CN110743040A - 一种多通道挤出3d生物打印制备仿生骨骼肌复合组织 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多通道挤出3D生物打印制备仿生骨骼肌复合组织，其制备方法包括以下步骤：配制骨支架仿生生物墨水、骨膜仿生生物墨水、肌纤维膜仿生生物墨水、肌肉仿生生物墨水；将MSCs和C2C12分别与对应的仿生生物墨水混合；使用多通道挤出3D生物打印机打印成型仿生骨、仿生骨膜、仿生肌纤维膜、仿生肌肉四层复合组织工程支架。本发明一种多通道挤出3D生物打印制备仿生骨骼肌复合组织，能够使创伤性骨骼肌损伤恢复时纤维化最小；通过多通道挤出3D生物打印制备的仿生骨骼肌复合组织，可以同时替代骨和骨骼肌的结构和功能，支持成肌细胞和成骨细胞的增殖和分化；并且利用3D生物打印技术使植入物易于定制，从而适应任何缺损形状。

Description

一种多通道挤出3D生物打印制备仿生骨骼肌复合组织
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，特别涉及一种多通道挤出3D生物打印制备仿生骨骼肌复合组织。
背景技术
骨骼肌是人体最大和最重要的器官之一，占体重的45％(Choi,J.S.etal.Journal of Controlled Release.2016,222:107-115)。其中每两个人中就有一个人以上受到骨骼肌损伤的影响。机动车事故、挤压伤和爆炸造成的严重创伤性肌肉损伤都是造成严重残疾的原因，并且会导致严重的疼和痛漫长的恢复期，加重病人的经济负担(Yelin,E.,et al.Seminars in Arthritis and Rheumatism.46(3):259-260)。肌肉功能依赖于稳定的骨头上适当的插入点，所以骨和肌肉都受损的创伤愈合的特别差。虽然最近在骨—肌肉组织工程方面取得了进展，但是目前还没有临床可用的有效的骨—肌肉植入物。这主要是由于设计和构建由具有不同物理化学性质的多种类型组织组成的三维(3D)构建体具有一定的复杂性。
治疗骨骼肌损伤的一个关键的临床挑战是骨骼肌损伤主要通过结疤而不是肌肉再生来愈合。这种纤维性疤痕组织是不柔韧的，没有功能的，并且限制了肌肉力量的恢复(Lemos,D.R.et al.Nature Medicine 2015,21:786-794)。我们可以通过开发有效的骨—肌肉植入物以支持功能性肌肉组织的再生来克服纤维化。但是目前还没有一种有效的植入材料可以同时替代骨和骨骼肌的结构和功能，从而使这些区域的细胞都能正常生长。另外，骨骼肌损伤没有确定的形状或尺寸，这使得不可能提前设计植入物。目前，重建骨—肌肉组织的方法大多数依赖于自体移植物的移植。然而自体移植物受到骨头的数量的限制，并且在重建手术期间可能会引起提供骨头部位发生病变。虽然涉及骨和肌肉的皮瓣可以转移，但这块肌肉没有功能，不能与支撑肌肉组织相结合。因此，本发明提出一种多通道挤出3D生物打印制备仿生骨骼肌复合组织，能够同时支持功能性骨骼肌和骨组织再生的新型骨—肌肉组织植入物，这种用于治疗骨骼和肌肉严重损伤的有效骨—肌肉植入物是重建仿生的、连续的骨骼/肌肉结构，在创伤性骨骼肌损伤恢复时，使纤维化最小化，能够支持成肌细胞和成骨细胞的增殖和分化，易于定制以适应任何缺损形状。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种多通道挤出3D生物打印制备仿生骨骼肌复合组织，可以有效解决背景技术中的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种多通道挤出3D生物打印制备仿生骨骼肌复合组织的制备方法，该方法包括以下步骤：
S1、通过向明胶水溶液中滴加甲基丙烯酸酐(MA)，得到高MA取代度和低MA取代度的甲基丙烯酸酯化明胶(GelMA)溶液，GelMA溶液包括仿生骨、仿生骨膜、仿生肌纤维膜、仿生肌肉四种，将甲基丙烯酸酯化明胶溶在低温下冷冻干燥，制得冻干GelMA；
S2、将步骤S1中不同浓度的冻干GelMA、藻酸盐(SA)和明胶溶解于去离子水中，得到不同比例的GelMA预聚物溶液；
S3、使用探针型超声波均质器将羟基磷灰石(HAP)和白磷钙石(WH)纳米粒子在去离子水中超声处理，然后将不同浓度的HAP和WH纳米粒子水溶液与步骤S2中对应的GelMA预聚物溶液充分混合，得到GelMA复合溶液；
S4、在步骤S3制得的GelMA复合溶液中加入一定浓度的2-羟基-4'-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮(PI)，得到对应的仿生生物墨水，仿生生物墨水包括骨支架仿生生物墨水、骨膜仿生生物墨水、肌纤维膜仿生生物墨水、肌肉仿生生物墨水；
S5、在打印之前，将所有溶液储存在恒温箱中；将成骨细胞(MSCs)与骨支架仿生生物墨水混合，MSCs和骨骼肌成肌细胞(C2C12)与骨膜仿生生物墨水混合，MSCs和C2C12与肌纤维膜仿生生物墨水混合，并将C2C12与肌肉仿生生物墨水混合，实现细胞在水凝胶中的均匀分散；
