CN105435311B - 一种组织工程骨软骨复合支架及其制备方法 - Google Patents

一种组织工程骨软骨复合支架及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种组织工程骨软骨复合支架及其制备方法，属于生物材料技术领域。该支架为多层一体化结构，由软骨组织支架层、软骨组织钙化层、多孔的细胞隔断膜和骨组织支架层构成。软骨组织支架层接种软骨细胞并引入促进成软骨的生长因子，促进软骨细胞的生长；选用生物相容性好且可降解的硫酸肝素蛋白聚糖等主要原料，采用交联反应、冷冻干燥、定向造孔、多层复合、完全一体化等方法获得力学性能良好的功能化多层一体化组织工程骨软骨复合支架。本发明采用微纳米羟基磷灰石晶体和可降解的非化学计量的聚乙二醇/聚ε‑己内酯纳米同轴短纤维以及接枝了RGD的硫酸肝素蛋白聚糖/氧化海藻酸钠与N‑琥珀酰壳聚糖进行复合，主要用于关节软骨及软骨下骨全层缺损的修复。

Description

一种组织工程骨软骨复合支架及其制备方法
技术领域
本发明属于生物材料工程技术领域，涉及人体关节软骨的组织工程支架制备技术。
背景技术
目前，因创伤、感染、肿瘤及退变等导致的可动关节端软骨缺损是骨科临床常见疾病，常表现为顽固性疼痛、关节活动障碍，严重者可丧失运动功能，并且软骨损伤会导致进一步的软骨磨损和关节面的损坏。由于关节软骨没有血管、神经和淋巴系统，直径超过2～4mm的软骨缺损几乎不能完全自我修复；且临床上单纯关节软骨损伤比较少见，更多的是伴随软骨下骨的病变，包括创伤引起的软骨下骨的缺损，骨软骨炎病变引起的软骨下骨的坏死，软骨退变引起的软骨下骨的硬化、脂肪变等。因此，在修复软骨的同时还需修复软骨下骨。传统治疗方法均存在诸多明显缺陷：关节清理术暂时缓解症状，不能阻止病程发展；关节融合术、关节切除成形术使关节功能严重丧失；人工关节置换术存在远期骨溶解和假体松动等问题；关节镜下骨软骨移植术，自体移植造成供体区域缺损且来源有限、异体移植则存在排斥反应及潜在传染疾病等弊端；难以实现关节软骨及软骨下骨的自然修复再生。组织工程技术的迅速发展，为关节软骨及软骨下骨缺损的再生修复提供了新的解决方案。
用组织工程学方法修复关节软骨及软骨下骨，在临床研究或动物实验研究中取得了一定的临床效果，使得全层的关节损伤修复成为可能。目前组织工程骨软骨支架材料设计主要分为以下几类：1)骨采用支架而软骨不采用支架，即在骨支架上方直接种植上高密度的软骨细胞或成软骨细胞，经体外培养后植入或者不经体外培养直接植入体内对关节软骨及软骨下骨缺损进行修复；2)采用适合骨、软骨构建的两种支架材料，分别在体外培养形成组织工程骨和软骨，然后粘合、或手术缝合、或顺序植入等方法将组织工程骨和软骨部分组装成组织工程骨软骨复合体；3)骨和软骨部分皆采用相同的支架材料的一体化单层支架；4)骨软骨部分分别采用两种不同的支架材料构建的一体化的双层支架。而其中一体化双层支架，其骨和软骨支架层的成分及结构是根据骨和软骨生长的需要而设计的，因而这种一体化的组织工程骨软骨复合支架具有更优良的特性。
组织工程骨软骨支架材料存在的主要问题是构建的骨和软骨的界面结合较差以及支架种植体与周围宿主骨软骨整合性能不佳，而且关节软骨构建后的功能不理想。导致以上问题的主要原因与目前支架材料的设计缺陷有关。纵观自然关节组织的构造，它包含了软骨区、软骨钙化区和骨化区等多个区域，其组织和结构是逐渐过渡的，没有明显的界面，因而力学结构稳定。反观目前组织工程骨软骨体支架材料的设计，骨和软骨部分没有过渡区，在界面处杨氏模量无法匹配，因而界面处容易导致应力集中。此外，这种设计亦难以实现种植体与周围宿主骨软骨较好的整合。这足以说明软骨钙化层是组织工程骨软骨支架材料设计不可缺少的要素。因此，要解决骨和软骨界面的结合问题，必须在骨和软骨间引入过渡层，即软骨钙化层。软骨钙化层的引入不仅有利于骨和软骨界面的杨氏模量的匹配，也由于种植体与周围宿主骨软骨组织结构更加相似而有助于种植体与周围宿主骨软骨间的界面整合。此外，作为骨软骨过渡界面的软骨钙化层是一种物理屏障，还起到了阻断血管侵入软骨的作用，是防止全层缺损骨化及软骨修复不可缺少的条件。目前为此，软骨钙化层研究主要大多聚焦在深层软骨细胞的研究中，或通过深层软骨细胞在矿化基质的培养构建软骨钙化层，或是通过深层软骨细胞在单层矿化基质的培养构建软骨钙化层，这些研究发现矿化基质以及含有磷酸钙颗粒的基质有利于软骨钙化层的形成。这些研究仅孤立地对软骨钙化层进行研究而忽略了骨层和浅层软骨细胞层及其代谢对软骨钙化层的影响。
发明内容
本发明的目的是提供一种组织工程骨软骨复合支架，它能有效地解决关节软骨及软骨下骨的重建问题，有利于体内关节软骨及软骨下骨全层缺损的修复。
本发明的另一个目的是提供一种组织工程骨软骨复合支架的制备方法。它能有效地解决组织工程骨软骨复合支架制备成形问题。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种组织工程骨软骨复合支架，通过分别制备其复合溶胶，复合支架的软骨支架层为上层复合溶胶，它是在接枝了RGD(精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸三肽序列)的硫酸肝素蛋白聚糖、氧化海藻酸钠与N-琥珀酰壳聚糖复合形成的溶胶基体中均匀混入生长因子和纳米同轴短纤维及软骨细胞悬浮液的方式，并对生长因子进行联合序贯使用构建而成；复合支架的软骨钙化层为中间层复合溶胶，它是在接枝了RGD的硫酸肝素蛋白聚糖、氧化海藻酸钠与N-琥珀酰壳聚糖复合形成的溶胶基体中均匀混入微米羟基磷灰石、载生长因子的纳米同轴短纤维和软骨肥大细胞悬浮液的方式，对生长因子进行缓释构建而成；复合支架的骨支架层为底层复合溶胶，它是在接枝了RGD的氧化海藻酸钠-海藻酸钠与钙离子交联形成的溶胶基体中均匀混入纳米羟基磷灰石、生长因子的纳米同轴短纤维和成骨细胞悬浮液的方式，对生长因子进行缓释构建而成；将上述三种功能层复合溶胶组装在一起，构成一体化组织工程骨软骨复合支架，同时，在中间层和底层之间通过静电纺丝的方式制备孔径小于5μm的多孔的细胞隔断膜。
