(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)组，其中最佳的提取方法是(5)、(6)组。

本发明提取的挥发油用β-CD(β-环糊精)制备包合物，制备方法可以选用饱和水溶液法、超声波法、研磨法和胶体磨法，优选饱和水溶液法。

具体实施方式

所用原料均为市购且符合药典标准的饮片。本发明所用黄芩(酒炙)、苦杏仁(炒)均从药材公司直接购买。

实施例1、

处方：柴胡481g 连翘481g 黄芩(酒炙)240.5g 野菊花240.5g 金银花240.5g 苦杏仁(炒)192.4g 可溶性淀粉454g 淀粉91g，β-环糊精适量。制成1000g颗粒剂(10g/袋)；服法：一日3次，每次1～2袋，清热解毒，主治风热感冒。

1、取金银花、野菊花、连翘、黄芩、柴胡和苦杏仁饮片。

2.提取挥发油：将粉碎过的连翘、柴胡和野菊花，按照处方比例量，置于HA220-40-48型超临界的萃取装置中，采用CO₂超临界提取挥发油，最佳萃取条件为萃取压力25MPa，萃取温度40℃，分离罐I压力6MPa，解析温度40℃，分离罐II压力5MPa，解析温度40℃，萃取2.5小时。取处方比例量的金银花，置于超临界萃取装置中，采用CO₂超临界提取挥发油，最佳萃取条件为萃取压力20MPa，萃取温度45℃，分离罐I压力6MPa，解析温度40℃，分离罐II压力5MPa，解析温度40℃，待稳定后吸入式加入95％乙醇(95％乙醇∶金银花＝0.35∶1)作为夹带剂进行萃取，萃取1小时。合并两次萃取物(得率约为2.5％)，挥去乙醇。

3.超临界萃取物的精制：将干燥的超临界萃取物用适量的硅藻土拌样后转移入圆底烧瓶中，用挥发油提取器提取挥发油(按照2000年版药典附录XD挥发油测定法项下进行)，得率约为4.3％。

4.挥发油的包合：(按重量/重量比，即1克挥发油用8克β-环糊精)取挥发油8倍量的β-环糊精，加入到环糊精12倍量(按重量/重量比，即1克β-环糊精用12克水)的蒸馏水中，沸水浴加热使溶解，置于40℃水浴中冷却。在78HW-1型电动搅拌机(转速100-200r/min)搅拌下，水浴条件下控制温度为40℃，缓慢滴加挥发油，搅拌1小时，得大量沉淀。混合物在冰箱中3～5℃冷藏24小时，滤过，滤渣用石油醚分次洗涤，固形物40℃干燥，得挥发油β-环糊精包合物。得率为93.8％。

5.药材的提取：将提取过挥发油的金银花、连翘、柴胡和野菊花药材与处方量的黄芩及苦杏仁合并，置多功能提取罐中，加入5倍量65％乙醇，浸泡过夜，提取3次，每次加入5倍量65％乙醇，每次提取时间为1小时，提取液滤过，合并三次滤液，得提取液。

6.提取液的浓缩：把提取液放入B-10单放浓缩器中，在65℃、0.08Mpa条件下回收乙醇，得浸膏，浸膏的相对密度为1.3(60℃测定)。

7.提取物的干燥：将浸膏置于101型的真空干燥箱中，于80℃、0.08Mpa条件下干燥12小时，得干燥物。干燥提取物的得率为23.96％。用多功能型粉碎机粉碎成粉末(80目)。

8.颗粒的制备：用多维混合机将β-环糊精包合物和药材粉末均匀混合，再与可溶性淀粉、淀粉以1∶1∶0.2的比例混合，搅拌混合30分钟。以85％乙醇作粘合剂，用制粒机制粒(10目)，制好的颗粒置于65℃、0.08Mpa条件下烘干。将干燥的颗粒按每袋10g的剂量装入铝塑复合膜材料制成的包装袋中。本品为无糖型颗粒剂，为棕黄色的颗粒，色泽均匀，气味微苦。

实施例2

处方：野菊花5g，柴胡10g，连翘10g。

称取处方比例的柴胡(40目)、连翘(20目)和野菊花(20目)置于超临界萃取装置中，调整萃取压力为20MPa和萃取温度为40℃，待仪器稳定后萃取2.5小时后，在出料口接收萃取物，称量萃取物的重量，并与最佳萃取条件计算出的理论含量相比，得率为95.58％。

称取β-CD(β-环糊精)2g，置于研钵内，再量取8ml(4倍量)蒸馏水加入研钵中，充分混合研磨成糊状；同时精密量取0.5ml挥发油(用无水乙醇溶解为2ml，混匀)，用滴管加入β-CD糊状物中，边滴边研磨。研匀后置于40℃烘箱内烘干部分水分，滤过，滤渣用15ml石油醚分三次洗涤沉淀；沉淀物再于40℃条件下干燥，即得包合物。在显微镜下观察，明显可见包合物与不含挥发油的包合物形状不同，晶格排列发生变化，由此初步说明包合物已形成。

超临界提过挥发油的药渣，用65％乙醇提取。其余操作步骤同实施例1。用5％PVP醇水(50％)溶液作粘合剂，颗粒成形，外形较好。

实施例3

处方：野菊花10g，柴胡10g，连翘10g。

称取处方比例的柴胡(40目)、连翘(20目)和野菊花(20目)用常规水蒸气蒸馏法提取挥发油2小时，提取挥发油过程中产生的药液浓缩后加入总提液中备用。

称取β-CD(β-环糊精)2.0039g，置于研钵内，再量取4ml(2倍量)蒸馏水加入研钵中，充分混合研磨成糊状；同时精密量取0.5ml挥发油(用无水乙醇溶解为2ml，混匀)，用滴管加入β-CD糊状物中，边滴边研磨。研匀后置于40℃烘箱内烘干部分水分，滤过，滤渣用15ml石油醚分三次洗涤沉淀；沉淀再于40℃下干燥4h，即得包合物，称重为1.9841g。收得率为83.68％。包合率为62.5％。

水蒸气蒸馏法提取挥发油的药渣，用95％乙醇提取。其余操作步骤同实施例1。用5％PVP醇水(50％)溶液作粘合剂，颗粒成形，外形较好。

实施例4

处方：野菊花5g，柴胡5g，连翘5g。

称取处方比例的柴胡(40目)、连翘(20目)和野菊花(20目)置于超临界萃取装置中，调整萃取压力为20MPa和萃取温度为40℃，待仪器稳定后萃取2.5小时后，在出料口接收萃取物，称量萃取物的重量，并与最佳萃取条件计算出的理论含量相比，得率为95.58％。

称取β-CD2.0011g，置于胶体磨内，再量取8ml(4倍量)蒸馏水加入，研匀后加入精密量取的0.5ml挥发油(用无水乙醇溶解为2ml，混匀)，充分研磨至糊状，滤过，滤渣用15ml石油醚分三次洗涤，沉淀于40℃下干燥4h即得包合物，称重为1.9853g。收得率为83.70％。包合率为62.5％。

