CN107213523A - 一种促进成骨生长的共交联双网络水凝胶支架的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种促进成骨生长的共交联双网络水凝胶支架的制备方法。包括如下步骤：（1）GelMA的制备；（2）可光交联OGP的制备；（3）水凝胶支架的制备：将50mg步骤（1）制备的GelMA和20mg步骤（2）制备的可光交联OGP溶于1mL PBS中，混合均匀后，加入光引发剂10mg，均匀混合后在紫外光下照射，制得水凝胶支架。本发明制备的水凝胶支架有明显的促进骨密度增加、骨缺损愈合的作用，可调控成骨细胞的增殖分化、基质矿化、提高碱性磷酸酶活性；水凝胶支架的多孔状结构，可使OGP共交联于多孔支架表面，诱导OGP缓慢释放，实现生物支架在骨缺损、植骨融合等骨科领域的作用。

Description

一种促进成骨生长的共交联双网络水凝胶支架的制备方法

技术领域

本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种促进成骨生长的共交联双网络水凝胶支架的制备方法。

背景技术

据文献报道，随着经济水平的提高，工业化进程加速，汽车保有量连年增加，每年超过五万高能量损伤导致的骨缺损需手术治疗。在一些复杂的情况下，如肿瘤切除、骨质疏松、感染和创伤引起的大块骨缺损，骨的再生和自我平衡面临着巨大的挑战。临床上用于骨缺损修复的常用方法包括同种异体骨移植、自体骨移植、BMP-2因子的运用等。但此三种方法均有各种缺点，如自体骨来源有限、手术时间加长、术中失血增多、取髂骨区术后疼痛、免疫排斥、疾病传播、异常骨化、软组织肿胀、脊髓神经根炎、假体周围骨吸收、致癌、骨溶解、炎症等，种种缺点限制了其在骨缺损领域的应用。为了避免这些问题，人们不断探索、研究新的材料以达到骨组织修复、再生的效果。

骨的再生修复是一个连续的、贯穿一生的过程，需要细胞因子, 例如生长因子等的参与。生长因子与骨的再生、修复密切相关，可影响骨、上皮、结缔组织细胞的增殖、迁移及分化。近年的研究热点成骨生长多肽（osteogenic growth polypeptide, OGP）在促进细胞增殖方面，与生长因子、组织生长因子相当。在碱性磷酸酶活性及基质矿化方面，成骨生长多肽效果更好。OGP最初是在哺乳动物血清中被发现，主要结构是一个十四肽氨基酸序列，活性部分是碳端序列片段组蛋白H4。OGP在没有成纤维细胞生长因子及生长激素的作用下，可促进成骨细胞的成熟，进而增加骨小梁密度，促进骨形成和愈合。有研究表明，OGP可增加骨形成和骨小梁密度是由于转化生长因子（TGF）、胰岛素样生长因子（IGF）等的作用。这些结果表明，OGP促进骨髓基质干细胞的成骨细胞分化。Vanella等研究表明，OGP可直接调控骨髓MC3T3-E1分化成为成骨细胞。与蛋白质BMP-2相比，OGP具有稳定、耐高温、耐有机溶剂等多项优点。但是，直接使用OGP存在作用时间短和容易流失等缺点。

Van Den Bulcke等首次介绍了甲基丙烯酸酐改性的明胶(GelMA)，它应用广泛，可用于骨、软骨和血管等。明胶具有优良的理化性能，如亲水性强、侧链反应活性高等，且明胶来源广泛、价格低廉、生物相容性好、生物可降解等优点，被广泛用于组织工程支架材料。明胶最重要的氨基酸序列是精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸（RGD）序列，此序列可促进细胞粘附、增殖和分化。美国食品和药物管理局（FDA）认定明胶安全，且已将明胶用做等离子膨胀剂和稳定剂，包括疫苗等。不仅如此，GelMA不仅具有明胶的生物学活性，还具有光交联水凝胶的理化定制能力。

