CN105435306A - 生物纳米补片的制备法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种经黄芪甲苷诱导BMSC复合聚乳酸-羟基乙酸纳米颗粒修饰的小肠粘膜下层基质构建生物纳米补片的制备方法，先采用复乳法制备出聚乳酸-羟基乙酸纳米颗粒(PLGA)；采用脱细胞技术，制备具有天然三维超微结构的小肠粘膜下层基质(SIS)，使PLGA纳米颗粒粘附于SIS表面，经PLGA纳米颗粒表面修饰后的SIS，将更加有利于宿主细胞的粘附和生长；通过黄芪甲苷诱导BMSC，促进其增殖分化，并使之复合生长于PLGA纳米颗粒表面修饰的猪小肠粘膜下层基质(PLGA-SIS)，从而得到理化性质稳定、生物相容性好、力学强度高、并且利于组织再生的AS-BMSC-PLGA-SIS生物补片。
Description
技术领域
本发明属于生物和医药技术领域，涉及材料化学，具体为通过脱细胞技术，合成具有良好生物相容性的黄芪甲苷诱导BMSC复合聚乳酸-羟基乙酸纳米颗粒修饰小肠粘膜下层基质构建的生物纳米补片(AS-BMSC-PLGA-SIS)，本发明还涉及该生物纳米补片在医学方面的用途。
背景技术
腹壁疝，创伤、肿瘤、感染造成的腹壁缺损，是外科常见的病症，其治疗是外科临床棘手的难题之一。临床手术所使用的人工修补材料主要还是依赖进口，价格昂贵。腹壁修复重建材料目前使用最多的，是不可降解的聚合体材料，不可吸收的聚合体材料植入体内后，会导致过量的瘢痕形成。这种长期的、过量的炎症过程将导致手术后的一些并发症发生，这些并发症会影响患者的生活质量，严重者甚至可以威胁患者生命。近年来生物补片在腹壁疝、腹壁缺损修补中的应用，已经成为研究的热点，但是到目前为止国际上还未找到一种完全理想的修复材料。
寻找一种理化性质稳定、生物相容性好、力学强度高、并且利于组织再生的修复重建材料，是治疗腹壁疝和缺损的关键。因此，开发研制新型腹壁修复重建材料，对于我国腹壁疝和腹壁缺损的治疗具有重要的意义，拥有广阔的应用前景。
目前现有的生物补片包括小肠粘膜下层基质(smallintestinalsubmucosa，SIS)、人工脱细胞真皮基质(acellulardermalmatrix，ADM)等的制备方法为：采用脱细胞技术，去除能引起宿主免疫排斥反应的所有细胞成分，完整保留细胞外基质和立体网状支架结构。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种黄芪甲苷诱导BMSC复合聚乳酸-羟基乙酸纳米颗粒修饰的小肠粘膜下层基质构建的生物纳米补片(AS-BMSC-PLGA-SIS)的制备方法，采用该方法制得的AS-BMSC-PLGA-SIS生物补片能用于治疗腹壁疝和缺损，能够减少腹腔黏连和炎症，促进纤维性结缔组织和间皮细胞生长，促进伤口血管生成和胶原蛋白合成，从而加快腹壁缺损的愈合。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种生物纳米补片(AS-BMSC-PLGA-SIS)的制备方法：采用复乳法制备得到核心粒径为150～200nm的PLGA纳米颗粒(poly(lactic-co-glycolicacid)，其表征具有良好生物相容性和生物降解性)；采用脱细胞技术，制备得到SIS(smallintestinalsubmucosa，其具有天然三维超微结构)，使PLGA纳米颗粒粘附于SIS表面，得PLGA-SIS(PLGA纳米颗粒表面修饰的猪小肠粘膜下层基质)；通过黄芪甲苷诱导BMSC，促进其增殖分化，并使之复合生长于PLGA-SIS；得生物纳米补片AS-BMSC-PLGA-SIS；
所述PLGA纳米颗粒为聚乳酸-羟基乙酸纳米颗粒；
所述SIS是小肠粘膜下层基质。
备注说明：经上述PLGANP表面修饰后的SIS，将更加有利于宿主细胞的粘附和生长。
作为本发明的生物纳米补片的制备方法的改进，依次进行以下步骤：
1)、室温下，取PLGA溶于有机溶剂Ⅰ中，得到有机溶液(为无色透明液体)，所述PLGA与有机溶剂Ⅰ的质量体积比为1g：80～160ml；
泊罗沙姆188搅拌下溶于去离子水中，得到水溶液(为无色透明液体)，泊罗沙姆188与去离子水的质量体积比为1g：90～110ml(较佳为1g：100ml)；
所述PLGA为聚乳酸-羟基乙酸共聚物(即poly(lactic-co-glycolicacid))；
备注说明：该PLGA优选LA/GA＝50/50；
所述有机溶剂Ⅰ为丙酮：乙醇＝2.5～3.5:1的体积比(较佳为3:1)；
2)、室温下，将有机溶液于搅拌下滴加(30～60分钟滴加完毕)到水溶液中，所述PLGA与泊罗沙姆188的质量比为1:3.5～4.5(较佳为1：4)；
滴加完毕后，继续搅拌30～60min(目的是蒸发掉大部分有机溶剂)，得到带乳光的纳米悬浊液；