超临界提过挥发油的药渣，用75％乙醇提取。其余操作步骤同实施例1。用5％淀粉浆(煮浆法)作粘合剂，颗粒成形，外形较好。

实施例5

处方：野菊花5g，柴胡10g，连翘10g，黄芩(酒炙)10g，金银花10g，苦杏仁(炒)8g。

称取处方比例的柴胡(40目)、连翘(20目)和野菊花(20目)置于超临界萃取装置中，调整萃取压力为20MPa和萃取温度为40℃，待仪器稳定后萃取2.5小时后，在出料口接收萃取物，称量萃取物的重量，并与最佳萃取条件计算出的理论含量相比，得率为95.58％。

金银花的超临界萃取：称取40目金银花药材置于超临界萃取装置中，调整萃取压力为20MPa和萃取温度为45℃，待仪器稳定后吸入式加入95％乙醇(95％乙醇∶药材＝0.35∶1)作为夹带剂，萃取1小时后，在出料口接收萃取物，自然挥去乙醇后，称量干燥物的重量，并计算得率。

称取β-CD(β-环糊精)2g，置于研钵内，再量取8ml(4倍量)蒸馏水加入研钵中，充分混合研磨成糊状；同时精密量取0.5ml挥发油(用无水乙醇溶解为2ml，混匀)，用滴管加入β-CD糊状物中，边滴边研磨。研匀后置于40℃烘箱内烘干部分水分，滤过，滤渣用15ml石油醚分三次洗涤沉淀；沉淀物再于40℃条件下干燥，即得包合物。在显微镜下观察，明显可见包合物与不含挥发油的包合物形状不同，晶格排列发生变化，由此初步说明包合物已形成。

黄芩、苦杏仁，加入超临界提过挥发油的药渣，用75％乙醇提取。其余操作步骤同实施例1。用5％PVP醇水(50％)溶液作粘合剂，颗粒成形，外形较好。

实施例6

处方：野菊花10g，柴胡10g，连翘10g，黄芩(酒炙)50g，金银花50g，苦杏仁(炒)40g。

称取处方比例的柴胡(40目)、连翘(20目)、金银花(40目)和野菊花(20目)置于超临界萃取装置中，调整萃取压力为20MPa和萃取温度为40℃，待仪器稳定后萃取2.5小时后，在出料口接收萃取物，称量萃取物的重量，并与最佳萃取条件计算出的理论含量相比，得率为78.31％。

称取β-CD2.0002g，加蒸馏水40ml，沸水浴加热使溶解，置40℃水浴冷却。在电动搅拌机(转速100-200r/min)搅拌下，控制温度为40℃，滴加精密量取的挥发油0.5ml(用无水乙醇溶解为2ml，混匀)，搅拌1h，得大量沉淀。混合物在冰箱中3～5℃放置24h，滤过，滤渣用15ml石油醚分三次洗涤，固形物40℃干燥4h，得挥发油β-CD包合物1.9917。收得率为84.03％。包合率为75％。

黄芩、苦杏仁，加入超临界提过挥发油的药渣，用90％乙醇提取。其余操作步骤同实施例1。用85％乙醇作粘合剂，颗粒成形，外形较好，硬度合适。

实施例7

处方：野菊花5g，柴胡6g，连翘6g，黄芩(酒炙)5g，金银花5g，苦杏仁(炒)4g。

称取处方比例的柴胡(40目)、连翘(20目)、金银花(40目)和野菊花(20目)常规进行水蒸汽蒸馏法提取挥发油，加水量为药材重量的5倍，先浸泡2小时，回流3小时后再蒸馏1小时。提取挥发油过程中产生的药液浓缩后加入总提液中备用。

称取β-CD1.9994g，加蒸馏水40ml，沸水浴加热使溶解，置40℃水浴冷却后滴加精密量取的挥发油0.5ml(用无水乙醇溶解为2ml，混匀)，摇匀，置超声仪上超声1h，得大量沉淀。混合物在冰箱中3～5℃放置24h，滤过，滤渣用15ml石油醚分三次洗涤，固形物40℃干燥4h，得挥发油β-CD包合物1.9912g。收得率为84.01％。包合率为70％。

黄芩、苦杏仁加入水蒸汽蒸馏法提取挥发油后的药渣，用70％乙醇提取。其余操作步骤同实施例1。用10％淀粉浆(冲浆法)作粘合剂，颗粒成形，外形较好，硬度合适。

实施例8

处方：野菊花8g，柴胡10g，连翘10g，黄芩8g，金银花8g，苦杏仁6g。

称取处方比例的柴胡(40目)、连翘(20目)、金银花(40目)和野菊花(20目)置于超临界萃取装置中，调整萃取压力为20MPa和萃取温度为40℃，待仪器稳定后萃取2.5小时后，在出料口接收萃取物，称量萃取物的重量，并与最佳萃取条件计算出的理论含量相比，得率为78.31％。

称取β-CD1.9994g，加蒸馏水40ml，沸水浴加热使溶解，置40℃水浴冷却后滴加精密量取的挥发油0.5ml(用无水乙醇溶解为2ml，混匀)，摇匀，置超声仪上超声1h，得大量沉淀。混合物在冰箱中3～5℃放置24h，滤过，滤渣用15ml石油醚分三次洗涤，固形物40℃干燥4h，得挥发油β-CD包合物1.9912g。收得率为84.01％。包合率为70％。

黄芩、苦杏仁，加入超临界提过挥发油的药渣，用80％乙醇提取。其余操作步骤同实施例1。用5％淀粉浆(煮浆法)作粘合剂，颗粒成形，外形较好，装入胶囊。

实施例9

处方：野菊花50g  柴胡100g  连翘100g  黄芩(酒炙)50g  金银花50g  苦杏仁(炒)40g

1、取处方量金银花、野菊花、连翘、黄芩、柴胡和苦杏仁饮片。

2.将连翘、柴胡和野菊花，常规水蒸汽方法提取挥发油，加水量为药材重量的5倍，先浸泡2小时，回流3小时后再蒸馏2小时。

3.挥发油的包合：(按重量/重量比，即1克挥发油用8克β-环糊精)取挥发油8倍量的β-环糊精，加入到环糊精12倍量(按重量/重量比，即1克β-环糊精用12克水)的蒸馏水中，沸水浴加热使溶解，置于40℃水浴中冷却。在78HW-1型电动搅拌机(转速100-200r/min)搅拌下，水浴条件下控制温度为40℃，缓慢滴加挥发油，搅拌1小时，得大量沉淀。混合物在冰箱中3～5℃冷藏24小时，滤过，滤渣用石油醚分次洗涤，固形物40℃干燥，得挥发油β-环糊精包合物。得率为93.8％。

4.药材的提取：将提取过挥发油的金银花、连翘、柴胡和野菊花药材与处方量的黄芩及苦杏仁合并，置多功能提取罐中，加入5倍量65％乙醇，浸泡过夜，提取3次，每次加入5倍量65％乙醇，每次提取时间为1小时，提取液滤过，合并三次滤液，得提取液。

