CN113941033B - 一种双载药纳米纤维水凝胶复合软骨修复系统及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种双载药纳米纤维水凝胶复合软骨修复系统，载有kartogenin的同轴纳米纤维为骨架，载有七叶皂苷钠的复合水凝胶填充于骨架的空隙并使其最终形成具有弹性的圆柱体，其中：所述同轴纳米纤维由芯层和壳层构成，芯层为聚乳酸，kartogenin均匀分散在聚乳酸中，壳层为丝素蛋白；所述复合水凝胶由七叶皂苷钠、壳聚糖、氧化羟乙基纤维素组成，七叶皂苷钠均匀分散在壳聚糖中。本发明具备优良的生物相容性、机械性能，同轴纤维膜能为软骨再生提供正确的引导，同时双载药的梯度释放能对软骨修复的不同阶段产生促进作用，保证了软骨修复的质量。

Description

一种双载药纳米纤维水凝胶复合软骨修复系统及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及软骨修复系统，尤其是一种双载药纳米纤维水凝胶复合软骨修复系统，本发明还涉及其制备方法。
背景技术
在临床骨科治疗中存在着大量因关节炎、运动损伤等各种原因导致的软骨缺损的病例，治疗手段通常是对缺损处进行清理，注射消炎药物缓解病人的疼痛，自体骨移植进行重建等。由于软骨组织的特殊结构，人体内一旦发生了软骨缺损很难通过人体的自愈能力进行恢复，因而对于关节软骨缺损的修复没有很好的方法。
随着材料工程学的发展，一些新型的仿生组织修复材料应运而生，但在软骨缺损方面，这些材料大多存在力学性能不佳，修复能力差等缺陷，而将自身细胞或外加细胞以及某些生长因子或蛋白加入到修复材料中可促进软骨修复。
目前制备软骨修复系统的材料主要包括天然生物材料、合成材料、或二者组成的复合材料等。丝素蛋白是一种天然生物材料，具有良好生物相容性、降解产物无毒、力学性能可调等优点。近些年的研究表明，通过种植各种细胞、不同的化学修饰以及负载各种生长因子等，丝素蛋白生物支架在骨组织工程中的应用变得越来越广泛。聚乳酸是一种绿色高分子材料，原料来源充足、无污染且可被生物降解，同时，聚乳酸还具有良好的机械性能和物理性能，易被加工制作成膜，但降解速率较慢，且降解产物呈酸性，易引发周围组织炎症，一般需要复合其他材料。壳聚糖是甲壳素脱除部分乙酰基的产物，具有无毒、安全、可生物降解的特点，能支持细胞的黏附与生长，还能抑制成纤维细胞的生长和瘢痕的形成，并促进内皮细胞的生长。
发明内容
本发明的目的在于提供一种双载药纳米纤维水凝胶复合软骨修复系统及其制备方法，该软骨修复系统不仅具备优良的生物相容性、机械性能，内部骨架取向同轴纤维膜还能为软骨再生提供正确的引导，同时双载药的梯度释放能对软骨修复的不同阶段产生促进作用，保证了软骨修复的质量。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种双载药纳米纤维水凝胶复合软骨修复系统，载有kartogenin的同轴纳米纤维为骨架，载有七叶皂苷钠的复合水凝胶填充于骨架的空隙并使其最终形成具有弹性的圆柱体，其中：
所述同轴纳米纤维由芯层和壳层构成，芯层为聚乳酸，kartogenin均匀分散在聚乳酸中，壳层为丝素蛋白；
所述复合水凝胶由七叶皂苷钠、壳聚糖、氧化羟乙基纤维素组成，七叶皂苷钠均匀分散在壳聚糖中。
优选地，所述同轴纳米纤维的直径为900-1600nm，芯层直径为300nm-750nm。
一种双载药纳米纤维水凝胶复合软骨修复系统的制备方法，包括以下步骤：
1)将聚乳酸和kartogenin溶于二氯甲烷中得到芯层纺丝溶液，将丝素蛋白溶于六氟异丙醇中得到壳层纺丝溶液，将二者进行同轴静电纺丝，得到以聚乳酸和kartogenin为芯层、以丝素蛋白为壳层的同轴纳米纤维；
