CN114558172B - 一种双层仿生人工骨膜及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双层仿生人工骨膜及其制备方法和应用。双层仿生人工骨膜包括仿生生发层和仿生纤维层,仿生生发层以甲基丙烯酰化明胶与纳米羟基磷灰石制备的GelMA‑H‑nHA水凝胶作为生物墨水通过3D打印技术制备。仿生纤维层以甲基丙烯酰化明胶与N‑丙烯酰基2‑甘氨酸制备的P(ACG‑GelMA‑L)‑Mg2+水凝胶作为生物墨水通过3D打印技术制备。本发明骨膜具有双层生物活性仿生、慢速降解、高强度等特点,可保护缺损区,防止纤维组织渗入损伤骨从而阻碍修复疗效,而且其还具有促进成骨、成血管与免疫调节功能,促进缺损区域新骨形成。本发明采用3D打印技术可实现对不规则骨缺损区域形状特异性、个性化的骨膜打印。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料及生物医学工程技术领域,特别涉及一种双层仿生人工骨膜及其制备方法和应用。
背景技术
外伤、肿瘤和遗传病等其他骨病导致的骨缺损、骨折延迟愈合甚至不愈合是骨 科面临的一大挑战。目前,大量治疗集中于研究和开发种植骨,包括异体和自体植 骨,以及各种组织工程植骨材料。然而,人们过多关注骨缺损本身,却忽视了骨膜 及损伤在骨科疾病发展中发挥的重要作用。
骨膜作为正常骨组织的重要组成部分,是包裹在骨组织周围的薄而韧的结缔组织膜,对骨组织的发育和修复起着决定性作用,可分为内层和外层。外层又称纤维 层,细胞成分较少,主要含有胶原和弹力纤维以及丰富的血管网。外层为骨膜和骨 提供结构支撑、保护作用和血液供应。临床研究发现,骨膜损伤会导致纤维组织渗 入损伤骨,从而阻碍修复疗效。内层称为形成层,紧贴骨表面,富含成骨细胞和具 有多潜能分化潜能的间充质干细胞,形成成骨细胞或软骨母细胞。作为前体细胞库, 一旦损伤发生,可通过分化作用参与骨修复。
目前,多项研究已经集中于构建人工骨膜促进骨缺损修复。但迄今为止构建的 人工骨膜均为单层,未能模拟天然骨膜的双层微体系结构。因此,如何构建双层结 构的多功能仿生骨膜,使其发挥生物活性及组织学作用,是一个需要解决的关键问 题。此外,天然高分子可降解材料通常面临体内降解较快的问题,这会导致负载药 物过快的释放与清除及难以维持组织形态,而材料降解缓慢会影响组织长入,所以 如何使人工骨膜的降解与新骨生长速率相匹配,同样是一个亟待解决的难题。
发明内容
本发明为了解决上述技术问题,提供了一种双层仿生人工骨膜及其制备方法和应用。
本发明是通过以下技术方案得以实现的。
一种双层仿生人工骨膜,包括仿生生发层和仿生纤维层,所述仿生生发层选用GelMA-H-nHA材料,仿生纤维层选用P(ACG-GelMA-L)-Mg2+材料。
作为双层仿生人工骨膜的优选实施方式,所述仿生生发层以GelMA-H-nHA水 凝胶作为生物墨水通过3D打印技术制备。
进一步的,所述GelMA-H-nHA水凝胶中,每毫升去离子水中含GelMA-H 0.1-0.2g、nHA0.03-0.13g。
作为双层仿生人工骨膜的优选实施方式,所述仿生纤维层以 P(ACG-GelMA-L)-Mg2+水凝胶作为生物墨水通过3D打印技术制备。
进一步的,所述P(ACG-GelMA-L)-Mg2+水凝胶中,每毫升去离子水含GelMA-L 0.05-0.1g、ACG 0.2-0.35g,Mg离子浓度为5-20mM。
一种双层仿生人工骨膜的制备方法,包括以下步骤:
S1.将GelMA-H和nHA在去离子水中均匀分散,然后加入光引发剂,混合均匀;
S2.将ACG和GelMA-L溶于含有Mg2+的去离子水中,然后加入光引发剂,混 合均匀;
S3.3D打印双层骨膜支架:以步骤S1制备的混合物作为生物墨水进行生发层骨 膜支架打印;生发层打印完后,以步骤S2制备的混合物作为生物墨水进行纤维层骨 膜支架打印,最后在紫外光下进行光引发聚合20-40min,得到双层骨膜支架。
