CN105688287A - 用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片的制备方法，包括以下步骤：分别获取脱细胞羊膜和脂肪干细胞；将所述脂肪干细胞接种于所述脱细胞羊膜上于培养基中培养至细胞完全覆盖所述脱细胞羊膜。通过利用脂肪干细胞的分化潜能，以及脱细胞羊膜对脂肪干细胞的刺激诱导作用，促使脂肪干细胞分化成上皮细胞；而脱细胞羊膜的抗原性较低，又能够为细胞提供充足的营养物质，以保持细胞活性及细胞正常的生长，从而使得脂肪干细胞的存活率及转化率较高，提高皮肤修复效果，达到快速修复皮肤创伤的目的。

Description

用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片及其制备方法

技术领域

本发明涉及组织工程领域，特别涉及一种用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片及其制备方法。

背景技术

皮肤是人体与外界环境接触的屏障，不仅起保护、分泌、代谢和感觉等作用，而且参与免疫反应和维持机体内环境的稳定。作为人体最表露的皮肤，其受损伤及大面积烫烧伤意外的发生率较高。早期的烧伤创面覆盖可以抑制细菌生长、预防感染、防止水分及电解质的丢失；自体皮肤移植是治疗烧伤的首选，但是对于大面积烧伤，自体皮肤不能满足需求，而异体皮肤能引起明显的免疫排斥，因此，截至目前，严重创伤和大面积烧伤患者的皮源缺乏仍然是临床亟待解决的难题。

目前，组织工程化皮肤的研究已成为生命科学研究领域的热点之一，而市场上也已出现用于临床的组织工程皮肤产品，虽有一定的临床效果，但不仅价格昂贵，技术操作繁琐，有一定的技术难度且成本造价较高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中组织工程皮肤覆盖物制作较繁琐，难度较大且修复效果差等缺陷，提供一种制作简单且修复效果较好的用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片及其制备方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片的制备方法，包括以下步骤：

分别获取脱细胞羊膜和脂肪干细胞；

将所述脂肪干细胞接种于所述脱细胞羊膜上于培养基中培养至所述脂肪干细胞完全覆盖所述脱细胞羊膜。

在本发明提供的用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片的制备方法中，在所述脂肪干细胞接种于所述脱细胞羊膜之前，还包括对脱细胞羊膜进行杀菌的过程，包括以下步骤：

取脱细胞羊膜于无菌环境下装入无菌铝箔膜中，抽真空封口，钴60辐照灭菌3～5小时，辐照剂量为3～5kGy。

在本发明提供的用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片的制备方法中，将所述脂肪干细胞接种于所述脱细胞羊膜时，所述脱细胞羊膜处于平整状态。

在本发明提供的用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片的制备方法中，所述脂肪干细胞的接种密度为(0.5～5)×10⁴/cm²。

在本发明提供的用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片的制备方法中，所述培养基中含有质量分数为10％～20％血清。

在本发明提供的用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片的制备方法中，所述脱细胞羊膜的获取过程包括以下步骤：

取胎盘羊膜，去除血块和绒毛膜，用1.0-3.0g/L胰酶于恒温水浴中酶解消化去除羊膜表面的上皮细胞，清洗后，去除羊膜的海绵层、纤维母细胞层及浆液性渗出液，再次清洗，即获得所述脱细胞羊膜。

在本发明提供的用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片的制备方法中，所述脂肪干细胞的获取过程包括以下步骤：

取脂肪组织，去除血管和纤维，剪碎，洗涤后，离心，吸取中间层脂肪组织，清洗后再次离心，取上层脂肪组织于质量分数为0.03％～0.06％的Ⅰ型胶原酶中消化15～30分钟，加入PBS或生理盐水，并吹打组织，制成细胞悬液，经细胞过滤器过滤，收集滤液，并将滤液以1000～2000转/分的转速离心，获得细胞沉淀，洗涤细胞沉淀后对其再次离心，收集沉淀，即原代脂肪干细胞。

在本发明提供的用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片的制备方法中，所述脂肪干细胞的获取过程，还包括对所述原代脂肪干细胞进行传代培养的过程，具体步骤为：

