CN111840330B

CN111840330B - 一种防脱发修复组合物及应用

Info

Publication number: CN111840330B
Application number: CN202010766392.8A
Authority: CN
Inventors: 亓爱杰; 李少波; 马宏磊; 亓爱磊
Original assignee: Nuosa Union Beijing Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Nuosa Union Beijing Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2020-08-03
Filing date: 2020-08-03
Publication date: 2022-04-22
Anticipated expiration: 2040-08-03
Also published as: CN111840330A

Abstract

本发明实施例涉及再生医学，具体涉及一种防脱发修复组合物及应用。本发明实施例提供的防脱发修复组合物，包括：毛囊祖细胞，间充质干细胞因子，间充质干细胞裂解液和富血小板纤维蛋白；其中，每10mL间充质干细胞裂解液与(1‑10)×10⁶个毛囊祖细胞，0.2‑0.6mL间充质干细胞因子，0.2‑0.6mL富血小板纤维蛋白混合；间充质干细胞裂解液通过包括下述步骤的方法制得：将(1‑10)×10⁷的间充质干细胞消化后，溶于10mL生理盐水中，经冻融或机械破碎而得。本发明提供的防脱发修复组合物，可从根本上解决毛囊问题，使毛囊重新恢复功能，治疗脱发效果好。

Description

一种防脱发修复组合物及应用

技术领域

本发明涉及再生医学，具体涉及一种防脱发修复组合物及应用。

背景技术

据世界卫生组织资料显示，成年男性中每5人就有1人脱发，而女性群体中每20人就有1人脱发。

在我国脱发问题趋向年轻化，如今80后和90后逐渐成为脱发的主力军，该人群脱发比例已经超过35％，由于过劳肥等原因引起的秃顶更让不少人困扰。

根据《中国脱发人群调查》数显示，我国脱发人群约2亿，九成不治不会好转。男性脱发人数约1.3亿，我国男性脱发率近20％。其中，20-40岁男士是脱发主力军。

现在市面上主要有三种方法减少脱发，改善毛发：

1、使用肉毒素：肉毒素阻断了神经信号传递，使头皮组织处于松弛状态，利于毛发的生出；但是长期、反复使用，会造成头皮组织变薄，损伤毛囊土壤；

2、使用玻尿酸：通过水分及相应营养的补充可促进毛发生长，但是多次使用会造成头皮组织渗透压失衡(低渗)；

3、毛发移植：操作过程繁琐且疼痛感明显，费用相对高昂，无法解决毛囊移植后存活率的问题。

毛囊祖细胞是定植于毛囊外根鞘隆突区的一群成体干细胞，属于上皮成分，具有慢周期性、自我更新、未分化和体外增殖能力强等特点。毛囊相当于毛发的工厂，而毛囊祖细胞相当于种子，种子发芽需要适宜的环境。脱发的原因究其根本就是毛囊祖细胞减少，损伤或环境改变使毛囊不能长出健康的毛发。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

发明目的

为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种防脱发修复组合物及其应用。本发明提供的防脱发修复组合物，可从根本上解决毛囊问题(毛囊是毛发的基本单位)，通过移植新的毛囊祖细胞补充给毛囊，使其分泌多种细胞因子，皮肤生长所需的油脂等，使毛囊重新恢复功能。本发明提供的防脱发修复组合物，毛囊祖细胞、间充质干细胞因子、间充质干细胞裂解液和富血小板纤维蛋白以一定比例混合后能明显促进新生血管形成与激活毛囊细胞的发育及增生，治疗脱发效果好。

解决方案

为实现本发明目的，本发明实施例提供了一种防脱发修复组合物，所述防脱发修复组合物包括：毛囊祖细胞，间充质干细胞因子，间充质干细胞裂解液和富血小板纤维蛋白(PRF)；

