CN105617461A - 用于治疗皮肤烧伤的皮肤贴片及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于治疗皮肤烧伤的皮肤贴片的制备方法，包括以下步骤：分别获取脂肪干细胞和异体皮基质；将所述脂肪干细胞与胶原溶液混合后接种于所述异体皮基质；其中，所述脂肪干细胞来源于皮肤烧伤患者自体。通过利用脂肪干细胞的分化潜能，以及异体皮基质的刺激诱导作用，促使脂肪干细胞分化成表皮细胞；而由于脂肪干细胞来源于烧伤患者自体，因此其抗原性较低，不易引起免疫排斥反应，从而提高皮肤修复效果，达到快速修复皮肤创伤的目的；除此之外，由于加快了修复速度，因此不易造成创伤部位色素累积形成疤痕等，减轻患者痛苦。

Description

用于治疗皮肤烧伤的皮肤贴片及其制备方法
技术领域
本发明涉及组织工程领域，特别涉及一种用于治疗皮肤烧伤的皮肤贴片及其制备方法。
背景技术
皮肤是人体与外界环境接触的屏障，不仅起保护、分泌、代谢和感觉等作用，而且参与免疫反应和维持机体内环境的稳定。作为人体最表露的皮肤，其受损伤及大面积烫烧伤意外的发生率较高。早期的烧伤创面覆盖可以抑制细菌生长、预防感染、防止水分及电解质的丢失；自体皮肤移植是治疗烧伤的首选，但是对于大面积烧伤，自体皮肤不能满足需求，且疗程周期较长，治疗过程中，皮肤创口易出现感染；而异体皮基质肤则会引起明显的免疫排斥反应；而移植人造皮肤，皮下的分泌物易形成水疱，进而对人造皮肤造成损伤，且人造皮肤较昂贵，制作工艺较复杂。因此，截至目前，严重创伤和大面积烧伤患者的皮源缺乏仍然是临床亟待解决的难题。
目前，组织工程化皮肤的研究已成为生命科学研究领域的热点之一，而市场上也已出现用于临床的组织工程皮肤产品，虽有一定的临床效果，但不仅价格昂贵，技术操作繁琐，有一定的技术难度且成本造价较高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中采用异体皮基质修复皮肤烧伤创口易引起免疫排斥反应且疗效效率低等缺陷，提供一种能够避免免疫排斥反应且修复效果较好的用于治疗皮肤烧伤的皮肤贴片及其制备方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种用于治疗皮肤烧伤的皮肤贴片的制备方法，包括以下步骤：
分别获取脂肪干细胞和异体皮基质；
将所述脂肪干细胞与胶原溶液混合后接种于所述异体皮基质；
其中，所述脂肪干细胞来源于皮肤烧伤患者自体。
在本发明提供的用于治疗皮肤烧伤的皮肤贴片的制备方法中，所述脂肪干细胞的终浓度为(2～4)×104个/ml。
在本发明提供的用于治疗皮肤烧伤的皮肤贴片的制备方法中，所述胶原溶液中，胶原的质量分数为0.1～0.3％。
在本发明提供的用于治疗皮肤烧伤的皮肤贴片的制备方法中，所述脂肪干细胞的获取过程，包括以下步骤：
无菌条件下，取所述皮肤烧伤患者的脂肪组织，剔除脂肪中肉眼可见的血管和纤维部分，经PBS溶液清洗后，剪碎，酶解振荡消化20～60分钟，用完全培养基中止消化，再置于冰浴中吹打消化10～20分钟，过滤，去除未消化的脂肪组织和结缔组织后，对滤液进行离心，去除上层油滴，取下层脂肪细胞，PBS清洗后，即获得原代脂肪干细胞。
在本发明提供的用于治疗皮肤烧伤的皮肤贴片的制备方法中，所述脂肪干细胞的获取过程还包括以下步骤：
洗涤所述原代脂肪干细胞，去除红细胞，用完全培养基重悬，然后接种于多聚鸟氨酸包被的培养板上，培养2～6小时，移去上清液后胰酶消化，去除未消化的成纤维细胞和内皮细胞，即获得纯化后的原代脂肪干细胞。
在本发明提供的用于治疗皮肤烧伤的皮肤贴片的制备方法中，所述脂肪干细胞的获取过程还包括以下步骤：
