CN110938587A

CN110938587A - 一种表皮干细胞混悬液的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN110938587A
Application number: CN201911177830.0A
Authority: CN
Inventors: 陈莉; 邢志青; 王红丽; 周健; 王杰; 李冬丽
Original assignee: JINAN PANSHENG BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: JINAN PANSHENG BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2020-01-08
Filing date: 2020-01-08
Publication date: 2020-03-31

Abstract

本发明公开了表皮干细胞混悬液的制备方法及其应用。该方法采用改良的组织贴壁法从人的包皮组织中获得表皮干细胞和表皮干细胞因子，将收获的表皮干细胞和表皮干细胞因子进行混合，获得细胞混悬液，将混悬液移植到皮肤创面，促进表皮细胞的粘附、生长、迁徙，为后期表皮干细胞发挥修复作用提供良好的微环境。

Description

一种表皮干细胞混悬液的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种表皮干细胞混悬液的制备方法及其应用，属于细胞培养技术领域。

背景技术

皮肤创面修复是整形科和外科最常遇到的问题之一。皮肤创面修复是一个非常复杂的生物学过程，如果皮肤创面较大，或合并糖尿病、感染、局部缺血缺氧及其他慢性疾病等将妨碍创面的正常愈合过程，从而导致创面延迟愈合甚至长期不愈合。

目前临床上常用的创面治疗方法有负压引流、生物敷料、皮片移植以及皮瓣移植等，虽然取得了一定程度的疗效，但失败率近半数。深度创伤愈合后更是缺失毛囊、皮脂腺、汗腺等皮肤附属器官，导致无法有效重建生理功能，严重影响患者的生活质量。

干细胞是具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，具有高度的增殖潜能和分化潜能，还可以分泌大量的细胞因子，参与组织修复、血管再生、免疫调节、炎症反应等。表皮干细胞是成体干细胞的一种，其增殖分化维系着表皮的正常结构和生理功能，是皮肤及附属器官发生、修复的基础，也是皮肤创面修复过程中的重要种子细胞。表皮干细胞在特定诱导条件下可以诱导分化成皮肤和附属器官，研究表面在缺失表皮干细胞的情况下，上皮组织的修复进度将受到明显的影响。组织工程表皮很多年前就被应用于大面积烧伤的治疗，对提高烧伤病人的存活率起了非常关键的作用，但是一般的组织工程表皮移植到人体后有很多问题，包括表皮容易增生过度、表皮容易起水泡、不能形成完整生理功能的皮肤，因此限制了临床应用和推广。近几年组织工程皮肤应用较广泛，它包含了真皮和表皮，是在体外用培养的表皮细胞、真皮细胞和胶原蛋白合成的，临床应用于治疗创面愈合有较好的疗效。但是此类组织工程皮肤培养时间较长，需要较长时间才能形成皮肤结构，耽误了治疗时机。

目前表皮干细胞的培养方法主要有两种：一种是IV型胶原粘附法，这种方法培养的干细胞增殖较差；第二种是分选法，用免疫磁珠或者流式细胞仪进行分选，得到较高纯度的表皮干细胞，但是这种方法操作复杂，而且成本较高，不利于大规模推广。

发明内容

本发明克服了上述现有技术的不足，提供一种表皮干细胞混悬液的制备方法及其应用。该方法采用改良的组织贴壁法从人的包皮组织中获得表皮干细胞和表皮干细胞因子，将收获的表皮干细胞和表皮干细胞因子进行混合，获得细胞混悬液，将混悬液移植到皮肤创面，促进表皮细胞的粘附、生长、迁徙，为后期表皮干细胞发挥修复作用提供良好的微环境。

一种表皮干细胞混悬液的制备方法，包括如下步骤：

(1)采集包皮组织，使用含抗生素的缓冲液处理后将组织切成小块，加入Disapase酶溶液消化60-120min，消化后的组织将真皮和表皮分开；

(2)将步骤(1)获得的表皮组织切碎后接种到预先用Coating Matrix处理过的培养皿中，放入培养箱中过夜；次日在上述培养皿中加入表皮干细胞培养基继续培养，当细胞融合度达到70～80％进行传代培养，传到P3代细胞；

(3)步骤(2)获得的P3代细胞继续传代培养P4代细胞，当P4代细胞的融合度达到70-80％时收取培养液的上清液A，将上清液A离心，收集上清液B，将上清液B浓缩100过倍后过滤除菌，即可获得表皮干细胞因子；