将所述脂肪干细胞以(3～8)×10⁴个/cm²的密度接种于无血清培养基中进行原代培养，每隔2～3天更换新的培养基；待细胞融合度达到70～80％后，消化、洗涤并稀释细胞，然后离心弃上清液，用所述无血清培养基重悬细胞后，按1：(3～6)进行传代培养，每隔2～3天换液，待细胞融合度达到70～80％后，重复细胞消化传代的步骤，收集第2～4代脂肪干细胞。

本发明还提供一种用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片，由上述用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片制备方法所获得的。

实施本发明提供的用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片及其制备方法，可以达到以下有益效果：通过利用脂肪干细胞的分化潜能，以及脱细胞羊膜对脂肪干细胞的刺激诱导作用，促使脂肪干细胞分化成上皮细胞；而脱细胞羊膜的抗原性较低，又能够为细胞提供充足的营养物质，以保持细胞活性及细胞正常的生长，从而使得脂肪干细胞的存活率及转化率较高，提高皮肤修复效果，达到快速修复皮肤创伤的目的；除此之外，由于加快了修复速度，因此不易造成创伤部位色素累积形成疤痕等，减轻患者痛苦；另外，羊膜和脂肪干细胞均来自于废弃的组织，因此成本较低，能够减轻患者负担。

具体实施方式

为解决现有技术中通过组织工程获得的皮肤修复创伤效果不佳、修复效率低且成本较高，操作复杂等缺陷，本发明的创新点在于提供一种负载有脂肪干细胞的羊膜贴片及其制备方法，利用脂肪干细胞的分化能力，以及脱细胞羊膜对脂肪干细胞的刺激分化作用，使得脂肪干细胞转化成上皮细胞，从而能够实现修复皮肤创伤的目的。

具体地，本发明提供的用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片，其制备方法包括以下步骤：

S1、分别获取脱细胞羊膜和脂肪干细胞；

S2、将脂肪干细胞接种于脱细胞羊膜上于培养中培养至细胞完全覆盖脱细胞羊膜。

羊膜是人体最厚的基膜，来源广泛，多为孕妇生产后的废弃物，成本较低且不存在伦理问题。羊膜分为五层：上皮层、基底膜、致密层、纤维母细胞层和海绵层；其中，羊膜基底膜含有纤维粘连素、层粘连素、Ⅳ型胶原、硫酸乙酰肝素蛋白多糖，以及其他一些蛋白多糖大分子和一些细胞生长因子如表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子，能够满足脂肪干细胞所需营养物质需求，促进脂肪干细胞的黏附、迁移、生长、增殖和分化成上皮细胞等重要功能，且羊膜基底膜易于上皮细胞移行长入，增强上皮细胞的黏附性，促进上皮细胞的生长增殖，阻止上皮细胞凋亡；除此之外，羊膜基底膜中含有多种蛋白酶抑制剂，通过抑制相应的蛋白酶而发挥抗炎作用，从而起到抑制炎症的目的；另外，由于羊膜不表达人白细胞抗原A、B、C及DR或β微球蛋白，同时有无血管的基质，因此，抗原性较低。

羊膜经多步骤的脱细胞处理后，组织中的可溶性蛋白成分和细胞成分被去除，只保留了原有组织结构中的不可溶成分，主要包括胶原、弹性蛋白、氨基葡聚糖和结构蛋白等，为细胞生长和皮肤创伤修复提供了营养基础。在本发明中经胰酶消化后获得的脱细胞羊膜，其上皮细胞层、成纤维细胞层、海绵层均消失，仅保留了基膜层和致密层，有效地去除了羊膜中的细胞成分，保留了纤维网状结构，进一步降低了抗原性，有利于提高皮肤创伤的修复效率。

而脂肪干细胞具有较强的分化潜能，通过脱细胞羊膜的刺激作用，能够诱导脂肪干细胞转化为上皮细胞，从而达到修复皮肤创伤的目的。而脂肪干细胞通常来源于人体多余的脂肪组织，来源及采集较为简便，成本较低。

进一步地，在步骤S1中，脱细胞羊膜的获取过程，包括以下步骤：

S11、无菌环境下，取胎盘羊膜，去除血块和绒毛膜，用1.0-3.0g/L胰酶于恒温水浴中酶解消化20～40分钟，去除羊膜表面的上皮细胞，清洗后，去除羊膜的上皮层、海绵层、纤维母细胞层及浆液性渗出液，再次清洗，即获得脱细胞羊膜，放入PBS溶液中，于2～6℃密封保存备用。可以理解的是，脱细胞羊膜也可采用机械法制备获取，具体为现有技术，在此不再赘述。

