CN113577389A - 一种来自猪耳软骨的脱细胞软骨材料及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种来自猪耳软骨的脱细胞软骨材料及制备方法和应用，制备方法包括以下步骤：(1)从猪的耳软骨上提取耳软骨材料；(2)耳软骨材料初步处理；(3)病毒灭活；(4)一次清洗；(5)脱细胞；(6)二次清洗；(7)注射水清洗；(8)灭菌。相对于脱细胞肋软骨材料，脱细胞耳软骨材料的孔径和孔隙率更大，微孔数量更多，可能会更加促进细胞迁移分化，影响局部组织分化和免疫反应。在应用于肋软骨缺损修复时，脱细胞耳软骨材料的细胞增殖率更高，可能是由于该材料拥有更大的孔径和微孔数量，促进了软骨细胞的粘附和增殖。

Description

一种来自猪耳软骨的脱细胞软骨材料及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种来自猪耳软骨的脱细胞软骨材料及制备方法和应用，属于生物材料技术领域。

背景技术

凭借无免疫排斥性、数量充足、可塑性佳、组织相容性好和形态稳定等优点，自体肋软骨在整形外科领域广泛应用，如耳廓再造手术和肋软骨隆鼻手术。在耳廓再造的重建手术中，需要采取2-3根自体肋软骨雕刻拼接为耳廓形态的支架，自体肋软骨采取后会遗留软骨缺失，并且，多根肋软骨缺失可能导致更加明显的胸廓形态异常，如胸壁局部凹陷、双侧胸廓发育不对称等，影响美观。为了减少胸廓的局部凹陷变形，术中通常将雕刻剩余的肋软骨碎片回植于软骨采集区域，并保留软骨膜。目前手术中会根据耳廓尺寸，优化手术设计方案，以采取尽可能少的肋软骨，术中剩余材料数量较少，大多为碎片软骨，无法完全填充于肋软骨缺损部位。因此，利用术中剩余的自体肋软骨材料修复缺损难度较大，寻找能够替代肋软骨、数量充足的合适材料是重要解决办法，寻找合适的材料填充于肋软骨缺失部位，重建局部胸壁形态，是减少胸廓畸形发生的重要方面。

目前，脱细胞材料是一种比较理想的生物材料，该材料去除了细胞成分，保留了细胞外基质结构、信号分子和功能蛋白，由于细胞外基质结构在不同种属中为高度保守，因此，异种来源的细胞外基质能够进行移植应用，免疫排斥反应较小，能够促进细胞粘附和诱导组织再生。脱细胞材料已广泛应用于临床手术，如关节和支气管手术中、人来源的脱细胞真皮基质材料、猪来源的脱细胞心脏瓣膜等，而尚未有脱细胞软骨材料填充应用于肋软骨缺损区域的相关研究。

猪来源生物材料是人类组织器官修复的最佳选择之一，其软骨材料充足，取材容易，便于进行后续工厂化生产。

在脱细胞软骨材料的制备过程中，要充分考虑不同脱细胞方法对细胞外基质的破坏作用，寻找更加温和有效的脱细胞技术是制备脱细胞材料的重要方面。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种来自猪耳软骨的脱细胞软骨材料及制备方法和应用，收集猪耳软骨材料，经过脱细胞等处理后，初步制备了猪来源的脱细胞耳软骨和肋软骨材料，并进行材料学理化性质比较、生物相容性分析、巨噬细胞极化反应和动物体内缺损填充再生的相关分析，评估将脱细胞软骨材料应用于肋软骨缺损修复的可行性。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种来自猪耳软骨的脱细胞软骨材料的制备方法，包括以下步骤：(1)从猪的耳软骨上提取耳软骨材料；(2)耳软骨材料初步处理；(3)病毒灭活；(4)一次清洗；(5)脱细胞；(6)二次清洗；(7)注射水清洗；(8)灭菌；

其中步骤(1)具体为：将猪全麻后，剃除术区毛发，用碘酊消毒、酒精脱碘，铺无菌巾；局部浸润麻醉后，沿耳廓软骨底部将耳廓完整切除，局部止血后，游离局部皮肤，直接拉拢缝合断段，外敷抗生素软膏，继续处理切下的耳廓组织，沿耳廓中部切开，沿切口向两侧剥离，将皮肤、皮下组织和软骨膜完全去除，只保留耳软骨，置于生理盐水中备用。

本发明的有益效果是：相对于脱细胞肋软骨材料，脱细胞耳软骨材料的孔径和孔隙率更大，微孔数量更多，可能会更加促进细胞迁移分化，影响局部组织分化和免疫反应。在应用于肋软骨缺损修复时，脱细胞耳软骨材料的细胞增殖率更高，可能是由于该材料拥有更大的孔径和微孔数量，促进了软骨细胞的粘附和增殖，而且脱细胞耳软骨材料对M1和M2型巨噬细胞的抑制作用更强，可能是由于其孔径、微孔数量和某些特殊细胞外基质成分造成。从性能上看，脱细胞耳软骨材料优于脱细胞肋软骨材料，此外，猪来源的耳软骨比肋软骨取材更加简易，量大充足，更方便进行工厂化的生产制作，产品成本低，便于后续临床手术的广泛应用。

而具体的猪来源的耳软骨的采取步骤中，区别与现有技术中对于猪耳软骨的一般处理，本发明在处理时，将软骨膜完全去除，不做保留，这是因为软骨膜由许多蛋白质连接在一起构成，并且容纳高度集中的血管，这些物质及结构不利于脱细胞软骨材料的制备，因此，本发明将其完全去除，虽然在处理时多了一步，但是处理起来并不是特别麻烦，而对制成的脱细胞软骨材料来说，去除软骨膜可以提升其各方面的性能，尤其是应用在脱细胞软骨材料填充修复肋软骨缺损时，匹配性更好，修复效果更佳。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，步骤(2)具体为：将步骤(1)获取的耳软骨材料去除软骨膜和结缔组织，切割成合适尺寸，用纯化水冲洗至表面无污渍。其中合适尺寸指直径小于2cm，厚度不超过3mm。

进一步，步骤(3)具体为：采用过氧乙酸和乙醇的混合溶液处理，耳软骨材料置于混合溶液中，耳软骨材料和混合溶液体积比例为1:20，灭活时间4小时，灭活温度20℃。

进一步，所述过氧乙酸和乙醇的混合溶液中，过氧乙酸和乙醇的体积比为1:24。

进一步，步骤(4)和步骤(6)操作相同，具体为：采用pH在6-8之间的磷酸盐缓冲溶液清洗，温度10-30℃，磷酸盐缓冲溶液与耳软骨材料体积比例为30:1，每次15分钟，清洗至少3次，直至检测冲洗后的冲洗液pH在6-8之间(一般清洗3次后，ph符合要求，如果ph不符，就继续冲洗)，然后采用纯化水清洗，温度范围为10-30℃，纯化水与耳软骨材料体积比例为30:1，每次15分钟，清洗1次；步骤(7)具体为：采用注射用水清洗4次，每次15分钟，注射用水与耳软骨材料体积比例为30：1，温度范围为10-30℃；步骤(8)具体为：采用钴60辐射灭菌，然后置于灭菌小瓶封存。

