CN113425909A - 一种角膜损伤修复的生物材料及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种角膜损伤修复的生物材料，所述角膜损伤修复的生物材料为脂肪间充质干细胞来源的脱细胞基质。本发明还提供了该角膜损伤修复的生物材料的制备方法，包括获取脂肪间充质干细胞，传代培养和脱细胞基质的制备。本发明提供的角膜损伤修复的生物材料的生物相容性好，来源广泛，适合于大量生产，而且能够促进角膜上皮细胞生长，促进角膜缺损修复；促进角膜三叉神经轴突再生，恢复角膜知觉；降低炎症反应；降低后期角膜瘢痕形成，治疗修复甚佳，在促进角膜缺损修复方面具有良好的应用前景。

Description

一种角膜损伤修复的生物材料及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及组织功能及眼科修复技术领域，特别是一种角膜损伤修复的生物材料及其制备方法与应用。
背景技术
角膜是眼睛最外层的透明层，在良好的视力形成过程中发挥重要的作用。眼科医生在临床诊治过程中最常见的眼部疾病包括眼表擦伤和角膜上皮缺陷。受损的角膜如果不及时治疗，发展为持续性角膜上皮缺损后将会导致严重的并发症，如眼部感染、发生基质溃疡、穿孔、瘢痕等，最终影响视力。针对难治性角膜上皮缺损的病例，临床医生通常会采取羊膜移植。羊膜移植已被证明对眼表疾病的治疗有显著疗效，其含多种生长因子和抑制炎症的蛋白等。但羊膜可能携带来自供者的病毒等，存在潜在的传染病传播风险。并且羊膜厚度韧性等受供体影响较大，质量较难把控。
近年脂肪间充质干细胞被证明具有减少细胞凋亡、减轻炎症反应、抑制纤维化、提高组织修复潜力等重要的生物学功能，然而其治疗眼表损伤的研究局限于结膜下注射等，此种方式不仅损伤结膜组织，同时治疗效果欠佳。
本发明的目的在于提供一种角膜损伤修复的生物膜材料，它来源于脂肪间充质干细胞，不但生物相容性好，能降低移植后免疫反应；来源广泛，适合于大量生产，而且能够促进细胞生长，促进角膜缺损修复；降低炎症反应；降低后期角膜瘢痕形成，治疗修复甚佳。
发明内容
针对上述情况，为弥补现有技术所存在的不足，本发明提供一种生物相容性好，能够有效促进角膜缺损修复的角膜修复材料。
本发明解决问题的技术方案如下：
本发明的一个目的是提供一种角膜损伤修复的生物材料，所述角膜损伤修复的生物材料为脂肪间充质干细胞来源的脱细胞基质。
本发明的另一个目的是提供脂肪间充质干细胞来源的脱细胞基质在制备角膜结构和功能修复产品中的用途。
本发明的第三个目的是提供一种所述脂肪间充质干细胞来源的脱细胞基质的制备方法，所述制备方法包括获取脂肪间充质干细胞，传代培养和脱细胞基质的制备。
进一步地，所述获取脂肪间充质干细胞包括以下具体步骤：取获得的脂肪组织，洗涤后剪碎，浸泡在消化液中进行消化；消化完成后，离心、留沉淀，即得脂肪间充质干细胞。
进一步地，获取脂肪间充质干细胞过程中所述脂肪组织优选为抽脂或者重睑手术中获得的脂肪组织。
进一步地，获取脂肪间充质干细胞过程中所述洗涤介质为PBS缓冲液+100U/mL青霉素/链霉素。
进一步地，获取脂肪间充质干细胞过程中所述消化液为0.1～0.2％的胶原酶A。
进一步地，获取脂肪间充质干细胞过程中所述消化的温度为37℃，消化时间为8～10h；
进一步地，获取脂肪间充质干细胞过程中所述离心条件为：转速1000～1200rpm，时间8～12min。
进一步地，所述传代培养包括以下具体步骤：用培养液重悬获取的脂肪间充质干细胞，置于培养箱中，待细胞长至80％～90％密度时进行传代，停止传代后，更换培养液，进行3～4周的培养。
进一步地，传代培养过程中所述培养液配方为：DMEM+10％牛血清+100U/mL青霉素/链霉素。
进一步地，传代培养过程中所述培养箱的培养条件设定为温度37℃，5％CO2。
进一步地，传代培养过程中所述传代具体包括以下步骤：弃去培养液，用PBS缓冲液润洗，加入0.1％胰酶进行消化；用含血清的培养液进行中和后，离心；弃去上清，用培养液重悬，1:3～4传代。
进一步地，传代培养过程中停止传代后所用培养液配方为：DMEM+10％牛血清+100U/mL青霉素/链霉素+50μmol/L维他命C。