通过采用上述技术方案,本申请采用3D打印技术设计并制备了由生发层和纤 维层组成的双层骨膜。甲基丙烯酰化明胶(GelMA)被选择作为主要生物墨水,因 其具有丰富的生物活性位点和较好的加工性能,同时能起到增稠的作用,从而可做 到挤出式打印。将纳米羟基磷灰石(nHA)作为共同墨水加入GelMA中,打印出仿 生生发层。nHA作为人和动物骨骼的主要无机成分,可通过化学键与骨组织结合, 释放的钙离子(Ca2+)参与体内代谢,刺激或诱导骨的再生。此外,nHA可与GelMA 的聚合物链结合,起到可逆交联作用,从而增强韧性和黏聚强度。为使纤维层具备 较高的机械强度,起到保护缺损区免受外界组织损伤的作用,将GelMA与刺激响应 型氢键单体N-丙烯酰基2-甘氨酸(ACG)结合形成混合油墨,通过3D打印技术制 成特异性纤维层。其中ACG因后聚合作用产生多重氢键增强了GelMA水凝胶的力 学特性。GelMA与ACG共聚反应可以稳定PACG网络,使其在体内在适当的时间 内降解。为进一步增强骨缺损的修复效果,将镁离子负载到纤维层中,镁离子可以 促进骨矿化和血管生成,并调节免疫系统。
作为双层仿生人工骨膜制备方法的优选实施方式,步骤S1中,每毫升去离子水 中加入GelMA-H 0.1-0.2g、nHA 0.03-0.13g。
作为双层仿生人工骨膜制备方法的优选实施方式,步骤S2中,每毫升去离子水 中加入GelMA-L 0.05-0.1g、ACG 0.2-0.35g,Mg离子浓度为5-20mM。
作为双层仿生人工骨膜制备方法的优选实施方式,步骤S1和S2中,所述光引 发剂的加入量为单体固含量的1.5-2.5%,即每1g GelMA单体加入15-25μl光引发 剂。
一种双层仿生人工骨膜在制备治疗骨缺损产品中的应用。
本申请具有以下有益效果。
1.本发明仿生双层骨膜结构可以保护缺损区,防止纤维组织渗入损伤骨从而阻碍修复疗效。仿生双层骨膜结构中,生发层中的nHA可与GelMA的聚合物链结合, 起到可逆交联作用,从而增强韧性和黏聚强度。纤维层中的GelMA与刺激响应型氢 键单体N-丙烯酰基2-甘氨酸(ACG)结合形成了高机械强度的混合油墨。ACG因后 聚合作用产生多重氢键增强了GelMA水凝胶的力学特性,弥补了单纯GelMA力学 强度不足的缺点。此外,单纯GelMA体内降解较快,难以维持组织形态,且会导致 负载的药物被快速释放与清除,本发明中的GelMA与ACG共聚反应可以稳定PACG 网络,延长降解时间。
2.本发明仿生双层骨膜具有促进成骨、成血管与免疫调节功能,可促进缺损区域新骨形成。生发层负载的nHA可通过化学键与骨组织结合,释放的钙离子(Ca2+)参 与体内代谢,刺激或诱导骨的再生。同时,纤维层中负载的镁离子可以促进骨矿化 和血管生成,并调节免疫系统。
3.制作方法上,本发明采用3D打印技术,可以实现对不规则骨缺损区域形状特 异性、个性化的骨膜打印。有望结合临床影像数字资料,利用软件模拟缺损形态针 对性地打印支架,符合数字化、精细化、个体化的临床治疗模式。
附图说明
图1是本发明GelMA-H-nHA水凝胶和P(ACG-GelMA-L)-Mg2+水凝胶的理化 性质图(其中,a.PACG和P(ACG-GelMA-L)的膨胀行为结果图;b.GelMA-H-nHA 水凝胶的平衡含水量结果图;c.P(ACG-GelMA-L)-Mg2+水凝胶的平衡含水量结果图; d.GelMA-H-nHA水凝胶的体外降解结果图;e.P(ACG-GelMA-L)-Mg2+水凝胶的体 外降解结果图;f.Ca2+和Mg2+的动态释放结果图);
图2是本发明水凝胶的力学性能结果图(其中,a.GelMA-H-nHA水凝胶的拉伸 应力结果图;b.GelMA-H-nHA水凝胶的压缩应力结果图;c.P(ACG-GelMA-L)-Mg2+水凝胶的拉伸应力结果图;d.P(ACG-GelMA-L)-Mg2+水凝胶的压缩应力结果图);