5.提取液的浓缩：把提取液放入B-10单放浓缩器中，在65℃、0.08Mpa条件下回收乙醇，得浸膏，浸膏的相对密度为1.3(60℃测定)。

6.提取物的干燥：将浸膏置于101型的真空干燥箱中，于80℃、0.08Mpa条件下干燥12小时，得干燥物。干燥提取物的得率为23.96％。用多功能型粉碎机粉碎成粉末(80目)。8.颗粒的制备：用多维混合机将环糊精包合物和药材粉末均匀混合，再与可溶性淀粉、淀粉以1∶1∶0.2的比例混合，搅拌混合30分钟。以85％乙醇作粘合剂，用制粒机制粒(10目)，制好的颗粒置于65℃、0.08Mpa条件下烘干。将干燥颗粒装入胶囊。日服3次，每次1袋；小儿酌减，症重加倍。

实施例10

药效学研究表明，本发明药物组合物不但具有抗炎、镇痛、解热、止咳、祛痰的确切作用，而且具有明显的体内外抗病毒及体外抑菌作用。

一、实验材料

1.试药：按实验例1制得的本发明药物组合物，每袋10g。用法用量：口服，一次2袋，一日3次。

2.阳性对照药：双黄连口服液：来源：黑龙江圣泰制药有限公司  批号：030304  规格：10ml×10支/盒  功能主治：清热解毒，祛痰止咳。用于上呼吸道感染。用法用量：口服，一次2支，一日3次。

3.实验动物：昆明种小鼠：体重18～22g，雌雄兼用，来源于黑龙江中医药大学实验动物中心，合格证号：黑动字第P00101006号。Wistar属大鼠，体重180～220g，雄性，来源于黑龙江中医药大学实验动物中心，合格证号：黑动字第P00102004号。

二、实验方法与步骤

(一)抗炎试验

(1)对大鼠足跖肿胀的影响

取140～160g雄性大鼠50只，随机分为5组，分别是：本发明药物组合物高剂量组10.8g/kg，本发明药物组合物中剂量组5.4g/kg，本发明药物组合物低剂量组2.7g/kg，阳性对照组双黄连口服液10.8ml/kg，空白对照组给予等容量生理盐水。连续给药7d，末次给药0.5h后从右后足跖心向踝关节方向皮下注0.1ml蛋清。分别测定注射后0.5、1.0、2.0、3.0h和注射前右后足的体积。结果见表1。

表1、本发明药物组合物、双黄连口服液对大鼠足跖肿胀的影响

组别	动物数(n)	右后足正常体积(ml)	致炎后不同时间(h)右后足跖体积(ml)
							0.5h	1.0h	2.0h	3.0h
			高剂量组	10	1.079±0.165	1495±0.220*					1.457±0.218*	1.333±0.191*	1.275±0.226*
中剂量组	10	0.965±0.138					1.484±0.225*	1.376±0.238*	1.432±0.240	1.473±0.290
			低剂量组	10	1.054±0.222	1.759±0.295					1.658±0.341	1.471±0.227	1.448±0.192
阳性对照	10	1.112±0.167					1.1642±0.199*	1.453±0.170*	1.438±0.174*	1.321±0.156*
			空白对照组	10	1.067±0.235	1.938±0.404					1.736±0.230	1.668±0.271	1.605±0.265

注：各用药组与空白对照组比较^*P＜0.05 ^**P＜0.01

实验结果：本发明药物组合物具有抗炎作用。

(2)对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响

取25～30g健康雄性小鼠50只随机分为5组，分别是：本发明药物组合物高剂量组15.6g/kg，本发明药物组合物中剂量组7.8g/kg，本发明药物组合物低剂量组3.9g/kg，阳性对照组双黄连口服液15.6ml/kg，空白对照组给予等容量生理盐水，连续给药7d，末次给药1h后于小鼠右耳廓两面均匀涂布二甲苯0.02ml/只致炎，致炎3h后断椎处死。结果见表2。

表2、本发明药物组合物、双黄连口服液对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响

组别	动物数(n)	肿胀程度(mg)	肿胀率(％)
				高剂量组	10	1.20±0.57*	38.91±18.63*
中剂量组	10	1.61±0.62	54.48±19.05
				低剂量组	10	1.79±0.65	66.08±25.20
阳性对照组	10	1.57±0.55*	58.07±22.20
				空白对照组	10	2.08±0.41	69.19±17.49

注：各用药组与空白对照组比较^*P＜0.05 ^**P＜0.01

实验结果本发明药物组合物具有抗炎作用。

(3)对腹腔注射醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增高的影响

取体重18～22g健康雄性小鼠50只，分为5组，每组10只，分别是：本发明药物组合物高剂量组15.6g/kg，本发明药物组合物中剂量组7.8g/kg，本发明药物组合物低剂量组3.9g/kg，阳性对照组双黄连口服液15.6ml/kg，空白对照组给予等容量生理盐水。采用灌胃给药，连续7d，末次给药1h后各鼠均静注0.5％伊文思蓝生理盐水溶液0.1ml/10g，随即腹腔注射0.6％醋酸0.20ml/只，20min后断椎处死，用6ml生理盐水分三次洗涤腹腔，吸出洗涤液、合并后加入生理盐水至10ml，3000转离心15min，取上清夜于590nm比色测定光密度，以平均光密度值做t检验。结果见表3。

表3、药物对腹腔注射醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增高的影响

组别	动物数(只)	光密度
			高剂量组	10	0.455±0.132**
中剂量组	10	0.444±0.106**
			低剂量组	10	0.470±0.125*
阳性对照组	10	0.406±0.117*
			空白对照组	10	0.579±0.105

注：各用药组与空白对照组比较^*P＜0.05 ^**P＜0.01

实验结果：本发明药物组合物具有抗炎作用。

(二)止痛试验

(1)热板法：取体重18～22g经痛阈筛选合格(痛阈在5～30s)的雌性小鼠50只，随机分为5组，分别是：本发明药物组合物高剂量组15.6g/kg，本发明药物组合物中剂量组7.8g/kg，本发明药物组合物低剂量组3.9g/kg，阳性对照组双黄连口服液15.6ml/kg，空白对照组给予等容量生理盐水，给药前测定其自放在热板上至出现舔后足所需时间作为该鼠正常痛阈值。结果见表4。

表4、本发明药物组合物、双黄连口服液对小鼠热板痛阈值的影响

组别	数量(n)	给药前痛阈(秒)	给药后不同时间痛阈(秒)
						15min	30min	60min
			高剂量组	10	14..35±2.58				34.19±6.02**	23.11±3.25**	19.58±2.21**
中剂量组	10	14..59±2.27				30.28±6.26**	21.23±4.00*	16.66±3.31
			低剂量组	10	15.36±2.30				30.12±4.62**	20.73±4.29*	17.18±3.44
阳性对照组	10	14.15±2.17				30.13±4.38**	27.82±3.94**	20.82±3.59**
			空白对照组	10	14.12±3.32				22.44±2.69	16.90±2.72	15.21±2.89