进一步地，传代培养过程中传代所述消化的温度为37℃，消化时间为8～10h；所述离心条件为：转速600～1000rpm，时间3～5min；所述培养液配方为：DMEM+10％牛血清+100U/mL青霉素/链霉素；所述培养箱的培养条件设定为温度37℃，5％CO2。
进一步地，所述脱细胞基质的制备包括以下具体步骤：弃去培养皿中所有培养液，用PBS缓冲液润洗后，加入脱细胞液，静置，用PBS缓冲液冲洗后加入DNA酶，置于培养箱中培养；最后用PBS缓冲液进行洗涤，置于黑暗中，4℃保存。
进一步地，所述脱细胞基质的制备中所述脱细胞液的配方为0.5％Triton+20mmol/LNH4OH+PBS缓冲液。
进一步地，所述脱细胞基质的制备中所述静置时间为4～10min。
进一步地，所述脱细胞基质的制备中所述DNA酶的浓度为100U/mL。
进一步地，所述脱细胞基质的制备中所述PBS缓冲液冲洗次数为2～5次。
进一步地，所述脱细胞基质的制备中所述培养箱的培养条件设定为温度37℃，5％CO2；
进一步地，所述脱细胞基质的制备中置于培养箱培养时间为1～2h。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明提供的角膜损伤修复的生物材料，由脂肪间充质干细胞制备得到，脂肪间充质干细胞可自体/异体来源，创伤小，细胞数量多，免疫排斥反应小，脂肪间充质干细胞来源的脱细胞基质(DMA)制备简单，适合于大量生产，其细胞相容性好，能降低移植后免疫反应，可针对患者角膜缺损的大小、形态进行个体化治疗。
2.本发明提供的脂肪干细胞来源的细胞外脱细胞基质在角膜修复过程中，抑制了炎症、加快了角膜上皮修复速度、促进了角膜神经的恢复，更好地维持了眼表微环境的稳定，降低后期角膜瘢痕形成，其移植于眼表后，促进角膜结构恢复正常，治疗修复效果甚佳，因此其形成的膜片可以替代羊膜，作为新型的角膜损伤修复材料。
附图说明
图1为角膜损伤修复的生物材料的制备及应用的模式图。
图2为分离和鉴定脂肪干细胞及角膜细胞。(A)光镜下的脂肪干细胞；标尺：200μm。(B)流式检测脂肪干细胞的纯度。(C)光镜下脂肪间充质干细胞进行脱细胞处理之前和之后。标尺：200μm。(D)免疫荧光化学确定脂肪间充质干细胞进行脱细胞处理之前和之后的成分；胶原：CK19(绿色)和纤连蛋白(红色)。标尺：20μm。
图3为角膜损伤修复的生物材料对角膜上皮细胞增殖的影响。(A)分离培养兔角膜上皮细胞，进行光镜下观察。标尺：50μm。(B)免疫荧光染色鉴定分离获得的角膜上皮细胞，分化指标CK12：绿色；干性指标P63：红色。标尺：20μm(C)扫描电镜观察脱细胞基质表面形态以及角膜上皮细胞在上面生长的状态。标尺：20μm。(D)CCK-8检测了三组的增殖情况。CTR：普通培养皿组；AM：羊膜组；DMA：脱细胞基质组。(E)流式细胞学检测了三组的细胞周期。(F)四个组中细胞周期分布差异。(G)统计了四组之间增殖期S-期的差异变化。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
图4为角膜损伤修复的生物材料的制备及应用。(A)DMA作为角膜损伤修复材料的应用。(B)Control组代表没有任何移植组；AM组代表羊膜移植组；DMA组代表脂肪间充质干细胞脱细胞基质组。眼表滴加荧光素钠，定期进行裂隙灯观察。(C)根据荧光素钠染色的情况，进行角膜损伤面积的计算和统计。(D)角膜修复后期，根据眼表点状荧光着染的情况，进行角膜损伤评分和统计。(E)利用眼表OCT检测，定期观察三组小鼠角膜厚度的统计。(F)在裂隙灯下进行角膜透明度评分和统计。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
图5为组织切片观察角膜缺损修复情况。(A)HE染色，将正常角膜、碱烧伤后无处理组、羊膜移植组和脂肪间充质干细胞脱细胞基质处理组进行对比。标尺：100μm。(B)MASSON染色，将正常角膜、碱烧伤后无处理组、羊膜移植组和脂肪间充质干细胞脱细胞基质处理组进行对比。标尺：100μm。(C)免疫荧光染色，将正常角膜、碱烧伤后无处理组、羊膜移植组和脂肪间充质干细胞脱细胞基质处理组进行对比。β-catenin染色：绿色；PCNA染色：红色；凋亡染色：TUNEL红色。标尺：100μm。进行荧光染色统计，*P<0.05,**P<0.01。