S6、使用多通道挤出3D生物打印机依据G代码命令，按一定挤出压力和速度完成细胞负载仿生生物墨水在三维立体方向上的成型及骨骼肌组织图案化，最终获得仿生骨、仿生骨膜、仿生肌纤维膜、仿生肌肉四层复合组织工程支架；
S7、生物打印后，立即将制备的样品暴露于UV照射下以实现光交联，然后用聚丁二酸丁二醇(PBS)洗涤并置于培养箱内的细胞培养基中。
优选的，所述步骤S1中，GelMA溶液中MA的取代度范围为：仿生骨为60.0-90.0％，仿生骨膜为10.0-30.0％，仿生肌纤维膜为10.0-30.0％，仿生肌肉为10.0-30.0％。
优选的，所述步骤S2具体操作为：
仿生骨中GelMA的浓度为5.0-10.0％(W/V)，SA的浓度为0.0-3.0％(W/V)，明胶的浓度为2.0-5.0％(W/V)；
仿生骨膜中GelMA的浓度为2.0-7.0％(W/V)，SA的浓度为0.0-3.0％(W/V)，明胶的浓度为1.0-4.0％(W/V)；
仿生肌纤维膜中GelMA的浓度为2.0-7.0％(W/V)，SA的浓度为0.0-3.0％(W/V)，明胶的浓度为1.0-4.0％(W/V)；
仿生肌肉中GelMA的浓度为2.0-7.0％(W/V)，SA的浓度为0.0-3.0％(W/V)，明胶的浓度为2.0-5.0％(W/V)；
将上述四层物质对应的溶液分别溶解于70-90℃的去离子水中，加热0.5-3h。
优选的，所述步骤S3中的HAP和WH纳米粒子的超声处理时间为10-50min，HAP和WH纳米粒子水溶液的浓度为：
仿生骨中HAP和WH纳米粒子水溶液的浓度范围为50.0-200.0μg·mL-1，HAP纳米粒子水溶液和WH纳米粒子水溶液的体积比为5:1、4:1、3:1、1:1四种中的一种；
仿生骨膜中HAP和WH纳米粒子水溶液的浓度范围为5.0-30.0μg·mL-1，HAP纳米粒子水溶液和WH纳米粒子水溶液的体积比为4:1、3:1、2:1、1:1四种中的一种；
仿生肌纤维膜中HAP和WH纳米粒子水溶液的浓度范围为0.5-20.0μg·mL-1，HAP纳米粒子水溶液和WH纳米粒子水溶液的体积比为4:1、3:1、2:1、1:1四种中的一种；
仿生肌肉中HAP和WH纳米粒子水溶液的浓度范围为0.0-10.0μg·mL-1，HAP纳米粒子水溶液和WH纳米粒子水溶液的体积比为3:1、2:1、1:1、0:0四种中的一种。
优选的，所述步骤S4中，仿生生物墨水中PI的浓度范围均为0.1-2.0％(W/V)。
优选的，所述步骤S5中，恒温箱的温度范围为15-60℃。
优选的，所述步骤S5中MSCs和C2C12的浓度范围分别为：
仿生骨中MSCs的浓度范围为1.0-5.0M·mL-1；
仿生骨膜中MSCs的浓度范围为0.5-4.0M·mL-1，C2C12的浓度范围为0.5-4.0M·mL-1；
仿生肌纤维膜中MSCs的浓度范围为0.5-4.0M·mL-1，C2C12的浓度范围为0.5-4.0M·mL-1；
仿生肌肉中C2C12的浓度范围为5.0-10.0M·mL-1。
优选的，所述步骤S6中的多通道挤出3D生物打印机的喷嘴直径为180.0-240.0μm，挤出压力为20.0-45.0psi，挤出速度为200.0-500.0mm·min-1。
优选的，所述步骤S7中UV照射时间为10-40s。
一种多通道挤出3D生物打印制备仿生骨骼肌复合组织，该仿生骨骼肌复合组织是通过上述任一项所述的制备方法制备得到的。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：该种多通道挤出3D生物打印制备仿生骨骼肌复合组织，能够使创伤性骨骼肌损伤恢复时纤维化最小；
通过多通道挤出3D生物打印制备的仿生骨骼肌复合组织，可以同时替代骨和骨骼肌的结构和功能，支持成肌细胞和成骨细胞的增殖和分化；
并且利用3D生物打印技术使植入物易于定制，从而适应任何缺损形状；
综上，本发明多通道挤出3D生物打印制备的仿生骨骼肌复合组织，有助于为开发其他复合组织提供技术支持，制备方法简单，并且得到的仿生骨骼肌复合组织支架综合性能好。
附图说明
图1为现有研究进展的骨仿生生物墨水、骨膜仿生生物墨水、肌纤维膜仿生生物墨水和肌肉仿生生物墨水的不同组成的示意图；
图2为现有研究进展的仿生生物墨水的打印性能与GelMA的浓度、MA的取代度和SA浓度的关系；
图3为现有研究进展的骨仿生生物墨水、骨膜仿生生物墨水、肌纤维膜仿生生物墨水和肌肉仿生生物墨水的流变学测量；
图4为现有研究进展的骨仿生生物墨水、骨膜仿生生物墨水、肌纤维膜仿生生物墨水和肌肉仿生生物墨水在剪切速率为0.1、1.0、和10.0(1s-1)时的粘度；
图5为现有研究进展的仿生生物墨水在打印7d后，共培养于仿生骨膜支架和仿生肌纤维膜支架上的在MSCs和C2C12的荧光显微图像；
图6为现有研究进展的仿生生物墨水在打印7d后，细胞在仿生骨膜支架和仿生肌纤维膜支架上的扩散情况的荧光显微图像；