3)、将带乳光的纳米悬浊液于37～40℃用旋转蒸发仪旋蒸90～120min(目的是去除残余的有机溶剂和部分水)，得到高分子胶体悬浮液；4000～6000rpm/s高速离心25～35min(例如为5000rpm/s高速离心30min)弃去沉淀，得到PLGA纳米乳液；
备注说明：该PLGA纳米乳液中PLGA的粒径为150～200nm；
备注说明：上述步骤中未进行透析，原因是离心过程泊洛沙姆188已被充分去除；
4)、将猪小肠制成小肠粘膜下层基质(即，将猪小肠剪成10cm小段，剪开平铺，将小肠内层粘膜、外层浆膜及肌肉层剥去，得到小肠粘膜下层基质；此为常规技术)；
5)、将小肠粘膜下层基质先用有机溶剂Ⅱ进行浸泡10～14h(用量比为1g/5ml，浸泡时间较佳为12h)，再用去离子水冲洗；有机溶剂Ⅱ为甲醇：氯仿＝1:0.9～1.1体积比(较佳为1:1)混合而得；
6)、将步骤5)所得的小肠粘膜下层基质经消化后，用去生理盐水冲洗(例如冲洗3次，每次30分钟)；
7)、将步骤6)所得的小肠粘膜下层基质先浸泡在质量浓度为0.5％的十二烷基磺酸钠(SDS)溶液中(1g/4～6ml的用量比)，振摇3～4h，去离子水洗净；
然后再用体积浓度为0.1％的过氧乙酸溶液浸泡20～40min(1g/4～6ml的用量比)后，去离子水洗净；
所述体积浓度为0.1％的过氧乙酸溶液的配制方法为：利用体积浓度为20％的乙醇水溶液作为稀释剂对过氧乙酸进行稀释，从而使最终所得的过氧乙酸溶液中过氧乙酸的体积浓度为0.1％；
最后干燥(用低温真空干燥机进行干燥)，密封后钴-60辐射灭菌；
8)、无菌环境下，将步骤7)所得的小肠粘膜下层基质(SIS)放入DMEM高糖培养液中浸泡(用量比约为0.5g/3ml)22～26h(较佳为24h)后，吸除小肠粘膜下层基质(SIS)表面多余的DMEM高糖培养液；加入由PLGA纳米乳液和DMEM高糖培养液组成的混合液浸泡(用量比约为0.5g/3ml)12～24h后，再次吸除小肠粘膜下层基质(SIS)表面的多余的混合液，得到PLGA-SIS；
所述混合液中，PLGA纳米乳液和DMEM高糖培养液的体积比为1:1.8～2.2(较佳为v：v＝1：2)；
9)、将第三代BMSC细胞(大鼠BMSC细胞)经消化离心后，用DMEM高糖培养液稀释至BMSC细胞的浓度为1.8～2.2×105cell/ml(较佳为2×105cell/ml)，得BMSC细胞悬液；
将BMSC细胞悬液滴加在步骤8)所得的PLGA-SIS于37℃、5％CO2培养箱中静置培养22～26h(较佳为24h)后，加入DMEM高糖培养液继续于37℃、5％CO2培养66～78h(较佳为72h)，中间(即，继续培养至一半时间时)更换一次DMEM高糖培养液；
备注说明：每0.5g的小肠粘膜下层基质(SIS)所得的PLGA-SIS配用1.8～2.2ml(较佳为2ml)的BMSC细胞悬液、4.5～5.5ml(较佳为5ml)的DMEM高糖培养液；
10)、将黄芪甲苷溶于DMEM高糖培养液中，从而配制成浓度为黄芪甲苷浓度为150～170μmol/L(较佳为160μmol/L)的含黄芪甲苷的DMEM高糖培养液；
将步骤9)的所得物用上述含黄芪甲苷的DMEM高糖培养液进行培养液的更换，利用所述含黄芪甲苷的DMEM高糖培养液对BMSC细胞于37℃，5％CO2的条件下干预22～26h(较佳为24h)后，得到生物纳米补片(AS-BMSC-PLGA-SIS)。
备注说明：每0.5g的小肠粘膜下层基质(SIS)所得的PLGA-SIS配用5～7ml(较佳为6ml)含黄芪甲苷的DMEM高糖培养液。
作为本发明的生物纳米补片的制备方法的进一步改进：
所述步骤6)中的消化为：将步骤5)所得的小肠粘膜下层基质浸泡(用量比为10g/50ml)在0.02％EDTA-0.25％胰酶溶液的稀释液中，于36.5～37.5℃恒温摇床内消化11.5～12.5h(较佳为37℃，12h)；
所述0.02％EDTA-0.25％胰酶溶液的稀释液为将0.02％EDTA-0.25％胰酶溶液(Trypsin-EDTASolution,0.25％:0.02％)与磷酸盐缓冲液(PBS)按照V:V＝1:4混合后而得；
备注说明：上述0.02％EDTA-0.25％中，％为质量体积％，即g/100ml。
上述步骤5)所得的小肠粘膜下层基质与0.02％EDTA-0.25％胰酶溶液的稀释液的用量比为1g/4～6ml；
EDTA为乙二胺四乙酸，胰酶为胰蛋白酶；
所述步骤9)中的消化为：将第三代BMSC细胞浸泡在0.02％EDTA-0.25％胰酶溶液中，于36.5～37.5℃恒温摇床内消化11.5～12.5h(较佳为37℃，12h)。
作为本发明的生物纳米补片的制备方法的进一步改进：
所述DMEM高糖培养液为GibcoDMEM高糖培养基(货号11965-092)。