取纯化后的原代脂肪干细胞以0.5～2×105个/ml的密度接种于DMEM培养基进行扩增培养7～10天，每隔2-3天换液一次。
在本发明提供的用于治疗皮肤烧伤的皮肤贴片的制备方法中，所述DMEM培养基中添加有2～5％人血清、5～15ng/ml的ITS、50～150U/ml的链霉素、50～150U/ml青霉素、5～35ng/ml的EGF和5～15ng/ml的LIF。
在本发明提供的用于治疗皮肤烧伤的皮肤贴片的制备方法中，所述异体皮基质的获取过程，包括以下步骤：
取健康猪腹部或背部皮进行脱脂脱毛处理，去掉0.2～0.6mm的表皮，制成厚度为0.2～0.4mm的真皮层皮片，清洗后消毒20～40分钟，反复清洗，于消化液中消化2～4天，反复清洗皮片，然后加入非离子型表面活性剂孵育2～4天，至细胞成分完全去除，获得脱细胞真皮，然后分别用氯化钠和PBS反复冲洗，即获得异体皮基质。
在本发明提供的用于治疗皮肤烧伤的皮肤贴片的制备方法中，所述消化液中包含有质量百分数为0.10～0.40％胰蛋白酶、0.01～0.03％乙二酸乙二胺和0.01～0.03％氢氧化钠。
本发明还提供一种用于治疗皮肤烧伤的皮肤贴片，由上述用于治疗皮肤烧伤的皮肤贴片制备方法所获得的。
实施本发明提供的用于治疗皮肤烧伤的皮肤贴片及其制备方法，可以达到以下有益效果：通过利用脂肪干细胞的分化潜能，以及异体皮基质的刺激诱导作用，促使脂肪干细胞分化成表皮细胞；而由于脂肪干细胞来源于烧伤患者自体，因此其抗原性较低，不易引起免疫排斥反应，从而提高皮肤修复效果，达到快速修复皮肤创伤的目的；除此之外，由于加快了修复速度，因此不易造成创伤部位色素累积形成疤痕等，减轻患者痛苦。
具体实施方式
为解决现有技术中通过异体皮基质修复烧伤皮肤存在易引起免疫排斥反应且修复效率低等缺陷，本发明的创新点在于提供一种负载有皮肤烧伤患者自体脂肪干细胞的皮肤贴片及其制备方法，通过采用自体脂肪干细胞结合异体皮基质，以降低因异体皮基质引起的免疫排斥反应，从而降低皮肤贴片的抗原性，提高皮肤修复效率。
具体地，本发明提供的用于治疗皮肤烧伤的皮肤贴片，其制备方法包括以下步骤：
S1、分别获取脂肪干细胞和异体皮基质；
其中，脂肪干细胞来源于皮肤烧伤患者自体；异体皮基质为经脱细胞处理后的皮肤基质，可以是同种异体皮基质(即除皮肤烧伤患者以外的人类皮基质)，也可以是异种异体皮基质(如猪、牛等动物皮基质)；
S2、将脂肪干细胞与胶原溶液混合后接种于异体皮基质上即可。
异体皮基质不仅用来作为修复烧伤皮肤的贴片，而且其中保留了原有组织结构中的不可溶成分，主要包括胶原、弹性蛋白、氨基葡聚糖和结构蛋白等，为细胞生长和皮肤创伤修复提供了营养基础能够为脂肪干细胞提供生长所需营养物质及促使脂肪干细胞分化成表皮细胞的细胞因子，使得脂肪干细胞能够维持其细胞活性，并能够分化成表皮细胞；而由于脂肪干细胞来源于烧伤皮肤患者本体，因此其抗原性相对较弱，能够避免异体皮基质直接接触皮肤烧伤部分所引起的免疫排斥反应，以此提高修复皮肤效率的目的。
进一步地，步骤S1中，优选地，脂肪干细胞的获取过程，包括以下步骤：
S11A、原代脂肪干细胞的获取；
无菌条件下，取所述皮肤烧伤患者的脂肪组织，剔除脂肪中肉眼可见的血管和纤维部分，经PBS溶液清洗后，剪碎，酶解振荡消化20～60分钟，用完全培养基中止消化，再置于冰浴中吹打消化10～20分钟，过滤，去除未消化的脂肪组织和结缔组织后，对滤液进行离心，去除上层油滴，取下层脂肪细胞，PBS清洗后，即获得原代脂肪干细胞；
其中，优选地，完全培养基为含有(5～10)％胎牛血清和(0.5～2)％双抗的高糖DMEM培养基。
S12A、对步骤S11A中获取的原代脂肪干细胞进行纯化；