图7为现有研究进展的仿生生物墨水在打印1、3和7d后，共培养于仿生骨膜支架和仿生肌纤维膜支架上的MSCs和C2C12的存活率和正常增值水平；
图8为本发明具有骨-肌肉仿生结构及矩形共连续结构的3D打印仿生骨骼肌复合组织荧光图片；
图9为本发明具有骨-肌肉仿生结构及矩形共连续结构的3D打印仿生骨骼肌复合组织的界面作用示意图；
图10为本发明不同层数及厚度3D打印支架的紫外光照片；
图11为本发明3D打印一体化支架仿生骨、骨-肌肉界面及仿生肌肉层的扫描电镜形貌图；
图12为本发明3D打印一体化支架中不同仿生部位的压缩模量的梯度性变化示意图；
图13为本发明3D打印一体化支架中不同仿生部位的孔隙率/密度变化示意图；
图14为本发明3D打印一体化支架中不同仿生部位的降解行为变化示意图；
图15为本发明通过分别使用OCN(绿色)和MY-32(红色)的双重免疫染色监测在负载MSCs和C2C12的骨-肌肉连续支架中成骨和肌原蛋白的表达水平示意图；
图16为本发明用茜素红染色后测定3D打印的仿生支架的不同区域中的矿化水平示意图；
图17为本发明成骨细胞和成肌细胞在仿生骨膜支架和仿生肌纤维膜支架中共培养比单独培养时的活性比较示意图；
图18为本发明在仿生骨膜支架中单独和共培养时成骨细胞的密度示意图；
图19为本发明在仿生肌纤维膜支架中单独和共培养时成肌细胞的密度示意图；
图20为本发明3D打印的仿生骨-肌肉支架在小鼠股骨肌肉损伤模型中的植入示意图；
图21为本发明在小鼠股骨肌肉损伤模型中植入3D打印一体化仿生骨-肌肉复合支架后的示意图；
图22为本发明植入3D打印一体化仿生骨-肌肉复合支架后，再生肌肉组织的H&E染色图片；
图23为本发明植入3D打印一体化仿生骨-肌肉复合支架后，肌纤维直径的定量分析(放大倍数10×和40×)；
图24为本发明植入3D打印一体化支架1个月后再生组织中OCN和MY-32的免疫组化图像及其定量分析示意图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合具体实施方式对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
实施例1
一种多通道挤出3D生物打印制备仿生骨骼肌复合组织，由以下制备方法制备得到：
S1、通过向明胶水溶液中滴加MA，仿生骨中MA的取代度为81.4％；仿生骨膜是19.7％；仿生肌纤维膜是19.7％；仿生肌肉是19.7％。
S2、仿生骨中GelMA的浓度为7.0％(W/V)、SA的浓度为0.5％(W/V)和明胶的浓度为3.0％(W/V)；仿生骨膜支架中GelMA的浓度为5.0％(W/V)、SA的浓度为0.5％(W/V)和明胶的浓度为2.0％(W/V)；仿生肌纤维膜支架中GelMA的浓度为5.0％(W/V)、SA的浓度为0.5％(W/V)和明胶的浓度为2.0％(W/V)；仿生肌肉支架中GelMA的浓度为5.0％(W/V)、SA的浓度为0.5％(W/V)和明胶的浓度为3.0％(W/V)，将上述四层物质对应的溶液分别溶解于80℃的去离子水中，加热1h。
S3、超声处理HAP和WH纳米粒子溶液30min，仿生骨中HAP和WH纳米粒子溶液的浓度为100.0μg·mL-1，HAP纳米粒子溶液和WH纳米粒子溶液的体积比为3:1；仿生骨膜支架中HAP和WH纳米粒子溶液的浓度为10.0μg·mL-1，HAP纳米粒子溶液和WH纳米粒子溶液的体积比为1:1；仿生肌纤维膜支架中HAP和WH纳米粒子溶液的浓度为1.0μg·mL-1，HAP纳米粒子溶液和WH纳米粒子溶液的体积比为1:1；仿生肌肉支架中HAP和WH纳米粒子溶液的浓度范围为0.0μg·mL-1，HAP纳米粒子溶液和WH纳米粒子溶液的体积比为0:0。将上述四种溶液与步骤2中的对应的四种溶液分别混合在一起。
S4、在仿生骨、仿生骨膜、仿生肌纤维膜、仿生肌肉支架中加入浓度为0.5％(W/V)的PI。
S5、在打印之前，将所有溶液储存在37℃恒温箱中。将浓度为3.0M·mL-1的MSCs与骨仿生生物墨水混合、浓度为1.5M·mL-1的MSCs和1.5M·mL-1的C2C12与骨膜仿生生物墨水混合、浓度为1.5M mL-1的MSCs和1.5M·mL-1的C2C12与肌纤维膜仿生生物墨水混合、并将浓度为8.0M·mL-1的C2C12与肌肉仿生生物墨水混合，实现细胞在水凝胶中的均匀分散。
S6、使用多通道挤出3D生物打印机依据G代码命令，用直径为210.0μm的喷嘴，按35.0psi的挤出压力和300.0mm·min-1的速度完成细胞负载生物墨水在三维立体方向上的成型及骨骼肌组织图案化，最终获得仿生骨、骨膜、肌纤维膜、肌肉四层复合组织工程支架。其中每一层的组成是不同的，包括gelMA浓度、MA取代度、明胶浓度、HA/WH浓度、比例等。
S7、生物打印后，立即将制备的样品暴露于UV照射下25s以交联，然后用PBS洗涤并置于培养箱内的细胞培养基中。
实施例2
一种多通道挤出3D生物打印制备仿生骨骼肌复合组织，由以下制备方法制备得到：
S1、通过向明胶水溶液中滴加MA，仿生骨中MA的取代度为90.0％；仿生骨膜是25.0％；仿生肌纤维膜是25.0％；仿生肌肉是25.0％。