作为本发明的生物纳米补片的制备方法的进一步改进：
所述步骤5)中，
有机溶剂Ⅱ为甲醇：氯仿＝1:1体积比(V:V)混合而得，每1g粘膜下层基质配用4～6ml的有机溶剂Ⅱ，浸泡时间为10～14小时(例如为12h)。
备注说明：用去离子水冲洗的次数为3次，每次25～35分钟。
作为本发明的生物纳米补片的制备方法的进一步改进：
步骤1)和步骤2)均在2～4cm转子，400～800rpm/s搅拌条件下进行。
作为本发明的生物纳米补片的制备方法的进一步改进：
步骤7)中的干燥为低温真空干燥：于5～100的真空度、-60～-40℃的温度下干燥120～240分钟；
步骤7)中的钴-60辐射灭菌为20～30kGy(1百万特拉)。
本发明还同时提供了上述方法制备的生物纳米补片(AS-BMSC-PLGA-SIS)的用途，其特征是：用于制备治疗腹壁缺损的修复材料。
备注说明：0.02％EDTA-0.25％胰酶溶液，即胰蛋白酶-EDTA溶液(Trypsin-EDTASolution,0.25％:0.2％)，例如可购自南京森贝伽。
在本发明中使用了光学显微镜(TEM)、纳米激光粒度仪(DLS)、拉伸测试系统(tensiletestsystem)和扫描电子显微镜(SEM)等仪器。
本发明是一种经黄芪甲苷诱导BMSC复合聚乳酸-羟基乙酸纳米颗粒修饰的小肠粘膜下层基质构建生物纳米补片的制备方法，本发明是采用复乳法制备出表征具有良好生物相容性和生物降解性、核心粒径为150～200nm的聚乳酸-羟基乙酸纳米颗粒(poly(lactic-co-glycolicacid)，PLGA)；采用脱细胞技术，制备具有天然三维超微结构的小肠粘膜下层基质(smallintestinalsubmucosa,SIS)，使PLGA纳米颗粒粘附于SIS表面，经PLGA纳米颗粒表面修饰后的SIS，将更加有利于宿主细胞的粘附和生长；通过黄芪甲苷诱导BMSC，促进其增殖分化，并使之复合生长于PLGA纳米颗粒表面修饰的猪小肠粘膜下层基质(PLGA-SIS)，从而得到理化性质稳定、生物相容性好、力学强度高、并且利于组织再生的AS-BMSC-PLGA-SIS生物补片。
采用本发明方法制得的AS-BMSC-PLGA-SIS生物补片通过光学显微镜、透射电子显微镜(TEM)、纳米激光粒度仪(DLS)、拉伸测试系统(tensiletestsystem)和扫描电子显微镜(SEM)等表征方法对其结构和形貌进行了表征，所得结果分别如图1～图7所示。具体结果如下：
光学显微镜下表明正常培养下BMSC成梭形，漩涡状；TEM扫描提示PLGA纳米颗粒为白色球体，稍有成团，纳米颗粒总体大小均匀，在水溶液中分散性良好；纳米激光粒度仪分析结果提示PLGA纳米颗粒直径约为150-200nm，尺寸分布集中。拉伸测试系统(tensiletestsystem)提示SIS在湿润条件下有较好的承重力，一块2×8cm2的SIS承重力约为4～6N。SEM图谱可以看出SIS两面结构不同，光滑面由致密的成熟纤维组织构成，粗糙面纤维断裂分散，无序，均不含细胞，光滑面三维培养中几乎没有PLGA纳米颗粒，细胞亦难以吸附生长，粗糙面由于纤维的杂乱，便于PLGA纳米颗粒贴附和细胞生长，且细胞嵌入支架材料生长，生长状态良好。
本发明的发明点在于：不止是单纯的生物补片，SIS生物补片表面附着PLGA纳米颗粒增大了比表面积，增加附着细胞数目，在使用前培养附着干细胞，可以加快细胞生长，适当浓度黄芪甲苷干预提高了细胞增殖速率，进一步加快愈合速度。
该AS-BMSC-PLGA-SIS生物补片在动物腹壁缺损实验中证实具有良好的生物兼容性、稳定性和组织再生性。通过AS-BMSC-PLGA-SIS生物补片在动物实验结果中表明，AS-BMSC-PLGA-SIS生物补片可以降低免疫原性，增强其生物相容性，并促进宿主细胞的附着生长从而加快伤口愈合。
本发明具有以下特点：1、脱细胞技术制备的AS-BMSC-PLGA-SIS生物补片具有很好的生物相容性、抗粘连和抗感染性；2、在大鼠腹壁缺损实验实验中证实制备的AS-BMSC-PLGA-SIS生物补片具有良好的生物相容性、抗粘连和抗感染性；3、制备的AS-BMSC-PLGA-SIS生物补片对大鼠腹壁缺损修复有良好的促进表现。
综上所述，本发明的AS-BMSC-PLGA-SIS生物补片在腹壁缺损修补，为临床上创伤、肿瘤、感染造成的腹壁缺损提供便宜、安全稳定的修复材料。开发研制新型腹壁修复重建材料，对于我国腹壁疝和腹壁缺损的治疗具有重要的意义，拥有广阔的应用前景。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是PLGA纳米颗粒的透射电子显微镜。
图2是PLGA纳米颗粒的纳米激光粒度仪照片，光均粒径163nm。
图3是SIS照片。
图4是SIS的力学强度照片；