(4)步骤(3)获得的P4代细胞消化，离心，收获表皮干细胞悬液；

(5)将步骤(3)获得的表皮干细胞因子和步骤(4)中获得表皮干细胞培养液混合，获得表皮干细胞混悬液。

进一步的，上述表皮干细胞培养基为添加牛垂体提取物(25-200μg/ml)、胰岛素(5-50μg/ml)、纤维母细胞因子(1-5ng/ml)、维生素C(20-200μg/ml)、转铁蛋白(1-10μg/ml)、青霉素(100U/ml)、链霉素(100ng/ml)的K-SFM角质培养基。

进一步的，上述步骤(1)中所述的抗生素为青霉素-链霉素、两性霉素B或庆大霉素的一种；所述缓冲液为pH7.4的磷酸盐缓冲液、注射用生理盐水或D-Hank’s液的一种。

进一步的，上述步骤(1)中的Disapase酶溶液的浓度为2.5mg/mL(现用现配，PBS溶解)。

进一步的，上述步骤(2)中所述培养箱的培养条件为36-37℃、4.5-5％CO₂。

进一步的，上述步骤(2)中传代培养指表皮干细胞按照2-3×10⁴/cm²的密度传代。

进一步的，上述步骤(3)中的完全培养基指含抗生素、10～15％胎牛血清的DME/F12，DMEM，高糖DMEM，α-MEM的其中一种。

进一步的，上述步骤(5)中表皮干细胞因子终浓度为25-50μg/ml。

本申请还保护利用上述制备方法制备的表皮干细胞混悬液。

本申请还保护上述表皮干细胞混悬液在皮肤创伤愈合中的应用。

有益效果：

(1)组织工程皮肤培养时间较长，需要18-20天时间构建皮肤结构，延误最佳治疗时机；本发明产品只需要8-14天即可获得用于临床的表皮干细胞，可以很快的应用于临床。

(2)采用改良组织块贴壁法从人包皮组织中分离培养得到表皮干细胞，操作步骤更简单，比传统的酶消化法获得的细胞纯度高，细胞增殖快，细胞不易老化。

(3)用表皮干细胞因子重悬表皮细胞，表皮干细胞因子含有许多生长因子，激肽释放酶7，层粘连蛋白亚基γ-2，前纤维蛋白1抗体，人类分泌性蛋白，粘结合蛋白多糖-1，胰岛素生长因子，激肽释放酶Ⅰ，层粘连蛋白β3同种型1(片段)，层粘连蛋白亚基γ-1，胶原蛋白α-1(Ⅵ)链，层粘连蛋白亚基β-1等，不同于细胞培养基中添加的细胞因子，可以促进表皮干细胞在创面更好的存活和发挥修复作用。

(4)采用双筒注射器将细胞混悬液和纤维蛋白胶混合在一起，同时作用于皮肤创面，可以更好的给表皮干细胞一个应力支撑，能促进细胞均匀分布和增殖，让细胞更好的发挥修复作用。

附图说明

图1 原代培养的表皮干细胞的形态(×40A：第6天)。

图2 P4代培养的表皮干细胞的形态(×40A：传代第2天B：传代第3天)。

图3 25μg/ml表皮干细胞因子对表皮干细胞划痕恢复效果对照图。

图4 50μg/ml表皮干细胞因子对表皮干细胞划痕恢复效果对照图。

图5 表皮干细胞混悬液对大鼠表面创伤愈合情况图。

具体实施方式

为了使本技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步说明，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部，本发明不受下述实施例的限制。

实施例1表皮干细胞混悬液的制备

一、方法和步骤

(一)表皮干细胞的分离培养

1、组织来源：包皮组织来自5～30岁健康供者，患者无泌尿系感染，无HBV、HCV、HIV、梅毒等传染性疾病，经包皮环切术采集组织。

2、细胞培养基的配制：向K-SFM角质培养基中添加牛垂体提取物(25μg/ml)，胰岛素(10μg/ml)，纤维母细胞因子(1ng/ml)，维生素C(20μg/ml)，转铁蛋白(1μg/ml)，100U/ml青霉素、100ng/ml链霉素，配制成表皮干细胞培养基。