S2、仿生骨中GelMA的浓度为6.0％(W/V)、SA的浓度为0.5％(W/V)和明胶的浓度为3.0％(W/V)；仿生骨膜支架中GelMA的浓度为4.0％(W/V)、SA的浓度为0.5％(W/V)和明胶的浓度为2.0％(W/V)；仿生肌纤维膜支架中GelMA的浓度为4.0％(W/V)、SA的浓度为0.5％(W/V)和明胶的浓度为2.0％(W/V)；仿生肌肉支架中GelMA的浓度为4.0％(W/V)、SA的浓度为0.5％(W/V)和明胶的浓度为3.0％(W/V)，将上述四层物质对应的溶液分别溶解于80℃的去离子水中，加热1h。
S3、超声处理HAP和WH纳米粒子溶液30min，仿生骨中HAP和WH纳米粒子溶液的浓度为100.0μg·mL-1，HAP纳米粒子溶液和WH纳米粒子溶液的体积比为3:1；仿生骨膜支架中HAP和WH纳米粒子溶液的浓度为10.0μg·mL-1，HAP纳米粒子溶液和WH纳米粒子溶液的体积比为1:1；仿生肌纤维膜支架中HAP和WH纳米粒子溶液的浓度为1.0μg·mL-1，HAP纳米粒子溶液和WH纳米粒子溶液的体积比为1:1；仿生肌肉支架中HAP和WH纳米粒子溶液的浓度范围为0.0μg·mL-1，HAP纳米粒子溶液和WH纳米粒子溶液的体积比为0:0。将上述四种溶液与步骤2中的对应的四种溶液分别混合在一起。
S4、在仿生骨、仿生骨膜、仿生肌纤维膜、仿生肌肉支架中加入浓度为0.5％(W/V)的PI。
S5、在打印之前，将所有溶液储存在37℃恒温箱中。将浓度为3.0M·mL-1的MSCs与骨仿生生物墨水混合、浓度为1.5M·mL-1的MSCs和1.5M·mL-1的C2C12与骨膜仿生生物墨水混合、浓度为1.5M·mL-1的MSCs和1.5M·mL-1的C2C12与肌纤维膜仿生生物墨水混合、并将浓度为8.0M·mL-1的C2C12与肌肉仿生生物墨水混合，实现细胞在水凝胶中的均匀分散。
S6、使用多通道挤出3D生物打印机依据G代码命令，用直径为210.0μm的喷嘴，按35.0psi的挤出压力和300.0mm·min-1的速度完成细胞负载生物墨水在三维立体方向上的成型及骨骼肌组织图案化，最终获得仿生骨、骨膜、肌纤维膜、肌肉四层复合组织工程支架。其中每一层的组成是不同的，包括GelMA浓度、MA取代度、明胶浓度、HA/WH浓度、比例等。
S7、生物打印后，立即将制备的样品暴露于UV照射下25s以交联，然后用PBS洗涤并置于培养箱内的细胞培养基中。
实施例3
一种多通道挤出3D生物打印制备仿生骨骼肌复合组织，由以下制备方法制备得到：
S1、通过向明胶水溶液中滴加MA，仿生骨中MA的取代度为81.4％；仿生骨膜是19.7％；仿生肌纤维膜是19.7％；仿生肌肉是19.7％。
S2、仿生骨中GelMA的浓度为7.0％(W/V)、SA的浓度为0.5％(W/V)和明胶的浓度为4.0％(W/V)；仿生骨膜支架中GelMA的浓度为5.0％(W/V)、SA的浓度为0.5％(W/V)和明胶的浓度为3.0％(W/V)；仿生肌纤维膜支架中GelMA的浓度为5.0％(W/V)、SA的浓度为0.5％(W/V)和明胶的浓度为3.0％(W/V)；仿生肌肉支架中GelMA的浓度为5.0％(W/V)、SA的浓度为0.5％(W/V)和明胶的浓度为4.0％(W/V)，将上述四层物质对应的溶液分别溶解于80℃的去离子水中，加热1h。
S3、超声处理HAP和WH纳米粒子溶液30min，仿生骨中HAP和WH纳米粒子溶液的浓度为100.0μg·mL-1，HAP纳米粒子溶液和WH纳米粒子溶液的体积比为3:1；仿生骨膜支架中HAP和WH纳米粒子溶液的浓度为10.0μg·mL-1，HAP纳米粒子溶液和WH纳米粒子溶液的体积比为1:1；仿生肌纤维膜支架中HAP和WH纳米粒子溶液的浓度为1.0μg·mL-1，HAP纳米粒子溶液和WH纳米粒子溶液的体积比为1:1；仿生肌肉支架中HAP和WH纳米粒子溶液的浓度范围为0.0μg·mL-1，HAP纳米粒子溶液和WH纳米粒子溶液的体积比为0:0。将上述四种溶液与步骤2中的对应的四种溶液分别混合在一起。
S4、在仿生骨、仿生骨膜、仿生肌纤维膜、仿生肌肉支架中加入浓度为0.5％(W/V)的PI。
S5、在打印之前，将所有溶液储存在37℃恒温箱中。将浓度为3.0M·mL-1的MSCs与骨仿生生物墨水混合、浓度为1.5M·mL-1的MSCs和1.5M·mL-1的C2C12与骨膜仿生生物墨水混合、浓度为1.5M·mL-1的MSCs和1.5M·mL-1的C2C12与肌纤维膜仿生生物墨水混合、并将浓度为8.0M·mL-1的C2C12与肌肉仿生生物墨水混合，实现细胞在水凝胶中的均匀分散。
S6、使用多通道挤出3D生物打印机依据G代码命令，用直径为210.0μm的喷嘴，按35.0psi的挤出压力和300.0mm·min-1的速度完成细胞负载生物墨水在三维立体方向上的成型及骨骼肌组织图案化，最终获得仿生骨、骨膜、肌纤维膜、肌肉四层复合组织工程支架。其中每一层的组成是不同的，包括GelMA浓度、MA取代度、明胶浓度、HA/WH浓度、比例等。