所述纳米同轴纤维的内轴为载生长因子的聚乙二醇，外轴为聚ε-己内酯。
所述的纳米同轴短纤维在骨组织支架层复合溶胶、软骨组织钙化层复合溶胶和软骨组织支架层复合溶胶所载的生长因子分别为BMP-2、Wnt/β-catenin和FGF-2。
本发明的另一个目的是通过以下技术方案来实现的：一种组织工程骨软骨复合支架的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：载生长因子的纳米同轴短纤维的制备，将聚ε-己内酯溶于氯仿配成质量分数为20％的聚合物溶液作为外轴，流速设置为0.5mL/h，将聚乙二醇溶于蒸馏水配成质量分数为40％的聚合物溶液并加入生长因子作为内轴，流速设置为0.1mL/h，外加直流高电压为20kV，以转速为1200r/min的高速转动的滚筒作为接收器，喷射针头的外针头内径为1.1mm，内针头外径为0.6mm，内针头内径0.3mm和滚筒边缘的距离为15cm，制备得到定向的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴纤维，真空干燥，将聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴纤维在-20℃环境下固定并用冰冻切片包埋剂包埋，再将包埋的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴纤维在-70℃下冷冻5min，通过冰冻切片机在-20℃环境下进行冰冻切割。将冰冻切割后的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维立即混悬于蒸馏水中，然后离心15min分离聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维；再抽滤洗涤三遍，将得到的载生长因子的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维冷冻干燥，灭菌，备用。
步骤二：纳米羟基磷灰石的制备，将硝酸钙和磷酸氢二铵分别溶于蒸馏水中配成质量体积比分别为11.8w/v％硝酸钙溶液和6.58w/v％的磷酸氢二铵溶液，将硝酸钙溶液与磷酸氢二铵溶液在搅拌下混合均匀并加入氨水调节至PH＝11，然后向混合溶液中加入4～8g乙二胺四乙酸并在180℃条件下水热6小时，然后抽滤、清洗、烘干，灭菌，备用。
步骤三：微米羟基磷灰石的制备，将硝酸钙和磷酸氢二铵分别溶于蒸馏水中配成质量体积比分别为11.8w/v％硝酸钙溶液和6.58w/v％的磷酸氢二铵溶液，将硝酸钙溶液与磷酸氢二铵溶液在搅拌下混合均匀并加入氨水调节至PH＝11，然后向混合溶液中加入6～9g乙二胺四乙酸二钠并在180℃条件下水热10小时，然后抽滤、清洗、烘干，灭菌，备用。
步骤四：软骨组织支架层的构建，无菌条件下，将步骤一得到的且已灭菌的载生长因子的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维以及生长因子和软骨细胞悬浮液依次均匀地分散于接枝了RGD的硫酸肝素蛋白聚糖、氧化海藻酸钠与N-琥珀酰壳聚糖复合形成的溶胶基体中，备用。
步骤五：软骨组织钙化层的构建，无菌条件下，将上述步骤得到的且已灭菌的载生长因子的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维、微米羟基磷灰石和软骨肥大细胞悬浮液均匀地分散于接枝了RGD的硫酸肝素蛋白聚糖、氧化海藻酸钠与N-琥珀酰壳聚糖复合形成的溶胶基体中，备用。
步骤六：多孔的细胞隔断膜的构建，将质量比为20︰1的聚乙二醇︰聚ε-己内酯溶于体积比为1︰9的N,N-二甲基甲酰胺︰二氯甲烷混合溶剂中，配成质量分数为20％的聚合物溶液，流速设置为0.5mL/h，外加直流高电压为15kV，以转速为200r/min滚筒作为接收器，针头和接收装置的距离为15cm，制备得到一层纤维膜，真空干燥，灭菌，备用。
步骤七：骨组织支架层的构建，无菌条件下，将上述步骤得到的且已灭菌的载生长因子的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维、纳米羟基磷灰石和成骨细胞悬浮液均匀地分散于接枝了RGD的氧化海藻酸钠-海藻酸钠复合溶胶中，备用。
步骤八：组织工程骨软骨复合支架的组装：无菌条件下，将构建软骨组织支架层的复合溶胶注入聚四氟乙烯模具底层，待形成凝胶后，向聚四氟乙烯模具中注入构建软骨组织钙化层的复合溶胶，待形成凝胶后，在其表面覆上聚乙二醇/聚ε-己内酯多孔细胞隔断膜，然后缓慢注入构建骨组织支架层的复合溶胶，最后在最上层加入氯化钙水溶液对海藻酸钠进行交联并对骨组织支架层进行平行孔道造孔。
所述的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维为平均长度≤10μm的生长因子的载体。
所述的微米羟基磷灰石为形状规整的微米棒。
所述的多孔的细胞隔断膜为孔径＜5μm的生物相容性好的可降解的聚乙二醇/聚ε-己内酯多孔膜。
所述的纳米羟基磷灰石为长度在30～100nm之间且形状规整的纳米棒。
所述的生长因子BMP-2分别载于骨组织支架层的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维和软骨组织支架层中接枝了RGD的硫酸肝素蛋白聚糖、氧化海藻酸钠与N-琥珀酰壳聚糖复合形成的溶胶基体中。
所述的软骨组织钙化层为关节软骨和软骨下骨的过渡界面。
所述的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维在骨组织支架层、软骨组织钙化层和软骨组织支架层所载的生长因子分别为BMP-2、Wnt/β-catenin和FGF-2，实现了生长因子的联合和序贯使用。