原位形成可生物降解水凝胶化合物主要包括交联聚合等。由于凝胶化速度快、反应条件温和、凝胶时间和空间可控，原位光交联法引起了人们广泛关注。GelMA一般是在pH7.5的磷酸盐缓冲液中，由明胶与甲基丙烯酸酐反应合成。光交联法合成的GelMA，可在体温下作为支架发挥作用。此外，GelMA还可以作为药物载体负载各种药物，实现药物的装载和释放。但是，该类水凝胶材料在体液中存在药物释放快、水凝胶强度下降等问题。因此，构建一种和GelMA水凝胶共同交联的载药体系，有望在维持或者增加水凝胶强度的前提下，实现药物的负载和缓慢释放。

发明内容

本发明的目的在于提供一种促进成骨生长的共交联双网络水凝胶支架的制备方法，GelMA在光引发剂的作用下，发生自交联的单网络结构水凝胶，同时，可光交联的OGP复合到GelMA中，也可以发生GelMA-OGP的共交联，从而制备出具有成骨活性、稳定及生物学活性的多肽和明胶的共交联双网络水凝胶，并在体内及体外试验中进行研究，从而为GelMA-OGP在骨缺损治疗中的应用，提供坚实的实验基础。

为了实现上述目的，本发明构建一种共交联的双网络水凝胶支架，将可光交联的OGP和GelMA共同混合后，复合PI交联剂，其中，OGP和GelMA发生共交联，形成网络结构，GelMA之间发生交联形成网络结构，通过GelMA-OGP和GelMA-GelMA形成双网络结构的水凝胶，从而，维持该水凝胶力学强度和对OGP的缓释功能。其发明的机理主要包括如下过程：

1）制备甲基丙烯酸酐改性明胶GelMA；

2）通过甲基丙烯酸酐改性明胶得到GelMA的路线，合成具有甲基丙烯酸酐改性的具有光交联特性的OGP，即OGP-MA；

3）溶液中少量的OGP-MA和GelMA共同混合后，在PI光引发剂作用下，发生光交联形成GelMA-OGP的交联网络水凝胶；

4）在该水凝胶中大量的GelMA和GelMA也发生交联，形成交联网络水凝胶，从而整个体系形成GelMA-OGP和GelMA-GelMA的共交联双网络水凝胶支架。

为了实现上述目的，本发明采取以下技术方案：一种促进成骨生长的共交联双网络水凝胶支架的制备方法，包括如下步骤：

1）甲基丙烯酸酐改性的明胶的制备；

向20g明胶中加入200mL磷酸盐缓冲液，在60℃的环境下持续搅拌2小时；将上述明胶溶液缓慢透过水系滤膜，再在60℃搅拌的条件下每4分钟添加lmL甲基丙烯酸酐于明胶混合液中，共添加16次，然后继续搅拌2小时，形成甲基丙烯酸酐改性的光交联明胶；将制得的甲基丙烯酸酐改性的光交联明胶溶液置于800mL预热过的磷酸盐缓冲液中进行稀释，并持续缓慢搅拌15分钟，将稀释后的溶液置于透析袋中，以去离子水为透析液进行透析，每天更换两次透析液以去除未反应的甲基丙烯酸酐，持续透析一周；透析后，将溶液置于-80℃冰箱中，两天后放入冻干机冻干，将冻干样品于4℃条件下保存。

2）可光交联成骨生长多肽的制备

使用甲基丙烯酸酐与成骨生长多肽反应制得末端含有可光交联的甲基丙烯酰基的成骨生长多肽OGP-MA。

3）共交联双网络水凝胶支架的制备

将50mg步骤（1）制备的甲基丙烯酸酐改性的明胶和20mg步骤（2）制备的可光交联OGP溶解于1mL磷酸盐缓冲液中，混合均匀后，在搅拌的状态下加入10mg的2-羟基-4’-（2-羟基乙氧基）-2-甲基苯丙酮（PI，光引发剂659），将溶液均匀混合后，在紫外光下照射，制得共交联双网络水凝胶支架。