S7、生物打印后，立即将制备的样品暴露于UV照射下25s以交联，然后用PBS洗涤并置于培养箱内的细胞培养基中。
实施例4
一种多通道挤出3D生物打印制备仿生骨骼肌复合组织，由以下制备方法制备得到：
S1、通过向明胶水溶液中滴加MA，仿生骨中MA的取代度为81.4％；仿生骨膜是19.7％；仿生肌纤维膜是19.7％；仿生肌肉是19.7％。
S2、仿生骨中GelMA的浓度为7.0％(W/V)、SA的浓度为2.0％(W/V)和明胶的浓度为3.0％(W/V)；仿生骨膜支架中GelMA的浓度为5.0％(W/V)、SA的浓度为2.0％(W/V)和明胶的浓度为2.0％(W/V)；仿生肌纤维膜支架中GelMA的浓度为5.0％(W/V)、SA的浓度为2.0％(W/V)和明胶的浓度为2.0％(W/V)；仿生肌肉支架中GelMA的浓度为5.0％(W/V)、SA的浓度为0.5％(W/V)和明胶的浓度为3.0％(W/V)，将上述四层物质对应的溶液分别溶解于80℃的去离子水中，加热1h。
S3、超声处理HAP和WH纳米粒子溶液30min，仿生骨中HAP和WH纳米粒子溶液的浓度为100.0μg·mL-1，HAP纳米粒子溶液和WH纳米粒子溶液的体积比为3:1；仿生骨膜支架中HAP和WH纳米粒子溶液的浓度为10.0μg·mL-1，HAP纳米粒子溶液和WH纳米粒子溶液的体积比为1:1；仿生肌纤维膜支架中HAP和WH纳米粒子溶液的浓度为1.0μg·mL-1，HAP纳米粒子溶液和WH纳米粒子溶液的体积比为1:1；仿生肌肉支架中HAP和WH纳米粒子溶液的浓度范围为0.0μg·mL-1，HAP纳米粒子溶液和WH纳米粒子溶液的体积比为0:0。将上述四种溶液与步骤2中的对应的四种溶液分别混合在一起。
S4、在仿生骨、仿生骨膜、仿生肌纤维膜、仿生肌肉支架中加入浓度为0.5％(W/V)的PI。
S5、在打印之前，将所有溶液储存在37℃恒温箱中。将浓度为3.0M·mL-1的MSCs与骨仿生生物墨水混合、浓度为1.5M·mL-1的MSCs和1.5M·mL-1的C2C12与骨膜仿生生物墨水混合、浓度为1.5M·mL-1的MSCs和1.5M·mL-1的C2C12与肌纤维膜仿生生物墨水混合、并将浓度为8.0M·mL-1的C2C12与肌肉仿生生物墨水混合，实现细胞在水凝胶中的均匀分散。
S6、使用多通道挤出3D生物打印机依据G代码命令，用直径为210.0μm的喷嘴，按35.0psi的挤出压力和300.0mm·min-1的速度完成细胞负载生物墨水在三维立体方向上的成型及骨骼肌组织图案化，最终获得仿生骨、骨膜、肌纤维膜、肌肉四层复合组织工程支架。其中每一层的组成是不同的，包括GelMA浓度、MA取代度、明胶浓度、HA/WH浓度、比例等。
S7、生物打印后，立即将制备的样品暴露于UV照射下25s以交联，然后用PBS洗涤并置于培养箱内的细胞培养基中。
实施例5
一种多通道挤出3D生物打印制备仿生骨骼肌复合组织，由以下制备方法制备得到：
S1、通过向明胶水溶液中滴加MA，仿生骨中MA的取代度为81.4％；仿生骨膜是19.7％；仿生肌纤维膜是19.7％；仿生肌肉是19.7％。
S2、仿生骨中GelMA的浓度为7.0％(W/V)、SA的浓度为0.5％(W/V)和明胶的浓度为3.0％(W/V)；仿生骨膜支架中GelMA的浓度为5.0％(W/V)、SA的浓度为0.5％(W/V)和明胶的浓度为2.0％(W/V)；仿生肌纤维膜支架中GelMA的浓度为5.0％(W/V)、SA的浓度为0.5％(W/V)和明胶的浓度为2.0％(W/V)；仿生肌肉支架中GelMA的浓度为5.0％(W/V)、SA的浓度为0.5％(W/V)和明胶的浓度为3.0％(W/V)，将上述四层物质对应的溶液分别溶解于80℃的去离子水中，加热1h。
S3、超声处理HAP和WH纳米粒子溶液30min，仿生骨中HAP和WH纳米粒子溶液的浓度为100.0μg·mL-1，HAP纳米粒子溶液和WH纳米粒子溶液的体积比为4:1；仿生骨膜支架中HAP和WH纳米粒子溶液的浓度为10.0μg·mL-1，HAP纳米粒子溶液和WH纳米粒子溶液的体积比为2:1；仿生肌纤维膜支架中HAP和WH纳米粒子溶液的浓度为1.0μg·mL-1，HAP纳米粒子溶液和WH纳米粒子溶液的体积比为2:1；仿生肌肉支架中HAP和WH纳米粒子溶液的浓度范围为0.0μg·mL-1，HAP纳米粒子溶液和WH纳米粒子溶液的体积比为1:1。将上述四种溶液与步骤2中的对应的四种溶液分别混合在一起。
S4、在仿生骨、仿生骨膜、仿生肌纤维膜、仿生肌肉支架中加入浓度为0.5％(W/V)的PI。
S5、在打印之前，将所有溶液储存在37℃恒温箱中。将浓度为3.0M·mL-1的MSCs与骨仿生生物墨水混合、浓度为1.5M·mL-1的MSCs和1.5M·mL-1的C2C12与骨膜仿生生物墨水混合、浓度为1.5M·mL-1的MSCs和1.5M mL-1的C2C12与肌纤维膜仿生生物墨水混合、并将浓度为8.0M·mL-1的C2C12与肌肉仿生生物墨水混合，实现细胞在水凝胶中的均匀分散。