洗涤步骤S11A中获取的原代脂肪干细胞，去除红细胞，用完全培养基重悬，然后接种于多聚鸟氨酸包被的培养板上，培养2～6小时，移去上清液后胰酶消化，去除未消化的成纤维细胞和内皮细胞，即获得纯化后的原代脂肪干细胞。
S13A、对纯化后的原代脂肪干细胞进行扩增培养；
取步骤S12A中纯化后的原代脂肪干细胞以(0.5～2)×105个/ml的密度接种于DMEM培养基中进行扩增培养7～10天，每隔2-3天换液一次。在本发明中，优选地，将原代脂肪干细胞接种于细胞培养袋中，便于后期接种涂覆于异体皮基质上；同时在原代脂肪干细胞培养过程中，通过轻微晃动细胞培养袋更有利于原代脂肪干细胞充分接触培养基，以提高脂肪干细胞活性。
其中，DMEM培养基中添加有2～5％人血清、5～15ng/ml的ITS(其主要成份为胰岛素、转铁蛋白和硒)、50～150U/ml的链霉素、50～150U/ml青霉素、5～35ng/ml的EGF(EpidermalGrowthFactor，表皮生长因子)和5～15ng/ml的LIF(leukemiainhibitoryfactor,白血病抑制因子)。
其中，ITS中的胰岛素，能够降低蛋白质降解，增加氨基酸和葡萄糖的摄入，为细胞生长和分化提供能量，促使脂肪干细胞处于低糖环境，保持细胞活性，有利于脂肪干细胞向表皮细胞分化；同时，能够促进细胞利用葡萄糖和蛋白质，促进RNA、蛋白质和脂肪酸的合成，抑制细胞凋亡，是非常重要的细胞存活因子。转铁蛋白能够干预脂肪干细胞内的离子代谢，促进脂肪干细胞的生成。而硒是强力抗氧化元素，硒通过抗氧化物消除细胞培养过程中产生的自由基，减少和延缓脂褐素的形成，以达到抗细胞衰老和凋亡的目的；另外，硒作为谷胱甘肽过氧化物酶的成分，能催化还原型谷胱甘肽为氧化型谷胱甘肽，保护细胞的生物膜结构和功能的完整性，并保护细胞膜功能及预防细胞坏死和突变。
青霉素能够阻碍细菌的细胞壁合成，导致细胞泄漏死亡，从而抑制细菌的生长；而链霉素能够作用于细菌的核糖体，阻碍蛋白翻译，从而抑制细菌生长；自然环境下，不考虑人为产生的抗药性，对青霉素不敏感的绝大多数微生物对链霉素敏感，反之亦然；因此，最为优选地是将青霉素和链霉素搭配使用能够控制几乎全部常见的细菌，从而能够尽量避免细菌对脂肪干细胞的生长及活性造成的不良影响。
EGF能够促进细胞的迁移、黏附、增殖和存活，且EGF可以诱导脂肪干细胞的增殖、迁移，且不影响其分化潜能，对损伤组织具有修复和保护功能。
LIF能够促进细胞生长、增殖与分化，在细胞培养基中添加一定量的LIF可以取代滋养层细胞，维持脂肪干细胞的增殖，提高细胞增殖速率和长期增殖能力，并使得脂肪干细胞能够保持不分化状态。
可以理解的是，在本发明中，也可直接采用原代脂肪干细胞制作皮肤贴片。
进一步地，异体皮基质的获取过程为：
S1B、取健康猪腹部或背部皮进行脱脂脱毛处理，去掉0.2～0.6mm的表皮，制成厚度为0.2～0.4mm的真皮层皮片，清洗后消毒20～40分钟，反复清洗，于消化液中消化2～4天，反复清洗皮片，然后加入非离子型表面活性剂孵育2～4天，至细胞成分完全去除，获得脱细胞真皮，然后分别用氯化钠溶液和PBS缓冲液反复冲洗，以充分降低皮基质的抗原性；其中，氯化钠的质量分数为5～9％，用氯化钠溶液冲洗处理时间为8～16小时，每隔6小时换液；PBS冲洗处理8～16小时，每隔6小时换液，即获得异体皮基质。
其中，优选地，消化液中包含有质量百分数为0.10～0.40％胰蛋白酶、0.01～0.03％乙二酸乙二胺和0.01～0.03％氢氧化钠；非离子型表面活性剂为(0.4～0.6)％TritonX-100溶液。
步骤2中，在接种脂肪干细胞之前，需对异体皮基质进行杀菌处理，以进一步降低异体皮基质的抗原性，具体过程为：