图6为免疫荧光染色检测四组中炎症水平。(A)将正常角膜、碱烧伤后无处理组、羊膜移植组和脂肪间充质干细胞脱细胞基质处理组进行MMP9染色(红色)和MMP3(绿色)，观察对比该蛋白的表达水平。标尺：100μm。(B)统计了MMP9染色(红色)免疫荧光强度。*P<0.05,***P<0.001。(C)统计了MMP3(绿色)免疫荧光强度。*P<0.05,***P<0.001。
图7为免疫荧光染色检测四组中炎症水平。(A)将正常角膜、碱烧伤后无处理组、羊膜移植组和脂肪间充质干细胞脱细胞基质处理组进行IL-6染色(红色)和TNFα(绿色)，观察对比该蛋白的表达水平。标尺：100μm。(B)统计了IL-6染色(红色)免疫荧光强度。*P<0.05,***P<0.001。(C)统计了TNFα(绿色)免疫荧光强度。*P<0.05,***P<0.001。
图8为角膜神经恢复情况的观察。
图9为脂肪间充质干细胞脱细胞基质蛋白质谱分析。主要列举了含量最多的前50种蛋白。
具体实施方式
本发明第一方面提供一种角膜损伤修复的生物材料，所述角膜损伤修复的生物材料为脂肪间充质干细胞来源的脱细胞基质。
脂肪间充质干细胞由于含量丰富，易获得，并且可以大量扩增，具有广阔的临床应用前景，但是尚未有将脂肪间充质干细胞来源的细胞外基质应用于角膜缺损的研究，本发明对脂肪间充质干细胞来源的脱细胞基质进行组分分析，发现其除了富含大量结构蛋白外，还包含大量的生长因子、抗炎蛋白等，均能有效的促进组织损伤修复，本发明还进一步探究了脂肪间充质干细胞来源的脱细胞基质作为角膜辅料对角膜上皮细胞增殖、角膜神经修复的影响，结果显示脂肪间充质干细胞来源的脱细胞基质较羊膜能够更有效地促进角膜上皮细胞增殖、能够更有效促进角膜损伤愈合和组织修复，抗炎能力更显著，还可以促进神经的修复。
本发明的另一个目的是提供脂肪间充质干细胞来源的脱细胞基质在制备角膜结构和功能修复产品中的用途。
本发明的第三个目的是提供一种所述脂肪间充质干细胞来源的脱细胞基质的制备方法，所述制备方法包括获取脂肪间充质干细胞，传代培养和脱细胞基质的制备。
在本发明中，所述获取脂肪间充质干细胞包括以下具体步骤：取获得的脂肪组织，洗涤后剪碎，浸泡在消化液中进行消化；消化完成后，离心、留沉淀，即得脂肪间充质干细胞。
在本发明中，获取脂肪间充质干细胞过程中所述脂肪组织没有特殊限定；优选为抽脂或者重睑手术中获得的脂肪组织。
在本发明中，获取脂肪间充质干细胞过程中所述洗涤介质为PBS缓冲液+100U/mL青霉素/链霉素。本发明洗涤介质中含有青霉素/链霉素，能够防止洗涤过程中微生物的污染。
在本发明中，获取脂肪间充质干细胞过程中所述消化液为0.1～0.2％(1～2mg/mL)的胶原酶A；优选为0.15％(1.5mg/mL)的胶原酶A。
在本发明中，获取脂肪间充质干细胞过程中所述消化的温度为37℃，消化时间为8～10h；优选为所述消化的温度为37℃，消化时间为8h。
在本发明中，获取脂肪间充质干细胞过程中所述离心条件为：转速1000～1200rpm，时间8～12min；优选为转速1200rpm，时间10min。
在本发明中，所述传代培养包括以下具体步骤：用培养液重悬获取的脂肪间充质干细胞，养在培养皿中，置于培养箱，每三天更换一次培养液，待细胞长至80％～90％密度时进行传代，于第7天，停止传代，更换培养液，每两天更换一次培养液，进行3～4周的培养。优选为待细胞长至90％密度时进行传代，于第7天，停止传代，更换培养液，每两天更换一次培养液，进行3周的培养。
在本发明中，传代培养过程中所述培养液配方为：DMEM+10％牛血清+100U/mL青霉素/链霉素。
在本发明中，传代培养过程中所述培养箱的培养条件设定为温度37℃，5％CO2。
在本发明中，传代培养过程中所述传代具体包括以下步骤：弃去培养液，用PBS缓冲液润洗，加入0.1％胰酶进行消化；用含血清的培养液进行中和后，转移至试管，进行离心；弃去上清，用培养液重悬，1:3～4传代；优选为1:3传代。
