CN106310369A - 一种组合物、含有该组合物的3d敷料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及3D打印领域，特别涉及一种组合物、含有该组合物的3D敷料及其制备方法。含有该组合物的3D敷料能够有效修复创面。本发明利用3D打印和脂肪间充质干细胞、支架相结合的技术，快速打印出一种用于修复皮肤创面的3D打印敷料。该3D敷料机械强度良好，可用手术钳夹取，加入培养基后不松散，继续培养过程中未见破碎和大幅降解。

Description

一种组合物、含有该组合物的3D敷料及其制备方法
技术领域
本发明涉及3D打印领域，特别涉及一种组合物、含有该组合物的3D敷料及其制备方法。
背景技术
创面是正常皮肤(组织)在外界致伤因子如外科手术、外力、热、电流、化学物质、低温以及机体内在因素如局部血液供应障碍等作用下所导致的损害。常伴有皮肤完整性的破坏以及一定量正常组织的丢失，同时，皮肤的正常功能受损，也称为伤口或者创伤，创面修复既伤口修复。
皮肤创面的修复和愈合是外科学研究的热点与难点，严重烧伤、糖尿病足和肿瘤溃疡等难愈性伤口更是创伤外科领域的棘手问题。目前临床上主要采用药物、手术等方法来修复创面，难以取得令人满意的疗效，给患者带来了痛苦。而移植脂肪成活率较低也极大地限制了其在临床的广泛应用。
干细胞是一类具有自我复制能力和分化能力的多潜能细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界将其称之为“万用细胞”。脂肪间充质干细胞(ADSCs)是存在于脂肪组织中的干细胞，具有多向分化的潜能。相对于其它种子细胞，脂肪间充质干细胞具有来源广泛、含量丰富、分离简单、体外扩增稳定容易、不涉及伦理问题、便于自体移植、免疫原性低、对供区损伤小等优势，备受外科医生的重视。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种组合物、含有该组合物的3D敷料及其制备方法。本发明利用3D打印技术打印本发明提供的3D敷料，用于皮肤创面的修复和愈合。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种组合物，包括如下组分：
脂肪间充质干细胞可以有效促进皮肤创面愈合，它在体内外均可向皮肤表皮细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞等多种细胞分化，分泌多种生物活性分子限制炎症和凋亡，促进血管形成，参与损伤修复等，最终实现促进创面愈合的作用。
低免疫原性的脱细胞生物材料因具有天然特定的三维结构、富含活性因子等特点在一定程度上解决了脂肪细胞成活率低的问题。同时，支架材料也可以为脂肪间充质干细胞提供合适的生存和分化环境，选择合适的生物支架材料可以提高创面修复的效果。
在本发明的一些具体实施方案中，所述的组合物包括如下组分：
在本发明的一些具体实施方案中，所述的组合物包括如下组分：
在本发明的一些具体实施方案中，所述的组合物包括如下组分：
在本发明的一些具体实施方案中，所述的组合物包括如下组分：
在本发明的一些具体实施方案中，所述的组合物包括如下组分：
在本发明的一些具体实施方案中，所述的组合物包括如下组分：
在本发明的一些具体实施方案中，所述的组合物包括如下组分：
在本发明的一些具体实施方案中，所述生物大分子物质为壳多糖。
在本发明的一些具体实施方案中，所述胶原蛋白为Ⅰ型胶原蛋白。
在本发明的一些具体实施方案中，所述生长因子为EGF。
在本发明的一些具体实施方案中，所述脂肪脱细胞基质为人脂肪脱细胞基质冻干粉。
在本发明的一些具体实施方案中，所述组合物中的溶剂为Lonza。所述组合物中各组分的质量百分含量之和为100％，所述溶剂的加入量为100％减去生物大分子物质、胶原蛋白、生长因子和脂肪脱细胞基质之后的余量。
本发明还提供了所述的组合物在制备创伤修复的药物和/或制剂中的应用。
本发明还提供了一种3D敷料，包括所述的组合物。