进一步，各个清洗步骤使用超声波清洗机进行清洗，功率3000W以上，频率40kHz。

进一步，步骤(5)具体为：采用含有胰蛋白酶和乙二胺四乙酸二钠的磷酸盐缓冲溶液为脱细胞溶液，将耳软骨材料加入到脱细胞溶液中，并放入摇床内，脱细胞溶液与耳软骨材料体积比例为20:1，摇床设定为转速为150r/min，持续作用72小时，温度37℃，每24小时更换脱细胞溶液。

采用上述进一步方案的有益效果是本发明利用胰蛋白酶和乙二胺四乙酸二钠进行脱细胞处理，是一种更加温和有效的脱细胞方法，得到的脱细胞软骨材料，残余DNA含量小，达到了脱细胞的基本要求，还能有效去除α-Gal抗原，明显降低了后期植入体内的免疫排斥风险，此外，脱细胞软骨基质中引起炎症反应的细胞成分被有效去除，能够抑制巨噬细胞的极化反应。

基于本发明特殊的脱细胞步骤，本发明制得的脱细胞软骨材料基本保留了细胞外基质的结构和功能，为细胞增殖和组织再生提供了稳定的环境，细胞外基质中的胶原纤维成分大部分得到保留，在肋软骨缺损修复过程中，能诱导细胞迁移分化和组织再生，并提供机械支撑作，实现改善局部胸廓凹陷畸形的效果。

进一步，所述脱细胞溶液为含有胰蛋白酶2.5g/L和乙二胺四乙酸二钠0.5mM的磷酸盐缓冲溶液，pH在6-8之间。

采用上述进一步方案的有益效果是经过各种试验比对以及积累的经验，本发明得出采用上述脱细胞方式以及所用试剂效果最佳。

本发明还涉及一种采用所述的制备方法制备出的来自猪耳软骨的脱细胞软骨材料。

本发明还涉及一种所述来自猪耳软骨的脱细胞软骨材料的应用，其用于肋软骨缺损修复。

附图说明

图1为脱细胞软骨材料植入肋软骨缺损区域。(A)采取3根肋软骨，保留软骨膜完整。(B)缺损区域放入修剪为对应尺寸的脱细胞软骨材料。(C)软骨膜重新缝合包裹脱细胞软骨。

图2为脱细胞软骨DNA、GAG和胶原含量分析。(A)对照组DNA含量与脱细胞软骨DNA含量。(B)对照组α-Gal含量与脱细胞软骨α-Gal含量。(C)对照组胶原含量与脱细胞软骨胶原含量。(D)对照组GAG含量与脱细胞软骨GAG含量。*P<0.05。NAC(natural auricularcartilage)：对照组未处理耳软骨。DAC(decellularized auricular cartilage)：脱细胞耳软骨。NCC(natural costal cartilage)：对照组未处理肋软骨。DCC(decellularizedcostal cartilage)：脱细胞肋软骨。

图3为脱细胞软骨孔隙率、孔径与残余量分析。(A)脱细胞耳软骨和脱细胞肋软骨孔隙率比较。(B)脱细胞耳软骨和脱细胞肋软骨孔径比较。(C)脱细胞耳软骨和脱细胞肋软骨体外分解速度比较。*P<0.05。NAC：对照组未处理耳软骨。DAC：脱细胞耳软骨。NCC：对照组未处理肋软骨。DCC：脱细胞肋软骨

图4为不同软骨的组织学染色。HE：苏木素伊红染色。Masson：马松染色。AlcianBlue：阿利新蓝染色。NAC：对照组耳软骨。DAC：脱细胞耳软骨。NCC：对照组肋软骨。DCC：脱细胞肋软骨。HCC：人肋软骨。Scale bar＝100μm。

图5为脱细胞软骨的大体和电镜分析。(A)脱细胞耳软骨材料大体观，图中每小格为1mm。(B)脱细胞耳软骨材料表面扫描图。(C)脱细胞耳软骨材料截面扫描图。(D)脱细胞肋软骨材料大体观，图中每小格为1mm。(E)脱细胞肋软骨材料表面扫描图。(F)脱细胞肋软骨材料截面扫描图。DAC：脱细胞耳软骨。DCC：脱细胞肋软骨。Scale bar＝100μm。

图6为脱细胞软骨的生物相容性评估。(A)CCK-8检测肋软骨细胞的增殖情况。▲代表脱细胞肋软骨组与脱细胞耳软骨组存在显著性差异。■代表脱细胞耳软骨组与对照组存在显著性差异。★代表脱细胞肋软骨组与对照组存在显著性差异。(B)肋软骨细胞存活率比较。(C)活死细胞荧光染色比较。Control：无软骨材料的对照组。DAC：脱细胞耳软骨。DCC：脱细胞肋软骨。

图7为脱细胞软骨对巨噬细胞的极化作用影响。(A)M1型细胞表面标记物CD80表达情况。(B)M1型细胞表面标记物CD86表达情况。(C)M2型细胞表面标记物CD163表达情况。(D)M2型细胞表面标记物CD209表达情况。(E-F)M1型细胞炎症因子TNF-α和IL-1β情况。(G-H)M2型细胞抗炎因子TGF-β和IL-10情况。#代表与M0组进行组间比较。*代表与M1组进行组间比较。#P<0.05，*P<0.05。M0组：M0型巨噬细胞培养组；M1组：M1型巨噬细胞培养组；M2组：M2型巨噬细胞培养组；M1+DAC：M1型巨噬细胞+脱细胞耳软骨共培养组；M1+DCC：M1型巨噬细胞+脱细胞肋软骨共培养组；M2+DAC：M2型巨噬细胞+脱细胞耳软骨共培养组；M2+DCC：M2型巨噬细胞+脱细胞肋软骨共培养组。

图8为肋软骨缺损区域新生组织形态分析。(A-C)无软骨材料填充的Control组CT重建图像和术中探查图像。(D-F)肋软骨采集区域填充脱细胞耳软骨材料的DAC组CT重建图像和术中探查图像。(G-I)肋软骨采集区域填充脱细胞肋软骨材料的DCC组CT重建图像和术中探查图像。

图9为新生组织的组织学染色分析。H&E：苏木素伊红染色。Alcian Blue：阿利新蓝染色。Safranin O：番红O染色。Masson：马松染色。Alizarin Red：茜素红染色。Control：无软骨材料填充的对照组。DAC：脱细胞耳软骨填充组。DCC：脱细胞肋软骨填充组。Scale bar＝100μm。

图10为新生组织的基因表达分析。(A-B)软骨细胞相关基因Sox9和Acan表达情况。(C)软骨基质相关基因Col2α1表达情况。(D)成骨基因Runx2表达情况。(E)成纤维基因Col1α1表达情况。*P<0.05。Control：无软骨材料填充的空白对照组。DAC：脱细胞耳软骨填充组。DCC：脱细胞肋软骨填充组。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1：来自猪耳软骨的脱细胞软骨材料的制备

选购6只巴马迷你猪，5月龄，雄性，体重12-13kg。所有动物由整形外科医院动物中心提供，在本实验中均得到了人道主义关爱，获得医院动物伦理委员会批准。

采用以下制备方法制备来自猪耳软骨的脱细胞软骨材料：

(1)将猪全麻后，剃除术区毛发，用碘酊消毒、酒精脱碘，铺无菌巾；

局部浸润麻醉后，沿耳廓软骨底部将耳廓完整切除，局部止血后，游离局部皮肤，直接拉拢缝合断段，外敷抗生素软膏，继续处理切下的耳廓组织，沿耳廓中部切开，沿切口向两侧剥离，将皮肤、皮下组织和软骨膜完全去除，只保留耳软骨，置于生理盐水中备用。