在本发明中，传代培养过程中停止传代后所用培养液配方为：DMEM+10％牛血清+100U/mL青霉素/链霉素+50μmol/L维他命C。由于所用培养液配方中含有维他命C，其能刺激脂肪干细胞分泌大量细胞外基质，使得脱细胞之后的DMA具有一定的厚度和韧性，可以被完全揭起，在PBS中呈现半透明状态，形似正常的角膜组织。
在本发明中，传代培养过程中传代所述消化的温度为37℃，消化时间为8～10h；所述离心条件为：转速600～1000rpm，时间3～5min；优选为转速800rpm，时间4min。所述培养液配方为：DMEM+10％牛血清+100U/mL青霉素/链霉素；所述培养箱的培养条件设定为温度37℃，5％CO2。
在本发明中，所述脱细胞基质的制备包括以下具体步骤：弃去培养皿中所有培养液，用PBS缓冲液润洗后，加入脱细胞液，静置，用PBS缓冲液冲洗后加入DNA酶，置于培养箱中培养；最后用PBS缓冲液进行充分的洗涤，置于黑暗中，4℃保存。
在本发明中，所述脱细胞基质的制备中所述脱细胞液的配方为0.5％Triton+20mmol/LNH4OH+PBS缓冲液。
在本发明中，所述脱细胞基质的制备中所述静置时间为4～10min；优选为静置5min。
在本发明中，所述脱细胞基质的制备中所述DNA酶的浓度为100U/mL。
在本发明中，所述脱细胞基质的制备中所述PBS缓冲液冲洗次数为2～5次；优选为冲洗3次。
在本发明中，所述脱细胞基质的制备中所述培养箱的培养条件设定为温度37℃，5％CO2。
在本发明中，所述脱细胞基质的制备中置于培养箱培养时间为1～2h，优选为1h。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
实施例1
一种所述脂肪间充质干细胞来源的脱细胞基质的制备方法，包括以下步骤：
S1、取抽脂手术中获得的脂肪组织，用PBS缓冲液+100U/mL青霉素/链霉素进行洗涤后，剪碎；
S2、泡在0.1％的胶原酶A中进行消化，消化时间8h，消化温度37℃；
S3、进行离心，转速1000rpm，离心时间10min；
S4、留沉淀，用培养液(配方：DMEM+10％牛血清+100U/mL青霉素/链霉素)重悬，养在培养皿中，置于培养箱37℃，5％CO2条件下培养；
S5、每三天换一次培养液，待细胞长至80％密度，进行传代：弃去培养液，用PBS缓冲液润洗，加入0.1％胰酶进行消化，消化温度37℃；用含血清的培养液进行中和后，转移至试管，进行离心，转速600rpm，离心时间5min；弃去上清，用培养液重悬，1:3传代；
S6、于第7天，停止传代，更换培养液(配方：DMEM+10％牛血清+100U/mL青霉素/链霉素+50μmol/L维他命C)，每两天更换一次培养液，进行3周的培养；
S7、弃去培养皿中所有培养液，PBS缓冲液润洗后，加入脱细胞液(配方：0.5％Triton+20mmol/LNH4OH+PBS缓冲液)，静置4min，用PBS缓冲液冲洗3遍后加入100U/mLDNA酶，置于培养箱温度37℃，5％CO2条件下培养1h；
S8、用PBS缓冲液进行充分的洗涤，置于黑暗中，4℃保存。
实施例2
一种所述脂肪间充质干细胞来源的脱细胞基质的制备方法，包括以下步骤：
S1、取重睑手术中获得的脂肪组织，用PBS缓冲液+100U/mL青霉素/链霉素进行洗涤后，剪碎；
S2、泡在0.15％的胶原酶A中进行消化，消化时间8h，消化温度37℃；
S3、进行离心，转速1200rpm，离心时间10min；
S4、留沉淀，用培养液(配方：DMEM+10％牛血清+100U/mL青霉素/链霉素)重悬，养在培养皿中，置于培养箱37℃，5％CO2条件下培养；
S5、每三天换一次培养液，待细胞长至90％密度，进行传代：弃去培养液，用PBS缓冲液润洗，加入0.1％胰酶进行消化，消化温度37℃；用含血清的培养液进行中和后，转移至试管，进行离心，转速800rpm，离心时间4min；弃去上清，用培养液重悬，1:3传代；
S6、于第7天，停止传代，更换培养液(配方：DMEM+10％牛血清+100U/mL青霉素/链霉素+50μmol/L维他命C)，每两天更换培养液，进行3周的培养；
