CN105013014A

CN105013014A - 一种无细胞基质生物材料的制备方法和用途

Info

Publication number: CN105013014A
Application number: CN201510464887.4A
Authority: CN
Inventors: 李龙承; 沈乔; 李辉; 李先华; 沈传宝
Original assignee: FUHAN LANPU MEDICAL PRODUCT Co Ltd
Current assignee: FUHAN LANPU MEDICAL PRODUCT Co Ltd
Priority date: 2015-07-31
Filing date: 2015-07-31
Publication date: 2015-11-04

Abstract

本发明涉及一种无细胞基质生物材料的制备方法，包括获取组织，脱细胞处理；灭菌处理；收获脱细胞基质材料；获取脂肪组织；游离脂肪干细胞；收获脂肪干细胞；种植脂肪干细胞和收获无细胞基质生物材料。本发明还提供了一种无细胞基质生物材料的用途，可用于组织损伤的再生和修复，烧伤创面的覆盖和修复，膀胱的修复以及尿道替代。

Description

一种无细胞基质生物材料的制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种无细胞基质生物材料的制备方法。

背景技术

干细胞是一种具有自我更新能力和多系分化潜能的原始细胞，是细胞移植组织再生及修复的理想细胞。虽然胚胎干细胞是最原始的及最有分化潜能的干细胞，但目前来源十分有限。而经过高表达干细胞因子诱导的干细胞也称iPS细胞虽然具有诸多胚胎干细胞的特性，但因制备方法复杂，还涉及到使用病毒载体等安全性问题，目前临床应用还存在很多瓶颈。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSC)是存在于人体组织中具有多系分化潜能的一种亚全能干细胞群,如骨髓干细胞、脂肪干细胞、脐带血干细胞等。MSC来源丰富，比如可以取材于身体上多余的脂肪、游离方法简便、具有自我更新及多潜能分化能力，是一种理想的组织再生和修复材料。

目前已有异种脱细胞基质材料用于临床。因为经过脱细胞处理，材料内不存在异种细胞，这样将避免了人体对异种材料产生的免疫反应。但因为没有细胞成分，脱细胞基质材料因此是缺乏生物活性的材料，其对创伤、组织缺损等的修复作用有限。间充值干细胞大量存在于组织中，如来源于脂肪组织的脂肪干细胞，来源于骨髓的骨髓干细胞等。骨髓干细胞已用于临床治疗各种血液病多年，即骨髓移植。干细胞用于组织器官修复的细胞治疗目前存在诸多问题，虽然有临床应用报道，临床效果不确定。特别是用于外表创伤修复、或者损伤组织或器官的替代，如果没有细胞外基质材料的支撑，干细胞很难发挥作用。

发明内容

本发明旨在解决现有技术中存在的技术问题之一，为此，本发明的一个目的在于提供了一种无细胞基质生物材料的制备方法。

现有的脱细胞基质材料采用异种皮经脱细胞处理，使之成为不具抗原性的生物材料。由剩下的细胞外基质材料(主要由胶原和弹性蛋白组成)提供组织创面的覆盖，提供组织修复的支架而在临床应用中有一定的价值。但由于这种基质材料缺乏应有的和组织修复有关的细胞因子，其用途及有效性受到很大影响。间充值干细胞如游离自脂肪的脂肪干细胞具有多分化潜能，被认为是有用的细胞治疗手段。但干细胞单独在体内应用存在诸多问题，如干细胞需要细胞外基质的支持，才能更好地成活。基于上述理由，本发明结合无细胞基质材料和间充值干细胞技术提供一种有生物学活性的生物材料，该生物材料可用于各种组织的再生和修复，特别是创伤愈合、减少疤痕形成、皮肤再生、尿道替代、膀胱替代等。该发明描述的间充值干细胞的分离技术和脱细胞基质生物材料的制备技术也可以单独使用。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列技术而完成的：

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种无细胞基质生物材料的制备方法，包括以下步骤：

步骤S1：获取组织，所述组织来源于动物体；

步骤S2：脱细胞处理，将所述组织进行脱细胞处理；

步骤S3：灭菌处理；

步骤S4：收获脱细胞基质材料；

步骤S5：获取脂肪组织，所述脂肪组织来源于动物体；

步骤S6：游离脂肪干细胞；

步骤S7：收获脂肪干细胞；

步骤S8：种植脂肪干细胞，将所述脂肪干细胞种植在脱细胞基质材料中，培养；

步骤S9：收获无细胞基质生物材料。

另外，根据本发明上述实施例一种无细胞基质生物材料的制备方法，还可以具有如下附加的技术特征：

所述步骤S1中的组织为真皮组织或者膀胱组织中的一种。

根据本发明的实施例，所述脱细胞处理包括以下步骤：将步骤S1中的组织放置在培养皿中，加入胰酶，EDTA和Triton X-100；37度震荡消化3-4小时；PBS浸洗后，加入0.1％叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水，培养5分钟～3天；