所述的生长因子BMP-2分别载于骨组织支架层的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维和软骨组织支架层中接枝了RGD的硫酸肝素蛋白聚糖、氧化海藻酸钠与N-琥珀酰壳聚糖复合形成的溶胶基体中，实现了BMP-2的时序释放。
所述的软骨组织钙化层为关节软骨和软骨下骨的过渡界面有利于骨软骨界面的杨氏模量的匹配，还起到了阻断血管侵入软骨的作用。
所述的组织工程骨软骨复合支架为能实现不同功能的骨组织支架层、多孔的细胞隔断膜、软骨组织钙化层和软骨组织支架层在功能、组成成分和三维空间结构上对天然关节软骨及软骨下骨进行仿生的功能化多层一体化组织工程骨软骨复合支架，有利于复合支架种植体与周围宿主骨软骨间的界面整合。
本发明与现有技术相比具有如下优点和有益效果：
1)采用硫酸肝素蛋白聚糖、氧化海藻酸钠、N-琥珀酰壳聚糖、聚ε-己内酯、聚乙二醇、羟基磷灰石等主要原料构建的功能化多层一体化组织工程骨软骨复合支架生物相容性好且可降解。
2)采用纳米羟基磷灰石和同轴电纺聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维对复合溶胶进行改性，本发明通过在海藻酸钠溶胶基体中均匀地混入纳米羟基磷灰石和同轴电纺聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维，一方面纳米羟基磷灰石和同轴电纺聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米短纤维的纳米级微观结构特性有利于蛋白质的吸附及调节与其相接触的细胞黏附、铺展与基因表达；另一方面纳米羟基磷灰石和同轴电纺聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米短纤维与海藻酸盐水凝胶基体共混复合，增强海藻酸钠溶胶基体的力学性能。
3)采用同轴电纺聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维在骨组织支架层、软骨组织钙化层、软骨组织支架层和接枝了RGD的硫酸肝素蛋白聚糖、氧化海藻酸钠与N-琥珀酰壳聚糖复合形成的溶胶基体中载不同的生长因子。本发明通过在聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维载BMP-2、Wnt/β-catenin、FGF-2和在接枝了RGD的硫酸肝素蛋白聚糖、氧化海藻酸钠与N-琥珀酰壳聚糖复合形成的溶胶基体中载BMP-2、TGF-β1从而有效地实现多种生长因子的缓控释、时序释放以及联合序贯使用；促进软骨细胞、骨细胞以及内皮细胞的增殖分化，引导软骨、骨和血管的形成和实关节软骨和软骨下骨的重建。
4)本发明的创新还在于：在关节软骨和软骨下骨之间引入过渡层，即软骨钙化层。软骨钙化层的引入不仅有利于骨和软骨界面的杨氏模量的匹配，也由于种植体与周围宿主骨软骨组织结构更加相似而有助于种植体与周围宿主骨软骨间的界面整合。此外，作为骨软骨过渡界面的软骨钙化层是一种物理屏障，还起到了阻断血管侵入软骨的作用，是防止全层缺损骨化及软骨修复不可缺少的条件。该方法基于仿生原理，充分模拟天然关节软骨及软骨下骨的功能、组成成分和三维空间结构特征，使其制备的组织工程骨软骨复合支架具有功能化多层一体化的特点。
附图说明
图1为本发明的制备工艺流程图
图2为本发明的纳米羟基磷灰石的扫描电子显微镜照片
图3为本发明的微米羟基磷灰石的扫描电子显微镜照片
图4为本发明的复合溶胶支架骨组织支架层干燥后的扫描电子显微镜照片
具体实施方式
本发明的制备工艺流程如图1所示，除特别申明外，所用原料均为化学纯，下面结合具体实施例详细描述本发明，应当理解的是这些实施例仅用于例证本发明，本发明不仅局限于这些实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例1：
准确称取1.00g聚ε-己内酯，加入5mL氯仿中，配制成20w/v％溶液，磁力搅拌溶解均匀；准确称取2.00g聚乙二醇，50ng BMP-2加入5mL蒸馏水中，配制成40w/v％溶液，磁力搅拌溶解均匀。分别注入5mL的干燥注射器中，注射器固定在微量注射泵的卡槽中，高压直流电源输出端固定在同轴喷头上(外针头内径为1.1mm，内针头外径为0.6mm，内针头内径0.3mm)，外轴为聚ε-己内酯溶液，流速设置为0.5mL/h。内轴为聚乙二醇溶液，流速设置为0.1mL/h，外加直流高电压为20kV，以高速转动的滚筒作为接收器(转速为1200r/min)，同轴喷头和接收装置的距离为15cm，制备得到定向的纤维膜。将获得的纤维膜室温下真空干燥48h，然后将定向纤维膜用蒸馏水完全浸润后，以垂直于定向方向折叠(间隔2cm)，将厚度约为2cm的折叠纤维按纤维垂直方向在-20℃环境下固定并用冰冻切片包埋剂包埋，再将包埋的纤维在-70℃下冷冻5min，通过冰冻切片机在-20℃环境下进行冰冻切割。将冰冻切割后的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维立即混悬于蒸馏水中，然后离心15min分离聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维，再抽滤洗涤三遍，将得到的载BMP-2的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维冷冻干燥，灭菌，备用。