(2)将步骤(1)获取的耳软骨材料去除软骨膜和结缔组织，切割成合适尺寸(直径小于2cm，厚度不超过3mm)，用纯化水冲洗至表面无污渍。

(3)采用过氧乙酸和乙醇的混合溶液处理，耳软骨材料置于混合溶液中，耳软骨材料和混合溶液体积比例为1:20，灭活时间4小时，灭活温度20℃。其中，所述过氧乙酸和乙醇的混合溶液中，过氧乙酸和乙醇的体积比为1:24。

(4)采用pH在6-8之间的磷酸盐缓冲溶液清洗，温度10-30℃，磷酸盐缓冲溶液与耳软骨材料体积比例为30:1，每次15分钟，清洗至少3次，直至检测冲洗后的冲洗液pH在6-8之间，然后采用纯化水清洗，温度范围为10-30℃，纯化水与耳软骨材料体积比例为30:1，每次15分钟，清洗1次。

(5)采用含有胰蛋白酶和乙二胺四乙酸二钠的磷酸盐缓冲溶液为脱细胞溶液，将耳软骨材料加入到脱细胞溶液中，并放入摇床内，脱细胞溶液与耳软骨材料体积比例为20:1，摇床设定为转速为150r/min，持续作用72小时，温度37℃，每24小时更换脱细胞溶液。其中，所述脱细胞溶液为含有胰蛋白酶2.5g/L和乙二胺四乙酸二钠0.5mM的磷酸盐缓冲溶液，pH在6-8之间。

(6)采用pH在6-8之间的磷酸盐缓冲溶液清洗，温度10-30℃，磷酸盐缓冲溶液与耳软骨材料体积比例为30:1，每次15分钟，清洗至少3次，直至检测冲洗后的冲洗液pH在6-8之间，然后采用纯化水清洗，温度范围为10-30℃，纯化水与耳软骨材料体积比例为30:1，每次15分钟，清洗1次.

(7)采用注射用水清洗4次，每次15分钟，注射用水与耳软骨材料体积比例为30：1，温度范围为10-30℃。

(8)采用钴60辐射灭菌，然后置于灭菌小瓶封存。得到的来自猪耳软骨的脱细胞软骨材料。

各个清洗步骤建议使用超声波清洗机进行清洗，功率3000W以上，频率40kHz。清洗过程也可在摇床中进行。

实施例2：来自猪耳软骨的脱细胞软骨材料植入肋软骨缺损区域

选购18只健康新西兰大白兔，雄性，3月龄，体重2kg左右。所有动物由整形外科医院动物中心提供，在本实验中均得到了人道主义关爱，获得医院动物伦理委员会批准。

(1)分组

为了比较本发明制备的来自猪耳软骨的脱细胞软骨材料与现有技术中来自猪肋软骨的脱细胞软骨材料的区别，设置两组填充组，分别为按照实施例1的制备方法制备的脱细胞耳软骨材料和按照现有技术中常规方法获取猪肋软骨材料后用实施例1的步骤(2)-(8)制备出的脱细胞肋软骨材料。获取猪肋软骨材料的方法为：将猪全麻后，剃除术区毛发，用碘酊消毒、酒精脱碘，铺无菌巾；局部浸润麻醉后，以圆刀在胸骨下端右侧做10cm切口，切线与肋弓平行，分层切开皮肤、皮下和肌肉层，暴露第6、7、8肋软骨，将3根肋软骨完整切除，置于生理盐水中备用；充分止血后，分层缝合切口，再次消毒，局部外敷抗生素软膏，术后连续三天给予肌肉内注射青霉素，预防感染。

将18只大白兔分为3组，分别为空白对照组、脱细胞耳软骨填充组和脱细胞肋软骨填充组。

(2)手术操作

将大白兔全麻后，暴露术区，用碘酊、酒精消毒。局部浸润麻醉后，以圆刀在胸骨下端右侧做10cm切口，切线与肋弓平行。分层切开皮肤、皮下和肌肉层，暴露第5、6、7肋软骨，在软骨中间切开软骨膜，将软骨膜从中间向两侧缓慢推开，尽量保留软骨膜完整，将3根肋软骨完整切除。在空白对照组，直接将软骨膜重新缝合。在两个脱细胞软骨填充组，分别将脱细胞耳软骨材料和脱细胞肋软骨材料填充于软骨缺损区域，并将软骨膜重新缝合包裹脱细胞软骨。充分止血后，分层缝合切口，局部外敷抗生素软膏。术后连续三天给予肌肉内注射青霉素，预防感染。4个月后，将实验动物全麻，进行胸廓CT扫描。然后依照原手术操作和CT重建图像辅助，剥离取出肋软骨缺损区域新生组织，分别保存于多聚甲醛、液氮，供后续研究使用(如图1所示)。

实施例3

分别检测空白对照组和两组填充组的以下性质：肋软骨CT重建、DNA含量测定、总胶原含量测定、糖胺聚糖(GAG)含量测定、α-Gal含量测定、降解率和孔隙率测定、组织学检查(包括苏木素伊红HE染色、阿利新蓝Alcian Blue染色、茜素红Alizarin Red染色、马松Masson染色、番红固绿Safranin O and fast green staining染色)、扫描电镜测量脱细胞软骨材料孔径、兔肋软骨细胞的培养和传代、脱细胞软骨材料毒性检测、Live/Dead细胞活性检测、巨噬细胞极化反应(包括试剂的配制、PMA诱导THP-1细胞为M0、THP-1诱导极化成M1/M2、ELISA法检测细胞上清的相关蛋白、流式细胞术检测细胞表面标记物)、PCR检测(包括总RNA抽提、反转录、定量PCR、PCR结果处理)。

以上检测方法采用本领域常用技术，其可以是以下的具体方法，也可以是类似方式，能验证出实验结果均可。

1、肋软骨CT重建

使用整形外科医院放射科64排CT进行术后胸廓CT检查，具体参数为：BrillianceCT 64排,管电压120kV，管电流220mA，层厚1mm，旋转时间0.75s，像素矩阵512X512。数据由Extended Brilliance^TM工作站进行处理，获得重建三维图像。

2、DNA含量测定

(1)将脱细胞软骨材料置于液氮中研磨成粉末，取2ml离心管加入200ul缓冲液GA和20mg粉末组织，震荡混匀。

(2)加入20ul蛋白酶K(10mg/ml)，充分振荡混匀，然后56℃水浴60分钟，震荡2-3次促进完全消化裂解。将上述充分裂解样本加入200ul缓冲液GB，振荡混匀，70℃水浴10分钟，充分混匀。

(3)待离心管冷却后加入200ul无水乙醇，充分混匀15秒，将以上内容物加入吸附柱CB3中。以12000rpm速度离心处理30秒，倒掉收集管中的废液。

(4)向吸附柱CB3中加入500ul缓冲液GD，以12000rpm速度离心处理30秒，倒掉收集管中的废液。

(5)加入600ul漂洗液PW，以12000rpm速度离心处理30秒，倒掉收集管中的废液。

(6)再次重复上一步操作后，将吸附柱CB3放回收集管，以12000rpm速度离心处理2分钟，然后室温晾干数分钟。

(7)将吸附柱CB3转入干净离心管，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μl洗脱缓冲液TE，室温放置4分钟，以12000rpm速度离心处理2分钟，将溶液收集到离心管。4℃保存，用微量分光光度计检测DNA含量。