2)将壳聚糖与七叶皂苷钠溶解在乙酸溶液中，然后加入氧化羟乙基纤维素，配制成复合水凝胶溶液；
3)将步骤1)得到的同轴纳米纤维剪裁后卷成圆柱体，放入模具，将步骤2)得到的复合水凝胶溶液注入膜具，交联固化后取出，即为双载药纳米纤维水凝胶复合软骨修复系统。
优选地，所述聚乳酸与kartogenin的质量比为105-109：1
优选地，所述聚乳酸与丝素蛋白的重量比为1-3：1。
优选地，所述壳聚糖与七叶皂苷钠的重量比为5-10：1。
优选地，所述壳聚糖与氧化羟乙基纤维素的重量比为0.5-3：1。
优选地，所述乙酸溶液的浓度为0.5-5wt％。
优选地，所述同轴静电纺丝的工作参数为；芯层纺丝液以0.1-0.2mm/min的推注速度推出，壳层纺丝液以0.1-0.2mm/min的推注速度推出，芯层与壳层速率比在1：1到1：2之间，同轴针头与接收器之间电压为11-13kv，接受距离为5-10cm，环境温度为20-25℃，相对湿度为25-40％。
在本发明中，Kartogenin是一种能够促进人间充质干细胞成软骨分化的小分子。kartogenin在软骨的再生与保护、肌腱骨的愈合、创面的愈合、肢体的发育等再生领域有着广泛的应用。kartogenin可促进软骨修复，促进腱骨连接处软骨样过渡区形成，促进创面愈合所需的胶原合成，协调调节肢体发育。七叶皂苷钠具有众多药理活性，在抗炎、抗渗出、消肿、增加静脉张力和抗肿瘤等方面作用显著，且副作用小，临床已较为广泛的应用于减轻神经损伤、降低炎症反应、促进肠蠕动、抗肿瘤等，且耐受性好，临床应用潜力大。
本发明提供的软骨修复系统包括作为骨架的载药同轴纳米纤维和填充在骨架空隙中的复合水凝胶。复合水凝胶为骨架系统提供了一定的机械强度与粘性，kartogenin均匀分散在聚乳酸中，提高了修复系统促进软骨细胞生长的能力。同时，水凝胶中分散的七叶皂苷钠能够抑制软骨修复早期的炎症反应，有助于干细胞的增值。载药同轴纳米纤维膜为取向型纳米纤维膜，有利于细胞的黏附及生长，引导修复后的软骨组织与正常软骨组织有类似的功能分区，为软骨再生提供正确的引导。此外，同轴纳米纤维内负载的kartogenin会产生缓释现象，水凝胶中负载的七叶皂苷钠会与kartogenin实现梯度释放，在软骨修复的前期，七叶皂苷钠抑制炎症反应有利于干细胞的增值，软骨修复后期，kartogenin促进干细胞向软骨细胞分化，实现了两药的协同作用，极大地促进了软骨损伤的修复。
相对于现有效果，本发明的有益效果如下：
1.本发明提供的软骨修复系统，设计了以同轴纤维膜为骨架，填充水凝胶成型的结构，并且纤维膜与水凝胶分别载药，将kartogenin置于同轴纤维的芯层，七叶皂苷钠分散在水凝胶中，实现了两种药物的梯度释放以及两种药物对软骨修复的协同作用，提高了软骨修复效果。
2.本发明分为两层，模仿了正常软骨组织的结构，其中以取向同轴纤维膜为修复系统的骨架，不仅有利于软骨细胞的黏附，更为其提供了方向引导，解决了目前临床软骨修复成纤维软骨，不具有正常软骨功能性的问题。本发明制备方法简单，可操作性强，所制备修复系统具备优异的生物相容性、机械性能，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例1制备的同轴纳米纤维被卷曲成圆柱体后的实物照片。
图2为实施例1制备的同轴纳米纤维扫描电镜(SEM)图。
图3为实施例1制备的同轴纳米纤维的透射电镜(TEM)图。