注：各用药组与空白组比较^*P＜0.05 ^**P＜0.01

实验结果：本发明药物组合物具有镇痛作用。

(2)醋酸扭体法 取体重18～22g小鼠50只，随机分为5组，每组10只。分别是：本发明药物组合物高剂量组15.6g/kg，本发明药物组合物中剂量组7.8g/kg，本发明药物组合物低剂量组3.9g/kg，阳性对照组双黄连口服液15.6ml/kg，空白对照组给予等容量生理盐水，采用灌胃给药连续7d。末次给药0.5h后腹腔注射0.6％醋酸0.2ml/只。观察20min内各鼠出现扭体反应次数，结果见表5。

表5本发明药物组合物、双黄连口服液对小鼠醋酸反应次数的影响

组别	动物数(只)	扭体反应次数(次)
			高剂量组	10	15.2±3.85**
中剂量组	10	16.1±5.07**
			低剂量组	10	16.0±6.43*
阳性对照组	10	14.6±4.65**

空白对照组

10

26.8±8.94

注：各用药组与空白对照组比较^*P＜0.05 ^**P＜0.01

实验结果：本发明药物组合物具有镇痛作用。

(三)解热试验

(1)酵母法：取体重150～200g，雌雄各半大鼠，用体温计间隔1h测直肠体温两次，以平均值作为基础体温。选取体温变化不超过0.3℃者50只，将其随机分为5组，每组10只。即本发明药物组合物高剂量组10.8g/kg，本发明药物组合物中剂量组5.4g/kg，本发明药物组合物低剂量组2.7g/kg，阳性对照组双黄连口服液10.8ml/kg，空白对照组给予等容量生理盐水。采用灌胃给药，连续7d。末次给药0.5h后各小鼠于背部皮下注射20％酵母混悬液10ml/kg。结果见表6。

表6本发明药物组合物、双黄连口服液对酵母所致大鼠发热的影响

注：各用药组与空白对照组比较^*P＜0.05 ^**P＜0.01

实验结果：本发明药物组合物具有解热作用。

(2)2，4-二硝基苯酚法：取体重150～200g，雌雄性大鼠，用体温计间隔1h测直肠体温2次，以平均值作为基础体温。选取体温变化不超过0.3℃者50只，将其随机分为5组，每组10只。即本发明药物组合物高剂量组10.8g/kg，本发明药物组合物中剂量组5.4g/kg，本发明药物组合物低剂量组2.7g/kg，阳性对照组双黄连口服液10.8ml/kg，空白对照组给予等容量生理盐水。采用灌胃给药，连续7d。末次给药0.5h后每鼠于背部皮下注射2，4-二硝基苯酚1ml/100g(15mg/kg)。结果见表7。

表7本发明药物组合物、双黄连口服液对2，4-二硝基苯酚所致大鼠发热的影响(X±S)

注：各用药组与生理盐水组比较^*P＜0.05 ^**P＜0.01

实验结果：本发明药物组合物高剂量组从20min到180min都有降温作用P＜0.01。

(四)止咳试验

取体重18～22g，健康小鼠50只，将其随机分为5组，每组10只。即本发明药物组合物高剂量组15.6g/kg，本发明药物组合物中剂量组7.8g/kg，本发明药物组合物低剂量组3.9g/kg，阳性对照组双黄连口服液15.6ml/kg，空白对照组给予等容量生理盐水。采用灌胃给药，连续7d。末次给药1h后每只小鼠于接受5秒钟浓氨水喷雾，取出小鼠，观察1min内咳嗽次数。

表8、本发明药物组合物、双黄连口服液对浓氨水所致小鼠咳嗽的影响

组别	动物数(只)	咳嗽次数
			高剂量组	10	4.0±1.49**
中剂量组	10	8.2±2.70*
			低剂量组	10	8.9±2.77
阳性对照组	10	4.5±1.58**
			空白对照组	10	10.8±3.94

注：各用药组与空白对照组比较^*P＜0.05 ^**P＜0.01

实验结果：本发明药物组合物具有止咳作用。

(五)祛痰试验

取健康小鼠，体重18～22g，雌雄各半，将其随机分为5组，每组10只。即本发明药物组合物高剂量组15.6g/kg，本发明药物组合物中剂量组7.8g/kg，本发明药物组合物低剂量组3.9g/kg，阳性对照组双黄连口服液15.6ml/kg，空白对照组给予等容量生理盐水。采用灌胃给药，连续7d。末次给药0.5h后每只鼠腹腔注射酚红0.1ml(5mg)/10g体重，注射酚红后0.5h处死动物，剥离气管周围组织，剪下自甲状软骨至气管分支处的一段气管，放入盛有2ml生理盐水的试管中，再加0.1ml氢氧化钠，用722型分光光度计，波长546nm测OD值，以平均光密度值做t检验。结果见表9。

表9、本发明药物组合物、双黄连口服液对小鼠气管段酚红排泌的影响

组别	动物数(只)	光密度
			高剂量组	10	0.1996±0.0666**
中剂量组	10	0.2474±0.0843*
			低剂量组	10	0.3019±0.1432
阳性对照组	10	0.1425±0.0421**
			空白对照组	10	0.3595±0.0890

注：各用药组与空白对照组比较^*P＜0.05 ^**P＜0.01

实验结果：本发明药物组合物具有祛痰作用。

(六)本发明药物组合物体内外抗病毒及体外抑菌作用

实验材料

受试药物实施例1制备的本发明药物组合物，1.87g生药/g制剂，，以三蒸水配制成1g生药/ml，隔水煮沸20分钟灭菌，用于体外抗病毒和抑菌试验。配制成29.2、14.6、7.3g生药/kg，用于体内抗病毒试验。

对照药双黄连口服液，1.5g生药/ml，哈药集团三精制药有限责任公司生产，批号：03012912，以三蒸水配制成1g生药/ml，隔水煮沸20分钟灭菌，用于体外抗病毒和抑菌试验。体内试验剂量设计：双黄连口服液临床日用量为90g生药/天，按60公斤体重计算为1.5g生药/kg，按动物与人公斤等效剂量折算，小鼠用16.5g生药/kg相当于临床等效剂量，选用临床等效剂量的2倍量33.0g生药/kg进行体内抗病毒试验。

病毒唑(三氮唑核苷Ribavirin)原料药，湖北省医药工业研究所产品，批号：020606，配成4mg/ml过滤除菌，用于体外抗病毒试验。

病毒流感病毒甲₃型(A₃)、副流感病毒1型(HVJ)、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒3型(ADV₃)、腺病毒7型(ADV₇)、单纯疱疹病毒1型  (HSV-1)，用于体外试验；流感病毒鼠肺适应株FM1，用于体内试验。均购自中国预防医学科学院病毒学研究所，本实验室传代后保存于-60℃冰箱备用。