任选地，所述胰酶的浓度为0.125％；

任选地，所述EDTA为1mM；

任选地，所述Triton X-100的浓度为0.25％。

根据本发明的实施例，所述灭菌处理为gamma射线照射。

根据本发明的实施例，所述游离脂肪干细胞包括以下步骤：将脂肪组织放置在培养皿，加入1％青霉素和链霉素的PBS，浸洗；用刀片将组织切成1mm见方的小块，加入含0.075％的1A型胶原酶；37度摇床孵化1小时；室温250℃离心10分钟，去除上面两层，保留细胞层；加入200mg/mL KH₂PO₄、200mg/L KCl、2.16g/LNa₂HPO₄.7H₂O、8g/L NaCl,30,000单位/L SOD、5g/L人血清白蛋白，重悬细胞；

任选地，所述脂肪组织与1A型胶原酶的比例为1-5:1。

根据本发明的实施例，所述种植脂肪干细胞包括以下步骤：

将步骤S4收获的脱细胞基质裁剪成2x2mm的小片，PBS浸泡2小时候，离心，浸洗，平放在60mm培养皿内，加入DMEM完全培养液至材料湿润；

将步骤S7收获的脂肪干细胞用DMEM完全培养液，所述DMEM培养液包括10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素)培养5-7天；

在裁剪好的每片基质材料上加500uL，5x10⁴悬浮的脂肪干细胞；

将培养皿放置37度CO₂培养箱培养30分钟，然后加入2mlDMEM完全培养液；

继续培养48小时。

另一方面，本发明提供无细胞基质生物材料的制备方法制备的生物材料用于组织损伤的再生和修复。

本发明提供无细胞基质生物材料的制备方法制备的生物材料用于烧伤创面的覆盖和修复。

本发明提供无细胞基质生物材料的制备方法制备的生物材料用于膀胱的修复。

本发明提供无细胞基质生物材料的制备方法制备的生物材料用于尿道替代。

本发明的技术效果为：

1)自身间充值干细胞如脂肪干细胞来源丰富，获取方法简单；

2)自身间充值干细胞具有多分化潜能性，能分化成各种胚层的细胞，如上皮细胞、神经细胞、肌肉细胞、成纤维细胞等；

3)间充值干细胞能分泌多种细胞因子，如血管生长因子、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)等，可以住进组织细胞再生；

4)因间充值干细胞取自自身，因此不具抗原性；

5)将脱细胞基质和自身干细胞结合能充分发挥二者的优点。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为本发明提供的一种无细胞基质生物材料的制备方法制备的生物材料用于膀胱修复的图

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

脱细胞基质材料可来源于同种及异种组织，组织可以是皮肤组织、器官如膀胱、尿道、输尿管等。取决于被修复组织的性质而选取。组织的来源可以是人、大鼠、仓鼠、猪、狗、兔、牛等。

实施例1：基于真皮的脱细胞基质材料的制备：

1)皮肤取自上述动物皮肤，可以取自尸体及手术过程的多余皮肤；

2)分离表皮层与真皮层：将皮肤浸泡在0.25％的胰酶及1mM的EDTA溶液中消化3个小时；

3)用机械方法将表皮层与真皮层分离；

4)脱细胞处理；

5)脱细胞溶液配制：0.125％胰酶、1mM EDTA、0.25％的TritonX-100；

6)将上述获得的真皮浸泡在脱细胞溶液中在37度震荡消化3-4小时；

7)用PBS浸洗，然后浸泡在含0.1％叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，持续时间为数分钟到数天；