注：图4中曲线A-D依次表示1层，2层，4层及8层SIS在湿润情况下的力学强度曲线。
图5是SIS(A)和SIS-PLGA(B)纳米颗粒的扫描电镜照片(其中A、B、E和F为粗糙面，C、D、G和H为光滑面)；
A为SIS(A)的于1000倍放大条件下的粗糙面；
B为SIS(A)的于6000倍放大条件下的粗糙面；
C为SIS(A)的于4000倍放大条件下的光滑面；
D为SIS(A)的于10000倍放大条件下的光滑裂面；
E为SIS-PLGA(B)的于1000倍放大条件下的粗糙面；
F为SIS-PLGA(B)的于4000倍放大条件下的粗糙面；
G为SIS-PLGA(B)的于10000倍放大条件下的光滑面；
H为SIS-PLGA(B)的于10000倍放大条件下的光滑面。
图6是BMSC的光学显微镜照片。
图7是BMSC细胞多样性鉴定结果。
图8是不同补片对BMSC影响的照片；
注：1-5分别表示正常组、BMSC-SIS支架组、BMSC-PLGA-SIS支架组、黄芪甲苷最佳浓度处理组和AS-BMSC-PLGA-SIS支架组。
图9补片覆盖区域腹壁组织HE染色。
图10补片覆盖区域腹壁组织Masson染色。
图11腹壁组织电镜分析图。
图12IHC检测缺损部位I型胶原、Ⅲ型胶原蛋白的表达情况。
图13CD31免疫组化。
图14不同组别CD31阳性表达的微血管数量情况分布图；
1-1,2-1,3-1,4-1,5-1分别表示第一周的正常组、腹壁缺损模型组、聚丙烯补片修复组、BMSC-PLGA-SIS修复组及AS-BMSC-PLGA-SIS修复组；以此类推1-4,2-4,3-4,4-4,5-4表示第四周的上述组1-8,2-8,3-8,4-8,5-8表示第八周的上述组。注：*P<0.05、**P<0.01(ANVOA)。
图15Real-timePCR检测结果；
注：横坐标1,4,8分别表示第一周，第四周和第八周，图例1-5分别表示正常组、腹壁缺损模型组、聚丙烯补片修复组、BMSC-PLGA-SIS修复组及AS-BMSC-PLGA-SIS修复组五组。
图16WesternBlot五组三个时间段6种蛋白表达情况；
注：1W，4W,8W分别表示第一周，第四周和第八周，1-5分别表示正常组、腹壁缺损模型组、聚丙烯补片修复组、BMSC-PLGA-SIS修复组及AS-BMSC-PLGA-SIS组五组。
具体实施方式
以下结合实施例进一步说明本发明。
实施例1、一种聚乳酸-羟基乙酸纳米乳液(PLGA)制备方法，依次进行以下步骤：
1)、室温下，取0.1gPLGA溶于16ml丙酮：乙醇(V/V)＝3:1的有机相(有机溶剂Ⅰ)中得到有机溶液(无色透明液体)；0.4g泊罗沙姆188在4cm磁子，800rpm/s搅拌下溶于40ml去离子水中，得到水溶液(无色透明液体)。
2)、室温下，将步骤1)所得的有机溶液在4cm磁子，800rpm/s转速下缓慢的滴加(30～60分钟滴加完毕)到水溶液中。滴加完毕后，继续搅拌30min，以蒸发掉大部分有机溶剂，得到带乳光的纳米悬浊液。
3)、将步骤2)所得的带乳光的纳米悬浊液于37℃下用旋转蒸发仪旋蒸120分钟，去除残余的有机溶剂和部分水，得到高分子胶体悬浮液。然后，5000rpm/s高速离心30min弃去沉淀，得到PLGA纳米乳液。
实施例2、一种聚乳酸-羟基乙酸纳米颗粒(PLGA)制备方法，依次进行以下步骤：
1)、室温下，取0.1gPLGA溶于16ml丙酮：乙醇(V/V)＝3:1的有机相(有机溶剂)中得到有机溶液(无色透明液体)；0.4g泊罗沙姆188在2cm磁子，800rpm/s搅拌下溶于40ml去离子水中，得到水溶液(无色透明液体)。
2)、室温下，将步骤1)所得的有机溶液在2cm磁子，800rpm/s搅拌速度下缓慢的滴加(30～60分钟滴加完毕)到水溶液中。滴加完毕后，继续搅拌30min，以蒸发掉大部分有机溶剂，得到带乳光的纳米悬浊液。
3)、将步骤2)所得的带乳光的纳米悬浊液于37℃条件下用旋转蒸发仪旋蒸120min，去除残余的有机溶剂和部分水，得到高分子胶体悬浮液。5000rpm/s高速离心30min弃去沉淀，得到PLGA纳米乳液。
实施例3、一种聚乳酸-羟基乙酸纳米颗粒(PLGA)制备方法，依次进行以下步骤：
1)、室温下，取0.1gPLGA溶于8ml丙酮：乙醇(V/V)＝3:1的有机相中得到有机溶液(无色透明液体)；0.4g泊罗沙姆188于2cm磁子，800rpm/s速度搅拌下溶于40ml去离子水中，得到水溶液(无色透明液体)。
2)、室温下，将步骤1)所得的有机溶液在2cm磁子，800rpm/s搅拌速度下缓慢的滴加(30～60分钟滴加完毕)到水溶液中。滴加完毕后，继续搅拌30min，以蒸发掉大部分有机溶剂，得到带乳光的纳米悬浊液。