动物ICR小鼠，体重13～15g，雌雄各半，用于体内抗病毒试验，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号为SCXK(京)2002-0003。

细菌 标准株：金黄色葡萄球菌26112(ATCC25923)、大肠杆菌4413(ATCC25922)、绿脓假单胞菌10211(ATCC27853)、变形杆菌49027、乙型溶血性链球菌32210各1株。

临床分离株：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌各9株、B族链球菌7株，肺炎克雷伯杆菌8株，分别由北京市积水潭医院和北京大学第一医院细菌室分离鉴定并提供。

细胞 人喉癌传代细胞Hep-2株，购自卫生部药品生物制品检定所。细胞培养液含10％小牛血清、0.29mg谷氨酰胺/ml、100u/ml青、链霉素的Eagle’s MEM(日本日水制药株式会社出品)。细胞维持液  除所含小牛血清为2％外，其他含量均同培养液。细菌培养基 营养琼脂培养基，批号030324，营养肉汤培养基，批号020918，均由中国药品生物制品检定所监制。仪器CO₂培养箱，日本Yamato科学株式会社生产。倒置显微镜，OLYMPUS牌。

试验方法[参考文献：贺玉琢、高英杰、富杭育.正柴胡饮的抗病毒作用的实验研究中国实验方剂学杂志 1996；2(1)：12；中华人民共和国卫生部药政局，新药(西药)临床前研究指导原则汇编(药学药理学毒理学)，163页，1993.7；卢长安，中西医结合病毒学研究技术与方法，孟庆云主编，中西医结合基础理论研究方法与实验技术，第一版，390～420页，北京：中国古籍出版社，1999.3。]

一、体外抗病毒试验

1、对Hep-2培养细胞的毒性试验

试验方法 按常规试验操作，将瓶中Hep-2细胞消化下来，接种于96孔细胞培养板中，置37℃5％CO₂培养箱中培养2天，长成单层细胞后，进行试验：将培养板中的培养液倾去，将试药以维持液连续2倍稀释11个浓度，加入板中200μl/孔，每稀释度加4孔，第12列不加药液作正常细胞对照。将培养板置37℃5％CO₂培养箱中培养3天，每日用倒置显微镜观察药液对细胞的影响。

表示药物对细胞的毒性程度分级：“-”：表示细胞生长基本正常，未出现中毒现象；“1”：表示中毒细胞发生率在25％以下；“2”：表示中毒细胞发生率在25％～50％之间；“3”：表示中毒细胞发生率在50％～75％之间；“4”：表示中毒细胞已在75％以上。若毒性为“1”及其以下“-”，则视为阴性，可认为此浓度药样对细胞无中毒现象，其余的“2”及其以上各级，均视为阳性，即所试药样在此浓度对细胞有中毒作用。

按上述方法取得试验结果利用Reed-Muench法计算50％毒性浓度(TC₅₀)如下：

本发明药物组合物的TC₅₀＝2.82mg生药/ml，TC₀＝1.95生药/ml，双黄连口服液的TC₅₀＝5.62mg生药/ml，TC₀＝3.91mg/ml，病毒唑Ribavirin的TC₅₀＝0.714mg/ml，TC₀＝0.5mg/ml。

选择对细胞生长无影响的最大无毒浓度TC₀及其以下浓度作抗病毒验。

2、各病毒滴度(TCID₅₀)的测定

按常规试验操作，将瓶中Hep-2细胞消化下来，接种于96孔细胞培养板中，置37℃5％CO₂培养箱中培养2天，长成单层细胞后，进行病毒毒力滴定试验，测定出各病毒的滴度(TCID₅₀)。具体操作为：将各病毒以细胞维持液作10倍连续稀释7个浓度，倒去细胞板中培养液，加入维持液100μl/孔，再将每稀释度病毒液加入板中4孔，每孔100μl，留1行不加病毒液改加维持液作为正常细胞对照。置37℃5％CO₂培养箱中培养，次日开始观察细胞病变(CPE)3天，以最后1日的CPE为准(判断标准同下)，以Reed-Muench法计算各病毒的TCID₅₀。

按上述方法滴定结果如下：

表10、病毒滴度(TCID₅₀)的测定

病毒	A3	RSV	HVJ	HSV-1	ADV3	ADV7
							TCID50	-4	-6	-5	-4	-4	-4

3、对病毒致细胞病变作用的影响

取已长成单层细胞的培养板，倒掉培养液，接种100 TCID₅₀的不同病毒液100μl于细胞孔，每一块细胞板接种二种病毒(各加6列)，留第8行不接种病毒作正常细胞对照。置37℃5％CO₂培养箱中吸附2小时，倒掉病毒液，用不含小牛血清的Eagle’s维持液洗细胞面1次后，加入从最大无毒浓度TC₀起倍比稀释5个浓度的药液(1～5行)200μl/孔，各浓度加3孔。第6行加1/4TC₅₀(0.714/4＝0.197mg/ml)Ribavirin，第7行不加药液作病毒对照，第8行为未感染未加药的正常细胞对照。置37℃5％CO₂培养箱中培养3天，每日在倒置显微镜下镜检CPE进展。细胞病变程度的判断：“-”：细胞生长正常，无病变出现；“1”：细胞病变约占整个单层细胞的＜25％；“2”：细胞病变约占整个单层细胞的25％～50％；“3”：细胞病变约占整个单层细胞的50％～75％；“4”：细胞病变约占整个单层细胞的75％～100％。

根据以上细胞病变五级标准判断，利用Reed-Muench法计算50％有效浓度(EC₅₀)，并求出治疗指数(TI＝TC₅₀/EC₅₀)，TI值越高，表明药效作用越强。

按上述方法通过两次试验结果表明，本发明药物组合物对流感病毒甲₃型(A₃)、副流感病毒1型(HVJ)、呼吸道合胞病毒(RSV)均显示出显著的抑制作用，其中本发明药物组合物对副流感病毒抑制作用显著，且对腺病毒3型(ADV₃)有明显的抑制作用。双黄连口服液对各病毒的抑制强度相对较弱，对腺病毒3型(ADV₃)无抑制作用。详见下表11。

表11、本发明药物组合物对常见呼吸道感染有关病毒的作用

病毒	本发明药物组合物				双黄连口服液				病毒唑Ribavirin(1，2次同)
										第1次		第2次		第1次		第2次
	EC50	TI	EC50	TI	EC50	TI	EC50	TI
										A3HVJRSVAd3	0.600.350.710.84	4.78.14.03.4	0.420.420.710.84	6.76.74.04.4	1.410.841.68	4.06.73.3	1.230.841.68-	4.66.73.3	++++

注：1.表中EC₅₀单位为mg生药/ml。

2.表中“+”为有抑制作用，“-”为无抑制作用，EC₅₀为50％有效浓度，TI为治疗指数TI＝TC₅₀/EC₅₀。

二、体内抗病毒试验(小鼠流感病毒性肺炎)