图3是本发明两种生物墨水的流变性检测结果图(其中,a.ACG-GelMA-L生物 墨水的温度扫描图;b.ACG-GelMA-L生物墨水的剪切稀化性能结果图;c. ACG-GelMA-L生物墨水的剪切速率(1、10、100、1000 1/s)的循环扫描图;d. GelMA-H-nHA生物墨水的温度扫描图;e.GelMA-H-nHA生物墨水的剪切稀化性能 结果图;f.GelMA-H-nHA生物墨水的剪切速率(1、10、100、1000 1/s)的循环扫描图);
图4是本发明模拟的3D打印过程和打印结构图像(其中,a.模拟GelMA-H-nHA 油墨在3D打印过程中,黏度随温度和剪切速率变化而变化的挤出过程图; b.GelMA-H-nHA厚度为2毫米的3D打印网格支架照片;c.ACG-GelMA-L-Mg2+厚 度为2毫米的3D打印网格支架照片;d.图C局部放大高清照片;e.直径为6mm,厚 度为1mm的双层骨膜支架照片);
图5是本发明3D打印双层骨膜支架促进体外成骨的评估结果图(其中,a.rMSCsALP和ARS染色评估成骨分化结果图;b.Runx2成骨标志基因相对表达水平结果图; c.ALP成骨标志基因相对表达水平结果图;d.COL-1成骨标志基因相对表达水平结 果图);
图6是本发明3D打印双层骨膜支架调节免疫和促进血管生成的结果图(其中, a.促炎细胞因子TNF-α的相对表达水平图;b.促炎细胞因子iNOS的相对表达水平 图;c.促炎细胞因子IL-6的相对表达水平图;d.促炎细胞因子IL-1β的相对表达水 平图;e.HUVECs在3h和6h形成的毛细血管样网络图;f.毛细管网络中形成的网 格数分析图;g.毛细血管网形成的连接数分析图;h.VEGF表达水平图;i.HIF-1α 表达水平图);
图7是本发明3D打印双层骨膜支架促进体内骨再生的评估结果图(其中,a. 支架植入后8周和12周骨缺损区的micro-CT图;b.定量分析8周和12周的新骨组 织BV/TV的结果图;c.定量分析8周和12周的新骨组织BMD的结果图;d.定量 分析8周和12周的新骨组织Tb·Th的结果图;e.植入后8周和12周颅骨缺损区HE 染色图(4x))。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本专利申请进行进一步的说明。
一、水凝胶的制备和表征
1、鉴定不同甲基丙烯酸甲酯(DM)化的GelMA
为了确定所得GelMA的甲基丙烯酸甲酯化程度,将明胶和GelMA分别溶于D2O 中。通过1H NMR谱图的积分计算其甲基丙烯酰化(DM)程度。根据公式(1)计算 GelMA的DM程度。
其中,A(明胶的赖氨酸亚甲基)和A(GelMA的赖氨酸亚甲基)分别表示明胶和GelMA光谱中赖氨酸亚甲基在2.8~2.95ppm的积分面积。将得到的高DM(65.98%) 和低DM(25.12%)的GelMA分别命名为GelMA-H和GelMA-L。
2、制备GelMA水凝胶:
将0.3g GelMA-H于40℃下溶于2ml去离子水中,随后加入6μl(占单体固含 量2%,即每1g GelMA-H单体加入20μl)的光引发剂IRGACURE 1173,在365nm 紫外光下,在交联烘箱(XL-1000紫外交联剂,美国NY Spectronics公司)中聚合 40min,得到GelMA-H15水凝胶。同样的,分别将0.1、0.14、0.2g GelMA-L溶于 2ml去离子水中,分别加入2μl、2.8μl、4μl光引发剂紫外光照射下交联,得到 GelMA-L5、GelMA-L7和GelMA-L10水凝胶(GelMA-Hx或GelMA-Lx中,x代表 GelMA质量含量,即每100毫升去离子水中加入的GelMA单体克数)。
3、制备GelMA-H-nHA水凝胶:
以2ml去离子水为溶剂,分别溶解0.3g的GelMA-H及一定质量的nHA(分别 为0.09g、0.15g和0.2g)。溶质均匀分散后,加入6μl光引发剂,经365nm紫外 光照射交联40min,得到GelMA-H15-nHA30、GelMA-H15-nHA50、 GelMA-H15-nHA67水凝胶(GelMA-H-nHAx中,x表示nHA相对于GelMA的质量 百分含量)。
4、制备P(ACG-GelMA-L)-Mg2+水凝胶:
用2ml含有20mMMgCl2的去离子水溶解0.5g ACG与一定质量的GelMA-L(分 别为0.1、0.14、0.2g)。然后加入光引发剂IRGACURE 1173(占单体固含量2%, 即每1g GelMA单体加入20μl光引发剂),经365nm紫外光照射交联40min,得 到P(ACG25-GelMA-L5)-Mg2+、P(ACG25-GelMA-L7)-Mg2+和 P(ACG25-GelMA-L10)-Mg2+水凝胶(P(ACGx-GelMA-Ly)-Mg2+中,x和y分别表示 ACG和GelMA-L的质量含量,即每100毫升去离子水中加入的单体克数)。
5、测量水凝胶动态溶胀行为
1)利用电子天平称量水凝胶初始湿重计为W0,随后在PBS溶液中浸泡t小时 后测量溶胀水凝胶的湿重计为Wt,实验均重复三次
2)利用公式(2)测量溶胀比(SW),评估水凝胶的动态溶胀行为
图1a显示原始PACG水凝胶在48h内迅速溶胀,最后溶于PBS中,而P (ACG-GelMA-L)-Mg2+水凝胶在7d内能保持其完整性并达到稳定的溶胀平衡。这种 稳定的溶胀既源于ACG与GelMA-L之间的化学交联,也源于PACG中Mg2+与羧 基之间的离子交联。
6、测量水凝胶平衡含水量(EWCs)
1)将水凝胶模压成圆柱形,在去离子水中浸泡至少一周达到平衡,测得湿重为W1,随后将水凝胶完全干燥,记录其干重为W0,实验均重复三次。
2)利用公式(3)测量平衡含水量(EWCs)
图1b和图1c所示的平衡含水量(EWCs)结果与溶胀率结果一致。包封nHA几乎 不影响GelMA-H-nHA水凝胶的EWCs,约为85%。虽然P(ACG-GelMAL)-Mg2+水凝胶表现出较低的EWCs,但可以吸收约61~78%的水。
7、测量水凝胶的体外降解情况
1)在37℃条件下,将150mg水凝胶置于含有1mL 5μg/mLⅡ型胶原酶溶液 的离心管中,每隔两天更换一次胶原酶溶液。
2)在指定的时间点,将液体从离心管中吸出。将剩余的水凝胶冻干72h,然后 记录各时间点的干重为Wt,初始水凝胶的干重记为W0,实验均重复三次
3)根据公式(4)计算水凝胶的残余百分数质量:
图1d和图1e显示,GelMA中加入nHA可以在一定程度上减缓降解速率,但 是仍然降解很快,难与新骨生长速度相匹配。相比之下,ACG与GelMA共聚可显 著抑制降解速率,延长降解时间至60d以上,有利于骨再生。
8、测量水凝胶的离子释放情况
1)在37℃条件下,将200mg GelMA-H-nHA和200mg P(ACG-GelMA-L)-Mg2+水凝胶分别浸入5mL PBS溶液中。
2)在某一时间点,取出水凝胶,收集剩余液体,用电感耦合等离子体发射光谱 仪(ICP-MS)测定离子的释放量。
图1f显示在降解过程中,GelMA-H-nHA水凝胶和P(ACG-GelMA-L)-Mg2+水凝 胶分别在28d内持续释放Ca2+和Mg2+。
9、测量水凝胶的力学特性
1)水凝胶浸泡在去离子水中直到达到平衡,在英斯特朗2344型微型试验机上 进行室温下拉伸和压缩力学性能测试。
2)将充分溶胀的水凝胶打孔成厚度为0.5mm的哑铃形试样进行拉伸强度测试, 拉伸试验十字头速度设定分别为10mm/min。
3)将充分溶胀的水凝胶模压成直径为4.2mm的圆柱形试样进行压缩强度测试, 压缩试验十字头速度设定分别为50mm/min。
4)按照公式(5)计算水凝胶样品的应力:其中F表示载荷,A表示初始截面 积。