进一步的，所述透析袋的截留分子量为10KD。

进一步的，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M， pH为7.5。

进一步的，所述在紫外光下照射的时间为3分钟。

一种应用本发明所述的制备方法制备的促进成骨生长的共交联双网络水凝胶支架。

有益效果：本发明通过可光交联的OGP和GelMA在光引发剂的作用下发生光交联形成GelMA-OGP、GelMA-GelMA共交联双网络结构的水凝胶支架，可以保留GelMA的RGD基团，保留其促进材料与支架黏附的能力。一方面通过GelMA的RGD序列，增强支架材料与周围组织细胞的吸附聚集功能，同时光交联复合物有明显的促进骨密度增加，刺激骨缺损的愈合的作用，可溶性的肽可调控成骨细胞的增殖分化、基质矿化、提高碱性磷酸酶活性。且调控转化生长因子（TGFs）、胰岛素样生长因子（IGFs）和成纤维细胞生长因子等，在体内可以增加骨形成及提高骨小梁密度；另一方面GelMA-OGP光交联复合物不会影响GelMA材料多孔结构，对细胞无毒性、对细胞增殖亦无影响，光交联后，不仅可以保留其可塑形性，且可实现OGP在支架材料表面缓释功能，促进骨组织的生长可使OGP共交联于多孔支架表面，诱导OGP缓慢释放，最终实现生物支架在骨缺损、植骨融合等骨科领域的作用，因此，本发明为骨缺损修复、关节融合技术的临床应用提供了一种新的方法。

附图说明

图1 OGP和OGP活性部分（10-14）激活成骨细胞的示意图。

图2 甲基丙烯酸酐改性的明胶的制备流程图。

图3 共交联双网络结构的水凝胶支架的制备示意图。

图4 GelMA和GelMA-OGP的扫描电镜图。

图5 小鼠MC3T3-E1种植于GelMA和GelMA-OGP的扫描电镜图。

图6 活死细胞染色荧光显微图。

图7 DAPI染色和鬼笔环肽染色的荧光显微图。

图8 CCK-8检测，对照组、GelMA组、GelMA-OGP组在培养第1、3、5、7天对细胞增殖的影响。

图9 ALP染色图。

图10 ALP染色显微图（×100）。

图11 ALP活性检测（*代表P＜0.05）。

图12 茜素红染色显微图（×100）。

图13 RT-PCR检测成骨相关基因（OSC、Runx2、OPN、OC、ALP），（* P＜0.05，** P＜0.001）。

图14 在股骨干骺端制作圆柱形缺损的实验图。

图15 股骨远端骨缺损术后X射线图，A为对照组，B为GelMA组，C为GelMA-OGP组，箭头指示的是原骨缺损位置。

图16 股骨远端骨缺损术后表面三维重建图，A为对照组，B为GelMA组，C为GelMA-OGP支架组，箭头指示的是原骨缺损位置。

图17 8周时骨体积/组织体积比，A为对照组，B为GelMA组，C为GelMA-OGP组（** P＜0.001）。

图18 8周时骨密度，A对照组，B为GelMA组，C为GelMA-OGP组（**表示P<0.001）。

图19 股骨远端骨缺HE染色图。

具体实施方式

为使本领域技术人员更全面地理解本发明，以下结合实施例和附图对本发明的技术方案进行说明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1促进成骨生长的共交联双网络水凝胶支架的制备

具体步骤为：

1）甲基丙烯酸酐改性的明胶的制备

图2为甲基丙烯酸酐改性明胶的制备流程图，向20g明胶中加入200mL磷酸盐缓冲液，在60℃的环境下持续搅拌2小时；将上述明胶溶液缓慢透过水系滤膜，再在60℃搅拌的条件下每4分钟添加lmL甲基丙烯酸酐于明胶混合液中，共添加16次，并持续搅拌2小时，形成甲基丙烯酸酐改性的明胶；将制得的甲基丙烯酸酐改性的明胶溶液置于800mL预热过的磷酸盐缓冲液中进行稀释，并持续缓慢搅拌15分钟，将稀释后的溶液置于透析袋中，透析袋的截留分子量为10KD，浸泡于纯水溶液中，每天更换两次透析液以去除未反应的甲基丙烯酸酐，持续透析一周；透析后，将溶液置于-80℃冰箱中，两天后放入冻干机冻干，将冻干样品于4℃条件下保存。