图4为实施例1制备得到的氧化羟乙基纤维素/壳聚糖(七叶皂苷钠)+聚乳酸(kartogenin)/丝素蛋白同轴纳米纤维组在56天内的药物累计释放率。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
材料：
聚乳酸：购买自Sigma-Aldrich西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司
Kartogenin：购买自MedChemExpress
丝素蛋白：购买自上海丝美特有限公司
氧化羟乙基纤维素：购买自Sigma-Aldrich西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司
壳聚糖：购买自Sigma-Aldrich西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司
七叶皂苷钠：购买自武汉爱民制药股份有限公司
BMSCs细胞：实验室自提，传3代后使用
CCK-8：购买自生工生物(上海)有限公司
实施例1
一种双载药纳米纤维水凝胶复合软骨修复系统，制备方法如下：
1)载药同轴纳米纤维的制备
将1g聚乳酸和0.001mg的kartogenin粉末溶于15mL二氯甲烷中，作为芯层纺丝溶液。将0.5g丝素蛋白溶于16g六氟异丙醇中，作为壳层纺丝溶液。将芯层和壳层溶液分别置于5mL一次性注射器中，连接好同轴实验装置后，设置芯层溶液以0.15mm/min的速度推出，壳层纺丝液以0.15mm/min的速度推出，同轴针管与接收板之间电压为11KV，接收距离为6cm，环境温度为25℃，相对湿度为30％，进行同轴静电纺丝，即得载药同轴纳米纤维，记为聚乳酸(kartogenin)/丝素蛋白同轴纳米纤维。
2)复合水凝胶的制备
将1g氧化羟乙基纤维素溶于20mL去离子水中搅拌，备用。将1g壳聚糖粉末与0.2g七叶皂苷钠粉末分散在20mL质量分数为1.5wt％的乙酸溶液中，加入等体积的氧化羟乙基纤维素溶液静置，得氧化羟乙基纤维素/壳聚糖(七叶皂苷钠)复合载药水凝胶。
3)双载药纳米纤维水凝胶软骨修复系统的制备
将步骤1所得的聚乳酸(kartogenin)/丝素蛋白同轴纳米纤维膜分别剪成宽3mm的条状膜和直径为5mm的圆形膜，备用。卷曲宽为3mm的条状膜以形成直径为5mm的圆柱体，放入聚四氟乙烯容器，加入步骤2)复合载药水凝胶至完全填充同轴纤维膜的缝隙，静置，通过450nm紫外光线照射进行交联。再将圆形膜叠放在上方，高度约0.5mm，再次注入步骤2)中复合载药水凝胶至完全填充同轴纤维膜的缝隙，静置，通过450nm紫外光线照射进行交联，即得到载药纳米纤维水凝胶复合软骨修复系统，记为氧化羟乙基纤维素/壳聚糖(七叶皂苷钠)+聚乳酸(kartogenin)/丝素蛋白同轴纳米纤维。
软骨修复系统常用的制备方法有浇筑成型法、静电纺丝法和熔融挤出法等。浇筑成型法操作简单，支架大小均一，是临床上制备填充物的常用方法。静电纺丝法制备的纤维具有纳米级尺寸，比表面积高，孔隙率大等优点，可模仿天然细胞外基质的结构，而且静电纺丝在常温常压下进行的，可以在加工过程中保持生长因子的活性。
图1为步骤1)制备的同轴纳米纤维被卷曲成圆柱体后的实物照片。圆柱体高为3mm、直径为5mm。
图2为步骤1)制备的同轴纳米纤维的扫描电镜(SEM)图。由SEM图可知，制备的纳米纤维粗细均匀，方向一致，能够为软骨再生提供良好的方向引导和物质支持。
图3为步骤1)制备的同轴纳米纤维的透射电镜(TEM)图。纤维直径为900-1600nm，芯层直径为300nm-750nm。
实施例2
一种双载药纳米纤维水凝胶复合软骨修复系统，制备方法如下：
1)载药同轴载药纳米纤维的制备