其中，每10mL间充质干细胞裂解液与(1-10)×10⁶个毛囊祖细胞，0.2-0.6mL间充质干细胞因子，0.2-0.6mL富血小板纤维蛋白混合；

间充质干细胞裂解液通过包括下述步骤的方法制得：将(1-10)×10⁷的间充质干细胞消化后，溶于10mL生理盐水中，经冻融或机械破碎而得。间充质干细胞裂解液的体积变化时，间充质干细胞的数量相应按比例变化。

上述防脱发修复组合物在一种可能的实现方式中，每10mL间充质干细胞裂解液与(3-6)×10⁶个毛囊祖细胞，0.3-0.5mL间充质干细胞因子，0.3-0.5mL富血小板纤维蛋白混合。

上述防脱发修复组合物在一种可能的实现方式中，每10mL间充质干细胞裂解液与5×10⁶个毛囊祖细胞，0.4mL间充质干细胞因子，0.4mL富血小板纤维蛋白混合。

上述防脱发修复组合物在一种可能的实现方式中，毛囊祖细胞通过包含下述步骤的方法制备而得：

a、取头皮样本，用含青霉素和链霉素的PBS浸泡；

b、用不含青霉素和链霉素的PBS洗涤；

c、用剪刀将样本的表皮刮掉，用胰酶和EDTA处理收集的毛囊组织，获得含毛囊祖细胞的细胞悬液，加PBS，离心；

d、将上清液废弃，用新的PBS重悬，取样计数，再次离心；

e、加入PBS使细胞浓度为(1-10)×10⁶/mL；

f、将磁珠包被的抗人CD200抗体用DPBS清洗一遍；

g、在离心管中将细胞和磁珠混匀，其中，抗人CD200抗体的加入量为0.5-3μg/mL；室温孵育，置于磁力架上，放置，吸去上清；

h、将磁珠包被的细胞用培养基洗脱，按5000-10000细胞/cm²密度接种于细胞培养瓶中；

i、于37℃、5％CO₂孵箱中培养18-30h后将悬浮的细胞和培养基弃掉，重新加入培养基；

j、培养48-72h后，待细胞融合度为80％时，消化，进行传代培养。

上述防脱发修复组合物在一种可能的实现方式中，头皮样本可以为受试者本人头皮样本，也可以为志愿者头皮样本。毛囊祖细胞通常不会作为异种组织被排斥。

上述防脱发修复组合物在一种可能的实现方式中，间充质干细胞裂解液通过包括下述步骤的方法制得：将(4-6)×10⁷的间充质干细胞消化后，溶于10mL生理盐水中，经冻融或机械破碎而得。

上述防脱发修复组合物在一种可能的实现方式中，间充质干细胞裂解液通过包括下述步骤的方法制得：将5×10⁷的间充质干细胞消化后，溶于10mL生理盐水中，经冻融或机械破碎而得。

上述防脱发修复组合物在一种可能的实现方式中，间充质干细胞裂解液通过冻融制得。

上述防脱发修复组合物在一种可能的实现方式中，冻融包括下述步骤：在-70℃或液氮中冷冻后，迅速于37℃融化，经3-6个冻融周期，使细胞破碎。

上述防脱发修复组合物在一种可能的实现方式中，间充质干细胞因子通过包括下述步骤的方法制备而得：

a、取P2-P6代间充质干细胞培养上清，超速离心，收取上层液体；

b、将上层液体通过分子量为50KD的回旋流/切向流超滤器进行干细胞因子的浓缩，接着将浓缩液通过分子量为30KD的回旋流/切向流超滤器，收集截留液，即为间充质干细胞因子。

c、用长针头吸取中间层至冻存管中，密封，4℃保存待用。

本发明实施例还提供了上述防脱发修复组合物在制备治疗脱发药物中的应用。

有益效果

(1)当毛囊祖细胞被分离出来并和真皮乳头细胞结合时，就会产生新的毛囊。而且毛囊祖细胞比起其他器官的干细胞更为容易取得。在拔下来的毛发当中，很有可能含有毛囊祖细胞，进行大量培养即可获得毛囊祖细胞。通过移植新的毛囊祖细胞补充给毛囊，使其分泌多种细胞因子，皮肤生长所需的油脂等，使毛囊重新恢复功能。