图2a和图2b显示,在GelMA-H凝胶中引入nHA,机械强度显著提高,当nHA 含量提高到67%时,拉伸应力和拉伸模量分别提高到116.28kPa和236.18kPa,是 GelMA-H凝胶的2.33倍和2.4倍。图2c和2d显示,P(ACG25-GelMA-L7)-Mg2+水 凝胶能够承受0.472MPa的拉应力和2.164MPa的压应力,高于图2a和2b中所示 GelMA水凝胶基骨膜支架。
二、3D打印双层骨膜支架的制备和表征
1.3D打印双层支架的制备
1.1 3D打印生发层骨膜支架:
采用挤出式3D生物打印机(中国杭州雷根诺沃)对双层骨膜支架进行打印。生发层每层高0.2mm,共4层。具体方法为:将GelMA、nHA和引发剂的混合物预热 至37℃,机筒温度设定为27℃,在印刷过程中,挤压速度固定为8mm/min,压力 为0.2MPa,平台温度设定为10℃。
1.2 3D打印纤维层骨膜支架:
打印完生发层后,对纤维层进行打印,纤维层每层高0.2mm,共4层。具体方 法为:先将含有MgCl2、ACG、GelMA-L和光引发剂的混合物在4℃预冷至少20min, 然后将混合物转移到18℃的桶中。印刷过程中,挤压速度设定为10mm/min,压力 为50k Pa,平台温度控制在-10℃。最后,在紫外光下进行光引发聚合30min,确保 化学交联完成。
2.两种生物墨水的流变性检测
2.1生物墨水凝胶-溶胶转变点检测:
采用直径25mm、间距1mm平行板Anton Paar MCR302(奥地利)测试GelMA-H、GelMA-H-nHA、GelMA-L和ACG-GelMA-L-Mg2+墨水的流变特性。将墨水置于平 台上,初始温度设定为4℃,直至胶凝。在4~40℃温度范围内进行温度扫描试验, 加热速度固定为2℃/min,频率和形变率分别设置为1Hz和0.5%。在此过程中,分 别记录储能模量G′、损耗模量G″和黏度,以确定凝胶-溶胶转变点,分析黏度 变化趋势。
温度扫描结果如图3a和3d所示,ACG单体的加入可能会扰乱GelMA-L的三螺 旋结构,表现为凝胶-溶胶转变温度降低到20℃左右,而在GelMA-H水溶液中加入 nHA并没有引起凝胶-溶胶转变温度的明显变化。
2.2生物墨水剪切稀化性能的验证:
设定剪切速率在一定温度下从0.1到1000s-1变化的程序,根据各自最适的打印 条件设定温度,分别设置GelMA-H和GelMA-H-nHA墨水为27℃,GelMA-L和 ACG-GelMA-L-Mg2+墨水为18℃。分别在18和27℃下从0.005Hz到10Hz进行频 率扫描试验,并设置剪切速率随时间变化的程序,记录黏度,时间间隔定为一步60 秒。
图3b和e显示了墨水的剪切稀化曲线,值得注意的是,ACG-GelMA-L-Mg2+和 GelMA-H-nHA墨水均具有适合3D打印的初始黏度。随着剪切速率的增加,油墨的 黏度不断降低,呈现出典型的剪切稀化特征。上述流变测试结果表明GelMA-H-nHA 和ACG-GelMA-L-Mg2+墨水适合挤出式3D打印。
2.3交替剪应变试验检查生物墨水的自恢复特性:
考察GelMA-H-nHA和ACG-GelMA-L-Mg2+水凝胶墨水在时间间隔为60s的交 替剪应变试验(1%,100%,200%,300%)中的自恢复特性,并记录储能模量G′和 损耗模量G″。
图3c和f结果表明,生物墨水在较宽的频率范围内保持了稳定的模量。另外, 交替剪应变扫描曲线显示了模量的快速恢复。在低剪应变(1%)下,G′和G″几 乎保持恒定,G′相比于G″占优势,提示由于氢键相互作用形成凝胶状态。当 剪应变增大到100%、200%和300%时,G'和G'逐渐接近,最终在高剪应变(300%) 下发生凝胶-溶胶转变。一旦剪应变回到1%,G′和G″在不到30s内就能恢复 到初始状态,验证了氢键的快速重构。上述流变测试结果表明GelMA-H-nHA和 ACG-GelMA-L-Mg2+墨水适合挤出式3D打印。