S7、弃去培养皿中所有培养液，PBS缓冲液润洗后，加入脱细胞液(配方：0.5％Triton+20mmol/LNH4OH+PBS缓冲液)，静置5min，用PBS缓冲液冲洗3遍后加入100U/mLDNA酶，置于培养箱37℃，5％CO2条件下培养1h；
S8、用PBS缓冲液进行充分的洗涤，置于黑暗中，4℃保存。
实施例3
一种所述脂肪间充质干细胞来源的脱细胞基质的制备方法，包括以下步骤：
S1、取抽脂手术中获得的脂肪组织，用PBS缓冲液+100U/mL青霉素/链霉素进行洗涤后，剪碎；
S2、泡在0.2％的胶原酶A中进行消化，消化时间10h，消化温度37℃；
S3、进行离心，转速1200rpm，离心时间8min；
S4、留沉淀，用培养液(配方：DMEM+10％牛血清+100U/mL青霉素/链霉素)重悬，养在培养皿中，置于培养箱37℃，5％CO2条件下培养；
S5、每三天换一次培养液，待细胞长至90％密度，进行传代：弃去培养液，用PBS缓冲液润洗，加入0.1％胰酶进行消化，消化温度37℃；用含血清的培养液进行中和后，转移至试管，进行离心，转速1000rpm，离心时间3min；弃去上清，用培养液重悬，1:4传代；
S6、于第7天，停止传代，更换培养液(配方：DMEM+10％牛血清+100U/mL青霉素/链霉素+50μmol/L维他命C)，每两天更换一次培养液，进行3周的培养；
S7、弃去培养皿中所有培养液，PBS缓冲液润洗后，加入脱细胞液(配方：0.5％Triton+20mmol/LNH4OH+PBS缓冲液)，静置10min，用PBS缓冲液冲洗3遍后加入100U/mLDNA酶，置于培养箱温度37℃，5％CO2条件下培养1h；
S8、用PBS缓冲液进行充分的洗涤，置于黑暗中，4℃保存。
为探究脂肪干细胞来源的脱细胞基质对角膜上皮细胞增殖、角膜缺损修复的影响，进行了一系列的实验。其中，体外实验分为三个组，对比普通培养皿、铺了羊膜的培养皿和铺了脂肪间充质干细胞脱细胞基质的培养皿促进角膜上皮细胞增殖的能力；体内实验分为三个组，对小鼠眼表进行碱烧伤后，一组为无治疗组，一组为用羊膜覆盖于眼表，一组为脂肪间充质干细胞脱细胞基质覆盖于眼表，进行治疗效果的对比。
主要仪器与设备
Figure BDA0003141042140000081
主要试剂及耗材
Figure BDA0003141042140000082
Figure BDA0003141042140000091
Figure BDA0003141042140000101
1、ADMSCs流式细胞学鉴定
取第三代ADMSCs，待细胞生长至密度接近于90％时，使用胰蛋白酶对细胞进行消化。待大部分细胞从培养皿脱离后，用移液枪反复吹打，使用含有血清的培养液进行中和，离心800rpm，4min。弃去上清后，加入PBS进行细胞重悬，离心800rpm，4min。重复清洗步骤三次后，调整细胞浓度至1×106/mL。接着，根据抗体说明书，加入CD90、CD105、CD73、CD20、CD31和CD45及对应的同行对照抗体，进行流式染色。避光孵育30min，使用轻柔地PBS润洗3次后，重悬细胞，进行流式细胞学检测。
2、脂肪间充质干细胞脱细胞基质(DMA)的制备
同实施例2。
3、角膜上皮细胞的培养
实验处死新西兰大白兔，使用新洁尔灭进行消毒，用无菌器械分离角膜组织后，将取下的角膜组织浸泡入氯霉素数分钟后，取出组织。将角膜泡入dispase II溶液中，置于4℃冰箱中消化过夜。第二天，在解剖显微镜下，分离角膜上皮层。加入2mL胰蛋白酶进行消化处理。用移液枪反复吹打成单个细胞，然后用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养液进行中和处理。最后，使用0.45μm的细胞滤器进行过滤，获得单个角膜上皮细胞。将细胞沉淀用新鲜的DMEM/F12培养液进行重悬，反复吹打，种于10cm培养皿中，放置于37℃细胞培养箱中(95％空气、5％CO2、100％湿度)中。经过24小时，角膜上皮细胞贴附在培养皿底部，更换培养液，去除未贴附的细胞。以后每隔2天更换培养液。原代兔角膜上皮细胞培养液为DMEM/F12(1:1)培养液(1％青霉素/链霉素)。细胞密度长至大约90％，及时进行传代，防止细胞分化。弃去培养液，用预热的PBS反复润洗后，加入胰蛋白酶消化5min。小心取出培养皿，用移液枪反复吹打成单个悬浮细胞。用含有胎牛血清的培养液中和胰蛋白酶后，将细胞转移到15mL离心管，800rpm，4min后，去除上清液，加入新鲜的培养液重悬细胞沉淀。