2）可光交联成骨生长多肽的制备

使用甲基丙烯酸酐与成骨生长多肽反应制得末端含有可光交联的甲基丙烯酰基的成骨生长多肽OGP-MA。

3）共交联双网络水凝胶支架的制备

图3为共交联双网络结构的水凝胶支架的制备示意图，将50mg步骤（1）制备的甲基丙烯酸酐改性的明胶和20mg步骤（2）制备的可光交联OGP-MA溶解于1mL磷酸盐缓冲液中，混合均匀后，在搅拌的状态下加入10mg的PI光引发剂659，将溶液均匀混合后，在紫外光下照射3分钟，制得共交联双网络水凝胶支架。

将GelMA和GelMA-OGP冷冻干燥、真空下表面喷金等程序后，应用扫描电镜观察支架结构，GelMA和GelMA-OGP具有明显的多孔连通的结构，孔的外观呈现不规则状，多为长梭形，孔径大小20～40μm，孔隙内部连通性良好（图4）。

将MC3T3-E1分别种植到GelMA、GelMA-OGP上，扫描电镜观察可见MC3T3-E1清晰可见，细胞与材料紧密粘附，细胞在支架孔隙中伸展良好，细胞排列呈纵行、长梭形伸展状，结构相对规则，细胞生长情况良好（图5）。

实施例2 GelMA、GelMA-OGP黏附聚集观察

实验分组：对照组、GelMA组、GelMA-OGP支架组。

先将GelMA，GelMA-OGP支架置入24孔板中，再将MC3T3-E1复苏、离心、计数，种植到两个24孔板中的支架上（每孔2×10⁴ 细胞）（对照组MC3T3-E1直接种植到培养板上），每组三个复孔，加入配置好的α-MEM培养基，在培养箱中培养24小时，直至细胞充分贴壁生长。每两天更换α-MEM培养基，对照组只在培养板上更换α-MEM培养基，分别培养1天、3天进行活死染色荧光显微镜观察。

活死染色步骤为：吸出培养液→用PBS清洗两遍→添加100 ul混合液至每孔（1μlA+1μl B+2ml PBS组成混合液）→常温避光保存30分钟→荧光显微镜观察。

细胞在避光染色30分钟后于荧光显微镜观察，红色荧光的死细胞及绿色荧光的活细胞清晰可见，三组在死亡细胞（红色细胞）数量上差异不大（图6）。

实施例3 MC3T3-E1种植到支架上的形态观察

实验分组：对照组、GelMA组 、GelMA-OGP支架组。

先将GelMA、GelMA-OGP支架置入96孔板中，再将MC3T3-E1复苏、离心、计数，种植到96孔板中的支架上（每孔2×10³ 细胞）（对照组MC3T3-E1直接种植到培养板上），加入α-MEM培养基，在培养箱中培养24小时，待细胞充分贴壁生长。每隔一天更换α-MEM培养基（对照组只在培养板上更换α-MEM培养基）。第3天时行Dapi和鬼笔环肽染色荧光显微镜观察。

Dapi及鬼笔环肽染色步骤：吸出培养液→应用PBS清洗→应用多聚甲醛固定15min→ PBS清洗2min*5次→1ul 鬼笔环肽+300ul PBS（1：300）稀释→96孔板每空加100ul混合液，反应40min→ PBS洗一次→每孔加150ul DAPI→避光保存10min→ PBS清洗3次→应用荧光显微镜观察。

如图7，在支架孔径形态无明显差异的情况下，相比于对照组和GelMA组，GelMA-OGP组在荧光显微镜下的显微照片观察可见细胞与支架黏附很好，细胞生长情况很好，细胞亮度高且均匀，伪足伸展更长，染成蓝色荧光的细胞核轮廓圆滑清晰，结构均匀。对照组中，细胞生长情况欠佳。