3.3D打印双层支架样本展示
3.1以GelMA-H-nHA墨水为例,设置程序模拟印刷过程中黏度的变化趋势
图4a模拟演示了GelMA-H15-nHA67印刷过程中墨水粘度随温度和剪切速率变 化的变化情况。具体而言,将油墨预冷至4℃,使其在凝胶状态下保持相对较高黏 度。当生物墨水转移到打印桶中,温度升高到27℃时,在低剪切速率下油墨黏度略 有下降。此后,在27℃挤压打印过程中,黏度随剪切速率的增加而明显下降。最终, 油墨在低温平台上挤出后恢复到初始状态,并能保持稳定状态,直至光引发聚合进 行。
3.2 3D打印支架样本展示:
图4b和4c分别展示了GelMA-H15-nHA67和ACG25-GelMA-L7-Mg2+墨水打印 的多层网格结构。由于墨水的自承受能力,挤出后丝状物保持稳定,结构几乎没有 坍塌。在图4d中可以观察到丝状物形成的清晰的网格化结构,验证了印刷构图保持 了较高的保真度。图4e为与体内骨缺损模型尺寸相匹配,打印直径6mm、厚度1mm 的骨膜支架。
三、3D打印双层骨膜支架可以促进成骨,调节免疫和促进血管生成
1.3D打印双层骨膜支架促进成骨
1.1碱性磷酸酶(ALP)染色评估rMSC早期成骨分化:
将rMSCs以1×105/孔的密度接种于24孔板中培养,然后加入GelMA-H、 GelMA-H-nHA或双层支架,培养3d和7d后,进行ALP染色。
如图5a所示,双层支架组在第7天染色显色面积显著大于其他组。实验结果表 明,nHA和镁离子的联合添加,导致ALP表达水平升高。
1.2茜素红S(ARS)染色测定基质矿化情况:
将rMSCs以1×105/孔的密度接种于24孔板中培养,然后加入GelMA-H、 GelMA-H-nHA或双层支架,培养14d和28d后,进行ARS染色。
如图5a所示,与其他三组相比,双层支架组表现出更强的基质矿化水平,实验 结果表明,其更高的促进骨再生潜能。
1.3利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分析成骨相关基因表达情况:
将rMSCs以2×105/孔的密度接种于6孔板中,分别加入GelMA-H、 GelMA-H-nHA或双层支架。用TRIzol(Invitrogen)提取细胞总RNA,Nanodrop检测 所提RNA浓度及纯度。按照试剂盒说明加入反转录酶,进行反转录及合成cDNA, -20℃保存。按照Green Master的试剂盒说明配制反应体系,并上 机检测。反应体系为:qPCR SYBR GreenMaster Mix 10ul,上下游引物(参见表1, 10uM)各0.4ul,cDNA 2ul,ddH2O 7.2ul。反应条件为:预变性95℃5min;变性 95℃10s,退火56℃20s,延伸72℃20s,共50个循环;熔解曲线95℃15s,60℃ 1min,95℃1s。每组均进行3个重复,以GADPH为内参基因,使用2-△△Ct法测定相对mRNA表达水平。
表1 qRT-PCR引物序列信息
通过RT-PCR结果(图5b-d,NC:阴性对照。*P<0.05,**P<0.01,***P< 0.001)可以看出,其与ALP和ARS染色结果一致,在双层支架刺激下,Runx2、ALP、 COL-1等成骨标志基因的相对表达水平这些基因的表达水平显著上调。
2.3D打印双层骨膜支架调节免疫
将Raw246.7细胞以2×105/孔的密度接种于6孔板中培养24h,随后加入LPS 处理24h后,分别加入P(ACG-GelMA-L)水凝胶、P(ACG-GelMA-L)-Mg2+水凝胶或 双层支架。培养24h后,利用RT-PCR技术检测促炎细胞因子(TNF-α、iNOS、IL-6、 IL-1β)的基因表达。图6a-d(NC:阴性对照。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001) 显示,与没有镁离子的组相比,P(ACG-GelMA-L)-Mg2+水凝胶和双层支架中促炎细 胞因子的表达均显著降低。