3、总胶原含量测定

(1)按照试剂盒说明书，配置试剂一、试剂二、试剂三、羟脯氨酸5μg/ml浓度标准液。

(2)首先进行样本处理：将脱细胞软骨材料研磨成粉末后，称取80mg加入6mol/L盐酸1ml，置于100℃烤箱静置水解5小时。

(3)在各管统一加入指示剂10μl、PH甲液1.5ml、PH乙液0.2ml。继续在各管逐滴加入乙液并摇匀，调整PH值在6.0-6.8之间。

(4)在各管加入双蒸水10ml稀释。取稀释后的样本3ml，加入20mg活性炭，混匀，3500rpm离心10分钟，取上清1ml作为待测液，转入测定管。

(5)另外设定空白管、标准管，分别加入1ml双蒸水和1ml羟脯氨酸标准液。

(6)按照如下操作流程进行检测：

(7)

4、糖胺聚糖(GAG)含量测定

(1)称取0.2g脱细胞软骨材料，研磨为粉末组织后，放进1.5ml离心管，加入500ul萃取液，震荡1分钟，分别置于56℃恒温水浴16小时、90℃恒温水浴10分钟，然后以2000rpm速度离心处理10分钟，移取上清液于1.5ml离心管。

(2)按照说明书指示方法，依次制备标准样品1-5号管，经过染色处理后，构建标准曲线。

(3)取50ul待测样品于1.5ml离心管，加入1ml染色液，经过震荡、孵育处理后，以12000rpm速度离心处理10分钟。吸取上清液，然后加入1ml解离液，经过震荡、孵育处理。使用分光光度仪检测在波长656nm参数下，获得待测样品吸光值，根据标准曲线获得对应待测样本浓度。

5、α-Gal含量测定

(1)称取30mg脱细胞软骨材料，研磨为粉末组织后，按1:9的比例加入PBS，在冰上充分匀浆裂解，最后将匀浆液以5000g速度离心10分钟，取上清液待检。

(2)设置标准孔、空白孔和样本孔，标准品孔内加入不同浓度标准品50ul。样本孔内加入待测样本50ul，空白孔内加入样本稀释液50ul。每孔内加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100ul，用封板膜封住反应孔，37℃温育60分钟。弃去液体，洗板5次后，每孔加入反应底物A、B各50ul，37℃避光孵育15分钟。