准确称取1.00g聚ε-己内酯，加入5mL氯仿中，配制成20w/v％溶液，磁力搅拌溶解均匀；准确称取2.00g聚乙二醇，50ng FGF-2加入5mL蒸馏水中，配制成40w/v％溶液，磁力搅拌溶解均匀。分别注入5mL的干燥注射器中，注射器固定在微量注射泵的卡槽中，高压直流电源输出端固定在同轴喷头上(外针头内径为1.1mm，内针头外径为0.6mm，内针头内径0.3mm)，外轴为聚ε-己内酯溶液，流速设置为0.5mL/h；内轴为聚乙二醇溶液，流速设置为0.1mL/h，外加直流高电压为20kV，以高速转动的滚筒作为接收器(转速为1200r/min)，同轴喷头和接收装置的距离为15cm，制备得到定向的纤维膜。将获得的纤维膜室温下真空干燥48h，然后将定向纤维膜用蒸馏水完全浸润后，以垂直于定向方向折叠(间隔2cm)，将厚度约为2cm的折叠纤维按纤维垂直方向在-20℃环境下固定并用冰冻切片包埋剂包埋，再将包埋的纤维在-70℃下冷冻5min，通过冰冻切片机在-20℃环境下进行冰冻切割。将冰冻切割后的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维立即混悬于蒸馏水中，然后离心15min分离聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维；再抽滤洗涤三遍，将得到的载FGF-2的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维冷冻干燥，灭菌，备用。
准确称取1.00g聚ε-己内酯，加入5mL氯仿中，配制成20w/v％溶液，磁力搅拌溶解均匀；准确称取2.00g聚乙二醇，50ng Wnt/β-catenin加入5mL蒸馏水中，配制成40w/v％溶液，磁力搅拌溶解均匀。分别注入5mL的干燥注射器中，注射器固定在微量注射泵的卡槽中，高压直流电源输出端固定在同轴喷头上(外针头内径为1.1mm，内针头外径为0.6mm，内针头内径0.3mm)，外轴为聚ε-己内酯溶液，流速设置为0.5mL/h。内轴为聚乙二醇溶液，流速设置为0.1mL/h，外加直流高电压为20kV，以高速转动的滚筒作为接收器(转速为1200r/min)，同轴喷头和接收装置的距离为15cm，制备得到定向的纤维膜。将获得的纤维膜室温下真空干燥48h，然后将定向纤维膜用蒸馏水完全浸润后，以垂直于定向方向折叠(间隔2cm)，将厚度约为2cm的折叠纤维按纤维垂直方向在-20℃环境下固定并用冰冻切片包埋剂包埋，再将包埋的纤维在-70℃下冷冻5min，通过冰冻切片机在-20℃环境下进行冰冻切割。将冰冻切割后的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维立即混悬于蒸馏水中，然后离心15min分离聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维；再抽滤洗涤三遍，将得到的载Wnt/β-catenin的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维冷冻干燥，灭菌，备用。
准确称取4.72g硝酸钙(四水)溶于40mL蒸馏水配成浓度为0.5M的溶液，再准确称取1.58g磷酸氢二铵溶于24mL蒸馏水配成浓度为0.5M的溶液，将硝酸钙溶液与磷酸氢二铵在搅拌下混合均匀并加入氨水调节至PH＝11，然后向混合溶液中加入5.84g乙二胺四乙酸再移入高压反应釜并在180℃条件下水热6h，然后抽滤、洗涤、烘干得纳米羟基磷灰石。将得到的纳米羟基磷灰石灭菌，备用。
准确称取4.72g硝酸钙(四水)溶于40mL蒸馏水配成浓度为0.5M的溶液，再准确称取1.58g磷酸氢二铵溶于24mL蒸馏水配成浓度为0.5M的溶液，将硝酸钙溶液与磷酸氢二铵在搅拌下混合均匀并加入氨水调节至PH＝11，然后向混合溶液中加入7.44g乙二胺四乙酸二钠再移入高压反应釜并在180℃条件下水热10h，然后抽滤、洗涤、烘干得纳米羟基磷灰石。将得到的微米羟基磷灰石灭菌，备用。
准确称取1.00g聚ε-己内酯，0.05g聚乙二醇加入到N,N-二甲基甲酰胺︰二氯甲烷(体积1︰9)混合溶剂中，配制成聚乙二醇/聚ε-己内酯混合溶液，磁力搅拌溶解均匀，搅拌均匀后注入5mL的干燥注射器中，注射器固定在微量注射泵的卡槽中，高压直流电源输出端固定在注射器前段金属针上(针头内径为0.6mm)，流速设置为0.5mL/h，外加直流高电压为15kV，以滚筒作为接收器(转速为200r/min)，针头和接收装置的距离为15cm，将得到的纤维膜在室温下真空干燥48h，灭菌，备用。
无菌条件下，准确量取40w/v％接枝了RGD的硫酸肝素蛋白聚糖、氧化海藻酸钠溶液5mL，向其中依次加入载FGF-2的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维100mg、BMP-210ng、TGF-β1 10ng和1×107个/mL的软骨细胞悬浮液1mL；再准确量取10w/v％N-琥珀酰壳聚糖溶液20mL，将5mL 40w/v％接枝了RGD的硫酸肝素蛋白聚糖、氧化海藻酸钠溶液和20mL10w/v％N-琥珀酰壳聚糖溶液混合并快速搅拌均匀，将混合体系注入到圆柱形的聚四氟乙烯模具的底层，待形成凝胶后；准确量取40w/v％接枝了RGD的硫酸肝素蛋白聚糖、氧化海藻酸钠溶液5mL，向其中加入载Wnt/β-catenin的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维100mg、微米羟基磷灰石100mg和1×107个/mL的肥大软骨细胞悬浮液1mL；再准确量取10w/v％N-琥珀酰壳聚糖溶液20mL，将5mL 40w/v％接枝了RGD的硫酸肝素蛋白聚糖、氧化海藻酸钠溶液和20mL 10w/v％N-琥珀酰壳聚糖溶液混合并快速搅拌均匀，将混合体系注入到圆柱形的聚四氟乙烯模具中的凝胶上，在其表面覆上直径与模具内径相等的聚乙二醇/聚ε-己内酯多孔的细胞隔断膜，准确称取接枝了RGD的氧化海藻酸钠0.06g和海藻酸钠0.24g并配置成接枝了RGD的氧化海藻酸钠-海藻酸钠总质量体积分数为1.5％的溶液，向其中加入载BMP-2的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维100mg、纳米羟基磷灰石100mg和1×107个/mL的成骨细胞悬浮液1mL并搅拌均匀，将混合体系缓慢注入到聚乙二醇/聚ε-己内酯多孔的细胞隔断膜上，将4mL浓度为0.2M的氯化钙溶液小心均匀地喷到接枝了RGD的氧化海藻酸钠/海藻酸钠溶液的表面，反应20min，再以玻璃棒引流的方式缓慢加入2mL浓度为0.2M的氯化钙溶液对海藻酸钠进行交联并进行平行孔道造孔。即得组织工程骨软骨复合支架。