无菌环境下，取步骤S1B中获得的异体皮基质装入无菌铝箔膜中，抽真空封口，用钴60辐照霉菌3～5小时即可；其中，辐照剂量为3～5kGy，以不改变异体皮基质的理化性质为宜。
另外，在接种脂肪干细胞之前，还需在无菌环境中，将杀菌后的异体皮基质铺平，且异体皮基质上皮面朝上，具体可将异体皮基质固定平铺在略小于异体皮基质面积的玻璃平板上，或平铺与细胞培养皿内，多余的异体皮基质内折，使异体皮基质的接种面处于平整状态，然后再接种脂肪干细胞，并且在接种脂肪干细胞之后，异体皮基质需始终保持平整状态以使脂肪干细胞均匀分布于异体皮基质上，避免脂肪干细胞堆积，影响其细胞活性及正常生长。
步骤S2的具体过程为：
取质量分数为0.1～0.3％的胶原溶液，调整PH至7.0～7.4，将步骤S13A中所获得的脂肪干细胞与胶原溶液快速充分混合，使脂肪干细胞终浓度为(2～4)×104个/ml；
然后，在异体皮基质上铺入含有脂肪干细胞的胶原溶液，高度1～3mm，室温静置10～30min至胶原凝固即可。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本发明提供的一种用于治疗皮肤烧伤的皮肤贴片，其制备方法包括以下步骤：
S1a、患者选择；
烧伤病人入选标准：Ⅱ～Ⅲ度烧伤创面患者，并排除以下患者：
怀孕哺乳期妇女；对治疗中所用生物制剂过敏者；重度吸入性损伤及其他重要脏器损伤，如：肝肾功能损伤、颅脑损伤等；严重基础性疾病如：糖尿病、高血压、肿瘤或慢性脏器损害等；阻碍签署及理解知情同意者。
S2a、治疗前，对病人进行检查评估；
评估标准：检验血常规(WBC>3.0×10*9/L、LC>15％；Hb>80g/L；PLT>60×10*9/L)、肝肾功能、乙肝三系(表面抗原阴性)、丙肝抗体阴性、艾滋抗体阴性、梅毒抗体阴性。
S3a、脂肪干细胞的获取；
S31a、采集脂肪组织；
选择步骤S2a中达到评估标准的病人，在无菌条件下用抽脂机抽取病人腹部、臀部、大腿等脂肪含量丰富部位的脂肪组织，剔除脂肪中肉眼可见的血管和纤维部分，用PBS清洗脂肪组织3次，放入含有双抗(青霉素/链霉素，各为1％含量)的缓冲液中，无菌环境于4℃条件下保存备用。
S32a、获取原代脂肪干细胞；
取步骤S31a中获得的脂肪组织，于无菌条件下剪碎后，加入0.075％Ⅰ型胶原酶，37℃恒温并以50rpm振速振荡摇床消化40分钟，然后加入等量体积的完全培养基(高糖DMEM+8％胎牛血清+1％双抗)中止消化；然后，将消化液置于冰浴中，用吸管吹打15次后加入10mg/L的DnaseⅠ(脱氧核糖核酸酶I)孵育15分钟，经100微米滤网过滤，去除未消化的脂肪组织和结缔组织，4℃环境下、1000rpm离心10分钟，成熟脂肪细胞在表层油滴下方、培养基上方，去除上层油滴，将漂浮的脂肪细胞转移至新的离心管中，加入PBS清洗，4℃环境中1000rpm离心10分钟，重复此离心过程数次，即获得原代脂肪干细胞。
S33a、脂肪干细胞纯化；
将步骤S32a中获得的原代脂肪干细胞用1％的盐水洗涤2～3次以除去污染的红细胞，用完全培养基重悬，接种于多聚鸟氨酸包被的培养板，培养4小时，移去上清液，用0.25％的胰酶消化，去除难以消化的成纤维细胞、内皮细胞等，获得纯化后的原代脂肪干细胞。
S34a、脂肪干细胞的扩增培养；
将步骤S33a中获得的纯化后的原代脂肪干细胞置于300毫升的细胞培养袋内，原代脂肪干细胞的接种密度为1×105个/ml，添加DMEM培养基，放置于37℃、5％CO2培养箱中饱和湿度培养8天；