3、培养：(1)采集2g皮肤组织，放入含100U/ml青霉素、100ng/ml链霉素的PBS缓冲液中，2-8℃运输到实验室。(2)无菌条件下，用含100U/ml青霉素、100ng/ml链霉素的PBS缓冲液反复冲洗组织。(3)用手术刀将组织切成约1cm²的小块。(4)将组织转移到50ml离心管中，加入Disapase(2.5mg/mL)37℃水浴消化120min。(5)将表皮和真皮分开，收集所有的表皮组织到一新的10cm平皿中，用手术刀切碎至1mm²。(6)将表皮组织接种到预先用CoatingMatrix处理过的T75瓶中，放入37℃、5％CO₂培养箱中继续培养。(7)第二天从瓶子的侧壁轻轻加入7ml表皮干细胞培养基，切勿把组织块吹起来。以后每隔3天半换液一次，待5-6天细胞从组织块周边爬出，融合度达到70～80％进行传代操作，传到P3代细胞。

4、表皮干细胞的收获：(1)P3代细胞继续按照2.5×10⁴/cm²的密度传代到P4代，融合度达到70-80％，收取上清液到离心管中收获表皮干细胞因子，剩下细胞进行消化收集。(2)加入PBS清洗一遍，弃掉。(3)消化：每个培养瓶中加2ml gibco公司的Tryple Express，上下晃动培养瓶使酶覆盖整个底部，放于37℃培养箱中消化细胞8min。(4)中和：在显微镜下观察，如果表皮细胞全部脱落，加入8ml完全培养基(含100U/ml青霉素、100ng/ml链霉素、10％胎牛血清的DMEM)中和，轻轻吹打将细胞收集到离心管中。(5)收集：将细胞悬液1000rpm离心5min，弃上清。细胞沉淀用10ml DMEM培养基重悬，吹打4-5次将细胞团块吹散即可，1000rpm离心5min，弃上清，加入生理盐水洗两遍，用生理盐水重悬，用血球计数板或细胞计数仪计数，备用。

(二)、表皮干细胞因子的收获

(1)上述获得的表皮干细胞上清液2000rpm离心5min，去除细胞碎片及杂质。(2)将离心得到的上清置于超滤浓缩管(截留分子量3K)中，4500rpm离心15min，进行多次离心浓缩(离心后的上清液回收)，体积浓缩100倍。(3)0.22μm过滤除菌，即为表皮干细胞因子，使用BCA检测试剂盒测定蛋白浓度，使用时加入生理盐水稀释即可。

二、检测分析

原代分离得到的表皮细胞生长较快，第六天就可以看到组织周围爬出很多细胞(图1)。传代后细胞呈角质细胞形态，细胞增殖迅速，第二天细胞融合度可达50％(图2中A)，第三天可达90％(图2中的B)。

表皮干细胞因子使用BCA检测试剂盒测定蛋白浓度为0.7mg/ml。

实施例2表皮干细胞迁移实验

一、方法和步骤

(1)接种细胞：选取对数生长期的表皮干细胞，吸弃培养皿中的培养基；加入PBS清洗一遍，弃掉。消化：每个皿中加2ml gibco公司的Tryple Express，上下晃动平皿使酶覆盖整个底部，放于37℃培养箱中消化细胞8-10min。中和：在显微镜下观察，如果表皮细胞全部脱落，加入8ml完全培养基(含100U/ml青霉素、100ng/ml链霉素、10％胎牛血清的DMEM)中和，轻轻吹打将细胞收集到离心管中。收集：将细胞悬液1000rpm离心5min，弃上清。细胞沉淀用10mlDMEM培养基重悬，1000rpm离心5min，弃上清，加入表皮干细胞培养基重悬，用血球计数板或细胞计数仪计数，记录细胞密度，细胞总数及存活率，按照2-2.5×10⁴/cm²的密度传代。

(2)细胞融合度达到80％左右，按上述方法消化收集细胞，接种于6孔板中，150-200万/孔。

(3)3d后，吸弃旧培养基，加入1ml/孔PBS清洗细胞，用无菌无热源的100μl枪头在孔的中间划痕。

(4)划痕后，加入1ml/孔PBS轻轻冲洗划痕处，弃去PBS，清洗两遍。

(5)实验组A加入3-4ml含有25μg/ml浓度表皮细胞因子(实施例1获得的)的表皮干细胞培养基培养细胞，实验组B加入3-4ml含有50μg/ml浓度表皮细胞因子(实施例1获得的)的表皮干细胞培养基培养细胞，对照组只加入表皮干细胞培养基。