4、免疫荧光
具体实验步骤：弃去培养液，使用预热的PBS润洗数次后，加入浓度为4％的多聚甲醛，在室温下固定20min；加入PBS，进行洗涤，10min/次，共3次，去除残留的多聚甲醛；配置封闭液(10％驴血清+0.3％Triton X-100+PBS)，加入培养皿中，覆盖玻片，将其置于室温下1小时；加入PBS，进行润洗，10min/次，共3次；吸尽液体后，加入一抗(CK12、P63、Collagen、Fibronectin，抗体稀释根据抗体说明书进行配制)，4℃过夜；第二天，回收一抗，然后用PBS+0.1％Tweeen进行反复润洗，10min/次，共3次；吸尽液体后，加入相对应的荧光二抗(稀释比例需要根据抗体说明书进行配制)，室温下孵育1小时；弃去二抗，加入PBS进行反复的洗涤，10min/次，共3次；加入DAPI，进行对细胞核的着染；用无菌镊取出细胞玻片，将玻片放置于载玻片上，封片剂封片后，在荧光显微镜下进行观察。
5、CCK8实验
将24孔细胞爬片放置在24孔培养皿中，一组不做处理，一组铺上羊膜，一组铺上实施例2制得的脱细胞基质DMA；将细胞按照1×105个/孔的密度种在24孔培养皿中，设置三个复孔；种下结膜上皮细胞后，按照1:10的比例加入CCK8试剂，培养4小时；吸取培养液，加入96孔板，放入酶标仪。450nm为波长，读取数字；统计day0、day1、day2、day3的数值，进行分析。
6、细胞周期检测
取6孔板，一组不做处理，一组铺上羊膜，一组铺上实施例2制得的脱细胞基质DMA；将结膜上皮细胞按照2×106个/孔种在6孔培养皿中，每两天更换培养液，待细胞密度达到90％后，弃去培养液，加入PBS进行润洗后，加入胰蛋白酶消化，37℃放置5min。待细胞呈单个悬浮细胞后，加入含有血清的培养液进行中和。离心，800rpm，4min。弃去上清；加入预冷的70％冰乙醇固定细胞(700μL无水乙醇+300μL ddH2O提前配置，置于-20℃储存备用)，4℃过夜；离心去除乙醇，用PBS洗涤3次，离心800rpm，4min；加入400μL碘化丙锭(PropidiumIodide,PI，50μg/mL)+100μL RNaseA(100μg/mL)进行处理，室温下避光孵育30min；用流式细胞仪进行检测，所得结果按照细胞周期拟合软件Modfit分析。
7、组织学染色
H&E染色：将石蜡切片置于二甲苯中，进行8-10min的脱蜡处理。接着利用无水乙醇5min、90％乙醇2min、80％乙醇2min、70％乙醇2min，最后用蒸馏水2min。将组织放入苏木素试剂中进行染色，经过10min后，用水冲洗切片10min；加入伊红进行染色处理，2min。最后将切片依次放入95％酒精、100％酒精、二甲苯中。将切片从二甲苯中取出后，使用中性树脂进行封片，在显微镜下拍照观察。
马松染色：取适量的Weigert铁苏木素A液和Weigert铁苏木素B液进行等量混合，配制成Weigert铁苏木素染色液。用Weigert铁苏木素染色液处理切片后，用水轻柔地冲洗3min；用酸性乙醇分化液分化20s，水轻柔地冲洗3min；蓝化液返蓝20s，水冲洗3min；丽春红品红染色液处理5min，水冲洗3min；使用乙酸工作液进行片子的洗涤，动作轻柔，防止脱片；磷钼酸溶液处理后，去除多余的磷钼酸；苯胺蓝染色进行复染后，再利用乙酸工作液处理切片，直到切片无蓝色脱出为止。使用95％乙醇迅速脱水，无水乙醇脱水3次后，二甲苯透明处理、中性树脂封片。最后可以将切片放在显微镜下观察。
8、全角膜神经染色
取小鼠眼球，固定于4％多聚甲醛溶液中，放在4℃固定过夜。第二天，沿角膜缘剪下角膜后，于冰上固定1小时。用PBS洗涤3～5次后，置于96孔板中，用封闭液进行固定(10％驴血清+0.3％TritonX-100+PBS)。按比例配置一抗稀释液，每孔加入200uL抗体，于4℃过夜。次日取出角膜，洗涤数次后，加入荧光二抗，室温避光孵育1小时，洗涤数次后，加入Dapi，进行封片后，放置于共聚焦显微镜下进行观察。