进一步地，在步骤S1中，本发明优先采用细胞活性较强的第2～4代脂肪干细胞，第2～4代脂肪干细胞的获取过程为：

S12、原代脂肪干细胞的获取；

取脂肪组织，去除血管和纤维，剪碎，洗涤后，离心，吸取中间层脂肪组织，清洗后再次离心，取上层脂肪组织于质量分数为0.03％～0.06％的Ⅰ型胶原酶中消化15～30分钟，加入PBS或生理盐水，并吹打组织，制成细胞悬液，经细胞过滤器过滤，收集滤液，并将滤液以1000～2000转/分的转速离心，获得细胞沉淀，洗涤细胞沉淀后对其再次离心，收集沉淀，即原代脂肪干细胞。

S13、对原代脂肪干细胞进行传代培养至收获第2～4代脂肪干细胞；

取步骤S12中获得的原代脂肪干细胞进行细胞计数，以(3～8)×10⁴个/cm²的密度接种于无血清培养基中进行原代培养，每隔2～3天更换新的无血清培养基，待细胞融合度达到70～80％后，胰酶消化2～4分钟，加入等体积的PBS溶液或生理盐水稀释，反复吹打清洗，然后离心弃上清液，用无血清培养基重悬细胞后，按1：(3～6)的传代比例进行培养，采用无血清培养基进行扩增培养第一代脂肪干细胞，扩增过程中每隔2～3天更换新鲜的无血清培养基，待细胞融合度达到70～80％后，如此重复上述细胞消化传代步骤，完成第2～4代脂肪干细胞的传代和扩增培养。

步骤S2中，在接种脂肪干细胞之前，需对脱细胞羊膜进行杀菌处理，具体过程为：

无菌环境下，取步骤S11中获得的脱细胞羊膜装入无菌铝箔膜中，抽真空封口，用钴60辐照霉菌3～5小时即可；其中，辐照剂量为3～5kGy，以不改变脱细胞羊膜的理化性质为宜。

另外，在接种脂肪干细胞之前，还需在无菌环境中，将杀菌后的脱细胞羊膜铺平，且脱细胞羊膜上皮面朝上，具体可将脱细胞羊膜固定平铺在略小于脱细胞羊膜面积的玻璃平板上，或平铺与细胞培养皿内，多余的脱细胞羊膜内折，使脱细胞羊膜的接种面处于平整状态，然后再接种脂肪干细胞，并且在接种脂肪干细胞之后，脱细胞羊膜需始终保持平整状态以使脂肪干细胞均匀分布于脱细胞羊膜上，避免脂肪干细胞堆积，影响其细胞活性及正常生长。

步骤S2的具体过程为：

取步骤S13中获得的脂肪干细胞，细胞计数后，以(0.5～5)×10⁴/cm²密度接种于平铺杀菌后的脱细胞羊膜上进行培养至细胞贴壁，再添加含有10％～20％血清的培养基进行培养，待细胞长满脱细胞羊膜后待移植应用。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提供的一种用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片，其制备方法包括以下步骤：

S1a、脱细胞羊膜的获取；

于无菌洁净室内，将新鲜的人胎盘羊膜用无菌生理盐水洗净洗去其表面的血迹，去除血块和绒毛膜，留下包含上皮细胞层、基底膜和无血管基质的完整羊膜组织，用无菌PBS缓冲液冲洗干净，然后用2.0g/L胰酶37℃恒温水浴酶解消化30分钟，去除羊膜表面的上皮细胞，用PBS充分冲洗干净，将羊膜平铺在无菌的玻璃平板上，玻璃平板下面配有灯光便于观察，用细胞刮子刮除残留的上皮细胞、海绵层、纤维母细胞层及浆液性渗出液等，PBS清洗后，将脱细胞后的半透明羊膜取出放到PBS中，在4℃的温度下密封保存待用。