取13～15g健康小鼠，雌雄各半，按体重随机分为6组，每组10只，分别灌胃给药，本发明药物组合物以29.2、14.6、7.3g生药/kg三个剂量给予，双黄连口服液以33g生药/kg给予，对照组给予相同体积的蒸馏水。除正常对照组外，其余各组小鼠以乙醚轻度麻醉，用15LD₅₀的流感病毒鼠肺适应株FM1滴鼻感染小鼠，0.05ml/只。于感染前1d开始灌胃给药，正常对照组和病毒感染对照组给予同体积蒸馏水，每日2次，连续5d。第6天后取称小鼠体重后，固定，放血，解剖，摘取全肺称重(10％甲醛固定，进行病理组织学检查)。计算肺指数值，并求出肺指数抑制率。肺指数值大，表示肺部病变程度严重。将各组肺指数值进行t检验，比较组间差异性。

肺指数＝[肺重(g)/体重(g)]×100

病理组织学检查肺部及细支气管炎症病变程度判断标准：“-”小鼠肺部及细支气管正常结构，间质未见炎症；“+”小鼠肺部及细支气管有轻度炎症，间质充血：“++”小鼠肺部及细支气管有炎症浸润，以淋巴为主，有少量单核等炎症细胞；“+++”小鼠肺部及细支气管均有炎症浸润，间质大量炎症细胞，以淋巴、单核为主，并有中性分叶核：“++++”小鼠肺部及细支气管有弥漫性炎症浸润，以淋巴、单核为主，并有大量中性分叶核，肺泡融合，间质瘀血。

病理检查结果按秩和检验进行统计学处理。

表12、本发明药物组合物对小鼠流感病毒性肺炎的抑制作用

组别	剂量(g/kg)	鼠数(n)	肺指数(x±sd)	体重(x±sd)	抑制率(％)
						病毒对照组正常对照组双黄连口服液本发明药物组合物本发明药物组合物本发明药物组合物	--3329.214.67.3	101010101010	1.59±0.400.88±0.061.30±0.12*1.24±0.13*1.28±0.10*1.32±0.37	13.81±1.4919.95±1.0115.24±1.55*15.64±1.36*15.26±1.08*14.66±2.00	-18.4522.0219.3216.56

注：与病毒对照组比较^*P＜0.05。

表13、本发明药物组合物对小鼠流感病毒性肺炎的抑制作用

组别	剂量(g/kg)	鼠数(n)	肺部及细支气管炎症病变程度					秩和检验H值
									-	+	++	+++	++++
			正常对照组模型对照组双黄连口服液本发明药物组合物本发明药物组合物本发明药物组合物	--3329.214.67.3	101010101010	1000000	004340							033536	043234	030000	55.0**74.5*72.5*74.5*84.0

注：与模型组相比^*P＜0.05，^**P＜0.01 H0.05＝78，H0.01＝71

表12、13结果可见，感染病毒后小鼠体重明显降低、肺指数值明显提高、大量炎症细胞浸润。本发明药物组合物高、中剂量组对流感病毒感染小鼠引起的肺炎均有显著性的抑制作用，可使感染小鼠体重明显增加，肺指数值明显降低；肺病变程度明显减轻(病理报告略去)。

三、体外抑菌试验(琼脂稀释法)

将试药以1/8比例加入已融化的营养琼脂中，并做系列倍比稀释，倾注成含不同药液浓度的平板培养基。另用比浊法，将增菌16h的各菌种比浊至麦氏1号管(3亿菌/ml)，再将各菌做适当稀释，各吸取5μl滴加于平板上，同时设细菌对照，阳性药对照。将接种完的平皿置于37℃培养箱中培养，24h后观察结果，记录各菌生长及最低抑菌浓度MIC。

本发明药物组合物和双黄连口服液在体外对所试的6种细菌56种菌株均有不同程度的抑制作用，对金黄色葡萄球菌和变形杆菌的抑制作用本发明药物组合物强于双黄连口服液，其余细菌的抑制作用强度基本相同，详见表14。

表14、本发明药物组合物对各种菌的平均最低抑菌浓度(MIC±SDmg生药/ml)

	金葡(10)	大肠(10)	绿脓(10)	变形(10)	B链(8)	肺炎(8)
							本发明药物组合物双黄连口服液	6.89±5.24**20.31±9.89	34.38±16.1346.88±20.83	21.49±10.9332.81±17.19	16.80±10.75*32.81±17.19	14.04±12.6122.95±20.40	13.18±8.5921.50±8.08

注：()内的数字为菌株数，与双黄连口服液比较^*P＜0.05，^**P＜0.01。

按上述方法通过两次试验结果表明，本发明药物组合物对流感病毒甲₃型(A₃)、副流感病毒1型(HVJ)、呼吸道合胞病毒(RSV)均显示出显著的抑制作用，其中本发明药物组合物对副流感病毒抑制作用显著，且对腺病毒3型(ADV₃)有明显的抑制作用；双黄连口服液对各病毒的抑制强度相对较弱，对腺病毒3型(ADV₃)无抑制作用。体内试验显示：感染病毒后小鼠体重明显降低、肺指数值明显提高、大量炎症细胞浸润。本发明药物组合物高、中剂量组对流感病毒感染小鼠引起的肺炎均有显著性的抑制作用，可使感染小鼠体重明显增加，肺指数值明显降低；肺病变程度明显减轻。本发明药物组合物在体外对所试的6种细菌56种菌株均有不同程度的抑制作用，对金黄色葡萄球菌和变形杆菌的抑制作用本发明药物组合物强于双黄连口服液，其余细菌的抑制作用强度基本相同。

中药研究所实验动物病理检查报告 肉眼观察：正常对照组小鼠肺组织及支气管周围结构正常，模型组大部分小鼠肺组织瘀血，暗褐色，表面有渗出，本发明药物组合物大、中、小剂量组和双黄连口服液组与模型对照组相比肺部炎症均有不同程度的减轻。镜下观察：正常对照组小鼠肺间质及支气管周围未见有炎症浸润，结构正常。

模型组大部分小鼠肺间质可见大量炎症细胞浸润，以淋巴细胞为主，并有单核，中性及分叶核细胞，肺泡间质融合，形成肺大泡，间质大量瘀血，支气管周围大量炎症细胞浸润，少部分细支气管腔内有纤毛上皮及炎症细胞脱落。本发明药物组合物大、中剂量组和阳性药组小鼠肺部病变程度与模型组相比均有明显减轻。

表15、对小鼠肺部及细支气管炎的影响

组别	剂量(g/kg)	鼠数(n)	肺部及细支气管炎症病变程度					秩和检验H值
									-	+	++	+++	++++
			正常对照模型对照双黄连口服液本发明药物组合物本发明药物组合物本发明药物组合物	----3329.214.67.3	101010101010	1000000	004340							033536	043234	030000	55.0**74.5*72.5*74.5*84.0