实施例2：
准确称取1.00g聚ε-己内酯，加入5mL氯仿中，配制成20w/v％溶液，磁力搅拌溶解均匀；准确称取2.00g聚乙二醇，50ng BMP-2加入5mL蒸馏水中，配制成40w/v％溶液，磁力搅拌溶解均匀。分别注入5mL的干燥注射器中，注射器固定在微量注射泵的卡槽中，高压直流电源输出端固定在同轴喷头上(外针头内径为1.1mm，内针头外径为0.6mm，内针头内径0.3mm)，外轴为聚ε-己内酯溶液，流速设置为0.5mL/h；内轴为聚乙二醇溶液，流速设置为0.1mL/h，外加直流高电压为20kV，以高速转动的滚筒作为接收器(转速为1200r/min)，同轴喷头和接收装置的距离为15cm，制备得到定向的纤维膜。将获得的纤维膜室温下真空干燥48h，然后将定向纤维膜用蒸馏水完全浸润后，以垂直于定向方向折叠(间隔2cm)，将厚度约为2cm的折叠纤维按纤维垂直方向在-20℃环境下固定并用冰冻切片包埋剂包埋，再将包埋的纤维在-70℃下冷冻5min，通过冰冻切片机在-20℃环境下进行冰冻切割。将冰冻切割后的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维立即混悬于蒸馏水中，然后离心15min分离聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维；再抽滤洗涤三遍，将得到的载BMP-2的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维冷冻干燥，灭菌，备用。
准确称取1.00g聚ε-己内酯，加入5mL氯仿中，配制成20w/v％溶液，磁力搅拌溶解均匀；准确称取2.00g聚乙二醇，50ng FGF-2加入5mL蒸馏水中，配制成40w/v％溶液，磁力搅拌溶解均匀。分别注入5mL的干燥注射器中，注射器固定在微量注射泵的卡槽中，高压直流电源输出端固定在同轴喷头上(外针头内径为1.1mm，内针头外径为0.6mm，内针头内径0.3mm)，外轴为聚ε-己内酯溶液，流速设置为0.5mL/h；内轴为聚乙二醇溶液，流速设置为0.1mL/h，外加直流高电压为20kV，以高速转动的滚筒作为接收器(转速为1200r/min)，同轴喷头和接收装置的距离为15cm，制备得到定向的纤维膜。将获得的纤维膜室温下真空干燥48h，然后将定向纤维膜用蒸馏水完全浸润后，以垂直于定向方向折叠(间隔2cm)，将厚度约为2cm的折叠纤维按纤维垂直方向在-20℃环境下固定并用冰冻切片包埋剂包埋，再将包埋的纤维在-70℃下冷冻5min，通过冰冻切片机在-20℃环境下进行冰冻切割。将冰冻切割后的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维立即混悬于蒸馏水中，然后离心15min分离聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维；再抽滤洗涤三遍，将得到的载FGF-2的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维冷冻干燥，灭菌，备用。
准确称取1.00g聚ε-己内酯，加入5mL氯仿中，配制成20w/v％溶液，磁力搅拌溶解均匀；准确称取2.00g聚乙二醇，50ng Wnt/β-catenin加入5mL蒸馏水中，配制成40w/v％溶液，磁力搅拌溶解均匀。分别注入5mL的干燥注射器中，注射器固定在微量注射泵的卡槽中，高压直流电源输出端固定在同轴喷头上(外针头内径为1.1mm，内针头外径为0.6mm，内针头内径0.3mm)，外轴为聚ε-己内酯溶液，流速设置为0.5mL/h；内轴为聚乙二醇溶液，流速设置为0.1mL/h，外加直流高电压为20kV，以高速转动的滚筒作为接收器(转速为1200r/min)，同轴喷头和接收装置的距离为15cm，制备得到定向的纤维膜。将获得的纤维膜室温下真空干燥48h，然后将定向纤维膜用蒸馏水完全浸润后，以垂直于定向方向折叠(间隔2cm)，将厚度约为2cm的折叠纤维按纤维垂直方向在-20℃环境下固定并用冰冻切片包埋剂包埋，再将包埋的纤维在-70℃下冷冻5min，通过冰冻切片机在-20℃环境下进行冰冻切割。将冰冻切割后的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维立即混悬于蒸馏水中，然后离心15min分离聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维；再抽滤洗涤三遍，将得到的载Wnt/β-catenin的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维冷冻干燥，灭菌，备用。
准确称取4.72g硝酸钙(四水)溶于40mL蒸馏水配成浓度为0.5M的溶液，再准确称取1.58g磷酸氢二铵溶于24mL蒸馏水配成浓度为0.5M的溶液，将硝酸钙溶液与磷酸氢二铵在搅拌下混合均匀并加入氨水调节至PH＝11，然后向混合溶液中加入4g乙二胺四乙酸再移入高压反应釜并在180℃条件下水热6h，然后抽滤、洗涤、烘干得纳米羟基磷灰石。将得到的纳米羟基磷灰石灭菌，备用。
准确称取4.72g硝酸钙(四水)溶于40mL蒸馏水配成浓度为0.5M的溶液，再准确称取1.58g磷酸氢二铵溶于24mL蒸馏水配成浓度为0.5M的溶液，将硝酸钙溶液与磷酸氢二铵在搅拌下混合均匀并加入氨水调节至PH＝11，然后向混合溶液中加入6g乙二胺四乙酸二钠再移入高压反应釜并在180℃条件下水热10h，然后抽滤、洗涤、烘干得纳米羟基磷灰石。将得到的微米羟基磷灰石灭菌，备用。
准确称取1.00g聚ε-己内酯，0.05g聚乙二醇加入到N,N-二甲基甲酰胺︰二氯甲烷(体积1︰9)混合溶剂中，配制成聚乙二醇/聚ε-己内酯混合溶液，磁力搅拌溶解均匀，搅拌均匀后注入5mL的干燥注射器中，注射器固定在微量注射泵的卡槽中，高压直流电源输出端固定在注射器前段金属针上(针头内径为0.6mm)，流速设置为0.5mL/h，外加直流高电压为15kV，以滚筒作为接收器(转速为200r/min)，针头和接收装置的距离为15cm，将得到的纤维膜在室温下真空干燥48h，灭菌，备用。