S6、使用多通道挤出3D生物打印机依据G代码命令，用直径为210.0μm的喷嘴，按35.0psi的挤出压力和300.0mm·min-1的速度完成细胞负载生物墨水在三维立体方向上的成型及骨骼肌组织图案化，最终获得仿生骨、骨膜、肌纤维膜、肌肉四层复合组织工程支架。其中每一层的组成是不同的，包括GelMA浓度、MA取代度、明胶浓度、HA/WH浓度、比例等。
S7、生物打印后，立即将制备的样品暴露于UV照射下25s以交联，然后用PBS洗涤并置于培养箱内的细胞培养基中。
对比例1
(1)通过向明胶水溶液中滴加MA，仿生骨中MA的取代度为81.4％；仿生骨膜是19.7％；仿生肌纤维膜是19.7％；仿生肌肉是19.7％。
(2)仿生骨中GelMA的浓度为8.0％(W/V)、SA的浓度为0.5％(W/V)和明胶的浓度为3.0％(W/V)；仿生骨膜支架中GelMA的浓度为6.0％(W/V)、SA的浓度为0.5％(W/V)和明胶的浓度为2.0％(W/V)；仿生肌纤维膜支架中GelMA的浓度为6.0％(W/V)、SA的浓度为0.5％(W/V)和明胶的浓度为2.0％(W/V)；仿生肌肉支架中GelMA的浓度为6.0％(W/V)、SA的浓度为0.5％(W/V)和明胶的浓度为3.0％(W/V)，将上述四层物质对应的溶液分别溶解于80℃的去离子水中，加热1h。
(3)超声处理HAP和WH纳米粒子溶液30min，仿生骨中HAP和WH纳米粒子溶液的浓度为100.0μg·mL-1，HAP纳米粒子溶液和WH纳米粒子溶液的体积比为3:1；仿生骨膜支架中HAP和WH纳米粒子溶液的浓度为10.0μg·mL-1，HAP纳米粒子溶液和WH纳米粒子溶液的体积比为1:1；仿生肌纤维膜支架中HAP和WH纳米粒子溶液的浓度为1.0μg·mL-1，HAP纳米粒子溶液和WH纳米粒子溶液的体积比为1:1；仿生肌肉支架中HAP和WH纳米粒子溶液的浓度范围为0.0μg·mL-1，HAP纳米粒子溶液和WH纳米粒子溶液的体积比为0:0。将上述四种溶液与步骤2中的对应的四种溶液分别混合在一起。
(4)在仿生骨、仿生骨膜、仿生肌纤维膜、仿生肌肉支架中加入浓度为0.5％(W/V)的PI。
(5)在打印之前，将所有溶液储存在37℃恒温箱中。将浓度为3.0M·mL-1的MSCs与骨仿生生物墨水混合、浓度为1.5M·mL-1的MSCs和1.5M·mL-1的C2C12与骨膜仿生生物墨水混合、浓度为1.5M·mL-1的MSCs和1.5M·mL-1的C2C12与肌纤维膜仿生生物墨水混合、并将浓度为8.0M·mL-1的C2C12与肌肉仿生生物墨水混合，实现细胞在水凝胶中的均匀分散。
(6)使用多通道挤出3D生物打印机依据G代码命令，用直径为210.0μm的喷嘴，按35.0psi的挤出压力和300.0mm·min-1的速度完成细胞负载生物墨水在三维立体方向上的成型及骨骼肌组织图案化，最终获得仿生骨、骨膜、肌纤维膜、肌肉四层复合组织工程支架。其中每一层的组成是不同的，包括GelMA浓度、MA取代度、明胶浓度、HA/WH浓度、比例等。
(7)生物打印后，立即将制备的样品暴露于UV照射下25s以交联，然后用PBS洗涤并置于培养箱内的细胞培养基中。
对比例2
(1)通过向明胶水溶液中滴加MA，仿生骨中MA的取代度为81.4％；仿生骨膜是19.7％；仿生肌纤维膜是19.7％；仿生肌肉是19.7％。
(2)仿生骨中GelMA的浓度为7.0％(W/V)、SA的浓度为0.5％(W/V)和明胶的浓度为3.0％(W/V)；仿生骨膜支架中GelMA的浓度为5.0％(W/V)、SA的浓度为0.5％(W/V)和明胶的浓度为2.0％(W/V)；仿生肌纤维膜支架中GelMA的浓度为5.0％(W/V)、SA的浓度为0.5％(W/V)和明胶的浓度为2.0％(W/V)；仿生肌肉支架中GelMA的浓度为5.0％(W/V)、SA的浓度为0.5％(W/V)和明胶的浓度为3.0％(W/V)，将上述四层物质对应的溶液分别溶解于80℃的去离子水中，加热1h。
(3)超声处理HAP和WH纳米粒子溶液30min，仿生骨中HAP和WH纳米粒子溶液的浓度为100.0μg·mL-1，HAP纳米粒子溶液和WH纳米粒子溶液的体积比为3:1；仿生骨膜支架中HAP和WH纳米粒子溶液的浓度为10.0μg·mL-1，HAP纳米粒子溶液和WH纳米粒子溶液的体积比为1:1；仿生肌纤维膜支架中HAP和WH纳米粒子溶液的浓度为1.0μg·mL-1，HAP纳米粒子溶液和WH纳米粒子溶液的体积比为1:1；仿生肌肉支架中HAP和WH纳米粒子溶液的浓度范围为0.0μg·mL-1，HAP纳米粒子溶液和WH纳米粒子溶液的体积比为0:0。将上述四种溶液与步骤2中的对应的四种溶液分别混合在一起。
(4)在仿生骨、仿生骨膜、仿生肌纤维膜、仿生肌肉支架中加入浓度为0.5％(W/V)的PI。