3)将步骤2)所得的带乳光的纳米悬浊液在37℃条件下用旋转蒸发仪旋蒸90分钟，去除残余的有机溶剂和部分水，得到高分子胶体悬浮液。5000rpm/s高速离心30min弃去沉淀，得到PLGANP纳米乳液。
实施例4、一种聚乳酸-羟基乙酸纳米颗粒(PLGA)制备方法，依次进行以下步骤：
1)、室温下，取0.1gPLGA溶于8ml丙酮：乙醇(V/V)＝3:1的有机相中得到有机溶液(无色透明液体)；0.4g泊罗沙姆188于2cm磁子，400rpm/s速度搅拌下溶于40ml去离子水中，得到水溶液(无色透明液体)。
2)、室温下，将步骤1)所得的有机溶液在2cm磁子，400rpm/s搅拌速度下缓慢的滴加(30～60分钟滴加完毕)到水溶液中。滴加完毕后，继续搅拌60min，以蒸发掉大部分有机溶剂，得到带乳光的纳米悬浊液。
3)、将步骤2)所得的带乳光的纳米悬浊液在37℃条件下用旋转蒸发仪旋蒸90分钟，去除残余的有机溶剂和部分水，得到高分子胶体悬浮液。5000rpm/s高速离心30min弃去沉淀，得到PLGA纳米乳液。
实施例5、一种猪小肠粘膜下层基质(SIS)的制备处理方法，依次进行以下步骤：
1)、将猪小肠剪成10cm小段，剪开平铺，将小肠内层粘膜、外层浆膜及肌肉层剥去，得到小肠粘膜下层基质；此为常规技术；
2)化学方法处理：
将步骤1)所得的10g小肠粘膜下层基质依次进行如下的处理：
a、用甲醇：氯仿(V:V)＝1:1的混合有机溶剂50ml浸泡12h后，再用足量去离子水冲洗，冲洗3次，每次30分钟。
b、加入0.02％EDTA-0.25％胰酶溶液的稀释液50ml，在37℃恒温摇床内振动(30转/分的振动频率)消化12h后，足量生理盐水冲洗，冲洗3次，每次30分钟；
所述0.02％EDTA-0.25％胰酶溶液的稀释液为将0.02％EDTA-0.25％胰酶溶液(Trypsin-EDTASolution,0.25％:0.02％)与磷酸盐缓冲液(PBS)按照V:V＝1:4混合后而得；
备注说明：上述0.02％EDTA-0.25％中，％为质量体积％，即g/100ml；
EDTA为乙二胺四乙酸，胰酶为胰蛋白酶。
c、用50ml的质量浓度0.5％SDS浸泡，振摇(30转/分的振动频率)4h，足量生理盐水洗净。再用50ml的0.1％过氧乙酸(体积浓度为20％乙醇稀释)浸泡30min后去足量离子水洗净，
最后用低温真空干燥机进行干燥(5～100的真空度、-60～-40℃的温度下干燥120～240分钟)，密封后钴-60辐射灭菌(相应工艺参数为20～30kGy(1百万特拉))保存。
实施例6、大鼠BMSC的制备和鉴定(注：该项技术为常规技术)：
1)、取健康成年SD大鼠(150g左右)，1g/L新洁尔灭浸泡30min后，断颈处死，碘伏消毒，体积分数为75％的酒精消毒，铺无菌单盖住上身。
2)、无菌条件下取双侧股骨、胫骨，除去骨表面附着的软组织，用DMEM浸泡清洗，用弯钳将两端骨骺切除，显露骨髓腔。
3)、用10mL注射器吸取DMEM高糖培养液冲洗骨髓腔，以冲出骨髓；轻轻吹打，制成单细胞悬液；1000r/min离心20min，离心后去上清，用完全培养液重悬，入25cm2培养瓶中，共5ml完全培养液，置37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养，每三天换液。
4)、当细胞达到80％～90％融合时，0.25％胰酶-0.02％EDTA消化传代得到P1代细胞，继续培养，在每次传代中去处杂细胞，得到纯净的P3代细胞。
5)、将得到的细胞用流式细胞仪检测CD44，CD45，CD90的表达，并进行成脂诱导和成骨诱导鉴定。
结果为：流式细胞仪对BMSC细胞表型鉴定结果(图7)显示：CD44，CD45，CD90的阳性率依次为：2.62％，98.8％，98.69％，表明BMSC具有多种分化潜能，在特定条件下能分化为多种组织细胞。随后的成脂诱导和成骨诱导检测验证了BMSC的多能性，成脂诱导后经OilRedO(油红O)染色后光镜下可以看到橙红色油状液体，这是由于成脂肪诱导的过程中，细胞在胞浆中不断有油滴的累积，并不断的增加变大，最后整个细胞的胞浆中都是油滴。成骨诱导后经茜素红染色矿化结节呈现不同的红色，这是成骨诱导的过程是使钙离子能够以钙盐的方式沉淀下来，这就是我们常说的“钙结节”。
备注说明：根据上述鉴定结果表明本发明所得的BMSC的P3代细胞满足无杂细胞，具有多样性，细胞活力旺盛等条件，因此，可用于后续的实验。
实施例7、AS-BMSC-PLGA-SIS制备
1)无菌环境下，取一片灭菌后的SIS(实施例5所得)约0.5g，置于10cm培养皿中用3ml的DMEM高糖培养液浸泡，从而使SIS湿润；
2)浸泡24小时后吸去培养液(DMEM高糖培养液)，无菌滤纸吸去残余的培养液，加入3ml的无菌PLGA纳米乳液(PLGA纳米乳液和DMEM高糖培养液v：v＝1：2)，静置24h，从而使PLGA粘附于SIS表面，轻轻吸干SIS多余液体，即得到PLGA-SIS。