无菌条件下，准确量取40w/v％接枝了RGD的硫酸肝素蛋白聚糖、氧化海藻酸钠溶液5mL，向其中依次加入载FGF-2的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维100mg、BMP-210ng、TGF-β1 10ng和1×107个/mL的软骨细胞悬浮液1mL；再准确量取10w/v％N-琥珀酰壳聚糖溶液20mL，将5mL 40w/v％接枝了RGD的硫酸肝素蛋白聚糖、氧化海藻酸钠溶液和20mL10w/v％N-琥珀酰壳聚糖溶液混合并快速搅拌均匀，将混合体系注入到圆柱形的聚四氟乙烯模具的底层，待形成凝胶后；准确量取40w/v％接枝了RGD的硫酸肝素蛋白聚糖、氧化海藻酸钠溶液5mL，向其中加入载Wnt/β-catenin的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维100mg、微米羟基磷灰石100mg和1×107个/mL的肥大软骨细胞悬浮液1mL；再准确量取10w/v％N-琥珀酰壳聚糖溶液20mL，将5mL 40w/v％接枝了RGD的硫酸肝素蛋白聚糖、氧化海藻酸钠溶液和20mL 10w/v％N-琥珀酰壳聚糖溶液混合并快速搅拌均匀，将混合体系注入到圆柱形的聚四氟乙烯模具中的凝胶上，在其表面覆上直径与模具内径相等的聚乙二醇/聚ε-己内酯多孔的细胞隔断膜，准确称取接枝了RGD的氧化海藻酸钠0.06g和海藻酸钠0.24g并配置成接枝了RGD的氧化海藻酸钠-海藻酸钠总质量体积分数为1.5％的溶液，向其中加入载BMP-2的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维100mg、纳米羟基磷灰石100mg和1×107个/mL的成骨细胞悬浮液1mL并搅拌均匀，将混合体系缓慢注入到聚乙二醇/聚ε-己内酯多孔的细胞隔断膜上，将4mL浓度为0.2M的氯化钙溶液小心均匀地喷到接枝了RGD的氧化海藻酸钠/海藻酸钠溶液的表面，反应20min，再以玻璃棒引流的方式缓慢加入2mL浓度为0.2M的氯化钙溶液对海藻酸钠进行交联并进行平行孔道造孔。即得组织工程骨软骨复合支架。
实施例3：
准确称取1.00g聚ε-己内酯，加入5mL氯仿中，配制成20w/v％溶液，磁力搅拌溶解均匀；准确称取2.00g聚乙二醇，50ng BMP-2加入5mL蒸馏水中，配制成40w/v％溶液，磁力搅拌溶解均匀。分别注入5mL的干燥注射器中，注射器固定在微量注射泵的卡槽中，高压直流电源输出端固定在同轴喷头上(外针头内径为1.1mm，内针头外径为0.6mm，内针头内径0.3mm)，外轴为聚ε-己内酯溶液，流速设置为0.5mL/h；内轴为聚乙二醇溶液，流速设置为0.1mL/h，外加直流高电压为20kV，以高速转动的滚筒作为接收器(转速为1200r/min)，同轴喷头和接收装置的距离为15cm，制备得到定向的纤维膜。将获得的纤维膜室温下真空干燥48h，然后将定向纤维膜用蒸馏水完全浸润后，以垂直于定向方向折叠(间隔2cm)，将厚度约为2cm的折叠纤维按纤维垂直方向在-20℃环境下固定并用冰冻切片包埋剂包埋，再将包埋的纤维在-70℃下冷冻5min，通过冰冻切片机在-20℃环境下进行冰冻切割。将冰冻切割后的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维立即混悬于蒸馏水中，然后离心15min分离聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维；再抽滤洗涤三遍，将得到的载BMP-2的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维冷冻干燥，灭菌，备用。
准确称取1.00g聚ε-己内酯，加入5mL氯仿中，配制成20w/v％溶液，磁力搅拌溶解均匀；准确称取2.00g聚乙二醇，50ng FGF-2加入5mL蒸馏水中，配制成40w/v％溶液，磁力搅拌溶解均匀。分别注入5mL的干燥注射器中，注射器固定在微量注射泵的卡槽中，高压直流电源输出端固定在同轴喷头上(外针头内径为1.1mm，内针头外径为0.6mm，内针头内径0.3mm)，外轴为聚ε-己内酯溶液，流速设置为0.5mL/h；内轴为聚乙二醇溶液，流速设置为0.1mL/h，外加直流高电压为20kV，以高速转动的滚筒作为接收器(转速为1200r/min)，同轴喷头和接收装置的距离为15cm，制备得到定向的纤维膜。将获得的纤维膜室温下真空干燥48h，然后将定向纤维膜用蒸馏水完全浸润后，以垂直于定向方向折叠(间隔2cm)，将厚度约为2cm的折叠纤维按纤维垂直方向在-20℃环境下固定并用冰冻切片包埋剂包埋，再将包埋的纤维在-70℃下冷冻5min，通过冰冻切片机在-20℃环境下进行冰冻切割。将冰冻切割后的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维立即混悬于蒸馏水中，然后离心15min分离聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维；再抽滤洗涤三遍，将得到的载FGF-2的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维冷冻干燥，灭菌，备用。