(3)每孔加入终止液50ul，检测各孔在450nm波长的OD值，根据标准曲线获得对应待测样本浓度。

6、降解率和孔隙率测定

(1)预先测定每种低温烘干的脱细胞软骨材料质量为W₀。

(2)将脱细胞软骨材料置于含有10毫升PBS离心管中，摇床处理4、8、12、16周，设定参数120rpm，37℃。

(3)取出样本经过去离子水冲洗、低温烘干后，测定质量为W_m。根据公式测定残余量＝W_m/W₀×100％。

(4)用排水法进行脱细胞软骨材料的孔隙率测量，将材料放入含有3毫升无水乙醇的离心管中静置24小时，测量总体积为V₁。

(5)取出材料后，测定剩余溶液体积为V₂，孔隙率＝(3-V₂)/(V₁–V₂)×100％。以上每项测试每种样本进行5次。

7、组织学检查

将待测样本组织脱水、石蜡包埋处理，于整形外科医院病理科制备获得5μm石蜡切片。

7.1苏木素伊红(HE)染色

(1)将切片放入70℃烤箱中烘烤1-2小时；

(2)将切片依次放入二甲苯溶液，浸泡15分钟脱蜡，随后从高浓度至低浓度不同浓度酒精梯度浸泡5分钟；

(3)PBS冲洗切片2分钟，苏木素液染10分钟，用自来水冲洗1分钟；

(4)0.5％盐酸酒精(1:1混合质量分数为0.5％的盐酸和0.5％的乙醇，下同)快速分化，返蓝1分钟；

(5)伊红染色1.5分钟；

(6)先后快速置入70％(体积分数，下同)、85％、95％、100％梯度酒精；

(7)二甲苯处理5分钟，中性树脂封片。

7.2阿利新蓝(Alcian Blue)染色

(1)烤片、脱蜡、水化步骤同苏木素伊红染色；

(2)放入阿利新蓝染液中处理15分钟，自来水洗1分钟；

(3)于二甲苯处理5分钟，中性树脂封片；

(4)显微镜下观察，软骨细胞、酸性粘液物质呈蓝色。

7.3茜素红(Alizarin Red)染色

(1)烤片、脱蜡、水化步骤同苏木素伊红染色；

(2)切片放入茜素红染液处理5分钟，自来水洗1分钟；

(3)切片放置烤箱内烤干后，于二甲苯处理5分钟，中性树脂封片；

(4)显微镜下观察，钙盐沉积处呈深红色，背景淡红色或者近无色。

7.4马松(Masson)染色

(1)烤片、脱蜡、水化步骤同苏木素伊红染色；

(2)切片放入Masson A液中浸泡过夜后，将切片浸泡于Masson A液内于37℃烤箱内处理30分钟；

(3)自来水洗30秒；

(4)临用前将Masson B液及Masson C液等体积混合，切片放入混合液处理1分钟，自来水流水冲洗；

(5)1％盐酸酒精分化1分钟，核呈灰黑色，背景几乎无色或淡灰色；

(6)自来水稍洗，沥干水分，Masson D液处理6分钟，整个组织呈现亮红色；

(7)将水分尽量沥干,Masson E液处理约1分钟；

(8)稍微沥干Masson E液，直接放入Masson F液染色10秒；

(9)于1％冰醋酸漂洗分化，处理三次，每次5秒左右；

(10)于无水乙醇脱水处理后，于二甲苯处理5分钟，中性树脂封片；

(11)显微镜下观察，蓝色部分为胶原纤维，肌纤维呈红色。

7.5番红固绿(Safranin O and fast green staining)染色

(1)烤片、脱蜡、水化步骤同苏木素伊红染色；

(2)固绿染色液浸染5分钟，自来水洗1分钟；

(3)番红染色液浸染1分钟，自来水洗1分钟；

(4)0.5％盐酸酒精分化数秒,自来水洗10分钟；

(5)乙酸溶液处理切片1.5分钟，去除多余固绿染液，自来水洗1分钟；

(6)梯度乙醇溶液脱水后，二甲苯处理5分钟，中性树脂封片；

(7)显微镜下观察，软骨呈红色或橙红色，背景绿色。

8、扫描电镜测量脱细胞软骨材料孔径

(1)将脱细胞软骨材料放入含有2％戊二醛溶液中，静置固定24小时；

(2)更换为1％锇酸溶液固定0.5小时；

(3)用85％、95％、100％酒精梯度脱水；

(4)用乙酸异戊酯溶液置换处理4小时；

(5)将样本用二氧化碳临界干燥器干燥处理；

(6)真空喷溅铂金离子60秒；

(7)扫描电子显微镜拍照，每种脱细胞软骨测量10个样本，每个样本随机测量50个孔径。

9、兔肋软骨细胞的培养和传代

(1)根据前述肋软骨采取步骤，获得兔来源肋软骨组织；

(2)超净台铺无菌巾，用圆刀将软骨剪碎至1mm³大小；

(3)大量PBS反复冲洗后，以1200rpm速度离心5分钟，去上清后加入5倍体积0.25％胰蛋白酶；

(4)放入37℃恒温摇床内处理30分钟，以1200rpm速度离心5分钟，去除上清；

(5)加入5倍体积0.25％II型胶原酶消化软骨组织，37℃震荡8-12小时；

(6)静置后经70μm滤网过滤，收集细胞悬液；

(7)用PBS溶液洗涤重悬细胞沉淀后，加入2ml完全培养基重悬细胞沉淀；

(8)在显微镜下观察细胞活力、计数，于10cm培养皿中，以5x10⁴/ml密度接种软骨细胞；

(9)培养箱内培养48-72小时，待软骨细胞80％贴壁时，更换完全培养基，每2-3天换液；

(10)细胞生长达到90％后进行传代，吸出原培养基，用3ml PBS清洗细胞2次；

(11)加入2ml胰酶，37℃消化细胞15秒，观察细胞变圆脱离后，加入2ml完全培养基终止消化，轻柔吹打；

(12)以1200rpm速度离心5分钟，去掉上清液；

(13)用PBS溶液洗涤重悬细胞沉淀后，细胞沉淀内加入2ml完全培养基，制成细胞悬液,继续按照上述步骤培养细胞。

10、脱细胞软骨材料毒性检测

(1)取10mmx10mm脱细胞软骨材料，提前置于完全培养基12小时，临用时取出，用负压吸引管将材料表面的培养基洗净，然后将脱细胞软骨材料放置于6孔板内；

(2)取细胞密度为4.5x10⁷/ml的P2代肋软骨细胞悬液80ul，将细胞悬液滴入脱细胞软骨材料表面上。分2-3次进行，避免细胞悬液从软骨片表面流下，然后在材料周围加入1ml完全培养基，不要没过材料表面。

(3)将培养板放入培养箱2小时静置，再每孔加入1ml完全培养基，定期换培养液；

(4)分别设置空白组、脱细胞耳软骨组和脱细胞肋软骨组，空白组按照常规软骨细胞培养方法，不放置材料；

(5)在1、3、7、9、14d时，吸出原旧培养基后，每孔加入1mL含CCK-8的完全培养基(体积比1：9)；

(6)将培养板置于培养箱中2小时，每孔取100ul液体至96孔板中，检测450nm处OD值。每种液体各5个孔，三组样本分别重复实验3次。

11、Live/Dead细胞活性检测

(1)软骨细胞与脱细胞软骨材料共培养过程与前述9(1-4)部分相同；

(2)取出Live/Dead细胞活性试剂盒，将20μl组分B加入10mlPBS中混匀，然后加入5μl组分A混匀，配置获得工作液；

(3)实验组将支架浸泡于工作液，空白组培养板内直接加入工作液，分别在培养箱内孵育30分钟；

(4)使用荧光共聚焦显微镜观察软骨细胞的分布及活性，并拍照。

12、巨噬细胞极化反应

12.1试剂的配制

(1)0.5mg/ml PMA溶液：向5mg PMA中加入10mL DMSO溶液，混匀。

(2)THP-1细胞完全培养基：1640基础培养基+10％FBS+0.05mMβ-巯基乙醇+1％双抗。

(3)PMA诱导液：THP-1细胞完全培养基500ml+PMA(0.5mg/ml)30ul。

(4)M1极化诱导液：THP-1细胞完全培养基50ml+LPS(5ug/ml)100ul+IFN-γ(10ug/ml)100ul。

(5)M2极化诱导液：THP-1细胞完全培养基50ml+IL-4(10ug/ml)100ul+IL-13(10ug/ml)100ul。

12.2PMA诱导THP-1细胞为M0

(1)于6孔板培养THP-1细胞，当每孔细胞量达到5×10⁵/ml时，以1000rpm速度离心5分钟，弃上清；

(2)使用PMA诱导液重悬细胞，混匀后均匀铺于6孔板中，每孔2mL，置于37℃，5％CO2培养箱中静置培养72h。

12.3THP-1诱导极化成M1，M2

(1)收集细胞悬液，1000rpm离心5分钟，弃上清，根据实验分组使用对应诱导培养基重悬细胞，混匀后均匀铺于6孔板中，每孔2mL，置于37℃，5％CO2培养箱中静置培养。

(2)实验分组如下：M0组：M0组：M0+THP-1细胞完全培养基；M1组：M0+M1诱导液；M2组：M0+M2诱导液；M1+脱细胞耳软骨组：M0+M1诱导液+脱细胞耳软骨；M1+脱细胞肋软骨组：M0+M1诱导液+脱细胞肋软骨；M2+脱细胞耳软骨组：M0+M2诱导液+脱细胞耳软骨；M2+脱细胞肋软骨组：M0+M2诱导液+脱细胞肋软骨；