其中，DMEM培养基中添加有5％人血清、10ng/ml的ITS(胰岛素、转铁蛋白、硒)，100U/ml的链霉素和青霉素，20ng/ml的EGF(EpidermalGrowthFactor，表皮生长因子)，10ng/ml的LIF(leukemiainhibitoryfactor，白血病抑制因子)。
S4a、异体皮基质的制备；
将健康猪的整张腹部与背部皮用机械法进行初步脱脂，用镊子把毛剔除干净，用电动取皮机先将猪皮的皮下组织去掉，再去掉表皮0.4mm，制成厚度为0.3mm的真皮层皮片，经生理盐水洗净后浸入浓度为0.1％的医用新洁尔灭溶液中消毒，30分钟后取出，用无菌生理盐水反复冲洗10次；然后将皮片剪成1cm×1cm大小，PBS液冲洗两遍，浸泡于装有0.25％胰蛋白酶、0.02％乙二酸乙二胺(EDTA)及0.02％氢氧化钠混合消化溶液的玻璃瓶内，4℃下消化3d，每天晃动5次左右。4天后取出皮片，PBS液冲洗2遍，放入装有0.5％TritonX-100溶液的玻璃瓶内，室温下孵育，并持续震荡3d，直至细胞成分完全去除，获得脱细胞真皮。
最后，用质量分数为7％的NaCl溶液和pH值为7.4的PBS液冲洗；其中，NaCl溶液处理时间为12h，磷酸缓冲盐溶液处理时间为12h，每隔6h换液，重复5次，存于4℃PBS液中备用。
S5a、皮肤贴片的制备；
S51a、异体皮基质的杀菌处理；
取出步骤S4a中获得的异体皮基质在无菌净化间装入无菌铝箔膜包装袋中，抽真空封口，钴60辐照灭菌4小时，辐照剂量4kGy。
S52a、混合胶原溶液与脂肪干细胞；
取0.2％胶原溶液加入离心管中，用NaHCO2调整溶液PH至7.2，将步骤S34a中获得的脂肪干细胞与胶原溶液快速充分混合，使脂肪干细胞终浓度为3×104个/ml。
S53a、将含有脂肪干细胞的胶原凝胶涂覆于异体皮基质上；
无菌条件下，取步骤S51a中获得的异体皮基质，将步骤S52a中获得的含有脂肪干细胞的胶原凝胶涂覆在异体皮基质上，高度2mm左右，室温静置20min待其凝固或置培养箱待胶原凝固，即制成皮肤贴片。
使用时，将皮肤贴片贴敷在创面上，对齐后缝合、加压包扎和固定；而对于烧伤严重者，可采用多点注射脂肪干细胞配合皮肤贴片法治疗，每点注射步骤S34a获得的脂肪干细胞的体积小于250ml，脂肪干细胞的密度为3×104个/ml。
实施例2
与实施例1的不同之处在于，本实施例中，
S3b、脂肪干细胞的获取；
S31b、采集脂肪组织；
选择步骤S2a中达到评估标准的病人，在无菌条件下用抽脂机抽取病人腹部、臀部、大腿等脂肪含量丰富部位的脂肪组织，剔除脂肪中肉眼可见的血管和纤维部分，用PBS清洗脂肪组织3次，放入含有双抗(青霉素/链霉素，各为1％含量)的缓冲液中，无菌环境于4℃条件下保存备用。
S32b、获取原代脂肪干细胞；
取步骤S31b中获得的脂肪组织，于无菌条件下剪碎后，加入0.075％Ⅰ型胶原酶，37℃恒温并以50rpm振速振荡摇床消化20分钟，然后加入等量体积的完全培养基(高糖DMEM+5％胎牛血清+2％双抗)中止消化；然后，将消化液置于冰浴中，用吸管吹打15次后加入10mg/L的DnbseⅠ(脱氧核糖核酸酶I)孵育20分钟，经100微米滤网过滤，去除未消化的脂肪组织和结缔组织，4℃环境下、1000rpm离心10分钟，成熟脂肪细胞在表层油滴下方、培养基上方，去除上层油滴，将漂浮的脂肪细胞转移至新的离心管中，加入PBS清洗，4℃环境中1000rpm离心10分钟，重复此离心过程数次，即获得原代脂肪干细胞。
S33b、脂肪干细胞纯化；
将步骤S32b中获得的原代脂肪干细胞用1％的盐水洗涤3次以除去污染的红细胞，用完全培养基重悬，接种于多聚鸟氨酸包被的培养板，培养2小时，移去上清液，用0.25％的胰酶消化，去除难以消化的成纤维细胞、内皮细胞等，获得纯化后的原代脂肪干细胞。