备注说明：PLGA纳米乳液采用实施例4所得。
3)将第三代BMSC细胞浸泡在0.02％EDTA-0.25％胰酶消化(于37℃恒温摇床内消化12h)离心后，用DMEM高糖培养液稀释至BMSC细胞的浓度为2×105cell/ml，得BMSC细胞悬液；
以PLGA-SIS为载体，在其表面滴加2ml的BMSC细胞悬液，轻移至37℃，5％CO2孵箱中培养24h(使细胞贴于PLGA-SIS表面生长)后，加入5ml的DMEM高糖培养液继续培养(培养条件同上)，中间(即，培养至36h时)更换一次培养液。
4)、此时，BMSC在PLGA-SIS表面达50-60％融合，去除残余的培养液；然后加入6ml含最佳浓度(160μmol/L)黄芪甲苷的DMEM高糖培养液于37℃，5％CO2培养24h。得到生物纳米补片(AS-BMSC-PLGA-SIS)。
实施例8：AS-BMSC-PLGA-SIS生物纳米补片的体外实验
1)用DMEM高糖培养基配置0，20，40，80，160，200μmol/L黄芪甲苷溶液，得6种含不同浓度黄芪甲苷的培养基。
2)将BMSC细胞以8×104个种入96孔板，2×105个种入24孔板，(每组重复3次，96孔板分成6组，每孔加入200uL所述培养基；同样，24孔板分成6组，每孔加入1mL所述培养基生长24h)用无血清培养基同步化12h，使绝大多数细胞处于G0期。
3)孵育24h后进行cck-8检测，MSC的增殖(BrdU法)检测，流式细胞仪检测。
4)选择综合条件下对BMSC生长最佳的黄芪甲苷浓度，设定AS-BMSC-PLGA-SIS支架组、黄芪甲苷最佳浓度处理组、BMSC-PLGA-SIS支架组、BMSC-SIS支架组和正常组五组：
AS-BMSC-PLGA-SIS支架组，即，使用上述实施例7所得的；BMSC-PLGA–SIS是相对于实施例7而言取消了黄芪甲苷干预从而获得的；BMSC-SIS支架组即BMSC直接生长于湿润的SIS表面得到的。
5)重复步骤2)-3)，96孔板和24孔板各分为5组，每组重复3次。
结果为：CCK-8检测提示黄芪甲苷160μmol/L以下浓度标记24h，对大鼠BMSC细胞活性影响随浓度升高增强。流式细胞仪检测提示黄芪甲苷100μmol/L浓度标记24h，对大鼠Beta-TC-6细胞有明显降低早期凋亡，BMSC增殖阳性率随黄氏甲苷浓度的增加而升高，其中黄芪甲苷160μmol/L浓度时阳性率相对最高。
如图8所示，BMSC-160μmol/L黄芪甲苷-PLGA-SIS支架组、黄芪甲苷160μmol/L处理组、BMSC-PLGA-SIS支架组、BMSC-SIS支架组和正常组经cck-8，MSC的增殖检测，其细胞活性和增殖阳性率依次降低，经细胞经流式细胞仪凋亡检测凋亡阳性率高低顺序升高。
从上述结果得知：黄芪甲苷能有效提高细胞活力，提高细胞存活率，且对生长于PLGA-SIS生物补片上的BMSC毒性甚微制备的，这说明将经黄芪甲苷诱导的BMSC-PLGA-SIS生物纳米补片用于腹壁缺损时，能有效加快伤口愈合。
实施例9：AS-BMSC-PLGA-SIS生物纳米补片在大鼠腹壁缺损模型的体内实验
1)实验分组：
①正常SD大鼠对照组：
②腹壁缺损模型组：
③聚丙烯补片修复组
④BMSC-PLGA–SIS修复组
⑤AS-BMSC-PLGA-SIS修复组
取45只SD雄性大鼠，随机分成5组，其中4组麻醉后钝性分离皮肤与肌肉组织，具体如下：
①、模型组(腹壁缺损模型组)不植入任何材料，3-0缝线缝逐层缝合关腹；
②、修复组在腹部正中线一侧构建腹壁全层缺损(2.0cm×2.0cm大小)，予以结扎止血，同时保留腹壁表面皮肤及皮下组织，缺损处应用组织工程支架修补，置入材料(即，组织工程支架)的四角分别固定于缺损区域四角，两者重叠约0.5cm，用3-0缝线缝逐层缝合关腹。
当应用组织工程支架为聚丙烯补片时，该修复组命名为：聚丙烯补片修复组；该聚丙烯补片为疝修补平片和预裁补片(商品名：Bard)，由美国DavolInc.,SubsidiaryofC.R.Bard,Inc.生产；
当应用组织工程支架为BMSC-PLGA–SIS时，该修复组命名为：BMSC-PLGA–SIS修复组；该BMSC-PLGA–SIS按照示例7自制，减掉步骤4)即可；
当应用组织工程支架为黄芪甲苷干预的BMSC-PLGA-SIS时，该修复组命名为：AS-BMSC-PLGA–SIS修复组；该AS-BMSC-PLGA–SIS按照实施例7制备而得；
分别于术后1周、4周、8周分批以引颈法处死大鼠，每次处死各分组3只大鼠。观察大鼠日常情况、补片表面粘连情况，表面间皮细胞存活和再生情况，补片与周围组织长合情况；