结果分析
角膜上皮，脂肪干细胞的分离获取和脱细胞基质的制备(详见实施例2)及检测：第三代的脂肪干细胞成长梭形(图2中A)，流式细胞学检测显示脂肪干细胞纯度高(图2中B)，脂肪干细胞阳性指标：CD105(98.5％)，CD73(97.9％)和CD90(99.3％)，脂肪干细胞阴性指标：CD20(0.43％)，CD31(0.12％)和CD45(0.25％)。图2中C展示了光镜下脂肪干细胞分泌的细胞外基质和脱细胞基质(DMA)之后的形态。用免疫荧光进一步分析了脱细胞基质DMA中的组分，发现其由大量的胶原I和纤连蛋白构成(图2中D)。
本发明实验中角膜上皮细胞呈现鹅卵石样，形态和其他文献报道一致(图3中A)。角膜上皮细胞的标志物CK12阳性，并且有少量角膜上皮干细胞(P63)(图3中B)。由于脂肪干细胞含量丰富，易获得，并且可以大量扩增，具有广阔的临床应用前景。但是脂肪干细胞来源的细胞外基质尚未应用于角膜缺损的治疗，我们进一步的探究脂肪干细胞来源的脱细胞基质作为角膜辅料对角膜上皮细胞增殖、角膜缺损修复的影响。实验用临床上常用的羊膜作用对照。通过扫描电镜(图3中C)，进一步观察脱细胞基质(DMA)的形貌。DMA中纤维交错分布，角膜上皮细胞可以很好的黏附在DMA上。为探究DMA对角膜上皮细胞增殖的影响，实验分为了四组：单纯的培养皿组，培养皿表面覆盖羊膜组，培养皿表面覆盖DMA组。CCK8实验(图3中D)、流式细胞学检测(图3中E-G)均显示DMA能够较羊膜更有效的促进角膜上皮细胞增殖。
图4中A展示了DMA作为角膜损伤修复的生物材料的应用，脂肪间充质干细胞脱细胞基质能够被完整地从培养皿底揭起。维他命C能够刺激脂肪干细胞分泌大量细胞外基质，本发明停止传代后所用培养液配方中含有维他命C，使得脱细胞之后的DMA具有一定的厚度和韧性，因而可以被完全揭起，在PBS中呈现半透明状态，形似正常的角膜组织。DMA促进角膜缺损修复的效果与临床上最广泛应用的羊膜进行对比。应用whatmanIII滤纸片蘸取1NNaOH后，放置于小鼠眼表，进行角膜碱烧伤处理，构建眼表损伤的模型；制造角膜2mm直径的缺损。在小鼠眼表滴加外用冻干人纤维蛋白粘合剂，将羊膜/脂肪间充质干细胞脱细胞基质均匀的固定在眼表，并定期进行观察。应用荧光素钠的着染，在裂隙灯下仔细观察治疗后小鼠眼表缺损修复的状态。图4中C统计了18小时内，小鼠缺损的面积。结果显示，羊膜和DMA均能够有效促进损伤愈合，与无移植组的修复差异具有统计学意义。图4中D显示了24小时后，小鼠角膜点状荧光评分。结果显示羊膜能够加速伤口愈合，但是DMA促进修复的能力更强，差异具有统计学意义。图4中E利用了OCT检测小鼠角膜厚度，结果显示，DMA和羊膜都能够有效减弱角膜水肿，但DMA的消肿能力更加突出。图4中F在裂隙灯观察下，对小鼠的角膜透明度进行评分。虽然评分没有明显差异，但是可以看到DMA组有更多数量的角膜达到了完全透明的状态。
为了深入研究DMA对促进角膜结构恢复的治疗效果，将术后第8天的小鼠进行了角膜切片染色。图5中A展示了HE染色情况下，各组小鼠角膜的愈合情况。可以观察到DMA治疗组的小鼠角膜上皮更加完整，细胞排列紧密且均匀，上皮光滑。图5中B展示了MASSON染色下，小鼠角膜胶原的排布情况。DMA治疗组胶原排布紧密且有序，更加趋近于正常小鼠角膜的形态。通过免疫荧光染色，从图5中C可以观察到DMA治疗组的角膜结构更加完整，上皮之间形成了良好的连接，DMA的处理刺激了更多细胞进入了增殖状态。并且，DMA抑制了细胞的凋亡。结果表明DMA组更快更好地促进了角膜组织结构上的修复。
DMA有效地促进了角膜损伤后产生的眼表炎症吸收。可以观察到，MMP9和MMP3(图6)以及IL-6和TNFα(图7)均能被羊膜和DMA降低表达水平，但DMA的抗炎能力更显著。
DMA的移植，促进了角膜神经的修复。通过全角膜免疫荧光神经染色(βIIITubulin)，观察经过无移植、羊膜移植和脂肪干细胞脱细胞基质移植后角膜神经的恢复情况。从图8可以观察到，碱烧伤的处理，可以导致小鼠的神经大量破坏，无移植组的眼表在第8天，神经排布非常稀疏。羊膜的覆盖，一定程度上促进了角膜神经的生长，而DMA的治疗效果更加显著，角膜中央和周围都恢复了部分神经的分布，并且通过免疫荧光染色和PCR的手段，检测到DMA移植组的眼表神经营养因子更加丰富，提示DMA的覆盖可能在一定程度上促进了眼表分泌更多的营养因子，进而促进神经的修复。