注：与模型组相比^*P＜0.05，^**P＜0.01 H0.05＝78，H0.01＝71

该批试验给药组小鼠肺间质及细支气管的炎症与模型组相比，有不同程度的减轻，尤以本发明药物组合物大、中剂量及阳性对照药双黄连口服液组的肺和细支气管病变减轻明显。

(七)急性毒性实验：本发明药物组合物以67％浓度，一日内一次灌胃给药，每次0.8ml/20g，没有测出LD₅₀.。最大给药量为53.6g/kg，相当于临床人用量的125倍。

所以在固定其它药味和药量(金银花5g、黄芩5g、苦杏仁4g)不变的条件下，将野菊花、柴胡、连翘三味药物作为三个因素，将其不同的用量作为不同水平进行筛选。

实施例11

“野柴翘”药团实验研究

实验表明：野菊花1-5g，柴胡1-10g，连翘1-10g范围，“野柴翘”药团的抗病毒效高、抗病毒谱广，且解热、抗炎作用显著，优选的配比为野菊花5g、柴胡10g、连翘10g。即本发明药物组合物中的野菊花、柴胡和连翘组成的药团与金银花、黄芩、苦杏仁组配时，在抗病毒、解热、抗炎方面其协同作用明显。

表16、“野柴翘”药团筛选因素水平表

水平	因素
				A野菊花g	B柴胡g	C连翘g
	1	0	10				1
2				5	5	5
	3	1	1				10

表17、“野柴翘”药团筛选实验正交安排[L₉(3)⁴]表

实验号	因素			考察指标抗病毒的种类及其抗病毒的结果TI值
								A	B	C	A3流感病毒甲3型	HVJ副流感病毒	RSV合胞病毒	AD3腺病毒3型
	1	0	10	1	0.28	3.6	1.7								1.4
2								0	5	5	0.24	2.6	1.4	2.0
	3	0	1	10	0.30	3.8	1.8								2.6
4								5	10	5	0.44	7.4	3.8	3.2
	5	5	5	10	0.45	7.6	3.9								3.1
6								5	1	1	0.32	.4.0	2.0	2.2
	7	1	10	10	0.39	7.0	3.6								3.3
8								1	5	1	0.22	2.8	1.6	1.4

9		1	1	5	0.21	4.4	2.4	1.6
									A3	K1	0.27	0.37	0.27	A2C3B1
K2	0.40	0.30	0.30
				K3	0.27	0.28	0.38
R	0.13	0.09	0.11
				HVJ	K1	3.33	6.00	3.47		A2C3B1
K2	6.33	4.33	4.80
					K3	4.73	4.07	6.13
R	3.00	1.93	2.66
					RSV	K1	1.63	3.03	1.77					A2C3B1
K2	3.23	2.30	2.53
				K3		2.53	2.07	3.10
R	1.6	0.96	1.33
				AD3		K1	2.00	2.63	1.67	C3A2B1
K2	2.83	2.17	2.27
					K3	2.10	2.13	3.00
R	0.83	0.54	1.33

注：TI为抗病毒指数，TI值越大表示药物的抗病毒作用越强。TI＝TC₅₀/EC₅₀。

TC₅₀为50％细胞毒性浓度，单位为：mg生药/ml。

EC₅₀为50％有效浓度，单位为：mg尘药/ml。

综合上述抗病毒实验结果显示，最佳的药团组合为A₂C₃B₁，既野菊花5g、柴胡10g、连翘10g。但是，C₃、B₁均为边缘水平，所以要进行补救实验，固定A₂(野菊花5g)，变B₁为15g(柴胡15g)，变C₃为15g(连翘15g)，以A₂C_增补B_增补组成新的药团(野菊花5g、柴胡15g、连翘15g)与筛选出的A₂C₃B₁药团(野菊花5g、柴胡10g、连翘10g)，分别加入固定药物[黄芩5-10克，金银花5-10克，苦杏仁4-8克(实验方法相同、数据略)：优选黄芩5-8克，金银花5-8克，苦杏仁4-6克(实验方法相同、数据略)]金银花5g、黄芩5g、苦杏仁4g(实验数据见表18、19))后进行比较实验，两组比较实验的结果如下。

表18、筛选出的A₂C₃B₁药团与补作的A₂C_增补B_增补组成新的药团实验结果比较

实验组别	抗病毒的种类及其抗病毒的结果(TI值)
					A3流感病毒甲3型	HVJ副流感病毒	RSV合胞病毒	AD3腺病毒3型

A2C3B1药团组	4.6	8.0	4.1	3.6
					A2C增补B增补药团组	3.0	4.2	2.2	1.6

结论：“野柴翘药团”的最佳组合为A₂C₃B₁，既野菊花5g、柴胡10g、连翘10g。

以上的实验解决了“野柴翘药团”比例量的优选组合问题。为了考察“野柴翘药团”是否可以打散的问题，我们仍旧以抗病毒实验为指标，设计以下个各实验组，进行实验考察。

各实验组如下：

1组(有“药团”组)：“野柴翘药团”+其它固定药物(金银花5g、黄芩5g、苦杏仁4g)；

2组(无“药团”组)：0+其它固定药物(金银花5g、黄芩5g、苦杏仁4g)：

3组(半药团A组)：野菊花5g+柴胡10g+其它固定药物(金银花5g、黄芩5g、苦杏仁4g)；

4组(半药团B组)：野菊花5g+连翘10g+其它固定药物(金银花5g、黄芩5g、苦杏仁4g)；

5组(半药团C组)：连翘10g+柴胡10g+其它固定药物(金银花5g、黄芩5g、苦杏仁4g)；

6组(单野组)：野菊花5g+其它固定药物(金银花5g、黄芩5g、苦杏仁4g)：

7组(单柴组)：柴胡10g+其它固定药物(金银花5g、黄芩5g、苦杏仁4g)；

8组(单翘组)：连翘10g+其它固定药物(金银花5g、黄芩5g、苦杏仁4g)；

9组(“药团”变量组：野菊花10g+柴胡10g+连翘10g+其它固定药物(金银花5g、黄芩5g、苦杏仁4g)。

表19、“野柴翘药团”发生不同变化后的组方抗病毒比较实验结果

实验组别	抗病毒的种类及其抗病毒的结果(TI值)
					A3流感病毒甲3型	HVJ副流感病毒	RSV合胞病毒	AD3腺病毒3型
	1组(有“药团”组)	4.7	7.9	4.2					3.8
2组(无“药团”组)					-	-	-	-
	3组(半药团A组)	2.0	2.1	2.1					1.7
4组(半药团B组)					2.0	2.9	2.0	1.8
	5组(半药团C组)	1.8	2.0	2.1					-
6组(单野组)					1.3	1.8	1.9	1.6
	7组(单柴组)	1.4	1.6	1.8					-
8组(单翘组)					1.5	1.5	1.7	-
	9组(“药团”变量组	3.1	4.2	2.2					1.8