实施例4 MC3T3-E1增殖活性检测

实验分组：对照组，GelMA 、GelMA-OGP支架组。

复苏MC3T3细胞，种植至96孔板中（4块板，每孔2×103 细胞），加入α-MEM培养基和GelMA组、GelMA-OGP组浸出液，对照组只加入α-MEM培养基，置于培养箱培养24小时，直至细胞充分贴壁生长。四块板分别于细胞贴壁后第1、3、5、7天进行CCK-8检测。

CCK-8检测步骤： 在每个96孔板的复孔中加入10ul CK-8反应液（3组，每组3个复孔）（避免操作中在孔中生成气泡）→在恒温箱中培养1-4h→用酶标仪测量吸光度（450nm）。

CCK-8检测GelMA、GelMA-OGP材料对MC3T3-E1增殖的影响。结果显示（图8），GelMA、GelMA-OGP材料浸出液未明显细胞的生长，材料具有很好的生物相容性。

实施例5 MC3T3-E1成骨定向分化能力的检测

实验分组：对照组、GelMA组、GelMA-OGP支架组。

先分别将GelMA-OGP，GelMA材料分别放入24孔板中的8个孔中，剩下8个孔做对照组，不放材料。再将MC3T3-E1细细胞复苏、离心、计数，种植到两个24孔板中的支架材料上（每孔2×104 细胞）（对照组直接将细胞种植到培养板上）（3组，每组3个复孔），在培养箱中培养24小时，直至细胞充分贴壁生长。每两天更换成骨诱导培养基。14天后对第一个孔板进行ALP染色，21天后对第二个孔板行茜素红染色。

ALP染色步骤： 吸出培养基→用PBS清洗5次→用多聚甲醛固定10min→用蒸馏水清洗3次→加入BCIP/NBT工作液→常温避光培养30min→终止显色反应→干燥和封片→荧光显微镜下观察。

ALP活力检测步骤：分空白孔、标准孔、测定孔三组→加5μL双蒸水于空白孔，5μL酚标准应用液（0.1mg／ml）于标准孔，5μL待测样本于测定孔→每个孔加缓冲液（50μL）+基质液（50μL）→置于37℃水浴箱中15分钟→添加显色剂150μL于每个孔中→酶标仪测定吸光度→计算公式：ALP activity=（测定OD值-空白OD值）／（标准OD值-空白OD值） ×标准品浓度（0.1mg／ml）÷待测样本蛋白浓度（gprot／ml）。

茜素红染色步骤：吸出培养基→用PBS清洗5次→用多聚甲醛固定10min→用蒸馏水清洗3次→加入茜素红工作液→常温避光培养30min→终止显色反应→干燥和封片→荧光显微镜下观察。

ALP几乎存在于身体各组织中，是膜结合酶，成骨细胞中尤其丰富。ALP染色结果可见GelMA-OGP支架组相较其它两组，染色深度更深、染色面积更大，差异具有统计学意义（图9）。ALP染色电子显微镜下观GelMA-OGP组NBT-formazan较其他两组相比，更加密集（图10）。ALP 活性检测， GelMA-OGP组碱性磷酸酶活性较GelMA组和对照组相比显示， GelMA-OGP支架组活性明显更高，且差异具有统计学意义（P<0.05）（图11）。荧光显微镜下观，较对照组和GelMA组，GelMA-OGP支架组更多红褐色的钙结节（图12）。

实施例6成骨相关基因检测

耗材去RNA酶化：先配置0.1%DEPC溶液1L，将Eppeendorf（EP）管及移液枪头在0.1%DEPC溶液中浸泡过夜，并弃浸泡液，然后经高压灭菌后，80°C烘干备用。