S34b、脂肪干细胞的扩增培养；
将步骤S33b中获得的纯化后的原代脂肪干细胞置于300毫升的细胞培养袋内，原代脂肪干细胞的接种密度为0.5×105个/ml，添加DMEM培养基，放置于37℃、5％CO2培养箱中饱和湿度培养7天；
其中，DMEM培养基中添加有3％人血清、5ng/ml的ITS(胰岛素、转铁蛋白、硒)，50U/ml的链霉素和50U/ml的青霉素，5ng/ml的EGF(EpidermblGrowthFbctor，表皮生长因子)，5ng/ml的LIF(leukemibinhibitoryfbctor，白血病抑制因子)。
S4b、异体皮基质的制备；
将健康猪的整张腹部与背部皮用机械法进行初步脱脂，用镊子把毛剔除干净，用电动取皮机先将猪皮的皮下组织去掉，再去掉表皮0.2mm，制成厚度为0.2mm的真皮层皮片，经生理盐水洗净后浸入浓度为0.1％的医用新洁尔灭溶液中消毒，20分钟后取出，用无菌生理盐水反复冲洗10次；然后将皮片剪成1cm×1cm大小，PBS液冲洗两遍，浸泡于装有0.10％胰蛋白酶、0.01％乙二酸乙二胺(EDTB)及0.01％氢氧化钠混合消化溶液的玻璃瓶内，4℃下消化3d，每天晃动5次左右。4天后取出皮片，PBS液冲洗2遍，放入装有0.4％TritonX-100溶液的玻璃瓶内，室温下孵育，并持续震荡2d，直至细胞成分完全去除，获得脱细胞真皮。
最后，用质量分数为5％的NaCl溶液和pH值为7.4的PBS液冲洗；其中，NbCl溶液处理时间为8h，磷酸缓冲盐溶液处理时间为8h，每隔6h换液，重复5次，存于4℃PBS液中备用。
S5b、皮肤贴片的制备；
S51b、异体皮基质的杀菌处理；
取出步骤S4b中获得的异体皮基质在无菌净化间装入无菌铝箔膜包装袋中，抽真空封口，钴60辐照灭菌3小时，辐照剂量3kGy。
S52b、混合胶原溶液与脂肪干细胞；
取0.1％胶原溶液加入离心管中，用NaHCO2调整溶液PH至7.2，将步骤S34b中获得的脂肪干细胞与胶原溶液快速充分混合，使脂肪干细胞终浓度为2×104个/ml。
S53b、将含有脂肪干细胞的胶原凝胶涂覆于异体皮基质上；
无菌条件下，取步骤S51b中获得的异体皮基质，将步骤S52b中获得的含有脂肪干细胞的胶原凝胶涂覆在异体皮基质上，高度3mm左右，室温静置30min待其凝固或置培养箱待胶原凝固，即制成皮肤贴片。
使用时，将皮肤贴片贴敷在创面上，对齐后缝合、加压包扎和固定；而对于烧伤严重者，可采用多点注射脂肪干细胞配合皮肤贴片法治疗，每点注射步骤S34b获得的脂肪干细胞的体积小于250ml，脂肪干细胞的密度为2×104个/ml。
实施例3
与实施例1的不同之处在于，本实施例中，
S3c、脂肪干细胞的获取；
S31c、采集脂肪组织；
选择步骤S2a中达到评估标准的病人，在无菌条件下用抽脂机抽取病人腹部的脂肪组织，剔除脂肪中肉眼可见的血管和纤维部分，用PBS清洗脂肪组织3次，放入含有双抗(青霉素/链霉素，各为1％含量)的缓冲液中，无菌环境于4℃条件下保存备用。
其中，该病人为深Ⅱ度烧伤，胳膊部分烧伤面积为100cm2左右。
S32c、获取原代脂肪干细胞；
取步骤S31c中获得的脂肪组织，于无菌条件下剪碎后，加入0.075％Ⅰ型胶原酶，37℃恒温并以50rpm振速振荡摇床消化60分钟，然后加入等量体积的完全培养基(高糖DMEM+10％胎牛血清+0.5％双抗)中止消化；然后，将消化液置于冰浴中，用吸管吹打15次后加入10mg/L的DncseⅠ(脱氧核糖核酸酶I)孵育20分钟，经100微米滤网过滤，去除未消化的脂肪组织和结缔组织，4℃环境下、1000rpm离心10分钟，成熟脂肪细胞在表层油滴下方、培养基上方，去除上层油滴，将漂浮的脂肪细胞转移至新的离心管中，加入PCS清洗，4℃环境中1000rpm离心10分钟，重复此离心过程数次，即获得原代脂肪干细胞。