实验表明：组方中含有“野柴翘药团”，抗病毒谱广，抗病毒作用最强；组方中不含有“野柴翘药团”时，无抗病毒作用；“野柴翘药团”的用量比发生变化时，抗病毒作用相应减弱；“野柴翘药团”的组合药物发生变化时，抗病毒谱变窄，抗病毒作用减弱。证明“野柴翘药团”是该组方发挥抗病毒作用的核心和关键，本发明药物组合物中该药团的组成药物和药量均为优选组合。

我们另以大鼠解热和小鼠抗炎实验为指标考察“野柴翘药团”存在的合理性，具体实验结果见下表。

表20、组方筛选因素水平表

水平	因素
					A柴胡g	B连翘g	C黄、双、野g	D苦杏仁g
	123	15105	51015	黄、双、野黄、双黄、野					642

注：野菊花、黄芩、金银花各5g。

表21、工作安排表及实验结果[L₉(3)⁴]

水平		A	B	C	D	实验考查指标
								柴胡g	连翘g	黄、双、野	苦杏仁g	抗炎mm-2	解热℃
		试验号	1	15	5	黄、双、野	6							103.2±4.62	0.94±0.14
2	15							10	黄、双	4	78.75±6.44	0.71±0.22
			3	15	15	黄、野	2						117.27±6.84	1.07±0.14
4	10							5	黄、双	2	125.38±9.00	1.11±0.20
			5	10	10	黄、野	6						86.15±8.70	0.83±0.19
6	10							15	黄、双、野	4	71.36±7.10	0.70±0.22
			7	5	5	黄、野	4						132.08±13.22	1.19±0.22
8	5							10	黄、双、野	2	95.45±10.83	0.90±0.24
			9	5	15	黄、双	6						136.15±13.56	1.13±0.40
抗炎	K1							99.74	120.22	90.00*	94.93	B2D2A2C1
		K2	94.30*	86.78*	113.43	94.06*

	K3	121.23	108.26	111.83	126.27
							R	26.93	33.44	23.424	32.204
	解热	K1	0.91	1.08	0.85*							0.89	B2D2A2C1
K2						0.88*	0.81*	0.98	0.87*
		K3	1.07*	0.97	1.03*					1.10
R						0.19	0.27	0.18	0.24

结果显示，野菊花1-5克、柴胡1-10克、连翘1-10克、黄芩5-10克、金银花5-10克和苦杏仁4-8克的组方范围较好，优选野菊花5-8克、柴胡6-10克、连翘6-10克、黄芩5-8克、金银花5-8克和苦杏仁4-6克。最优选组方为柴胡10g、连翘10g、野菊花5g、黄芩5g、金银花5g和苦杏仁4g。“野柴翘药团”即野菊花1-5克、柴胡1-10克和连翘1-10克是组方发挥药效的核心，“野柴翘药团”的优选组合是野菊花5g、柴胡10g和连翘10g。

Claims (11)

1、一种治疗和预防呼吸道病毒感染的药物组合物，其特征在于该药物组合物的药效原料按重量份计为：

野菊花1-5份，柴胡1-10份，连翘1-10份。

2、权利要求1的药物组合物，其药效原料按重量份计为：

野菊花5份，柴胡10份，连翘10份。

3、一种治疗和预防呼吸道病毒感染的药物组合物，其特征在于该药物组合物的药效原料按重量份计为：野菊花1-5份，柴胡1-10份，连翘1-10份，黄芩5-10份，金银花5-10份，苦杏仁4-8份。

4、权利要求3的药物组合物，其药效原料按重量份计为：野菊花5-8份，柴胡6-10份，连翘6-10份，黄芩5-8份，金银花5-8份，苦杏仁4-6份。

5、权利要求4的药物组合物，其原料药用量按重量份计为：野菊花5份，柴胡10份，连翘10份，黄芩5份，金银花5份，苦杏仁4份。

6、权利要求3-5之一所述药物组合物的制备方法，包括如下步骤：

1)称取原料药野菊花、柴胡、连翘、黄芩、金银花、苦杏仁，备用；

2)取野菊花、柴胡、连翘、金银花，用超临界法或水蒸汽法提取挥发油，得挥发油，备用；

3)取步骤2)中提取挥发油后的药渣和黄芩、苦杏仁，用水和/或C₁-C₅直链或支链醇提取，浓缩醇提取液后，得到醇提取物；

4)取步骤2)中挥发油用饱和水溶液法、超声波法、研磨法或者胶体磨法，使β-环糊精对精制挥发油进行包合，得挥发油包合物；

5)取步骤4)中挥发油包合物、步骤3)中醇提取物与药学上适用载体混合，制成本发明药物组合物。

7、权利要求6所述药物组合物的制备方法，步骤2)中野菊花、柴胡和连翘用超临界法提取挥发油的条件为萃取压力15-35MPa，萃取温度30-60℃，分离罐I压力2-25MPa，解析温度30-60℃，分离罐II压力2-25MPa，解析温度30-60℃，萃取1-5小时；步骤2)中金银花用CO₂超临界提取挥发油的条件为萃取压力10-25MPa，萃取温度30-60℃，分离罐I压力2-25MPa，解析温度30-55℃，分离罐II压力2-25MPa，解析温度30-60℃，用45-100％乙醇作为夹带剂，萃取0.5-5小时；步骤2)中野菊花、柴胡和连翘用常规水蒸汽蒸馏法提取挥发油时，药材浸泡至少2小时，回流2-3小时后再蒸馏1～2小时；

步骤3)中提取挥发油后的药渣和黄芩、苦杏仁，用水和/或C₁-C₅直链或支链醇提取。

8、权利要求7所述药物组合物的制备方法，其中C₁-C₅直链或支链醇选自乙醇、甲醇、正丁醇。

9、权利要求7所述药物组合物的制备方法，其中用超临界法提取野菊花、柴胡和连翘挥发油的条件为萃取压力25MPa，萃取温度40℃，分离罐I压力6MPa，解析温度40℃，分离罐II压力5MPa，解析温度40℃，萃取2.5小时；用CO₂超临界提取金银花挥发油的条件为萃取压力20MPa，萃取温度45℃，分离罐I压力6MPa，解析温度40℃，分离罐II压力5MPa，解析温度40℃，用95％乙醇作为夹带剂，萃取1小时；所得野菊花、柴胡、连翘和金银花超临界萃取物干燥后，与硅藻土混合后，用挥发油提取器提取挥发油，得野菊花、柴胡、连翘和金银花的精制挥发油；用常规饱和水溶液法，使β-环糊精对精制挥发油进行包合，得挥发油包合物；将野菊花、柴胡、连翘和金银花提取挥发油后的药渣和黄芩、苦杏仁，用55-95％乙醇提取。

10、权利要求9所述药物组合物的制备方法，野菊花、柴胡、连翘和金银花提取挥发油后的药渣和黄芩、苦杏仁，用65-70％乙醇提取，乙醇提取液浓缩后，得醇提物；将挥发油包合物、醇提物与常规口服药用辅料混合。

11.权利要求3-5之一所述药物组合物在制备治疗和预防呼吸道病毒感染、抗炎、解热、镇痛药物中的应用。