本发明还提供了一种如所述的3D敷料的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：获得脂肪间充质干细胞的单细胞悬液，调整细胞浓度为0.9×105个/ml～1.1×106个/ml；
步骤2：取脂肪干细胞、生物大分子物质、胶原蛋白、生长因子、脂肪脱细胞基质和溶剂混合，调整pH值为7.2～7.4，制得支架材料溶液；
步骤3：取步骤1所述的单细胞悬液与步骤2制得的支架材料溶液按照配方混合。
具体的，获得脂肪间充质干细胞的单细胞悬液的方法为：取P3代脂肪间充质干细胞，吸去培养基，加入消化液进行消化，之后用适量血清终止消化，轻轻吹打；1500rpm，离心5min，弃上清，用4℃PBS洗涤细胞3次后重悬混匀，调整细胞浓度约为107个/ml。
本发明提供一种组合物、含有该组合物的3D敷料及其制备方法。含有该组合物的3D敷料能够有效修复创面。本发明利用3D打印和脂肪间充质干细胞、支架相结合的技术，快速打印出一种用于修复皮肤创面的3D打印敷料。该3D敷料机械强度良好，可用手术钳夹取，加入培养基后不松散，继续培养过程中未见破碎和大幅降解。
具体实施方式
本发明公开了一种组合物、含有该组合物的3D敷料及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的组合物、含有该组合物的3D敷料及其制备方法中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：人脂肪脱细胞基质的制备
在超净台内，用PBS缓冲液清洗标本3次。
将脂肪组织剪成3-5mm厚的组织块，置于低渗三羟甲基氨基甲烷缓冲液(含10mmol/L三羟甲基氨基甲烷、5mmol/L EDTA)中，-80℃冷冻、37℃水浴复温，反复冻融5次；
0.25％胰蛋白酶处理6h，无菌PBS缓冲液冲洗30min，3次；
异丙醇处理36h，无菌PBS缓冲液冲洗30min，3次；
0.25％胰蛋白酶处理6h,无菌PBS缓冲液冲洗30min，3次；
5×107U/L DNase-I及1×106U/L DNase-A处理16h,无菌PBS缓冲液冲洗30min，3次；
异丙醇处理8h，无菌PBS缓冲液冲洗30min，3次。
所有溶液均添加双抗(100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素)，处理过程均在持续均匀搅拌下进行，-40℃过夜后置于真空冻干机24h冻干，环氧乙烷低温消毒后密封备用。
实施例2：人脂肪间充质干细胞的分离培养
超净台内，用移液管吸弃脂肪组织下层液体，用移液管加入等体积的细胞清洗液，盖上瓶盖后上下颠倒摇晃，静置至明显分层；吸弃脂肪组织下层溶液(重复一次)。
用移液管将脂肪组织均匀分至50ml离心管中，补加细胞清洗液至40ml，1500rpm离心5min。用移液管吸弃上层脂肪油和下层液体，每管加入脂肪组织等体积的0.5％I型胶原酶溶液，封口后水平前后摇晃，充分混合均匀。
转移至恒温振荡器中，37℃、200R消化30-50min，直至脂肪完全消化。离心管配平后放入离心机，1500rpm离心5min。
用移液管吸弃油层，并倒弃剩余液体，加入40ml细胞清洗液重悬细胞沉淀，离心管配平后放入离心机内，1500rpm离心5min。
离心结束后，倒弃上清，Lonza培养基重悬细胞。将细胞接种于15cm培养皿中，每20ml脂肪接种1个15cm皿，每皿加入20ml细胞悬液，10ng/ml EGF。
48h后，对原代细胞进行换液，获得人脂肪间充质干细胞原代细胞(P0)，再经传代培养至细胞融合度达80-90％即得人脂肪间充质干细胞细胞。
实施例3：敷料
取P3代脂肪间充质干细胞，吸去培养基，加入消化液进行消化，之后用适量血清终止消化，轻轻吹打成单细胞悬液。
1500rpm,离心5min，弃上清，用4℃PBS洗涤细胞3次后重悬混匀，调整细胞浓度约为107个/ml。
在50ml离心管中，按配方先后加入壳多糖、I型胶原、EGF、人脂肪脱细胞基质冻干粉、Lonza，每一步充分搅拌混匀，并用1mol/L氢氧化钠调pH值至7.2-7.4，形成支架材料溶液。
组分 含量