通过蛋白质谱分析DMA中具体成分，图9所示，展示了脂肪间间充质干细胞来源的脱细胞基质中含量最丰富的前50种蛋白，研究发现DMA中除了富含多种细胞骨架蛋白外，还包含了多种生长因子，其成分可以激活多条与组织修复、细胞增殖修复等相关的信号通路。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种角膜损伤修复的生物材料，其特征在于，所述角膜损伤修复的生物材料为脂肪间充质干细胞来源的脱细胞基质。
2.脂肪间充质干细胞来源的脱细胞基质在制备角膜结构和功能修复产品中的用途。
3.一种权利要求1或2所述脂肪间充质干细胞来源的脱细胞基质的制备方法，其特征在于，包括获取脂肪间充质干细胞，传代培养和脱细胞基质的制备。
4.根据权利要求3所述的脂肪间充质干细胞来源的脱细胞基质的制备方法，其特征在于，所述获取脂肪间充质干细胞包括以下具体步骤：取获得的脂肪组织，洗涤后剪碎，浸泡在消化液中进行消化；消化完成后，离心、留沉淀，即得脂肪间充质干细胞。
5.根据权利要求4所述的脂肪间充质干细胞来源的脱细胞基质的制备方法，其特征在于，所述获取脂肪间充质干细胞还包括以下特征中的一项或几项：
a)所述脂肪组织优选为抽脂或者重睑手术中获得的脂肪组织；
b)所述洗涤介质为PBS缓冲液+100U/mL青霉素/链霉素；
c)所述消化液为0.1～0.2％的胶原酶A；
d)所述消化的温度为37℃，消化时间为8～10h；
e)所述离心条件为：转速1000～1200rpm，时间8～12min。
6.根据权利要求3所述的脂肪间充质干细胞来源的脱细胞基质的制备方法，其特征在于，所述传代培养包括以下具体步骤：用培养液重悬获取的脂肪间充质干细胞，置于培养箱中培养，待细胞长至80％～90％密度时进行传代，停止传代后，更换培养液，进行3～4周的培养。
7.根据权利要求6所述的脂肪间充质干细胞来源的脱细胞基质的制备方法，其特征在于，所述传代培养还包括以下特征中的一项或几项：
a)所述培养液配方为：DMEM+10％牛血清+100U/mL青霉素/链霉素；
b)所述培养箱的培养条件设定为温度37℃，5％CO2；
c)所述传代具体包括以下步骤：弃去培养液，用PBS缓冲液润洗，加入0.1％胰酶进行消化；用含血清的培养液进行中和后，离心；弃去上清，用培养液重悬，1:3～4传代；
d)停止传代后所用培养液配方为：DMEM+10％牛血清+100U/mL青霉素/链霉素+50μmol/L维他命C。
8.根据权利要求7所述的脂肪间充质干细胞来源的脱细胞基质的制备方法，其特征在于，所述传代还包括以下特征中的一项或几项：
a)所述消化的温度为37℃，消化时间为8～10h；
b)所述离心条件为：转速600～1000rpm，时间3～5min；
c)所述培养液配方为：DMEM+10％牛血清+100U/mL青霉素/链霉素；
d)所述培养箱的培养条件设定为温度37℃，5％CO2。
9.根据权利要求3所述的脂肪间充质干细胞来源的脱细胞基质的制备方法，其特征在于，所述脱细胞基质的制备包括以下具体步骤：弃去培养皿中所有培养液，用PBS缓冲液润洗后，加入脱细胞液，静置，用PBS缓冲液冲洗后加入DNA酶，置于培养箱中培养；最后用PBS缓冲液进行洗涤，置于黑暗中，4℃保存。
10.根据权利要求9所述的脂肪间充质干细胞来源的脱细胞基质的制备方法，其特征在于，所述脱细胞基质的制备还包括以下特征中的一项或几项：
a)所述脱细胞液的配方为0.5％Triton+20mmol/LNH4OH+PBS缓冲液；
b)所述静置时间为4～10min；
c)所述DNA酶的浓度为100U/mL；
d)所述PBS缓冲液冲洗次数为2～5次；
e)所述培养箱的培养条件设定为温度37℃，5％CO2；
f)置于培养箱培养时间为1～2h。
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