准确称取1.00g聚ε-己内酯，加入5mL氯仿中，配制成20w/v％溶液，磁力搅拌溶解均匀；准确称取2.00g聚乙二醇，50ng Wnt/β-catenin加入5mL蒸馏水中，配制成40w/v％溶液，磁力搅拌溶解均匀。分别注入5mL的干燥注射器中，注射器固定在微量注射泵的卡槽中，高压直流电源输出端固定在同轴喷头上(外针头内径为1.1mm，内针头外径为0.6mm，内针头内径0.3mm)，外轴为聚ε-己内酯溶液，流速设置为0.5mL/h；内轴为聚乙二醇溶液，流速设置为0.1mL/h，外加直流高电压为20kV，以高速转动的滚筒作为接收器(转速为1200r/min)，同轴喷头和接收装置的距离为15cm，制备得到定向的纤维膜。将获得的纤维膜室温下真空干燥48h，然后将定向纤维膜用蒸馏水完全浸润后，以垂直于定向方向折叠(间隔2cm)，将厚度约为2cm的折叠纤维按纤维垂直方向在-20℃环境下固定并用冰冻切片包埋剂包埋，再将包埋的纤维在-70℃下冷冻5min，通过冰冻切片机在-20℃环境下进行冰冻切割。将冰冻切割后的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维立即混悬于蒸馏水中，然后离心15min分离聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维；再抽滤洗涤三遍，将得到的载Wnt/β-catenin的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维冷冻干燥，灭菌，备用。
准确称取4.72g硝酸钙(四水)溶于40mL蒸馏水配成浓度为0.5M的溶液，再准确称取1.58g磷酸氢二铵溶于24mL蒸馏水配成浓度为0.5M的溶液，将硝酸钙溶液与磷酸氢二铵在搅拌下混合均匀并加入氨水调节至PH＝11，然后向混合溶液中加入8g乙二胺四乙酸再移入高压反应釜并在180℃条件下水热6h，然后抽滤、洗涤、烘干得纳米羟基磷灰石。将得到的纳米羟基磷灰石灭菌，备用。
准确称取4.72g硝酸钙(四水)溶于40mL蒸馏水配成浓度为0.5M的溶液，再准确称取1.58g磷酸氢二铵溶于24mL蒸馏水配成浓度为0.5M的溶液，将硝酸钙溶液与磷酸氢二铵在搅拌下混合均匀并加入氨水调节至PH＝11，然后向混合溶液中加入9g乙二胺四乙酸二钠再移入高压反应釜并在180℃条件下水热10h，然后抽滤、洗涤、烘干得纳米羟基磷灰石。将得到的微米羟基磷灰石灭菌，备用。
准确称取1.00g聚ε-己内酯，0.05g聚乙二醇加入到N,N-二甲基甲酰胺︰二氯甲烷(体积1︰9)混合溶剂中，配制成聚乙二醇/聚ε-己内酯混合溶液，磁力搅拌溶解均匀，搅拌均匀后注入5mL的干燥注射器中，注射器固定在微量注射泵的卡槽中，高压直流电源输出端固定在注射器前段金属针上(针头内径为0.6mm)，流速设置为0.5mL/h，外加直流高电压为15kV，以滚筒作为接收器(转速为200r/min)，针头和接收装置的距离为15cm，将得到的纤维膜在室温下真空干燥48h，灭菌，备用。
无菌条件下，准确量取40w/v％接枝了RGD的硫酸肝素蛋白聚糖、氧化海藻酸钠溶液5mL，向其中依次加入载FGF-2的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维100mg、BMP-210ng、TGF-β1 10ng和1×107个/mL的软骨细胞悬浮液1mL；再准确量取10w/v％N-琥珀酰壳聚糖溶液20mL，将5mL 40w/v％接枝了RGD的硫酸肝素蛋白聚糖、氧化海藻酸钠溶液和20mL10w/v％N-琥珀酰壳聚糖溶液混合并快速搅拌均匀，将混合体系注入到圆柱形的聚四氟乙烯模具的底层，待形成凝胶后；准确量取40w/v％接枝了RGD的硫酸肝素蛋白聚糖、氧化海藻酸钠溶液5mL，向其中加入载Wnt/β-catenin的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维100mg、微米羟基磷灰石100mg和1×107个/mL的肥大软骨细胞悬浮液1mL。再准确量取10w/v％N-琥珀酰壳聚糖溶液20mL，将5mL 40w/v％接枝了RGD的硫酸肝素蛋白聚糖、氧化海藻酸钠溶液和20mL 10w/v％N-琥珀酰壳聚糖溶液混合并快速搅拌均匀，将混合体系注入到圆柱形的聚四氟乙烯模具中的凝胶上，在其表面覆上直径与模具内径相等的聚乙二醇/聚ε-己内酯多孔的细胞隔断膜，准确称取接枝了RGD的氧化海藻酸钠0.06g和海藻酸钠0.24g并配置成接枝了RGD的氧化海藻酸钠-海藻酸钠总质量体积分数为1.5％的溶液，向其中加入载BMP-2的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维100mg、纳米羟基磷灰石100mg和1×107个/mL的成骨细胞悬浮液1mL并搅拌均匀，将混合体系缓慢注入到聚乙二醇/聚ε-己内酯多孔的细胞隔断膜上，将4mL浓度为0.2M的氯化钙溶液小心均匀地喷到接枝了RGD的氧化海藻酸钠/海藻酸钠溶液的表面，反应20min，再以玻璃棒引流的方式缓慢加入2mL浓度为0.2M的氯化钙溶液对海藻酸钠进行交联并进行平行孔道造孔。即得组织工程骨软骨复合支架。

Claims (10)

1.一种组织工程骨软骨复合支架，其特征在于：复合支架的软骨支架层为上层复合溶胶，它是在接枝了RGD的硫酸肝素蛋白聚糖、氧化海藻酸钠与N-琥珀酰壳聚糖复合形成的溶胶基体中均匀混入生长因子和纳米同轴短纤维及软骨细胞悬浮液的方式，并对生长因子进行联合序贯使用构建而成；复合支架的软骨钙化层为中间层复合溶胶，它是在接枝了RGD的硫酸肝素蛋白聚糖、氧化海藻酸钠与N-琥珀酰壳聚糖复合形成的溶胶基体中均匀混入微米羟基磷灰石、载生长因子的纳米同轴短纤维和软骨肥大细胞悬浮液的方式，对生长因子进行缓释构建而成；复合支架的骨支架层为底层复合溶胶，它是在接枝了RGD的氧化海藻酸钠-海藻酸钠与钙离子交联形成的溶胶基体中均匀混入纳米羟基磷灰石、生长因子的纳米同轴短纤维和成骨细胞悬浮液的方式，对生长因子进行缓释构建而成；将上述三种功能层复合溶胶组装在一起，构成一体化组织工程骨软骨复合支架，同时，在中间层和底层之间通过静电纺丝的方式制备孔径小于5μm的多孔的细胞隔断膜。
2.根据权利要求1所述的一种组织工程骨软骨复合支架，其特征在于：所述纳米同轴纤维的内轴为载生长因子的聚乙二醇，外轴为聚ε-己内酯。
3.根据权利要求1所述的一种组织工程骨软骨复合支架，其特征在于：所述的纳米同轴短纤维在骨组织支架层复合溶胶、软骨组织钙化层复合溶胶和软骨组织支架层复合溶胶所载的生长因子分别为BMP-2、Wnt/β-catenin和FGF-2。