P3代脂肪干细胞(实施例1获得) 0.9×105个/ml～1.1×105个/ml
壳多糖 1.8～2.2％
I型胶原 0.4～0.6％
EGF 4.5～5.5ng/mL
人脂肪脱细胞基质冻干粉 2.5～3.5％
Lonza(溶剂) 余量
取单细胞悬液与支架材料溶液按配方浓度混匀。
实施例4：敷料
取P3代脂肪间充质干细胞，吸去培养基，加入消化液进行消化，之后用适量血清终止消化，轻轻吹打成单细胞悬液。
1500rpm,离心5min，弃上清，用4℃PBS洗涤细胞3次后重悬混匀，调整细胞浓度约为107个/ml。
在50ml离心管中，按配方先后加入壳多糖、I型胶原、EGF、人脂肪脱细胞基质冻干粉、Lonza，每一步充分搅拌混匀，并用1mol/L氢氧化钠调pH值至7.2-7.4，形成支架材料溶液。
组分 含量
P3代脂肪干细胞(实施例1获得) 4.5×105个/ml-5.5×105个/ml
壳多糖 1.5-2.5％
I型胶原 0.4-0.6％
EGF 4.5-5.5ng/mL
人脂肪脱细胞基质冻干粉 4.5-5.5％
Lonza(溶剂) 余量
取单细胞悬液与支架材料溶液按配方浓度混匀。
实施例5：敷料
取P3代脂肪间充质干细胞，吸去培养基，加入消化液进行消化，之后用适量血清终止消化，轻轻吹打成单细胞悬液。
1500rpm,离心5min，弃上清，用4℃PBS洗涤细胞3次后重悬混匀，调整细胞浓度约为107个/ml。
在50ml离心管中，按配方先后加入壳多糖、I型胶原、EGF、人脂肪脱细胞基质冻干粉、Lonza，每一步充分搅拌混匀，并用1mol/L氢氧化钠调pH值至7.2-7.4，形成支架材料溶液。
取单细胞悬液与支架材料溶液按配方浓度混匀。
实施例6：敷料
取P3代脂肪间充质干细胞，吸去培养基，加入消化液进行消化，之后用适量血清终止消化，轻轻吹打成单细胞悬液。
1500rpm,离心5min，弃上清，用4℃PBS洗涤细胞3次后重悬混匀，调整细胞浓度约为107个/ml。
在50ml离心管中，按配方先后加入壳多糖、I型胶原、EGF、人脂肪脱细胞基质冻干粉、Lonza，每一步充分搅拌混匀，并用1mol/L氢氧化钠调pH值至7.2-7.4，形成支架材料溶液。
组分 含量
P3代脂肪干细胞(实施例1获得) 1×105个/ml
壳多糖 2％
I型胶原 0.5％
EGF 5ng/mL
人脂肪脱细胞基质冻干粉 3％
Lonza(溶剂) 余量
取单细胞悬液与支架材料溶液按配方浓度混匀。
实施例7：敷料
取P3代脂肪间充质干细胞，吸去培养基，加入消化液进行消化，之后用适量血清终止消化，轻轻吹打成单细胞悬液。
1500rpm,离心5min，弃上清，用4℃PBS洗涤细胞3次后重悬混匀，调整细胞浓度约为107个/ml。
在50ml离心管中，按配方先后加入壳多糖、I型胶原、EGF、人脂肪脱细胞基质冻干粉、Lonza，每一步充分搅拌混匀，并用1mol/L氢氧化钠调pH值至7.2-7.4，形成支架材料溶液。
组分 含量
P3代脂肪干细胞(实施例1获得) 4.5×105个/ml
壳多糖 2％
I型胶原 0.5％
EGF 5ng/mL
人脂肪脱细胞基质冻干粉 5％
Lonza(溶剂) 余量
取单细胞悬液与支架材料溶液按配方浓度混匀。
实施例8：敷料
取P3代脂肪间充质干细胞，吸去培养基，加入消化液进行消化，之后用适量血清终止消化，轻轻吹打成单细胞悬液。
1500rpm,离心5min，弃上清，用4℃PBS洗涤细胞3次后重悬混匀，调整细胞浓度约为107个/ml。
在50ml离心管中，按配方先后加入壳多糖、I型胶原、EGF、人脂肪脱细胞基质冻干粉、Lonza，每一步充分搅拌混匀，并用1mol/L氢氧化钠调pH值至7.2-7.4，形成支架材料溶液。
组分 含量
P3代脂肪干细胞(实施例1获得) 1×106个/ml
壳多糖 2％
I型胶原 0.5％
EGF 5ng/mL
人脂肪脱细胞基质冻干粉 5％
Lonza(溶剂) 余量
取单细胞悬液与支架材料溶液按配方浓度混匀。
实施例9：3D敷料制备
(1)3D建模
利用CAD/CAM等矢量建模软件，实现3D建模。