S2a、脂肪干细胞的获取；

从人体腹部采集脂肪组织，剔除脂肪中肉眼可见的血管和纤维部分，剪碎成1～2mm³大小组织块，用PH值为7.2-7.4的D-Hanks平衡盐液洗涤多次至洗出液清亮，去除残留的血液，在生物安全柜中，将脂肪组织块分装在50ml离心管中，以1000-1500r/min的转速离心5～10min，用移液管吸取离心后的中间层脂肪组织，加入等体积无菌生理盐水或PBS清洗，再以1000-2000rpm转速离心10min，吸取上层脂肪置于新离心管中，加入质量百分浓度为0.03％-0.06％的I型胶原酶中，混匀盖好盖，于37℃培养箱中震荡消化20min，然后加入PBS或者生理盐水，并吹打组织，制成细胞悬液，然后将细胞悬液经过75μm孔径的细胞过滤器过滤，去除未消化组织，收集滤液，即得到单细胞悬液，以1000-2000rpm离心10min，获得细胞沉淀，加入生理盐水或PBS重新洗涤细胞一次，再次离心，沉淀即为原代脂肪干细胞。

S3a、对原代脂肪干细胞进行传代培养，获取第三代脂肪干细胞；

取步骤S2a中获取的原代脂肪干细胞，以5×10⁴个/cm²的密度接种于无血清培养基中进行原代培养，在37℃、5％的CO₂培养箱中，每隔2-3天更换新鲜的无血清培养基，待细胞融合度达到70％-80％后，采用1×TrypLESelect(胰蛋白酶无酚红，来源于美国Invitrogen公司)于37℃消化3分钟，加入等体积的PBS稀释，反复吹打，将细胞清洗干净，然后将清洗后的细胞移入50mL离心管中，以1000-2000rpm转速离心5min，弃上清液，将细胞重悬于新的无血清培养基，按照1:4的传代比例，传代接种于新培养瓶中，采用无血清培养基进行扩增培养第一代脂肪干细胞，扩增过程每隔2-3天更换新鲜无血清培养基，待细胞融合度达到70％-80％后，如此重复上述的细胞消化传代过程，待第三代细胞融合度达到70％-80％后，停止传代培养，用于羊膜贴片的制作。

S4a、羊膜贴片的制备；

S41a、脱细胞羊膜的杀菌处理；

取出步骤S1a获得的脱细胞羊膜在无菌净化间装入无菌铝箔膜包装袋中，抽真空封口，钴60辐照灭菌4小时，辐照剂量4kGy。

S42a、接种第三代脂肪干细胞；

将步骤S41a中获取的脱细胞羊膜裁剪成略大于培养皿底部面积，然后将其平铺于玻璃培养皿底部，多余部分内折，使脱细胞羊膜的接种面处于平整状态，并赶出脱细胞羊膜底部的气泡；

取步骤S3a中获得的第三代脂肪干细胞，调整其密度为3×10⁴/cm²接种于平铺杀菌后的脱细胞羊膜上进行培养至细胞贴壁，再添加含有10％～20％血清的DMEM或DF12培养基进行培养，待细胞长满脱细胞羊膜后待移植应用即可。

为进一步验证本发明提供的用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片具有显著的有益效果，设置以下实验进行验证。

一、构建SD大鼠皮肤深Ⅱ度烫伤模型的构建

实验组：采用本发明实施例1制备的羊膜贴片进行治疗的大鼠；

对照组：采用现有技术中的组织工程化皮肤贴片进行治疗的大鼠；

实验组和对照组大鼠均来源于江苏大学动物实验中心，其体态及健康指标基本相同。

分别对实验组和对照组大鼠进行以下操作：

将体重200g的大鼠背部应用8％的Na2S进行脱毛处理，次日采用烫伤装置80℃损伤8s，制造一个直径为1.5cm的圆形创面。首先对创面进行常规清创处理，去除污物及脱落上皮，去除水泡并消毒；其次，将贴片根据损伤部位面积和形状进行修剪，将贴片与创面贴紧并覆盖整个创面，贴片大于创缘约2～3cm。

3天后打开实验组大鼠创面上的纱布，观察创面，发现创面渗出物较少，更换新的贴片，再隔3d，打开纱布，发现损伤部位开始出现上皮化，无感染，再次更换新的羊膜贴片，直到第9天，打开纱布，创面基本愈合，愈合后创面随访，愈合创面瘢痕增生少，色素沉着少。