(5)在打印之前，将所有溶液储存在37℃恒温箱中。将浓度为3.0M·mL-1的MSCs与骨仿生生物墨水混合、浓度为1.5M·mL-1的MSCs和1.5M·mL-1的C2C12与骨膜仿生生物墨水混合、浓度为1.5M·mL-1的MSCs和1.5M·mL-1的C2C12与肌纤维膜仿生生物墨水混合、并将浓度为8.0M·mL-1的C2C12与肌肉仿生生物墨水混合，实现细胞在水凝胶中的均匀分散。
(6)使用多通道挤出3D生物打印机依据G代码命令，用直径为210.0μm的喷嘴，按35.0psi的挤出压力和300.0mm·min-1的速度完成细胞负载生物墨水在三维立体方向上的成型及骨骼肌组织图案化，最终获得仿生骨、骨膜、肌纤维膜、肌肉四层复合组织工程支架。其中每一层的组成是不同的，包括GelMA浓度、MA取代度、明胶浓度、HA/WH浓度、比例等。
(7)生物打印后，立即将制备的样品暴露于UV照射下25s以交联，然后用PBS洗涤并置于培养箱内的细胞培养基中。
对比例1中调整GelMA浓度的大小，与实施例1相比，同样MA取代度、明胶浓度、HA/WH浓度、比例、SA浓度和PI浓度的溶液混合在一起后，GelMA浓度越大，对应的仿生生物墨水的力学性能越强。
对比例2中调整HA/WH浓度的大小，与实施例1相比，同样MA取代度、明胶浓度、HA/WH比例、SA浓度、GelMA浓度和PI浓度的溶液混合在一起后，HA/WH浓度的浓度越大，对应的放生生物墨水的骨形成能力越强。
由图8-14可知，本发明3D打印的仿生骨、骨膜、肌纤维膜和肌肉支架的物理特性良好，由图8可知，本发明制备得到的仿生骨骼肌复合组织外形结构良好；由9本发明制备得到的具有骨-肌肉仿生结构及矩形共连续结构的3D打印支架的界面作用示意图可知，本发明制备得到的仿生骨骼肌复合组中的仿生骨、骨膜、肌纤维膜和肌肉支架四层结构之间的连接紧密，且连接界面处相应的成骨细胞和成肌细胞分布均匀；由图10不同层数及厚度3D打印支架的紫外光照片可知，每一层的打印支架厚度较薄；由图11可知，图中中能量色散光谱证实了一体化3D打印支架中钙/镁元素含量的逐级变化。
图15-19为本发明成骨细胞和成肌细胞在具有梯度结构的生物打印支架中的分化；由图15通过分别使用OCN(绿色)和MY-32(红色)的双重免疫染色监测在负载MSCs和C2C12的骨-肌肉连续支架中成骨和肌原蛋白的表达水平，可知，经过培育后，本发明的成骨细胞和成肌细胞已经被诱导称为骨细胞和肌细胞；由图16用茜素红染色后测定3D打印的仿生支架的不同区域中的矿化水平，可知本发明制备得到的仿生骨骼肌复合组中各部分骨细胞矿化效果好；由图17可知，成骨细胞和成肌细胞在仿生骨膜支架和仿生肌纤维膜支架中共培养比单独培养时的活性更强；由图18可知，在仿生骨膜支架中单独和共培养时成骨细胞的密度随着培育的时间的增长而增密；由图19可知，在仿生肌纤维膜支架中单独和共培养时成肌细胞的密度随着培育时间的增长而增密。
图20-24为本发明通过3D打印的骨-肌肉支架在体内的骨骼肌组织的再生示意图；由图20可知，本发明3D打印的仿生骨-肌肉支架在小鼠股骨肌肉损伤模型中的植入效果良好，可以与原有的组织较好地连接在一起，而且仿生骨、骨膜、肌纤维膜和肌肉支架之间每一层的厚度均可以根据实际需要制作；由图21可知，本发明制备得到的仿生骨骼肌组织可以很好的与试验体融合在一起；由图22可知，本发明作为实验组的实施例1制备得到的仿生骨骼肌组织中细胞以及肌纤维分布的均匀度均比作为对照组的对比例2要更加均匀；由图23可知，本发明作为实验组的实施例1制备得到的仿生骨骼肌组织中肌纤维的数量和直径均比作为对照组的对比例2大，两者之间的差别具有统计学意义；由图24可知，植入本发明3D打印一体化支架1个月后，原组织不会与本发明制备得到的仿生骨骼肌组织发生太大的免疫作用，二者融合良好。
最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
对所公开的实施例的上述说明，是本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种多通道挤出3D生物打印制备仿生骨骼肌复合组织的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
S1、通过向明胶水溶液中滴加甲基丙烯酸酐(MA)，得到高MA取代度和低MA取代度的甲基丙烯酸酯化明胶(GelMA)溶液，GelMA溶液包括仿生骨、仿生骨膜、仿生肌纤维膜、仿生肌肉四种，将甲基丙烯酸酯化明胶溶在低温下冷冻干燥，制得冻干GelMA；
S2、将步骤S1中不同浓度的冻干GelMA、藻酸盐(SA)和明胶溶解于去离子水中，得到不同比例的GelMA预聚物溶液；
S3、使用探针型超声波均质器将羟基磷灰石(HAP)和白磷钙石(WH)纳米粒子在去离子水中超声处理，然后将不同浓度的HAP和WH纳米粒子水溶液与步骤S2中对应的GelMA预聚物溶液充分混合，得到GelMA复合溶液；
S4、在步骤S3制得的GelMA复合溶液中加入一定浓度的2-羟基-4'-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮(PI)，得到对应的仿生生物墨水，仿生生物墨水包括骨支架仿生生物墨水、骨膜仿生生物墨水、肌纤维膜仿生生物墨水、肌肉仿生生物墨水；