(3)培养72h后，收集细胞上清，保存于-80℃，进行ELISA检测。向细胞沉淀中加入无菌PBS缓冲液，进行流式检测。

12.4ELISA法检测细胞上清的相关蛋白

(1)将细胞上清液离心10分钟，速度3000rpm，吸取上清至离心管中备用；

(2)设立空白孔、标准孔、待测样品孔，分别加入对应标准液或待测样品100ul，37℃温育120分钟；

(3)按照检测说明书，分次加入生物素化抗体工作液、酶结合物工作液、显色底物溶液和终止溶液，经过洗板、温育等处理；

(4)立即用酶标仪在450nm依序测量各孔OD值，根据标准曲线计算待测样本浓度。

12.5流式细胞术检测细胞表面标记物

(1)将细胞沉淀用PBS重悬细胞，调整细胞密度为5×10⁶/ml，取5μl细胞悬液于EP管；

(2)加入100μl直标抗体稀释液(抗体与PBS按1:10混合)，与细胞混匀，4℃避光孵育40分钟；

(3)每管加入1ml流式分析液，以1500rpm速度离心5分钟，弃上清；

(4)用500μl预冷的流失分析液重悬细胞，吹吸混匀；

(5)立即上机检测，用FlowJo分析细胞阳性率。

13、PCR检测

13.1总RNA抽提

(1)取匀浆管，加入1ml的Trizol，置冰上预冷；

(2)取100mg组织，加入到匀浆管中；

(3)匀浆仪充分研磨直至无可见组织块；

(4)12000rpm离心10分钟取上清；

(5)加入250μl三氯甲烷，混匀20s，静置4分钟；

(6)4℃，12000rpm离心10分钟；

(7)取400μl上清于离心管中，加入异丙醇，上清与异丙醇体积比为1:0.8。充分混匀后，于-20℃静置15分钟；

(8)以12000rpm速度离心10分钟，管底白色沉淀即为RNA；

(9)小心吸除液体，加入75％乙醇1.5ml洗涤沉淀；

(10)4℃，12000rpm离心5分钟；

(11)小心吸弃上清，置于超净台室温干燥5分钟；

(12)加入30μl无RNA酶DEPC水溶解RNA，55℃孵育5分钟；

(13)检测待测RNA样品吸光值OD_260/280在1.8-2.0为纯度较高；

(14)使用琼脂糖凝胶电泳分析RNA降解程度以及是否有污染。

13.2反转录

(1)体系配置

(2)37℃水浴30分钟；

(3)65℃水浴10分钟灭活DNase I；

(4)体系配置

(5)混匀，离心；

(6)42℃水浴60分钟；

(7)85℃水浴10分钟，灭活逆转录酶。

13.3定量PCR

(1)引物信息

(2)PCR体系配置

(3)将以上反应体系加入到0.2ml的EP管中混合均匀，短暂离心。

(4)将以上溶液加到8联排管，按照如下反应程序进行扩增。

PCR反应程序设置

13.4PCR结果处理

以GAPDH为内参基因进行标准化处理，用2^-△△Ct方法计算数据。

使用软件SPSS 25.0(SPSS，USA)进行数据分析统计，各项定量指标以均数±标准差表示，两组填充组之间比较采用独立样本T检验分析，超过两组填充组的比较采用单因素方差分析，P<0.05表示存在显著性差异，用GraphPad Prism 8绘制统计图。

实验结果：

1.脱细胞软骨的理化性质

1.1DNA、α-Gal、GAG和胶原含量

经过处理后，两组脱细胞软骨材料里的DNA和α-Gal均有效去除，残余DNA含量低于40ng/mg(图2A)，α-Gal有效清除率约为80％(图2B)。胶原蛋白是细胞外基质的重要组成部分，其在脱细胞过程中大部分得到保留，在脱细胞耳软骨和脱细胞肋软骨中平均含量为99.42μg/mg和109.08μg/mg(图2C)。糖胺聚糖(GAG)在脱细胞操作过程中流失明显，含量约为对照组软骨(未处理软骨)的50％(图2D)。

1.2孔隙率、孔径与残余量分析

通过排水法测量，脱细胞耳软骨和脱细胞肋软骨的平均孔隙率分别为59.3％和44.8％(图3A)。经过扫描电镜图片中的测量，脱细胞耳软骨的孔径范围是20-70μm，平均孔径为43μm。脱细胞肋软骨的孔径相对较小，范围是15-60μm，平均孔径为36μm(图3B)。脱细胞耳软骨降解速度相对较快，经过4个月的体外降解，脱细胞耳软骨和脱细胞肋软骨的分别剩余质量百分数为41.3％和53.8％(图3C)。

1.3组织学染色分析

在组织切片染色结果中(图4)，HE染色显示，与对照组软骨相比，两种脱细胞软骨材料中均未见明显的细胞核，保留大量的软骨陷窝结构，细胞外基质结构保存完好，未见明显破坏。Masson染色显示，两种脱细胞软骨材料中均分布大量的胶原纤维，脱细胞肋软骨组蓝染区域颜色相对较淡。阿利新蓝染色显示两种脱细胞软骨材料中均分布大量的淡蓝色区域，比未脱细胞处理的软骨染色浅。对照组的猪肋软骨与人肋软骨在细胞分布和细胞外基质成分方面相似，细胞外基质丰富，而对照组的猪耳软骨细胞数量更多，分布更广泛。

1.4材料大体和电镜分析

经过冻干脱水处理后，如图5(A、D)所示，脱细胞耳软骨和脱细胞肋软骨质硬，根据切割尺寸不同，大致呈圆形，直径在3-10mm之间，脱细胞耳软骨厚度在0.3-0.6mm之间，脱细胞肋软骨厚度在0.09-0.3mm之间，两种脱细胞软骨材料表面可见微孔结构。扫描电镜可见两种脱细胞软骨材料结构连续完整，无明显断裂破坏，材料表面粗糙，可见大量的软骨陷窝结构，纵切面显示材料内部结构比表面更加疏松多孔，孔隙相互连通，脱细胞耳软骨比脱细胞肋软骨有更大的孔径和更多的微孔，如图5(B和C，E和F)所示。

2.脱细胞软骨的生物相容性分析

CCK-8结果显示，在肋软骨细胞与脱细胞软骨材料共培养组，脱细胞软骨材料对细胞增殖未见明显影响。在细胞培养第9天，软骨细胞的增殖达到高峰，其中，脱细胞耳软骨组增殖率比脱细胞肋软骨组和对照组高，差异具有显著性意义(图6A)。进一步用活死细胞染色分析细胞存活情况，三个组的细胞存活率均超过90％，组间无明显差异(图6B)。荧光染色显示大量软骨细胞存活于脱细胞软骨材料表面，可见少量淡红色的凋亡软骨细胞(图6C)。

3.脱细胞软骨对巨噬细胞的极化作用影响

如图7显示，M0型巨噬细胞的细胞表面标记物CD80,CD86,CD163和CD209均为阴性，未向M1或M2方向分化。经过LPS+IFN-γ诱导激活后，M1型表面标记物CD80和CD86表达明显增高，大量表达炎症因子TNF-α和IL-1β。在两个脱细胞软骨材料组，细胞表面标记物CD80和CD86表达明显降低，炎症因子TNF-α和IL-1β分泌明显减少，均与M1组有显著性差异，其中，脱细胞耳软骨组表达量下降更为明显。与空白组M0相比，两个脱细胞软骨材料组的部分巨噬细胞向M1极化，细胞表面标记物和炎症因子表达增高，有统计学意义。M2组的M0向M2型巨噬细胞极化，表面标记物CD163和CD209表达明显增高，抗炎因子TGF-β和IL-10分泌增多。在两个脱细胞软骨材料组，细胞表面标记物CD163和CD209表达相对降低，TGF-β和IL-10分泌减少，均与M2组有显著性差异，并且，脱细胞耳软骨组表达量下降更为明显。与空白组M0相比，两个脱细胞软骨材料组的细胞表面标记物表达增高，有统计学意义，但抗炎因子TGF-β和IL-10分泌差异不明显。进一步通过CCK-8实验检测，两种脱细胞软骨材料对巨噬细胞无明显抑制增殖的影响。

4.脱细胞软骨对缺损区域的组织再生分析

4.1新生组织的形态学评估

在无脱细胞软骨材料填充的Control组，CT重建图像显示在肋软骨缺损区域仅存在少量新生组织，形态不规则，近似成骨样密度，散在分布，并且，缺损区域的肋骨断端轻微向胸骨中线内移(图8A)。两个脱细胞软骨材料填充组之间CT图像无明显差异，三维重建图像显示在肋软骨采取区域分布大量新生组织，形状不规则，大致呈圆柱形(图8D，G)。术中探查结果与CT重建图像基本一致。Control组的肋软骨缺损区域比对侧明显凹陷，散在分布少量不规则组织块(图8B，C)。两个脱细胞软骨材料填充组的新生组织形态近似，脱细胞软骨填充区域仍可触及凹陷，但是凹陷程度较空白组明显改善(图8E，H)。新生组织长度约2-3cm，卷曲形状，白色，质软，部分标本中间可见红色髓样结构(图8F，I)，在少量组织标本和周围组织中可见残留的少量脱细胞软骨片。