而3天后打开对照组大鼠创面上的纱布，创面渗出物相对较多，更换新的贴片，再隔3天，打开纱布，发现渗出物减少；再次更换新的贴片，直至第9天，打开纱布，创面开始出现局部上皮化，再次更换新的贴片，直至第15天，创面基本愈合，愈合创面色素沉着，显褐色。

二、治疗病例

王某某，男，38岁，深II度烧伤，胳膊部分面积为130cm²左右，该治疗经患者王某某签字同意。

治疗时，局部创面常规清创处理，去除污物及脱落上皮，去除水泡并消毒。将本发明制成的羊膜贴片根据损伤部位面积和形状进行修剪，然后将贴片与创面贴紧并覆盖整个创面，贴片大于创缘约2～3cm。5d后打开纱布，观察创面，发现创面渗出较少，更换新的贴片，换药时，疼痛明显轻于未贴羊膜的烧伤病人。再隔3d，打开纱布，发现损伤部位开始出现上皮化，无感染，再次更换新的羊膜贴片，直到第10d，打开纱布，创面基本愈合，愈合后创面随访，愈合创面瘢痕增生少，色素沉着少。

以上对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (9)

1.一种用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

分别获取脱细胞羊膜和脂肪干细胞；

将所述脂肪干细胞接种于所述脱细胞羊膜于培养基中培养至所述脂肪干细胞完全覆盖所述脱细胞羊膜。

2.根据权利要求1所述的用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片的制备方法，其特征在于，在所述脂肪干细胞接种于所述脱细胞羊膜之前，还包括对脱细胞羊膜进行杀菌的步骤：

取脱细胞羊膜于无菌环境下装入无菌铝箔膜中，抽真空封口，钴60辐照灭菌3～5小时，辐照剂量为3～5kGy。

3.根据权利要求2所述的用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片的制备方法，其特征在于，将所述所述脂肪干细胞接种于所述脱细胞羊膜时，所述脱细胞羊膜处于平整状态。

4.根据权利要求1所述的用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片的制备方法，其特征在于，所述脂肪干细胞的接种密度为(0.5～5)×10⁴/cm²。

5.根据权利要求1所述的用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片的制备方法，其特征在于，所述培养基中含有质量分数为10％～20％血清。

6.根据权利要求1所述的用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片的制备方法，其特征在于，所述脱细胞羊膜的获取过程包括以下步骤：

取胎盘羊膜，去除血块和绒毛膜，用1.0-3.0g/L胰酶于恒温水浴中酶解消化去除羊膜表面的上皮细胞，清洗后，去除羊膜的海绵层、纤维母细胞层及浆液性渗出液，再次清洗，即获得所述脱细胞羊膜。

7.根据权利要求1所述的用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片的制备方法，其特征在于，所述脂肪干细胞的获取过程包括以下步骤：

取脂肪组织，去除血管和纤维，剪碎，洗涤后，离心，吸取中间层脂肪组织，清洗后再次离心，取上层脂肪组织于质量分数为0.03％～0.06％的Ⅰ型胶原酶中消化15～30分钟，加入PBS或生理盐水，并吹打组织，制成细胞悬液，经细胞过滤器过滤，收集滤液，并将滤液以1000～2000转/分的转速离心，获得细胞沉淀，洗涤细胞沉淀后对其再次离心，收集沉淀，即原代脂肪干细胞。

8.根据权利要求7所述的用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片的制备方法，其特征在于，所述脂肪干细胞的获取过程，还包括对所述原代脂肪干细胞进行传代培养的过程，具体步骤为：

将所述脂肪干细胞以(3～8)×10⁴个/cm²的密度接种于无血清培养基中进行原代培养，每隔2～3天更换新的培养基；待细胞融合度达到70～80％后，消化、洗涤并稀释细胞，然后离心弃上清液，用所述无血清培养基重悬细胞后，按1：(3～6)进行传代培养，每隔2～3天换液，待细胞融合度达到70～80％后，重复细胞消化传代的步骤，收集第2～4代脂肪干细胞。

9.一种用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片，其特征在于，由权利要求1-8任一项所述的用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片制备方法所获得的。