将1g聚乳酸和0.01mg的kartogenin粉末溶于15mL二氯甲烷中，作为芯层纺丝溶液。将1g丝素蛋白溶于32g六氟异丙醇中，作为壳层纺丝溶液。将芯层和壳层溶液分别置于5mL一次性注射器中，连接好同轴实验装置后，设置芯层溶液以0.1mm/min的速度推出，壳层纺丝液以0.2mm/min的速度推出，同轴针管与接收板之间电压为11KV，接收距离为8cm，环境温度为25℃，相对湿度为30％，进行同轴静电纺丝，即得载药同轴纳米纤维。
2)复合水凝胶的制备
将0.5g氧化羟乙基纤维素溶于20mL去离子水中搅拌，备用。将1g壳聚糖粉末与0.1g七叶皂苷钠粉末分散在20mL质量分数为0.5wt％的乙酸溶液中，加入等体积的氧化羟乙基纤维素溶液静置，得复合载药水凝胶。
3)双载药纳米纤维水凝胶软骨修复系统的制备
与实施例1相同。
实施例3
本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤2)中氧化羟乙基纤维素的加入量为0.3g。
1)载药同轴载药纳米纤维的制备
将1g聚乳酸和0.0005mg的kartogenin粉末溶于15mL二氯甲烷中，作为芯层纺丝溶液。将0.3g丝素蛋白溶于16g六氟异丙醇中，作为壳层纺丝溶液。将芯层和壳层溶液分别置于5mL一次性注射器中，连接好同轴实验装置后，设置芯层溶液以0.1mm/min的速度推出，壳层纺丝液以0.2mm/min的速度推出，同轴针管与接收板之间电压为11KV，接收距离为8cm，环境温度为25℃，相对湿度为30％，进行同轴静电纺丝，即得载药同轴纳米纤维，记为聚乳酸(kartogenin)/丝素蛋白同轴纳米纤维。
2)复合水凝胶的制备
将2g氧化羟乙基纤维素溶于20mL去离子水中搅拌，备用。将1g壳聚糖粉末与0.15g七叶皂苷钠粉末分散在20mL质量分数为3wt％的乙酸溶液中，加入等体积的氧化羟乙基纤维素溶液静置，得复合载药水凝胶。
3)双载药纳米纤维水凝胶软骨修复系统的制备
与实施例1相同。
试验例
(1)载药软骨修复系统的释放度检测
将实施例1步骤3)制备的载药神经导管浸入PBS中，放在摇床中(37℃，100pm)，在给定的时间间隔内，取1mL的释放介质，用220nm的紫外分光光度计进行检测，根据吸光值计算介质中的七叶皂苷钠和kartogenin的含量，然后用新鲜PBS溶液补偿试管，得到载药神经导管在56天内的药物累计释放率。
试验结果如图4示，结果表明：由于同轴纤维的包裹作用，kartogenin在软骨修复系统中的释放速度变慢，累计释放率在35天左右达到峰值，而分散在水凝胶中的七叶皂苷钠累计释放率在14天左右接近峰值。快速释放的七叶皂苷钠有利于缓解软骨修复前期产生的炎症反应，而缓慢释放的kartogenin更有利于在软骨修复后期发挥诱导干细胞向软骨细胞分化的作用。
(2)软骨修复系统对BMSCs细胞生长的影响
将本发明制备的软骨修复系统与BMSCs细胞共培养，分别于培养后的1，3，5天进行CCK-8细胞增殖活力检测，具体方法如下：
将各实施例组材料打孔至96孔板大小，置于超净工作台紫外光照射12小时灭菌，用生理盐水浸泡10分钟，然后将培养至2-3代的细胞用胰酶消化，稀释细胞浓度为1×104/mL，向各孔加入100μL细胞悬液，每组设6个复孔，培养5天，隔天换一次新鲜培养液。
分别于1、3、5天进行毒性检测，先在倒置荧光显微镜下观察细胞生长状态，然后向每孔加入10μL CCK-8，轻轻晃动使其混合均匀，在细胞培养箱培养4小时，取出培养板，弃去上清液，酶标仪上检测其OD值，OD值越高，说明细胞增殖速度越快。
同时设置空白组和以下对照组：
对照组1：
步骤1)：制备载药的聚乳酸/丝素蛋白同轴纳米纤维，方法同实施例1步骤1)；