a)各基因引物序列及反应条件

b)总RNA提取：成骨诱导7天后提取细胞总RNA

1)将细胞沉淀和1 ml Trizol加入1.5ml EP管中，充分震荡和裂解细胞，工作台上静置10分钟；

2)加入200μL氯仿，漩涡震荡15s，室温下静置5min，4 ℃，12，000g 20min高速离心；

3)弃上清，70%乙醇洗涤一次，4 ℃，12，000g 20min高速离心；

4)弃上清，无水乙醇洗涤一次，4 ℃，12，000g 20min高速离心；

5)弃上清，置于工作台上至沉淀干燥，取20μl DEPC溶解沉淀RNA；

6)按照A260/A280计算RNA纯度，1.8～2.0代表纯度较高；

7)RNA逆转录反应合成cDNA；

8)荧光定量PCR检测各基因mRNA的表达量。

RT-PCR结果显示，GelMA-OGP组，相比对照组及GelMA组，在OSC、Runx2、OC、OPN、ALP的表达表达量明显更高（P<0.05）（图13）。GelMA-OGP组和对照组相比，OSC增加了3.79±0.07倍（P<0.05），Runx2增加了15.61±1.18倍（P<0.05），OC增加了3.83±0.18倍（P<0.01），OPN增加了3.13±0.13倍(P<0.05)，ALP增加了2.82 ±0.29倍 (P<0.05)。GelMA-OGP组和GelMA组相比，OSC增加了2.29±0.04倍（P<0.05），Runx2增加了2.07±0.16倍（P<0.05），OC增加了1.48±0.07倍（P<0.01），OPN增加了1.74±0.07倍，ALP增加了1.38±0.14倍。以上数据均以只加成骨诱导培养液为对照组计算得出。总体结果表明，GelMA-OGP支架组和GelMA组及对照组相比，成骨分化效率及能力更强。

实施例7 建立大鼠股骨远端骨缺损动物模型

该动物实验方案已通过苏州大学动物理论研究委员会的批准。

一、实验分组

1对照组（10只）：单纯造股骨远端骨缺损模型，不植入材料；

2 GelMA组（10只）：造股骨远端骨缺损模型，植入GelMA；

3 GelMA-OGP组（10只）：造股骨远端骨缺损模型，植入GelMA-OGP；

二、术前准备

大鼠术前喂养在25℃恒温、恒湿的环境，每12小时昼夜交替，供给充足的饲料与饮水，每三天更换一次垫料，持续观察一周。术前准备的耗材包括：台布、无菌手术衣、无菌纱布、无菌手套、医用口罩、医用帽子、洞巾、一次性注射器（1ml，5ml，20ml）、缝合针、缝合线、生理盐水、乙醇、安尔碘、数码照相机。手术操作器械：显微钳、弯止血钳、直止血钳、持针器、有齿镊、刀片、直剪、弯剪。术前先给大鼠称重，按照50mg/kg 将2%戊巴比妥钠溶液肌肉或者皮下注射入大鼠体内。待大鼠麻醉成功，将其侧卧位固定于手术操作台上，下肢手术区备皮、消毒、铺巾，戴无菌手套、帽子、口罩、穿手术衣。

三、手术操作

所有手术操作均由同一实验员主刀完成。取左大腿外侧切口，通过外侧肌间隙入路暴露股骨远端，使用2.0mm克氏针在股骨干骺端制作一个直径和高度分别为 2mm 的圆柱形缺损（只打穿一侧骨皮质）（图14）。然后用无菌生理盐水反复冲洗缺损 2-3 次，无菌纱布拭干，将事先备好的经过紫外线灭菌的成骨材料填入骨缺损内，逐层缝合皮下组织及皮肤。术后，连续三天肌肉内注射青霉素（160万单位青霉素加5ml生理盐水稀释后，皮下注射0.5ml，平均每只老鼠大约16万单位）预防性抗感染治疗，术后维持大鼠生长环境25℃恒温，同时及时补给饲料、预防自食、及时更换垫料，密切观察大鼠的一般情况。术后第8周，行Micro-CT检测，然后肌注麻药处死大鼠，取近端股骨，剔除表面肌肉、筋膜等软组织，浸泡于10%福尔马林中，待行HE染色。

实施例8 大鼠离体股骨远端X线分析

将GelMA-OGP组、GelMA组及对照组于股骨远端造骨缺损模型术后8周行X线摄片检查，大鼠均由2%戊巴比妥钠溶液麻醉后，侧卧固定于X线摄片机。所有X线片均由同一实验员采用同一台X线摄片机完成。拍摄距离均为距离球管100cm、120kV、50Ma。