利用3D打印机内置的激光器对需修复伤口处进行扫描，获得伤口的大小、形状、厚薄及患者正常皮肤的表皮真皮厚度等数据，然后利用PlyEdit软件对扫描后的图像进行消除数字噪音等处理并对其进行编辑，使之产生一个连续的表面图像；利用Studio4.0软件将图像转化为立体光刻(.STL)文件并导入至Solid Works软件，使扫描后的溃疡表面图像转变为一个虚拟立体图像(或模块)，可以用来直接打印出对应的敷料。
(2)3D打印敷料
利用已经建好的3D敷料模具，将细胞和支架材料混合液一层一层喷涂在基材上，打印的层数和具体的量根据不同患者以及患者的不同部位而变化，打印完成后，等待其凝固，形成3D敷料。
(3)打印后处理
待敷料凝固后，将敷料从基材上剥离下来，并放在培养基(Lonza、10％FBS，0.1％青、链霉素)中于37℃、5％CO2、饱和湿度培养。
实施例10：3D敷料评价
(1)3D敷料质量检测：
对实施例3-8制得的医用敷料进行微生物检测和内毒素检测检测。其中，微生物检测(细菌、真菌)根据2015年版中华人民共和国药典第4部通则1100进行检测；内毒素检测根据2015年版中华人民共和国药典第4部通则1143进行检测。
检测结果：实施例3-8制得的生物制剂在细菌、真菌和内毒素的检测中，均呈阴性。说明了该干细胞制剂的质量合格，可用于创口的修复。
(2)力学性能评价
利用镊子夹，观察实施例3-8制得的3D敷料是否破碎，以此来判断敷料的弹性和韧性；并且观察刚打印的敷料和培养10天后的敷料在形状、厚度、弹性上是否有明显的变化。
结果显示：实施例3-8制得的3D敷料机械强度良好，可用手术钳夹取，加入培养基后不松散，继续培养过程中未见破碎和大幅降解。
实施例11：3D敷料的创伤修复效果检测
取70只小鼠，将小鼠常规饲养3d后，腹腔注射10％水合氯醛麻醉，每100g体重注射1ml 10％水合氯醛。剃去背部毛，在背部制成一个深入皮下的1cm*1cm的创面，造成小鼠创伤模型。将小鼠分为7组，其中一组为对照组，其余6组为实验组。对照组用无菌纱布包扎伤口，其余6组小鼠分别用实施例3～8制得的3D敷料进行治疗，7天后观察小鼠的伤口愈合程度，结果如表1所示：
表1
*表示与对照组相比具有显著性差异，P<0.05。
表1试验结果表明，本发明实施例3～8制备的3D敷料与对照组相比，显著(P<0.05)提高了小鼠的伤口愈合程度。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种组合物，其特征在于，包括如下组分：
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，包括如下组分：
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，包括如下组分：包括如下组分：
4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，包括如下组分：
5.根据权利要求1至4任一项所述的组合物，其特征在于，包括如下组分：
6.根据权利要求1至4任一项所述的组合物，其特征在于，所述生物大分子物质为壳多糖；
所述胶原蛋白为Ⅰ型胶原蛋白。
7.根据权利要求1至6任一项所述的组合物，其特征在于，所述生长因子为EGF；
所述脂肪脱细胞基质为人脂肪脱细胞基质冻干粉。
8.根据权利要求1至7任一项所述的组合物在制备创伤修复的药物和/或制剂中的应用。
9.一种3D敷料，其特征在于，包括如权利要求1至7任一项所述的组合物。
10.一种如权利要求9所述的3D敷料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：获得脂肪间充质干细胞的单细胞悬液，调整细胞浓度为0.9×105个/ml～1.1×106个/ml；
步骤2：取脂肪干细胞、生物大分子物质、胶原蛋白、生长因子、脂肪脱细胞基质和溶剂混合，调整pH值为7.2～7.4，制得支架材料溶液；
步骤3：取步骤1所述的单细胞悬液与步骤2制得的支架材料溶液按照配方混合。
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