4.一种组织工程骨软骨复合支架的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：载生长因子的纳米同轴短纤维的制备，将聚ε-己内酯溶于氯仿配成质量分数为20％的聚合物溶液作为外轴，流速设置为0.5mL/h，将聚乙二醇溶于蒸馏水配成质量分数为40％的聚合物溶液并加入生长因子作为内轴，流速设置为0.1mL/h，外加直流高电压为20kV，以转速为1200r/min的高速转动的滚筒作为接收器，喷射针头的外针头内径为1.1mm，内针头外径为0.6mm，内针头内径0.3mm和滚筒边缘的距离为15cm，制备得到定向的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴纤维，真空干燥，将聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴纤维在-20℃环境下固定并用冰冻切片包埋剂包埋，再将包埋的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴纤维在-70℃下冷冻5min，通过冰冻切片机在-20℃环境下进行冰冻切割，将冰冻切割后的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维立即混悬于蒸馏水中，然后离心15min分离聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维，再抽滤洗涤三遍，将得到的载生长因子的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维冷冻干燥，灭菌，备用；
步骤二：纳米羟基磷灰石的制备，将硝酸钙和磷酸氢二铵分别溶于蒸馏水中配成质量体积比分别为11.8w/v％硝酸钙溶液和6.58w/v％的磷酸氢二铵溶液，将硝酸钙溶液与磷酸氢二铵溶液在搅拌下混合均匀并加入氨水调节至PH＝11，然后向混合溶液中加入4～8g乙二胺四乙酸并在180℃条件下水热6小时，然后抽滤、清洗、烘干，灭菌，备用；
步骤三：微米羟基磷灰石的制备，将硝酸钙和磷酸氢二铵分别溶于蒸馏水中配成质量体积比分别为11.8w/v％硝酸钙溶液和6.58w/v％的磷酸氢二铵溶液，将硝酸钙溶液与磷酸氢二铵溶液在搅拌下混合均匀并加入氨水调节至PH＝11，然后向混合溶液中加入6～9g乙二胺四乙酸二钠并在180℃条件下水热10小时，然后抽滤、清洗、烘干，灭菌，备用；
步骤四：软骨组织支架层的构建，无菌条件下，将步骤一得到的且已灭菌的载生长因子的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维以及生长因子和软骨细胞悬浮液依次均匀地分散于接枝了RGD的硫酸肝素蛋白聚糖、氧化海藻酸钠与N-琥珀酰壳聚糖复合形成的溶胶基体中，备用；
步骤五：软骨组织钙化层的构建，无菌条件下，将上述步骤得到的且已灭菌的载生长因子的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维、微米羟基磷灰石和软骨肥大细胞悬浮液均匀地分散于接枝了RGD的硫酸肝素蛋白聚糖、氧化海藻酸钠与N-琥珀酰壳聚糖复合形成的溶胶基体中，备用；
步骤六：多孔的细胞隔断膜的构建，将质量比为20︰1的聚乙二醇︰聚ε-己内酯溶于体积比为1︰9的N,N-二甲基甲酰胺︰二氯甲烷混合溶剂中，配成质量分数为20％的聚合物溶液，流速设置为0.5mL/h，外加直流高电压为15kV，以转速为200r/min滚筒作为接收器，针头和接收装置的距离为15cm，制备得到一层纤维膜，真空干燥，灭菌，备用；
步骤七：骨组织支架层的构建，无菌条件下，将上述步骤得到的且已灭菌的载生长因子的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维、纳米羟基磷灰石和成骨细胞悬浮液均匀地分散于接枝了RGD的氧化海藻酸钠-海藻酸钠复合溶胶中，备用；
步骤八：组织工程骨软骨复合支架的组装：无菌条件下，将构建软骨组织支架层的复合溶胶注入聚四氟乙烯模具底层，待形成凝胶后，向聚四氟乙烯模具中注入构建软骨组织钙化层的复合溶胶，待形成凝胶后，在其表面覆上聚乙二醇/聚ε-己内酯多孔细胞隔断膜，然后缓慢注入构建骨组织支架层的复合溶胶，最后在最上层加入氯化钙水溶液对海藻酸钠进行交联并对骨组织支架层进行平行孔道造孔,得到一体化组织工程骨软骨复合支架。
5.根据权利要求书4所述的一种组织工程骨软骨复合支架的制备方法，其特征在于：所述的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维为平均长度≤10μm的生长因子的载体。
6.根据权利要求书4所述的一种组织工程骨软骨复合支架的制备方法，其特征在于：所述的微米羟基磷灰石为形状规整的微米棒。
7.根据权利要求书4所述的一种组织工程骨软骨复合支架的制备方法，其特征在于：所述的多孔的细胞隔断膜为孔径＜5μm的生物相容性好的可降解的聚乙二醇/聚ε-己内酯多孔膜。
8.根据权利要求书4所述的一种组织工程骨软骨复合支架的制备方法，其特征在于：所述的纳米羟基磷灰石为长度在30～100nm之间且形状规整的纳米棒。
9.根据权利要求书4所述的一种组织工程骨软骨复合支架的制备方法，其特征在于：所述的生长因子BMP-2分别载于骨组织支架层的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维和软骨组织支架层中接枝了RGD的硫酸肝素蛋白聚糖、氧化海藻酸钠与N-琥珀酰壳聚糖复合形成的溶胶基体中。
10.根据权利要求书4所述的一种组织工程骨软骨复合支架的制备方法，其特征在于：所述的软骨组织钙化层为关节软骨和软骨下骨的过渡界面。
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