股骨远端骨缺损造模术后8周， GelMA-OGP组股骨远端骨缺损处已基本看不出，缺损的部位骨皮质已连续，新生骨在X线片上显示高密度影，有外伤骨痂可见（图15C），而对照组及GelMA组缺损处清晰可见，无连续骨痂通过，提示GelMA-OGP组较另外两组缺损愈合更好，愈合速度更快。

实施例9 大鼠离体股骨大体观察及Micro-CT分析

（1）将术后8周的大鼠股骨离体后，将三组离体样本分别置于同一蓝色背景下，由同一实验员进行拍摄。拍摄角度为垂直股骨纵轴平面，股骨远端内外侧髁基本重叠即可。

（2）对术后8周离体后的大鼠股骨，进行Micro-CT扫描分析。Micro-CT机器参数设定如下：电压：65KV，电流：385μA，分辨率：18μm，转角度：0.7°。在工作站配套软件中，进行股骨远端表面三维重建。并在股骨远端骨缺损区域选取直径为3mm的圆柱形、高度为150层进行CT分析，记录BV（骨体积）、TV（组织体积）、BV/TV（骨体积/组织体积比）等参数，进行统计学分析。

股骨远端骨缺损的表面三维重建模型如图16所示。GelMA-OGP组（图16C）较GelMA组及对照组，新生骨量更多，原缺损部位几乎看不见，骨皮质连续，接近正常股骨远端，而GelMA组（图16 B）及对照组（图16A）骨缺损部位清晰可见，新生骨量较少，骨皮质不连续。

Micro-CT配套软件分析显示，BV/TV（骨组织体积/组织体积）的结果如图17所示，BMD（骨密度）的结果如图18所示。结果提示：在术后8周，Control组为(54.17±5.15)%，GelMA组为(56.19±4.82)%，GelMA-OGP组为(85.34±2.69)%。(Control vs GelMA-OGP，p<0.001；GelMA vs GelMA-OGP，p<0.001；Control vs GelMA，p=0.503)。

实施例10 HE染色

（1）取材与脱钙：将大鼠注入过量麻药处死，在无菌条件下，将大鼠股骨离体，去除肌肉、筋膜、肌腱等软组织，保留骨性结构，置于70%甲酸一周中进行脱钙，保留组织中有机质及细胞和组织的形态、结构和理化性质。

（2）脱水：用低浓到高浓度酒精作为脱水剂，依次在60%、70%、80%、90%的酒精中分别浸泡12h，100%酒精Ⅰ、Ⅱ中分别浸泡1h，逐渐脱去组织标本中的水分，再将组织放于二甲苯中，置换出组织中浸入的酒精。

（3）包埋：将处理好的股骨远端骨组织放置于熔化的的石蜡中，放入45℃石蜡箱中保温1 h，再放入65℃的石蜡箱中保温2h，待石蜡完全浸入股骨远端骨组织后，进行组织的包埋。把浸透了石蜡的股骨远端骨组织块放进包埋盒中，然后冷却凝固。