(6)12h、24h、36h后倒置显微镜下观察不同组的表皮干细胞迁移的情况，并拍照。

二、结果分析

如图3和图4所示，实验结果显示，使用表皮干细胞因子(25μg/ml、50μg/ml)进行人表皮干细胞的培养，两种浓度下的因子对表皮干细胞创口的愈合都具有显著的促进作用，24h后达到90％愈合，36h可以完全愈合，对照组需要36h后才能达到80～90％愈合。浓度为25μg/ml的表皮干细胞因子诱导表皮细胞增殖迁移的速度优于50μg/ml的细胞因子和对照组，划痕最先愈合。

实施例3表皮干细胞混悬液在皮肤创伤愈合中的应用

一、步骤和方法

1、模型构建

取32只裸鼠随机分为四组，每组8只，制备全层皮肤缺损模型，具体方法：实验动物经腹腔注射10％水合氯醛(5μl/g)麻醉，背部消毒，用预先制备的硬纸板模型放于背部(臀部)，无菌眼科剪剪出1cm×1cm大小的创口，深及筋膜，纱布止血，聚维酮碘溶液消毒。

将收集到的细胞悬液用生理盐水洗三次，用细胞因子将细胞重悬，得到细胞混悬液(表皮干细胞移植密度为1×10⁵～1×10⁶个/cm²，细胞因子为0.1～0.5mg/ml)。

实验分四组：空白对照组：左上伤口，将等体积的生理盐水和纤维蛋白胶灌入双筒注射器的两个筒中，均匀混合在裸鼠的创面上。阴性对照组：右上伤口，将等体积的纤维蛋白胶灌入双筒注射器的两个筒中，均匀混合在裸鼠的创面上；细胞移植组：左下伤口，将等体积的细胞混悬液和纤维蛋白胶灌入双筒注射器的两个筒中，在同样压力作用下，细胞混悬液和纤维蛋白胶同时挤出，均匀混合在裸鼠的创面上；细胞因子组：右下伤口，将等体积的细胞因子和纤维蛋白胶灌入双筒注射器的两个筒中，均匀混合在裸鼠的创面上。

操作完成后用碘伏纱布覆盖，自粘绷带包扎、固定。将鼠放回鼠笼单独喂养，自由饮食。1周，2周后清洗创面，去除污物、痂皮及新生毛发，观察创面愈合情况并拍照，重新包扎固定。

2、创面愈合率检测

术后1周，2周数码相机记录各组创面图像，分析创面面积。采用公式计算创面愈合率。

创面愈合率(％)＝[(原始创面面积-当前时间点测量面积)/原始创面面积]×100％。

二、结果分析

结果显示：所有小鼠均存活，进食良好。术后1周见四组小鼠创面逐渐缩小，而细胞移植组愈合最快，2周时大部分创面已经完全愈合。表1结果显示表皮干细胞移植组小鼠皮肤创面愈合率在各时间点都比对照组增高，差异具有统计学意义(p<0.05)。

表1各组创面愈合率比较(％)

注：与空白对照组相比，p<0.05。

Claims

1.一种表皮干细胞混悬液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述表皮干细胞培养基为添加牛垂体提取物、胰岛素、纤维母细胞因子、维生素C、转铁蛋白、青霉素、链霉素的K-SFM角质培养基。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的抗生素为青霉素-链霉素、两性霉素B或庆大霉素的一种；所述缓冲液为pH7.4的磷酸盐缓冲液、注射用生理盐水或D-Hank’s液的一种。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的Disapase酶溶液的浓度为2.5mg/mL。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述培养箱的培养条件为36-37℃、4.5-5％CO₂。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的传代培养指表皮干细胞按照2-3×10⁴/cm²的密度传代。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的完全培养基指含抗生素、10～15％胎牛血清的DME/F12，DMEM，高糖DMEM，α-MEM的其中一种。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述的表皮干细胞因子终浓度为25-50μg/ml。

9.利用如权利要求1-8任一项所述制备方法制备的表皮干细胞混悬液。

10.如权利要求1-8任一项所述制备方法制备的表皮干细胞混悬液在皮肤创伤愈合中的应用。