2)正常大鼠取腹壁组织，模型组及修复组取支架与周围组织交界区进行运用H&E染色、Masson染色、扫描电镜观察、免疫组化(IHC)、Real-timePCR(CollagenI-F：5-CGTGGAAACCTGATGTATGC-3；CollagenI-R：5-CAGGATCGGAACCTTCGCTT-3，96bp；CollagenIII-F：5-GATGCTGGTGCTGAGAAGAA-3；CollagenIII-R：5-GGCTGGAAAGAAGTCTGAGG-3，136bp；VEGF-F：5-GCAGCTTGAGTTAAACGAACG-3；VEGF-R：5-AGTTCCCGAAACCCTGAG-3，94bp；IL-6-F：5-GAGAAAAGAGTTGTGCAATGGC-3；IL-6-R：5-ACTAGGTTTGCCGAGTAGACC-3，443bp；MCP-1-F；5-ATGCAGGTCTCTGTCACGCT-3；MCP-1-R：5-GGTGCTGAAGTCCTTAGGGT-3，341bp；MMP-9-F：5-TTCAAGGACGGTCGGTATT-3；MMP-9-R：5-CTCTGAGCCTAGCCCCAACTTA-3，228bp；GADPH-F：5-GGCCTTCCGTGTTCCTACC-3；GADPH-R：5-CGCCTGCTTCACCACCTTC-3，103bp)和WesternBlot检测。
结果分别如图9-16所述。
模型组和3个修复组的实验结果如下：
模型组大鼠体重下降，行动迟缓，精神萎靡，进食无明显异常。术后模型构建后无大鼠死亡，均未见感染及皮下血肿现象。在第一周时，聚丙烯补片修复组的表面粘连程度较为突出，其他三组无显著性差异；在第八周阶段时，明显的发现以上四组从上到下，其表面粘连程度依次降低。从HE染色观察局部炎症浸润情况可知，模型组的炎症情况较为明显，正常组与其他三个实验组(补片组、BMSC-PLGA–SIS组、AS-BMSC-PLGA-SIS组)炎症现象轻微，且实验组均随着时间，其炎症现象消退，逐渐接近于正常组的情况。Masson染色观察胶原沉积情况可知，相比正常组和三个实验组(补片组、BMSC-PLGA-SIS组、AS-BMSC-PLGA-SIS组)，模型组腹壁组织的胶原纤维较为稀疏，表达区域较少，三个实验组胶原纤维逐渐增多，且从上到下绿色区域逐渐增多，接近正常组绿色区域的面积。观察扫描电镜图片，与正常组及模型组比较，聚丙烯补片修复组，BMSC-PLGA–SIS修复组和AS-BMSC-PLGA-SIS修复组的补片即经修饰处理的SIS逐渐被纤维性结缔组织和间皮细胞所覆盖或者代替，形成新的间皮细胞层，与缺损组织的修复密切相关且AS-BMSC-PLGA-SIS修复组伤口细胞生长更好。
免疫组化(IHC)检测表明腹壁缺损组织在补片、BMSC、SIS及黄氏甲苷处理之后能够提高I和III型胶原蛋白的表达量来促进伤口的修复。
在一周、四周及八周中，模型组的微血管密度均低于正常组，各实验组(聚丙烯补片修复组、BMSC-PLGA-SIS修复组、AS-BMSC-PLGA-SIS修复组)的微血管数量依次增多且黄芪甲苷预处理修复组的微血管密度大于正常组，揭示AS-BMSC-PLGA-SIS更能增大组织微血管密度，促进损坏组织的快速修复。
Real-timePCR结果趋势来看，胶原蛋白I、III、VEGF、MCP-1基因的表达随模型组、补片组、BMSC-PLGA-SIS组、AS-BMSC-PLGA-SIS组表达量上升，而MMP-9、IL-6表达量随之是降低的。
Westernblot结果表明BMSC、SIS以及黄芪甲苷处理后能增加CollagenI、CollagenIII、VEGF、MCP-1这4种蛋白的表达，AS-BMSC-PLGA-SIS组更是随时间推移接近正常组相应蛋白的表达，且值得指出的是正常组的这四个指标表达量均是最大的；
同时，结果显示，与没有经过处理的模型组2组相比，补片组、BMSC-PLGA-SIS组、AS-BMSC-PLGA-SIS组，即3、4、5组的IL-6与MMP-9的表达量是降低的，并且相应蛋白表达量依次增加，第五组的表达量接近于正常组的相关蛋白表达量，表明聚丙烯补片、BMSC、SIS以及黄芪甲苷处理后会抑制IL-6及MMP-9的表达。
从上述结果可以得知：AS-BMSC-PLGA-SIS生物纳米补片可以有效减少腹腔黏连和炎症的发生；通过形成纤维性结缔组织和间皮细胞增加伤口细胞间隙沉积，促进伤口血管生成加快伤口收缩愈合，说明AS-BMSC-PLGA-SIS生物纳米补片具有良好的生物相容性、抗粘连和抗感染性，对于伤口愈合有良好的促进作用。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (8)
1.生物纳米补片的制备方法，其特征是：采用复乳法制备得到核心粒径为150～200nm的PLGA纳米颗粒；采用脱细胞技术，制备得到SIS，使PLGA纳米颗粒粘附于SIS表面，得PLGA-SIS；通过黄芪甲苷诱导BMSC，促进其增殖分化，并使之复合生长于PLGA-SIS；得生物纳米补片AS-BMSC-PLGA-SIS；