3.3D打印双层骨膜支架促进血管生成
3.1成血管实验测量血管生成情况:
首先将Matrigel胶涂在96孔板的底部,在96孔板上培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),密度为3×104/孔。随后,将P(ACG-GelMA-L)-Mg2+水凝胶或双层支架 置入板中。在特定时间点(3h和6h),在倒置荧光显微镜(EVOS M5000,Invitrogen 公司)下观察形成的毛细管样结构,并利用Image J分析了网格和节点数目。
图6e显示HUVECs在不同水凝胶刺激下形成的毛细血管样网络图像,图6f-g 分析结果表明,与阴性对照组(NC)相比,P(ACG-GelMA-L)-Mg2+水凝胶和双层支架 均显著增加了网格和结的数量,提示其具有较强的促血管生成能力。
3.2 RT-PCR检测成血管相关基因表达:
将HUVECs细胞以2×105/孔的密度接种于6孔板中,分别加入 P(ACG-GelMA-L)-Mg2 +水凝胶或双层支架培养6h。利用RT-PCR技术检测VEGF和 HIF-1α的基因表达。
图6h-i(NC:阴性对照。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)结果显示, 与NC组相比,加入含镁离子水凝胶后VEGF和HIF-1α的表达水平明显升高,与 成管实验结果一致。
四、3D打印双层骨膜支架促进颅骨修复
1.大鼠颅骨缺损造模与支架植入
将39只雄性Sprague-Dawley大鼠(200-250mg)随机分为三组:(1)阴性对照组(NC,未经处理),n=13;(2)GelMA-H-nHA支架组,n=13;(3)双层支架组n=13。 按照标准实验方法建立大鼠颅骨临界大小缺损模型,即全身麻醉后,将大鼠颅部备 皮并消毒。然后,在生理盐水溶液持续冲洗的条件下,采用慢速电动环钻钻孔,构 建双侧6mm对称全层颅骨缺损。缺损处用支架填充或不填支架作为空白对照,用间 断缝合闭合上层组织。术后8周和12周处死大鼠,取颅骨,取得的样品用4%多聚 甲醛固定。
2.Micro-CT定量成骨分析
为了定量评价骨缺损内的骨形成情况,采用Scanco Medical μCT 50系统(ScancoMedical AG,Bruttisellen,Switzerland)对标本进行扫描,分辨率为15μm(1毫 米铝过滤器,100千伏,100毫安)。利用CTVox软件(Skyscan公司)重建三维图像, 并通过感兴趣区(ROI)骨密度(BMD)、骨体积与组织体积比(BV/TV)、骨小梁厚度 (Tb·Th)的值来量化分析新骨形成情况。
如图7a所示,3组骨组织在8周时均已出现钙化,当观察时间延长至12周时 新形成的骨组织增加更多,成骨密度和体积则表现出显著差异。由于仿生生发层与 纤维层的协同作用,双层支架的修复效果最好。Micor-CT结果进一步印证,双层支 架骨组织体积/总组织体积(BV/TV)、骨密度和骨小梁厚度(Tb·Th)均显著优于其 他组(图7b-d,*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001)。
3.HE染色观察组织成骨情况
固定后,标本在脱水前用EDTA(pH 7.2)脱钙4周,随后石蜡包埋。将石蜡样 本切成7μm厚的组织切片,进行苏木精-伊红(H&E)染色,并用荧光显微镜拍照。
图7e(NB、F和RS分别代表新生骨组织、纤维组织和残留支架)HE染色也 验证了支架的成骨功能,其中填充双层支架的样本成骨最多,而NC组和 GelMA-H-nHA支架组的样本仍有很多区域为纤维组织。HE染色结果与Micro-CT 结果一致,表明在镁离子和nHA纳米颗粒的协同作用下,3D打印双层支架有助于 对临界尺寸骨缺损的修复。