（4）切片与贴片：把包埋好的标本固定于切片机上，切成5-10µm的薄片。

将切下的薄片放在热水中烫平，然后将薄片均匀舒展的贴附在载玻片上，在恒温箱（45℃）中烘干。

（5）进行 HE 组织染色：

①将石蜡切片放在60℃的恒温箱中融化，然后用二甲苯脱蜡两次，时间分别5min和10min。

②将切片依次放入以下溶液中浸泡：100%乙醇5min（2次）→95%乙醇3min→80%乙醇1min→75%乙醇1min→双蒸水洗2min。

③Harris苏木素浸染切片5-8min，再用去离子水洗净。

④1%盐酸水溶液处理5-10s。

⑤使用灭菌纯化水浸泡切片大约15-30min。

⑥再用饱和碳酸锂水溶液浸泡3-5s，再用去离子水洗净。

⑦0.5%伊红中染色30-60s。

⑧常规酒精脱水处理：95%酒精5min（2次）→100%酒精5min→100%酒精2min。

⑨切片透明处理：二甲苯2-3min→二甲苯5min。

（6）封固：在玻片上滴上一滴封片用的树脂，盖上盖玻片，进行封片。

（7）显微镜下观察：细胞胞浆及纤维组织为的红色，胞核为深蓝色。

HE组织染色是骨组织损伤修复最常用的方法，通过染色可直观的在显微镜下观察新生骨的生长情况（图19）。切片方向为平行股骨干长轴由外侧向内侧切片。对照组，骨缺损仍较明显，外侧皮质未完全连续。GelMA组，可见稀少的骨小梁结构，骨缺损基本修复。GelMA-OGP组，可见原缺损部位有很多骨小梁形成，均匀类骨质均匀分布，可见大量的类骨样细胞存在，骨缺损完全修复。

综上所述，原位光交联甲基丙烯酸酯明胶/成骨生长多肽支架对小鼠MC3T3-E1细胞的生长无抑制作用，并可促进细胞黏附、伸展，生物相容性良好；可促进小鼠MC3T3-E1细胞的增殖和成骨分化；能够促进大鼠股骨远端骨缺损的修复，是一种有效的骨修复材料。

Claims (8)

1.一种促进成骨生长的共交联双网络水凝胶支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）甲基丙烯酸酐改性明胶的制备；

（2）可光交联成骨生长多肽的制备；

（3）共交联双网络水凝胶支架的制备

将50mg步骤（1）制备的甲基丙烯酸酐改性的明胶和20mg步骤（2）制备可光交联成骨生长多肽溶解于1mL磷酸盐缓冲液中，混合均匀后，在搅拌的状态下加入10mg的2-羟基-4’-（2-羟基乙氧基）-2-甲基苯丙酮光引发剂659，将溶液均匀混合后，在紫外光下照射，制得共交联双网络水凝胶支架。

2.根据权利要求1所述的一种促进成骨生长的共交联双网络水凝胶支架的制备方法，其特征在于，所述甲基丙烯酸酐改性明胶的制备方法为：向20g明胶中加入200mL磷酸盐缓冲液，在60℃的环境下持续搅拌2小时；将上述明胶溶液缓慢透过0.22μm水系滤膜，再在60℃搅拌的条件下每4分钟添加lmL甲基丙烯酸酐于明胶混合液中，共添加16次，然后继续搅拌2小时，形成甲基丙烯酸酐改性的明胶；将制得的甲基丙烯酸酐改性的明胶溶液进行透析冻干后，于4℃条件下保存。

3.根据权利要求2所述的一种促进成骨生长的共交联双网络水凝胶支架的制备方法，其特征在于，所述透析冻干的具体步骤为：将步骤（1）制得的甲基丙烯酸酐改性的明胶溶液置于800mL预热过的磷酸盐缓冲液中进行稀释，并持续缓慢搅拌15分钟，将稀释后的溶液置于透析袋中，以去离子水为透析液进行透析，每天更换两次透析液以去除未反应的甲基丙烯酸酐，持续透析一周；透析后，将溶液置于-80℃冰箱中，两天后放入冻干机冻干。

4.根据权利要求1所述的一种促进成骨生长的共交联双网络水凝胶支架的制备方法，其特征在于，所述可光交联成骨生长肽的末端含有可光交联的甲基丙烯酰基。

5.根据权利要求3所述的一种促进成骨生长的共交联双网络水凝胶支架的制备方法，其特征在于，所述透析袋的截留分子量为10KD。

6.根据权利要求1所述的一种促进成骨生长的共交联双网络水凝胶支架的制备方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M，pH为7.5。

7.根据权利要求1所述的一种促进成骨生长的共交联双网络水凝胶支架的制备方法，其特征在于，所述在紫外光下照射的时间为3分钟。

8.一种应用权利要求1~7任一项所述的制备方法制备的促进成骨生长的共交联双网络水凝胶支架。