4.2新生组织的组织学染色分析

组织学切片染色显示，Control组再生结构主要由纤维组织构成，可见大量梭型成纤维细胞。两种脱细胞软骨填充组表现为混合的新生组织，包括典型的软骨陷窝结构、特异性的软骨细胞外基质、钙化结节和纤维组织(图9)。脱细胞耳软骨组的图像可见更多的软骨细胞与软骨陷窝结构，分泌细胞外基质更丰富。与脱细胞耳软骨组相比，脱细胞肋软骨组可见较多的钙化结节和骨小梁结构。

4.3新生组织表达基因分析

与Control组相比，两个脱细胞材料填充组的软骨基因Sox9、Acan、和Col2α1表达均明显增高，差异有统计学意义(图10A-C)。在成骨基因Runx2方面，两个脱细胞软骨组基因表达较对照组均明显增高。而成纤维基因Col1α1在空白组相对于脱细胞耳软骨材料组和脱细胞肋软骨材料组表达均明显增加，差异有统计学意义。

结果分析：

目前，异种或异体材料移植首先要解决受体的免疫排斥反应，这也是应用生物来源材料的基本要求。材料内部的细胞成分和α-Gal抗原可能引起超急性免疫排斥反应和慢性免疫毒性反应。在本发明中，经过脱细胞处理后，两种脱细胞软骨的残余DNA含量均小于40ng/mg，达到了脱细胞的基本要求，80％的α-Gal抗原得到有效去除，明显降低了后期植入体内的免疫排斥风险。然而，脱细胞工艺在脱去细胞DNA成分的同时，也对细胞外基质成分产生破坏，不可避免的脱去了部分基质成分。经过脱细胞处理后，Elisa和马松染色分析显示，细胞外基质中的胶原纤维成分大部分得到保留。胶原纤维是软骨细胞外基质中重要的结构成分，在肋软骨缺损修复过程中，能诱导细胞迁移分化和组织再生，并提供机械支撑作用。已有研究指出，脱细胞过程中会明显导致糖胺聚糖(GAG)被洗脱，经过本发明相对温和的脱细胞处理后，Elisa结果显示脱细胞软骨材料保留了约50％的GAG，阿利新蓝染色为淡蓝色。软骨细胞外基质中的GAG具有促进软骨分化以及软骨内骨化的作用。因此，在脱细胞软骨的制备过程中，要充分考虑不同脱细胞方法对细胞外基质的破坏作用，寻找更加温和有效的脱细胞技术是制备脱细胞材料的重要方面。

扫描电镜显示脱细胞软骨表面和内部均为疏松多孔的结构，相对于脱细胞肋软骨材料，脱细胞耳软骨材料的孔径和孔隙率更大，微孔数量更多，可能会更加促进细胞迁移分化，影响局部组织分化和免疫反应。细胞外基质的完整结构和特殊内部微环境为细胞迁移和组织重建提供了场所，而其降解速度也明显影响组织重建的进程。经过4个月的体外降解，剩余脱细胞耳软骨和脱细胞肋软骨质量分数分别为41.3％和53.8％。相对较慢的降解速度使脱细胞软骨材料能在缺损处提供持久的机械支撑，以减少局部变形，并且为容纳细胞迁移和组织替代重塑提供长期的稳定环境。由于受到局部免疫吞噬反应、炎症因子等多种因素影响，脱细胞软骨材料在体内分解速度明显加快，逐渐被周围新生组织替代。经过4个月的动物体内实验，仅能在少数标本和周围组织中发现少量残余脱细胞软骨材料。

常规的脱细胞材料制备流程中，涉及物理法、化学法和酶法。其中残余的化学试剂和酶具有细胞毒性，影响该材料的临床应用。本发明中应用了更加温和的脱细胞处理方法，如用含有EDTA的胰酶连续处理72小时，配合使用超声波清洗震荡设备，反复进行冲洗材料，以减少遗留试剂的细胞毒性。活死细胞荧光染色显示，两种脱细胞软骨组和空白组均未见明显的死细胞。进一步的CCK-8实验结果指出，脱细胞软骨材料没有抑制细胞增殖，反而在部分时间点细胞增殖超过了空白对照组，该现象可能是由于细胞外基质缓慢释放的细胞因子具有促进软骨细胞增殖的作用，如TGF-β和IGF-1。其中，脱细胞耳软骨组的细胞增殖率更高，可能是由于该材料拥有更大的孔径和微孔数量，促进了软骨细胞的粘附和增殖。

手术创伤、填充异种移植物都会引起局部的免疫反应，在炎症反应早期，植入材料吸引局部巨噬细胞和中性粒细胞聚集，进而分泌IL-8等多种趋化因子，趋化更多炎症细胞(树突状细胞、淋巴细胞)聚集激活，随着炎症消退和组织修复重建开始，局部反应以巨噬细胞为主，凋亡细胞、组织碎片逐渐被吞噬处理，因此，巨噬细胞在调节局部免疫反应和异体材料修复重建中有重要作用。巨噬细胞能够被招募到炎症部位，受到各种细胞因子的影响，从M0型巨噬细胞极化为促进炎症反应的M1型巨噬细胞或抑制炎症的M2型巨噬细胞。M1型巨噬细胞能够继续引起局部炎症反应，释放各类炎症因子调控细胞增殖、分化和细胞凋亡。M1型巨噬细胞可能会抑制组织修复，引起异体材料的排斥反应。而M2型巨噬细胞具有抑制炎症反应的作用，能够吞噬局部坏死组织碎片，释放抑制性炎症因子，促进局部伤口愈合。目前研究发现，对于可降解的生物材料，M1型巨噬细胞在早期促进材料降解，M2型巨噬细胞在后期促进材料与组织融合、再生，但此过程受到不同材料的影响可能会产生明显相反的作用。因此，评估两种脱细胞软骨材料对巨噬细胞的极化反应，选择局部炎症反应轻的填充材料，对于组织修复和再生有重要意义。

巨噬细胞是由单核细胞经各种细胞因子刺激分化而来，目前常用佛波酯(PMA)刺激人单核细胞系THP-1定向分化获得体外巨噬细胞模型。本发明应用巨噬细胞和脱细胞软骨共培养的模式评估体外环境下的极化反应。经过诱导，THP-1细胞向M0型巨噬细胞分化，再通过LPS+IFN-γ或IL-4+IL-13的药物处理，M0型巨噬细胞分别向M1型或M2型巨噬细胞分化。在脱细胞软骨共培养组，两种脱细胞软骨材料均明显抑制M0型向M1型巨噬细胞的分化，细胞表面标记物CD80和CD86表达明显降低，炎症因子TNF-α和IL-1β分泌明显减少。另外，两种脱细胞软骨材料也表现出抑制M0型向M2型巨噬细胞的分化作用。并且通过CCK-8实验排除了脱细胞软骨材料抑制巨噬细胞增殖的可能性。因此，脱细胞软骨材料能够抑制巨噬细胞的极化反应，尤其是在抑制M1型巨噬细胞激活方面，其中的生理机制尚不明确，需要进一步深入分析，可能是涉及到免疫反应中JNK通路的抑制作用和STAT6/PPAR-γ通路的激活，有待进一步的分子机制研究。移植材料自身释放的活性分子以及移植部位存在的信号分子能够从细胞募集和分化等多个方面对巨噬细胞极化进行调节，如研究指出细胞外基质中的II型胶原具有调控M1型巨噬细胞，从而抑制炎症反应的作用。材料负载调控炎症反应的Micro-RNAs能抑制巨噬细胞激活，促进局部组织再生修复。另外，对巨噬细胞极化反应的调节作用也指出，脱细胞软骨基质中引起炎症反应的细胞成分被有效去除。两种脱细胞软骨材料中，脱细胞耳软骨对M1和M2型巨噬细胞的抑制作用更强，可能是由于其孔径、微孔数量和某些特殊细胞外基质成分造成。研究指出，材料自身的理化性质能够调节巨噬细胞的极化，同时，巨噬细胞对植入物的机械性能也会产生反应，小孔、柔软材料可能促进巨噬细胞向促炎类型分化，而大孔、质硬、纤维直径粗的材料促进巨噬细胞向抗炎类型分化。