S33c、脂肪干细胞纯化；
将步骤S32c中获得的原代脂肪干细胞用1％的盐水洗涤3次以除去污染的红细胞，用完全培养基重悬，接种于多聚鸟氨酸包被的培养板，培养6小时，移去上清液，用0.25％的胰酶消化，去除难以消化的成纤维细胞、内皮细胞等，获得纯化后的原代脂肪干细胞。
S34c、脂肪干细胞的扩增培养；
将步骤S33c中获得的纯化后的原代脂肪干细胞置于300毫升的细胞培养袋内，原代脂肪干细胞的接种密度为2×105个/ml，添加DMEM培养基，放置于37℃、5％CO2培养箱中饱和湿度培养10天；
其中，DMEM培养基中添加有2％人血清、15ng/ml的ITS(胰岛素、转铁蛋白、硒)，150U/ml的链霉素和150U/ml的青霉素，35ng/ml的EGF(EpidermclGrowthFcctor，表皮生长因子)，15ng/ml的LIF(leukemicinhicitoryfcctor，白血病抑制因子)。
S4c、异体皮基质的制备；
将健康猪的整张腹部与背部皮用机械法进行初步脱脂，用镊子把毛剔除干净，用电动取皮机先将猪皮的皮下组织去掉，再去掉表皮0.6mm，制成厚度为0.4mm的真皮层皮片，经生理盐水洗净后浸入浓度为0.1％的医用新洁尔灭溶液中消毒，40分钟后取出，用无菌生理盐水反复冲洗10次；然后将皮片剪成1cm×1cm大小，PBS液冲洗两遍，浸泡于装有0.40％胰蛋白酶、0.03％乙二酸乙二胺(EDTC)及0.03％氢氧化钠混合消化溶液的玻璃瓶内，4℃下消化2d，每天晃动5次左右。4天后取出皮片，PBS液冲洗2遍，放入装有0.6％TritonX-100溶液的玻璃瓶内，室温下孵育，并持续震荡4d，直至细胞成分完全去除，获得脱细胞真皮。
最后，用质量分数为9％的NaCl溶液和pH值为7.4的PBS液冲洗；其中，NaCl溶液处理时间为16h，磷酸缓冲盐溶液处理时间为16h，每隔6h换液，重复5次，存于4℃PBS液中备用。
S5c、皮肤贴片的制备；
S51c、异体皮基质的杀菌处理；
取出步骤S4c中获得的异体皮基质在无菌净化间装入无菌铝箔膜包装袋中，抽真空封口，钴60辐照灭菌5小时，辐照剂量5kGy。
S52c、混合胶原溶液与脂肪干细胞；
取0.3％胶原溶液加入离心管中，用NaHCO2调整溶液PH至7.2，将步骤S34c中获得的脂肪干细胞与胶原溶液快速充分混合，使脂肪干细胞终浓度为4×104个/ml。
S53c、将含有脂肪干细胞的胶原凝胶涂覆于异体皮基质上；
无菌条件下，取步骤S51c中获得的异体皮基质，将步骤S52c中获得的含有脂肪干细胞的胶原凝胶涂覆在异体皮基质上，高度1mm左右，室温静置10min待其凝固或置培养箱待胶原凝固，即制成皮肤贴片。
对病人烧伤部位贴片之前，需将局部烧伤创面作常规清创处理，去除污物及脱落上皮，去除水泡并消毒，将本实施例中制备的皮肤贴片根据烧伤部位面积和形状进行修建，然后将130cm2左右的皮肤贴片面朝向烧伤创面，使贴片与创面贴紧并覆盖整个创面，贴片大于创缘约2～3cm。5d后打开纱布，观察创面，发现创面渗出较少，更换新的皮肤贴片，更换贴片时，疼痛明显轻于未使用自体脂肪干细胞涂抹的异体皮贴片。再隔5d，打开纱布，发现损伤部位开始出现上皮化，无感染，再次更换新的贴片。直到第21d，打开纱布，创面基本愈合。愈合后创面随访，愈合创面瘢痕增生少，色素沉着少。而现有技术中采用异体皮基质修复烧伤皮肤需要30天甚至更长的修复期，相对于本发明的皮肤贴片所需时间较长，且由于免疫排斥性较强较易引发炎症，容易造成色素累积。