富血小板纤维蛋白(PRF)：即Platelet-Rich Fabrin，是一种区别于传统富血小板血浆(Platelet-rich plasma)技术的富含细胞因子和生长因子的新一代血小板浓缩物，其结构类似于天然血凝块，可以借助细胞因子的调节作用以及纤维蛋白的支架作用进行组织修复。

间充质干细胞分泌的细胞因子：即MSC细胞因子。间充质干细胞是一种具有多种用途的干细胞，可以自我扩增和分化为多种细胞，如：骨骼细胞，脂肪细胞等；还可以分泌大量的细胞因子，如：血小板生成素、血管生产素、白介素3、白介素6等，供应干细胞增殖和分化使用。

细胞裂解液中包括多种细胞因子和生长因子，可修复受损的组织细胞，发挥免疫重建功能。

本发明实施例中提供的防脱发修复组合物，毛囊祖细胞、间充质干细胞因子、间充质干细胞裂解液和富血小板纤维蛋白以一定比例混合后能明显促进新生血管形成与激活毛囊细胞的发育及增生，治疗脱发效果好。

(2)本发明提供的防脱发修复组合物，各组分之间相互影响，以特定比例混合使用时，治疗脱发效果更好。

(3)本发明提供的防脱发修复组合物，使用本发明提供的毛囊祖细胞的分离和培养方法，获得的毛囊祖细胞数量多且活性高；且使用毛囊祖细胞特异性的标记物CD200来分离毛囊祖细胞，获得的毛囊祖细胞纯度高。

(4)本发明提供的防脱发修复组合物，特别使用了间充质干细胞裂解液，并对制备过程中间充质干细胞的浓度和破碎方法进行了选择，可进一步提高防脱效果。

附图说明

一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

图1是本发明测试例患者A治疗前后效果对比图。

图2是本发明测试例患者B治疗前后效果对比图。

图3是本发明测试例患者C治疗前后效果对比图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

下述实施例中，所用试剂、人脂肪间充质干细胞以及磁珠包被的鼠抗人CD200抗体均为商购获得；可直接购买磁珠包被好的鼠抗人CD200抗体，也可以购买抗人CD200抗体后自行按照本领域通用方法包被。其中，