所述PLGA纳米颗粒为聚乳酸-羟基乙酸纳米颗粒；
所述SIS是小肠粘膜下层基质。
2.根据权利要求1所述的生物纳米补片的制备方法，其特征是依次进行以下步骤：
1)、室温下，取PLGA溶于有机溶剂Ⅰ中，得到有机溶液，所述PLGA与有机溶剂Ⅰ的质量体积比为1g：80～160ml；
泊罗沙姆188搅拌下溶于去离子水中，得到水溶液，泊罗沙姆188与去离子水的质量体积比为1g：90～110ml；
所述PLGA为聚乳酸-羟基乙酸共聚物；
所述有机溶剂Ⅰ为丙酮：乙醇＝2.5～3.5:1的体积比；
2)、室温下，将有机溶液于搅拌下滴加到水溶液中，所述PLGA与泊罗沙姆188的质量比为1:3.5～4.5；
滴加完毕后，继续搅拌30～60min，得到带乳光的纳米悬浊液；
3)、将带乳光的纳米悬浊液于37～40℃用旋转蒸发仪旋蒸90～120min，得到高分子胶体悬浮液；4000～6000rpm/s高速离心25～35min弃去沉淀，得到PLGA纳米乳液；
4)、将猪小肠制成小肠粘膜下层基质；
5)、将小肠粘膜下层基质先用有机溶剂Ⅱ进行浸泡10～14h，再用去离子水冲洗；有机溶剂Ⅱ为甲醇：氯仿＝1:0.9～1.1体积比混合而得；
6)、将步骤5)所得的小肠粘膜下层基质经消化后，用去生理盐水冲洗；
7)、将步骤6)所得的小肠粘膜下层基质先浸泡在质量浓度为0.5％的十二烷基磺酸钠溶液中，振摇3～4h，去离子水洗净；
然后再用体积浓度为0.1％的过氧乙酸溶液浸泡20～40min后，去离子水洗净；
所述体积浓度为0.1％的过氧乙酸溶液的配制方法为：利用体积浓度为20％的乙醇水溶液作为稀释剂对过氧乙酸进行稀释，从而使最终所得的过氧乙酸溶液中过氧乙酸的体积浓度为0.1％；
最后干燥，密封后钴-60辐射灭菌；
8)、无菌环境下，将步骤7)所得的小肠粘膜下层基质放入DMEM高糖培养液中浸泡22～26h后，吸除小肠粘膜下层基质表面多余的DMEM高糖培养液；加入由PLGA纳米乳液和DMEM高糖培养液组成的混合液浸泡12～24h后，再次吸除小肠粘膜下层基质表面的多余的混合液，得到PLGA-SIS；
所述混合液中，PLGA纳米乳液和DMEM高糖培养液的体积比为1:1.8～2.2；
9)、将第三代BMSC细胞经消化离心后，用DMEM高糖培养液稀释至BMSC细胞的浓度为1.8～2.2×105cell/ml，得BMSC细胞悬液；
将BMSC细胞悬液滴加在步骤8)所得的PLGA-SIS于37℃、5％CO2培养箱中静置培养22～26h后，加入DMEM高糖培养液继续于37℃、5％CO2培养66～78h，中间更换一次DMEM高糖培养液；
10)、将黄芪甲苷溶于DMEM高糖培养液中，从而配制成浓度为黄芪甲苷浓度为150～170μmol/L的含黄芪甲苷的DMEM高糖培养液；
将步骤9)的所得物用上述含黄芪甲苷的DMEM高糖培养液进行培养液的更换，利用所述含黄芪甲苷的DMEM高糖培养液对BMSC细胞于37℃，5％CO2的条件下干预22～26h后，得到生物纳米补片。
3.根据权利要求2所述的生物纳米补片的制备方法，其特征是：
所述步骤6)中的消化为：将步骤5)所得的小肠粘膜下层基质浸泡在0.02％EDTA-0.25％胰酶溶液的稀释液中，于36.5～37.5℃恒温摇床内消化11.5～12.5h；
所述0.02％EDTA-0.25％胰酶溶液的稀释液为将0.02％EDTA-0.25％胰酶溶液与磷酸盐缓冲液按照V:V＝1:4混合后而得；
所述步骤9)中的消化为：将第三代BMSC细胞浸泡在0.02％EDTA-0.25％胰酶溶液中，于36.5～37.5℃恒温摇床内消化11.5～12.5h。
4.根据权利要求3所述的生物纳米补片的制备方法，其特征是：
所述DMEM高糖培养液为GibcoDMEM高糖培养基。
5.根据权利要求4所述的生物纳米补片的制备方法，其特征是：
所述步骤5)中，
有机溶剂Ⅱ为甲醇：氯仿＝1:1体积比混合而得，每1g粘膜下层基质配用4～6ml的有机溶剂Ⅱ，浸泡时间为10～14小时。
6.根据权利要求2～5任一所述的生物纳米补片的制备方法，其特征是：步骤1)和步骤2)均在2～4cm转子，400～800rpm/s搅拌条件下进行。
7.根据权利要求6所述的生物纳米补片的制备方法，其特征是：
步骤7)中的干燥为低温真空干燥：于5～100的真空度、-60～-40℃的温度下干燥120～240分钟；
步骤7)中的钴-60辐射灭菌为20～30kGy。
8.如权利要求1～7任意一种方法制备的生物纳米补片的用途，其特征是：用于制备治疗腹壁缺损的修复材料。
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