肋软骨缺损后形成局部的空腔结构，在术后被肋间肌、血凝块和软骨膜等组织填充。并且，再生修复过程中该部位持续受到肌肉和骨骼的牵拉影响，进一步增加了组织修复的难度和不确定性。因此，需要将脱细胞软骨材料回植入软骨缺损部位，评估其对局部胸廓形态和组织修复再生的影响。肋软骨CT重建能够在术前评估局部胸廓形态和组织再生情况，提供直观图像认识，指导后续术中探查取材。本发明中，解剖探查结果与CT重建结果一致，在材料回植部位可见大量散在的新生组织，沿原肋软骨区域分布，患侧缺陷位置凹陷情况明显减轻，说明两种脱细胞软骨材料填充组均能促进组织再生，改善局部胸廓凹陷畸形。

在软骨缺损部位填充后，脱细胞软骨材料与周围组织融合，其新生组织的构成受到多种因素影响，如脱细胞软骨基质的自体成分、周围环境的细胞因子、肌肉和软骨膜等。组织学染色和PCR结果指出，空白组的再生组织主要是由纤维组织构成，未见明显的软骨细胞和软骨特异性基质。在脱细胞软骨材料填充组，可见软骨成分形态，以及软骨相关基因的高表达，同时，也发现大量非软骨成分，如纤维组织和成骨组织。其中，软骨细胞可能来源于周围的间充质干细胞或软骨膜增殖层内的软骨前体细胞。成骨方面，在脱细胞软骨材料填充组可见钙化结节和骨小梁结构，伴随成骨基因Runx2的相对高表达，尤其是在脱细胞肋软骨组，可能是由于肋软骨自身容易钙化的材料属性以及肋软骨缺损区域的微环境共同造成。因此，在各种炎症因子和各种信号分子的影响下，脱细胞软骨材料作为支架结构，吸引各类细胞、周围组织进行融合重建，再生组织结构复杂，由软骨、成骨、纤维结缔组织等多种成分构成。

目前大部分软骨再生的组织工程实验涉及到材料表面种植软骨细胞，经过体外培养1-2个月后再移植入动物皮下。通过这一方法能够获得成熟稳定的软骨结构，但也存在一定的局限性，如软骨细胞来源有限、软骨细胞纤维化、长时间和高要求的实验过程。在本发明中，无任何细胞负载的脱细胞软骨材料能够在肋软骨取出时，即刻填充在缺损区域，极大的缩减了准备时间，也减少了额外的手术操作。并且，猪来源的耳软骨比肋软骨取材更加简易，量大充足，更方便进行工厂化的生产制作，产品成本低，便于后续临床手术的广泛应用。

所以，本发明的脱细胞软骨材料基本保留了细胞外基质的结构和功能，为细胞增殖和组织再生提供了稳定的环境，其中脱细胞耳软骨较脱细胞肋软骨在各方面有更好的应用性，有望进行深入研究，探究其进一步应用于软骨修复和组织再生的临床研究。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行。

Claims (10)

1.一种来自猪耳软骨的脱细胞软骨材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)从猪的耳软骨上提取耳软骨材料；(2)耳软骨材料初步处理；(3)病毒灭活；(4)一次清洗；(5)脱细胞；(6)二次清洗；(7)注射水清洗；(8)灭菌；

其中步骤(1)具体为：将猪全麻后，剃除术区毛发，用碘酊消毒、酒精脱碘，铺无菌巾；局部浸润麻醉后，沿耳廓软骨底部将耳廓完整切除，局部止血后，游离局部皮肤，直接拉拢缝合断段，外敷抗生素软膏，继续处理切下的耳廓组织，沿耳廓中部切开，沿切口向两侧剥离，将皮肤、皮下组织和软骨膜完全去除，只保留耳软骨，置于生理盐水中备用。

2.根据权利要求1所述一种来自猪耳软骨的脱细胞软骨材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)具体为：将步骤(1)获取的耳软骨材料去除软骨膜和结缔组织，切割成合适尺寸，用纯化水冲洗至表面无污渍。

3.根据权利要求1所述一种来自猪耳软骨的脱细胞软骨材料的制备方法，其特征在于，步骤(3)具体为：采用过氧乙酸和乙醇的混合溶液处理，耳软骨材料置于混合溶液中，耳软骨材料和混合溶液体积比例为1:20，灭活时间4小时，灭活温度20℃。

4.根据权利要求3所述一种来自猪耳软骨的脱细胞软骨材料的制备方法，其特征在于，所述过氧乙酸和乙醇的混合溶液中，过氧乙酸和乙醇的体积比为1:24。

5.根据权利要求1所述一种来自猪耳软骨的脱细胞软骨材料的制备方法，其特征在于，步骤(4)和步骤(6)操作相同，具体为：采用pH在6-8之间的磷酸盐缓冲溶液清洗，温度10-30℃，磷酸盐缓冲溶液与耳软骨材料体积比例为30:1，每次15分钟，清洗至少3次，直至检测冲洗后的冲洗液pH在6-8之间，然后采用纯化水清洗，温度范围为10-30℃，纯化水与耳软骨材料体积比例为30:1，每次15分钟，清洗1次；步骤(7)具体为：采用注射用水清洗4次，每次15分钟，注射用水与耳软骨材料体积比例为30：1，温度范围为10-30℃；步骤(8)具体为：采用钴60辐射灭菌，然后置于灭菌小瓶封存。

6.根据权利要求5所述一种来自猪耳软骨的脱细胞软骨材料的制备方法，其特征在于，各个清洗步骤使用超声波清洗机进行清洗，功率3000W以上，频率40kHz。

7.根据权利要求1至6任一项所述一种来自猪耳软骨的脱细胞软骨材料的制备方法，其特征在于，步骤(5)具体为：采用含有胰蛋白酶和乙二胺四乙酸二钠的磷酸盐缓冲溶液为脱细胞溶液，将耳软骨材料加入到脱细胞溶液中，并放入摇床内，脱细胞溶液与耳软骨材料体积比例为20:1，摇床设定为转速为150r/min，持续作用72小时，温度37℃，每24小时更换脱细胞溶液。

8.根据权利要求7所述一种来自猪耳软骨的脱细胞软骨材料的制备方法，其特征在于，所述脱细胞溶液为含有胰蛋白酶2.5g/L和乙二胺四乙酸二钠0.5mM的磷酸盐缓冲溶液，pH在6-8之间。

9.一种采用权利要求1至8任一项所述的制备方法制备出的来自猪耳软骨的脱细胞软骨材料。

10.一种如权利要求9所述来自猪耳软骨的脱细胞软骨材料的应用，其特征在于，用于肋软骨缺损修复。

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