另外，对采用本实施例提供的皮肤贴片的病人分别检测其在治疗前及治疗后第7和21d血液中免疫球蛋白IgA、IgG、IgM含量，检测结果如下表1：
表1
(其中，对照组为正常人血液中免疫球蛋白IgA、IgG和IgM的含量。)
检测结果：通过采用本发明提供的皮肤贴片治疗皮肤烧伤伤口，在治疗第7天，免疫球蛋白含量明显升高；在治疗第20天时，免疫球蛋白含量已基本恢复正常，由此说明本发明提供的皮肤贴片不仅缩短了皮肤修复时间，而且修复效果较好。
以上对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (10)

1.一种用于治疗皮肤烧伤的皮肤贴片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
分别获取脂肪干细胞和异体皮基质；
将所述脂肪干细胞与胶原溶液混合后接种于所述异体皮基质；
其中，所述脂肪干细胞来源于皮肤烧伤患者自体。
2.根据权利要求1所述的用于治疗皮肤烧伤的皮肤贴片的制备方法，其特征在于，所述脂肪干细胞的终浓度为(2～4)×104个/ml。
3.根据权利要求1所述的用于治疗皮肤烧伤的皮肤贴片的制备方法，其特征在于，所述胶原溶液中，胶原的质量分数为0.1～0.3％。
4.根据权利要求2所述的用于治疗皮肤烧伤的皮肤贴片的制备方法，其特征在于，所述脂肪干细胞的获取过程，包括以下步骤：
无菌条件下，取所述皮肤烧伤患者的脂肪组织，剔除脂肪中肉眼可见的血管和纤维部分，经PBS溶液清洗后，剪碎，酶解振荡消化20～60分钟，用完全培养基中止消化，再置于冰浴中吹打消化10～20分钟，过滤，去除未消化的脂肪组织和结缔组织后，对滤液进行离心，去除上层油滴，取下层脂肪细胞，PBS清洗后，即获得原代脂肪干细胞。
5.根据权利要求4所述的用于治疗皮肤烧伤的皮肤贴片的制备方法，其特征在于，所述脂肪干细胞的获取过程还包括以下步骤：
洗涤所述原代脂肪干细胞，去除红细胞，用完全培养基重悬，然后接种于多聚鸟氨酸包被的培养板上，培养2～6小时，移去上清液后胰酶消化，去除未消化的成纤维细胞和内皮细胞，即获得纯化后的原代脂肪干细胞。
6.根据权利要求5所述的用于治疗皮肤烧伤的皮肤贴片的制备方法，其特征在于，所述脂肪干细胞的获取过程还包括以下步骤：
取纯化后的原代脂肪干细胞以0.5～2×105个/ml的密度接种于DMEM培养基进行扩增培养7～10天，每隔2-3天换液一次。
7.根据权利要求6所述的用于治疗皮肤烧伤的皮肤贴片的制备方法，其特征在于，所述DMEM培养基中添加有2～5％人血清、5～15ng/ml的ITS、50～150U/ml的链霉素、50～150U/ml青霉素、5～35ng/ml的EGF和5～15ng/ml的LIF。
8.根据权利要求1所述的用于治疗皮肤烧伤的皮肤贴片的制备方法，其特征在于，所述异体皮基质的获取过程，包括以下步骤：
取健康猪腹部或背部皮进行脱脂脱毛处理，去掉0.2～0.6mm的表皮，制成厚度为0.2～0.4mm的真皮层皮片，清洗后消毒20～40分钟，反复清洗，于消化液中消化2～4天，反复清洗皮片，然后加入非离子型表面活性剂孵育2～4天，至细胞成分完全去除，获得脱细胞真皮，然后分别用氯化钠和PBS反复冲洗，即获得异体皮基质。
9.根据权利要求8所述的用于治疗皮肤烧伤的皮肤贴片的制备方法，其特征在于，所述消化液中包含有质量百分数为0.10～0.40％胰蛋白酶、0.01～0.03％乙二酸乙二胺和0.01～0.03％氢氧化钠。
10.一种用于治疗皮肤烧伤的皮肤贴片，其特征在于，由权利要求1-9任一项所述的用于治疗皮肤烧伤的皮肤贴片制备方法所获得的。
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