1、毛囊祖细胞通过包含下述步骤的方法制备而得：

a、取受试者本人头皮样本，用含青霉素100U/mL，链霉素0.1mg/mL的PBS浸泡10min；

b、用不含青霉素和链霉素的PBS洗涤3次；

c、用剪刀将样本的表皮刮掉，用适量的0.25％胰酶+0.05％EDTA处理收集的毛囊组织，获得含毛囊祖细胞的细胞悬液，加PBS，1800rpm离心10min；

d、将上清液废弃，用新的PBS重悬，取样计数，1800rpm再次离心10min；

e、加入PBS使细胞浓度为5×10⁶/mL；

f、将磁珠包被的鼠抗人CD200抗体用DPBS清洗一遍；

g、在离心管中将细胞和磁珠(鼠抗人CD200抗体的加入量为1μg/mL)混匀，室温孵育30min，然后插到磁力架上，放置20min吸去上清；

h、将磁珠包被的细胞用培养基洗脱，按8000细胞/cm²密度接种于细胞培养瓶中；

i、于37℃、5％CO₂孵箱中培养24h后将悬浮的细胞和培养基弃掉，重新加入培养基；

j、培养48-72h后，待细胞融合度为80％时，消化，传代细胞；

k、传至20瓶左右时，消化，冻存细胞；

所述培养基为DMEM/F12培养基，包括DMEM/F12培养液，10％FBS(胎牛血清)，EGF50ng/mL，青霉素100U/mL，链霉素0.1mg/mL。

2、人脂肪间充质干细胞因子通过包括下述步骤的方法制得：

a、按照现有技术，培养人脂肪间充质干细胞至第3代，取第3代干细胞培养上清50mL，经12000rpm超速离心10min后，收取上层液体；

3、富血小板纤维蛋白(PRF)通过包括下述步骤的方法制备而得：

a、将装有5mL血液的采血管(不添加抗凝剂)两支对称放置到eppendorf离心机中，3000rpm离心10min；

b、经过离心，血液分成3层，上层为淡黄色的贫血小板血浆层，底层为红细胞层，二者之间即为富含血小板的纤维蛋白凝胶层；

c、用长针头慢慢吸取中间层至5mL冻存管中，密封，4℃保存待用。

实施例1

一种防脱发修复组合物，所述防脱发修复组合物包括：

将5×10⁶个毛囊祖细胞用10mL人脂肪间充质干细胞裂解液重悬，加入0.4mL间充质干细胞因子和0.4mL富血小板纤维蛋白；

人脂肪间充质干细胞裂解液通过包括下述步骤的方法制得：

将5×10⁷的人脂肪间充质干细胞消化后，溶于10mL生理盐水中，在液氮中冷冻后，迅速于37℃融化，经4个冻融周期，人脂肪间充质干细胞破碎，即得。

实施例2

一种防脱发修复组合物，所述防脱发修复组合物包括：

将1×10⁶个毛囊祖细胞用10mL人脂肪间充质干细胞裂解液重悬，加入0.3mL间充质干细胞因子和0.3mL富血小板纤维蛋白；

人脂肪间充质干细胞裂解液通过包括下述步骤的方法制得：

将4×10⁷的人脂肪间充质干细胞消化后，溶于10mL生理盐水中，在液氮中冷冻后，迅速于37℃融化，经4个冻融周期，人脂肪间充质干细胞破碎，即得。

实施例3

一种防脱发修复组合物，所述防脱发修复组合物包括：

将1×10⁷个毛囊祖细胞用10mL人脂肪间充质干细胞裂解液重悬，加入0.5mL间充质干细胞因子和0.5mL富血小板纤维蛋白；

人脂肪间充质干细胞裂解液通过包括下述步骤的方法制得：

将6×10⁷的人脂肪间充质干细胞消化后，溶于10mL生理盐水中，经细胞破碎仪破碎，即得。

对比例1

同实施例1，区别在于不加毛囊祖细胞。

对比例2

同实施例1，区别在于将10mL人脂肪间充质干细胞裂解液换成10mL的生理盐水。

对比例3

同实施例1，区别在于不加间充质干细胞因子，替换成0.4mL的生理盐水。

对比例4

同实施例1，区别在于不加富血小板纤维蛋白，替换成0.4mL的生理盐水。

测试例1

使用C3H小鼠用作毛发生长作用的小鼠模型。

(1)毛囊祖细胞的培养

取一只C3H小鼠，取其皮肤样本，按照前述方法培养毛囊祖细胞，后续小鼠实验中所用的防脱发组合物中的毛囊祖细胞均使用该毛囊祖细胞。

(2)防脱发组合物的制备

分别按照实施例1和对比例1-4配制防脱发组合物。

(3)脱毛及注射

另取5只7周龄C3H小鼠，适应环境后，对其麻醉，使用毛发修剪器除去小鼠毛发，观察24h，将剩余毛发除去；

每只小鼠的半个背部不进行注射，作为对照；

在另一边背部选2个大小为2×2cm的区域作为重复；每只鼠所选的区域位置相同；每只鼠分别注射实施例1和对比例1-4的防脱发组合物；

注射时针头间隔0.3cm，单点注射0.1毫升；

观察小鼠的毛发生长，分别在第5周和第7周时统计新生毛发长度：各区随机取5根新生毛发，测量后计算平均长度；结果见表1；其中，未注射的半个背部在第5周时能看到有新毛长出，但长度过短，无法测量。