步骤2)：制备不载药的氧化羟乙基纤维素/壳聚糖复合水凝胶，方法同实施例1步骤2)，但乙酸溶液中不加入七叶皂苷钠；
步骤3)：制备纳米纤维水凝胶软骨修复系统，方法同实施例1步骤3)，最终得到仅在同轴纳米纤维中含有kartogenin的复合软骨修复系统。
对照组2：
步骤1)：制备不载药的聚乳酸/丝素蛋白同轴纳米纤维，方法同实施例1步骤1)，但不向聚乳酸中加入kartogenin；
步骤2)：制备载药的氧化羟乙基纤维素/壳聚糖复合水凝胶，方法同实施例1步骤2)；
步骤3)：制备纳米纤维水凝胶软骨修复系统，方法同实施例1步骤3)，最终得到仅在复合水凝胶中含有七叶皂苷钠的复合软骨修复系统。
对照组3：
步骤1)：制备不载药的聚乳酸/丝素蛋白同轴纳米纤维，方法同实施例1步骤1)，但不向聚乳酸中加入kartogenin；
步骤2)：制备不载药的氧化羟乙基纤维素/壳聚糖复合水凝胶，方法同实施例1步骤2)，但乙酸溶液中不加入七叶皂苷钠；
步骤3)：制备纳米纤维水凝胶软骨修复系统，方法同实施例1步骤3)，最终得到在同轴纳米纤维和复合水凝胶中均不含药的复合软骨修复系统。
表1各组BMSCs细胞的OD值(n＝6)
Figure BDA0003360198450000071
Figure BDA0003360198450000081
注：与空白组相比，*P<0.05，**P<0.01。
从试验结果中可以看出，对照组3与空白组相比较差别不大(P>0.05)，说明复合软骨修复材料的加入对BMSCs细胞的生长增殖没有太大影响；对照组1的细胞增殖速度明显增加(P<0.05)，说明kartogenin对细胞增殖有一定促进作用；对照组2的细胞增殖速度有所增加，但与空白组相比无显著差异(P>0.05)；实施例1、2、3组的细胞增殖速度更快，其中实施例1在第3天就产生了极显著差异(P<0.01)，效果略优于其它实施例。

Claims (1)

1.一种双载药纳米纤维水凝胶复合软骨修复系统的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)载药同轴纳米纤维的制备
将1g聚乳酸和0.001mg的kartogenin粉末溶于15mL二氯甲烷中，作为芯层纺丝溶液；将0.5g丝素蛋白溶于16g六氟异丙醇中，作为壳层纺丝溶液；将芯层和壳层溶液分别置于5mL一次性注射器中，连接好同轴实验装置后，设置芯层溶液以0.15mm/min的速度推出，壳层纺丝液以0.15mm/min的速度推出，同轴针管与接收板之间电压为11KV，接收距离为6cm，环境温度为25℃，相对湿度为30％，进行同轴静电纺丝，即得载药同轴纳米纤维；
2)复合水凝胶的制备
将1g氧化羟乙基纤维素溶于20mL去离子水中搅拌，备用；将1g壳聚糖粉末与0.2g七叶皂苷钠粉末分散在20mL质量分数为1.5wt％的乙酸溶液中，加入等体积的氧化羟乙基纤维素溶液静置，得复合载药水凝胶；
3)双载药纳米纤维水凝胶软骨修复系统的制备
将步骤1所得的载药同轴纳米纤维分别剪成宽3mm的条状膜和直径为5mm的圆形膜，备用；卷曲宽为3mm的条状膜以形成直径为5mm的圆柱体，放入聚四氟乙烯容器，加入步骤2)复合载药水凝胶至完全填充同轴纤维膜的缝隙，静置，通过450nm紫外光线照射进行交联，再将圆形膜叠放在上方，高度约0.5mm，再次注入步骤2)中复合载药水凝胶至完全填充同轴纤维膜的缝隙，静置，通过450nm紫外光线照射进行交联，即得到双载药纳米纤维水凝胶复合软骨修复系统。
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