8)灭菌处理：将获得的真皮基质用gamma射线照射，以达到无菌目的。

实施例2：基于膀胱的脱细胞基质材料的制备：

1)膀胱组织放置在培养皿中，加入50ml含有0.1％叠氮化钠的PBS，用玻璃片将粘膜层刮除；

2)剩下的肌肉层及粘膜下层继续保留在上述溶液中5个小时，以溶解细胞；

3)用50ml PBS冲洗膀胱组织；

4)DNA酶消化：用50ml含有2000单位的DNA酶(Sigma公司)的1M的氯化钠溶液消化膀胱12小时。然后去除溶液，加入新的消化液重复3次；

5)然后用含50ml含0.1％的叠氮化钠的4％的去氧胆酸钠(sodiumdeoxycholatel)处理6个小时并搅拌，重复该过程一共3次；

6)所得的脱细胞基质4度保持在含0.1％的叠氮化钠和10％的硫酸新霉素溶液备用；

7)灭菌处理：将获得的真皮基质用gamma射线照射，以达到无菌目的。

实施例3：脂肪干细胞游离：

1)取脂肪组织或者吸脂术获得的脂肪；

2)用含有1％青霉素和链霉素的PBS浸洗；

3)用刀片将组织切成1mm见方的小块；

4)以溶液：组织5：1的比例加入含0.075％的1A型胶原酶(collagenasetype IA,Sigma公司)；

5)用37度摇床孵化1小时；

6)室温250g离心10分钟。此时溶液分为三层，下层为消化的细胞沉淀；

7)去除上面两层，保留细胞层；

8)重新悬浮细胞于脂肪组织保持液内，该溶液含200mg/mlKH2PO4、200mg/L KCl、2.16g/L Na₂HPO₄.7H₂O、8g/L NaCl,30,000单位/L SOD、5g/L人血清白蛋白。

实施例4：间充值干细胞在脱细胞基质材料中的种植：

1)将上述获得的脱细胞基质裁剪成2x2mm的小片，用PBS浸泡2小时候，离心甩干。用PBS浸洗一次并甩干；

2)将上述游离的脂肪干细胞用DMEM完全培养液(DMEM培养液加入10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素)培养至指数生长期；

3)用0.025％的胰酶消化细胞，离心，用DMEM完全培养液重新悬浮；

4)将上述脱细胞基质材料平放在60mm培养皿内，加入少量DMEM完全培养液，至材料湿润即可；

5)在每片基质材料上加500ul 5x10⁴悬浮的细胞；

6)将培养皿放置37度CO₂培养箱培养30分钟，然后加入2ml DMEM完全培养液；

7)继续培养48小时；

8)对于需要保持组织结构的脱细胞基质材料如膀胱或者尿道，方法同上，但干细胞的加入则是用27号针头将脂肪干细胞均匀注入基质材料内，每平方毫米注入5x10⁴细胞。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种无细胞基质生物材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤S1：获取组织，所述组织来源于动物体；

步骤S2：脱细胞处理，将所述组织进行脱细胞处理；

步骤S3：灭菌处理；

步骤S4：收获脱细胞基质材料；

步骤S5：获取脂肪组织，所述脂肪组织来源于动物体；

步骤S6：游离脂肪干细胞；

步骤S7：收获脂肪干细胞；

步骤S9：收获无细胞基质生物材料。

2.根据权利要求1所述的无细胞基质生物材料的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中的组织为真皮组织或者膀胱组织中的一种。

3.根据权利要求1所述的无细胞基质生物材料的制备方法，其特征在于，所述脱细胞处理包括以下步骤：将步骤S1中的组织放置在培养皿中，加入胰酶，EDTA和Triton X-100；37度震荡消化3-4小时；PBS浸洗后，加入0.1％叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水，培养5分钟～3天；

任选地，所述胰酶的浓度为0.125％；

任选地，所述EDTA为1mM；

任选地，所述Triton X-100的浓度为0.25％。

4.根据权利要求1所述的无细胞基质生物材料的制备方法，其特征在于，所述灭菌处理为gamma射线辐照灭菌。

5.根据权利要求1所述的无细胞基质生物材料的制备方法，其特征在于，所述游离脂肪干细胞包括以下步骤：将脂肪组织放置在培养皿加入1％青霉素和链霉素的PBS，浸洗；用刀片将组织切成1mm见方的小块，加入含0.075％的1A型胶原酶；37度摇床孵化1小时；25℃离心10分钟，去除上面两层，保留细胞层；加入200mg/mLKH₂PO₄、200mg/L KCl、2.16g/L Na₂HPO₄.7H₂O、8g/L NaCl,30,000单位/L SOD、5g/L人血清白蛋白，悬细胞；

任选地，所述脂肪组织与1A型胶原酶的比例为1-5:1。

6.根据权利要求1所述的无细胞基质生物材料的制备方法，其特征在于，所述种植脂肪干细胞包括以下步骤：

将步骤S7收获的脂肪干细胞用DMEM完全培养液培养5-7天；在裁剪好的每片基质材料上加500uL，5x10⁴悬浮的脂肪干细胞；

继续培养48小时；

任选地，所述DMEM培养液包括10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素。

7.根据权利要求1至6所述的无细胞基质生物材料的制备方法制备的生物材料用于组织损伤的再生和修复。

8.根据权利要求1至6所述的无细胞基质生物材料的制备方法制备的生物材料用于烧伤创面的覆盖和修复。

9.根据权利要求1至6所述的无细胞基质生物材料的制备方法制备的生物材料用于膀胱的修复。

10.根据权利要求1至6所述的无细胞基质生物材料的制备方法制备的生物材料用于尿道替代。