本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例,并非依此限制本发明的保护范围,故:凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化,均应涵盖于本发明 的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种双层仿生人工骨膜,其特征在于:包括仿生生发层和仿生纤维层,所述仿生生发层选用GelMA-H-nHA材料,仿生纤维层选用P(ACG-GelMA-L)-Mg2+材料;所述双层仿生人工骨膜的制备方法包括以下步骤:
S1.将GelMA-H和nHA在去离子水中均匀分散,然后加入光引发剂,混合均匀;
S2.将ACG和GelMA-L溶于含有Mg2+的去离子水中,然后加入光引发剂,混合均匀;
S3.3D打印双层骨膜支架:以步骤S1制备的混合物作为生物墨水进行生发层骨膜支架打印;生发层打印完后,以步骤S2制备的混合物作为生物墨水进行纤维层骨膜支架打印,最后在紫外光下进行光引发聚合20-40 min,得到双层骨膜支架;
所述GelMA-H为甲基丙烯酸甲酯化程度为65.98%的GelMA;GelMA-L为甲基丙烯酸甲酯化程度为25.12%的GelMA,甲基丙烯酸甲酯化程度计算公式为:
其中,A(明胶的赖氨酸亚甲基)和A(GelMA的赖氨酸亚甲基)分别表示明胶和GelMA光谱中赖氨酸亚甲基在2.8~2.95 ppm的积分面积。
2.根据权利要求1所述的一种双层仿生人工骨膜,其特征在于:所述仿生生发层以GelMA-H-nHA水凝胶作为生物墨水通过3D打印技术制备。
3.根据权利要求2所述的一种双层仿生人工骨膜,其特征在于:所述GelMA-H-nHA水凝胶中,每毫升去离子水中含GelMA-H 0.1-0.2g、nHA 0.03-0.13g。
4.根据权利要求1所述的一种双层仿生人工骨膜,其特征在于:所述仿生纤维层以P(ACG-GelMA-L)-Mg2+水凝胶作为生物墨水通过3D打印技术制备。
5.根据权利要求4所述的一种双层仿生人工骨膜,其特征在于:所述P(ACG-GelMA-L)-Mg2+水凝胶中,每毫升去离子水含GelMA-L 0.05-0.1g、ACG 0.2-0.35g,Mg离子浓度为5-20mM。
6.一种权利要求1-5任一所述双层仿生人工骨膜的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
S1.将GelMA-H和nHA在去离子水中均匀分散,然后加入光引发剂,混合均匀;
S2.将ACG和GelMA-L溶于含有Mg2+的去离子水中,然后加入光引发剂,混合均匀;
S3.3D打印双层骨膜支架:以步骤S1制备的混合物作为生物墨水进行生发层骨膜支架打印;生发层打印完后,以步骤S2制备的混合物作为生物墨水进行纤维层骨膜支架打印,最后在紫外光下进行光引发聚合20-40 min,得到双层骨膜支架。
7.根据权利要求6所述的一种双层仿生人工骨膜的制备方法,其特征在于:步骤S1中,每毫升去离子水中加入GelMA-H 0.1-0.2g、nHA 0.03-0.13g。
8.根据权利要求6所述的一种双层仿生人工骨膜的制备方法,其特征在于:步骤S2中,每毫升去离子水中加入GelMA-L 0.05-0.1g、ACG 0.2-0.35g,Mg离子浓度为5-20mM。
9.根据权利要求6所述的一种双层仿生人工骨膜的制备方法,其特征在于:步骤S1和S2中,所述光引发剂的加入量为单体固含量的1.5-2.5%。
10.一种权利要求1-5任一所述双层仿生人工骨膜在制备治疗骨缺损产品中的应用。
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