表1

测试例2

1、分别使用脱发患者A、B、C的头皮样本培养毛囊祖细胞，按照实施例1提供的防脱发修复组合物配方配制脱发患者A、B、C的防脱发修复组合物，对脱发患者A、B、C进行防脱发修复组合物治疗。

(1)操作前准备

a.器械消毒：制备过程中使用的剪刀、镊子应事先进行消毒，且消毒后保存时间不得超过12小时。

b.空间消毒：实验室洁净间和超净台应提前进行紫外或臭氧消毒，时间应不小于30Min，照射完毕后应开风机30min以便使空间内的臭氧排尽。

c.物品准备：制备物品事先查点，保证数量充足、质量合格。临时从非洁净区带入细胞操作间的物品，应在传递窗经紫外充分照射后方能使用。

d.洗手、更衣：除去腕部饰物和手表，用自来水充分洗刷手部，尤其清洁掌纹与指甲缝隙处的污垢。洗后用高效碘伏全面擦手、晾干。穿戴口罩和隔离衣、佩戴无菌手套。穿戴隔离衣要做到“三不露”：不暴露头发，不暴露口鼻，不暴露躯干部皮肤或内穿衣物。

e.环境要求：实验环境为万级或千级层流室，开放式操作必须在百级洁净工作台内进行。

(2)治疗

a.消毒：头皮组织常规碘伏消毒3遍并盐水清拭，不耐受疼痛者可先外敷麻药；

b.注射：34G针头间隔0.5-1cm，单点注射0.2-0.3毫升；本测试例中，34G针头间隔0.5cm，单点注射0.2毫升；

c.术后护理：常规碘伏消毒并生理盐水清洗头部，8小时后可以正常洗头；

一个疗程6-8次，每次间隔21-35天，治疗期间禁食辛辣、油腻等刺激性食物。

2、治疗效果：

患者A、B、C治疗前后效果分别如图1-3所示；图1为患者A治疗一个月后效果图，图2为患者B治疗两个月后效果图，图3为患者C治疗一个月后效果图。

总体而言，患者A、B、C治疗的效果如下：注射2周后，头皮油脂分泌好转，脱发量明显减少；注射3周后，局部毛发变得粗壮；6周以后，可以看到新发生长。一个疗程后能看到白发转黑。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种防脱发修复组合物，其特征在于，所述防脱发修复组合物由以下组成：毛囊祖细胞，间充质干细胞因子，间充质干细胞裂解液和富血小板纤维蛋白；

其中，每10mL间充质干细胞裂解液与(1-10)×10⁶个毛囊祖细胞，0.2-0.6mL间充质干细胞因子，0.2-0.6mL富血小板纤维蛋白混合；所述间充质干细胞裂解液通过包括下述步骤的方法制得：将(1-10)×10⁷的间充质干细胞消化后，溶于10mL生理盐水中。

2.根据权利要求1所述的防脱发修复组合物，其特征在于，每10mL间充质干细胞裂解液与(3-6)×10⁶个毛囊祖细胞，0.3-0.5mL间充质干细胞因子，0.3-0.5mL富血小板纤维蛋白混合。

3.根据权利要求2所述的防脱发修复组合物，其特征在于，每10mL间充质干细胞裂解液与5×10⁶个毛囊祖细胞，0.4mL间充质干细胞因子，0.4mL富血小板纤维蛋白混合。

4.根据权利要求1所述的防脱发修复组合物，其特征在于，间充质干细胞裂解液通过包括下述步骤的方法制得：将(4-6)×10⁷个间充质干细胞消化后，溶于10mL生理盐水中。

5.根据权利要求4所述的防脱发修复组合物，其特征在于，间充质干细胞裂解液通过包括下述步骤的方法制得：将5×10⁷个间充质干细胞消化后，溶于10mL生理盐水中。

6.根据权利要求1所述的防脱发修复组合物，其特征在于，间充质干细胞为骨髓来源的间充质干细胞，脂肪来源的间充质干细胞或脐带来源的间充质干细胞。

7.根据权利要求1所述的防脱发修复组合物在制备治疗脱发药物中的应用。