S5、在打印之前，将所有溶液储存在恒温箱中；将成骨细胞(MSCs)与骨支架仿生生物墨水混合，MSCs和骨骼肌成肌细胞(C2C12)与骨膜仿生生物墨水混合，MSCs和C2C12与肌纤维膜仿生生物墨水混合，并将C2C12与肌肉仿生生物墨水混合，实现细胞在水凝胶中的均匀分散；
S6、使用多通道挤出3D生物打印机依据G代码命令，按一定挤出压力和速度完成细胞负载仿生生物墨水在三维立体方向上的成型及骨骼肌组织图案化，最终获得仿生骨、仿生骨膜、仿生肌纤维膜、仿生肌肉四层复合组织工程支架；
S7、生物打印后，立即将制备的样品暴露于UV照射下以实现光交联，然后用聚丁二酸丁二醇(PBS)洗涤并置于培养箱内的细胞培养基中。
2.根据权利要求1所述的一种多通道挤出3D生物打印制备仿生骨骼肌复合组织的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，GelMA溶液中MA的取代度范围为：仿生骨为60.0-90.0％，仿生骨膜为10.0-30.0％，仿生肌纤维膜为10.0-30.0％，仿生肌肉为10.0-30.0％。
3.根据权利要求1所述的一种多通道挤出3D生物打印制备仿生骨骼肌复合组织的制备方法，其特征在于，所述步骤S2具体操作为：
仿生骨中GelMA的浓度为5.0-10.0％(W/V)，SA的浓度为0.0-3.0％(W/V)，明胶的浓度为2.0-5.0％(W/V)；
仿生骨膜中GelMA的浓度为2.0-7.0％(W/V)，SA的浓度为0.0-3.0％(W/V)，明胶的浓度为1.0-4.0％(W/V)；
仿生肌纤维膜中GelMA的浓度为2.0-7.0％(W/V)，SA的浓度为0.0-3.0％(W/V)，明胶的浓度为1.0-4.0％(W/V)；
仿生肌肉中GelMA的浓度为2.0-7.0％(W/V)，SA的浓度为0.0-3.0％(W/V)，明胶的浓度为2.0-5.0％(W/V)；
将上述四层物质对应的溶液分别溶解于70-90℃的去离子水中，加热0.5-3h。
4.根据权利要求1所述的一种多通道挤出3D生物打印制备仿生骨骼肌复合组织的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中的HAP和WH纳米粒子的超声处理时间为10-50min，HAP和WH纳米粒子水溶液的浓度为：
仿生骨中HAP和WH纳米粒子水溶液的浓度范围为50.0-200.0μg·mL-1，HAP纳米粒子水溶液和WH纳米粒子水溶液的体积比为5:1、4:1、3:1、1:1四种中的一种；
仿生骨膜中HAP和WH纳米粒子水溶液的浓度范围为5.0-30.0μg·mL-1，HAP纳米粒子水溶液和WH纳米粒子水溶液的体积比为4:1、3:1、2:1、1:1四种中的一种；
仿生肌纤维膜中HAP和WH纳米粒子水溶液的浓度范围为0.5-20.0μg·mL-1，HAP纳米粒子水溶液和WH纳米粒子水溶液的体积比为4:1、3:1、2:1、1:1四种中的一种；
仿生肌肉中HAP和WH纳米粒子水溶液的浓度范围为0.0-10.0μg·mL-1，HAP纳米粒子水溶液和WH纳米粒子水溶液的体积比为3:1、2:1、1:1、0:0四种中的一种。
5.根据权利要求1所述的一种多通道挤出3D生物打印制备仿生骨骼肌复合组织的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中，仿生生物墨水中PI的浓度范围均为0.1-2.0％(W/V)。
6.根据权利要求1所述的一种多通道挤出3D生物打印制备仿生骨骼肌复合组织的制备方法，其特征在于，所述步骤S5中，恒温箱的温度范围为15-60℃。
7.根据权利要求1所述的一种多通道挤出3D生物打印制备仿生骨骼肌复合组织的制备方法，其特征在于，所述步骤S5中MSCs和C2C12的浓度范围分别为：
仿生骨中MSCs的浓度范围为1.0-5.0M·mL-1；
仿生骨膜中MSCs的浓度范围为0.5-4.0M·mL-1，C2C12的浓度范围为0.5-4.0M·mL-1；
仿生肌纤维膜中MSCs的浓度范围为0.5-4.0M·mL-1，C2C12的浓度范围为0.5-4.0M·mL-1；
仿生肌肉中C2C12的浓度范围为5.0-10.0M·mL-1。
8.根据权利要求1所述的一种多通道挤出3D生物打印制备仿生骨骼肌复合组织的制备方法，其特征在于，所述步骤S6中的多通道挤出3D生物打印机的喷嘴直径为180.0-240.0μm，挤出压力为20.0-45.0psi，挤出速度为200.0-500.0mm·min-1。
9.根据权利要求1所述的一种多通道挤出3D生物打印制备仿生骨骼肌复合组织的制备方法，其特征在于，所述步骤S7中UV照射时间为10-40s。
10.一种多通道挤出3D生物打印制备仿生骨骼肌复合组织，其特征在于，该仿生骨骼肌复合组织是通过权利要求1-9中任一项所述的制备方法制备得到的。
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