CN105079874A - 一种基于纳米技术的小口径人工血管的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药和高分子材料领域,公开了一种基于纳米技术的小口径人工血管的制备方法。该制备方法包括以下步骤:将丝素和聚己酸内酯溶解于六氟异丙醇制成纺丝溶液,该纺丝溶液中聚己酸内酯和丝素的质量百分比浓度分别为5%和8%,采用静电纺丝技术,在直径为1~1.2mm的圆柱形棒状接收屏上,电纺制成管壁厚度为130μm~170μm的纳米纤维血管。本发明与现有技术相比采用静电纺丝技术,达到组织工程学提出的高组织相容性、高孔隙率、可塑性、可降解性要求,并应用细胞活性因子(机械生长因子)及具有抗凝活性的药物(肝素)修饰血管支架,克服以往细胞修饰血管支架在工艺上的复杂性和组织相容性较差的缺陷。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于纳米技术的小口径人工血管的制备方法。
背景技术
心脑血管疾病目前已成为我国威胁国民健康的头号杀手。中国老年人中,心脑血管病发病率高达30%,我国的相关机构报道因心脑血管意外死亡占总死亡的50%以上,随着我国老龄化人口的不断激增,患者数量还在不断的增加,给我过国民经济建设带来极重的负担。血管置换手术在动脉狭窄、动脉瘤、动脉粥样硬化及其他血管性疾病的治疗中广泛应用,而自体血管移植存在取材困难,手术时间长,血管口径不匹配等诸多缺陷,小口径人造血管的需求和重要性日益显现。
目前临床使用的人造血管却存在以下缺陷:
1)涤纶人造血管是最早使用的血管材料,且由于通畅率较高,长期以来被成功地用于大血管置换,但无法完全满足小口径人造血管的制造要求。
2)真丝人造血管由于其螺旋型绉缩不够稳定,易造成血管吸瘪,且保形性差、强力较低,而限制了临床的应用。
3)人造血管材料是膨化聚四氟乙烯,它具有很好的生物相容性与抗凝性,但顺应性较差,移植物的通畅率仅为30%,尤其是直径小于6mm的ePTFE人造血管上述缺点更加明显,远期通畅率极差。
以上三种人造血管的根本缺陷在于顺应性都非常差,完全不具备人体动脉的柔韧性与弹性,这个缺陷在与小口径动脉吻合时就表现的非常明显,这也是血栓易在吻合口部位形成的主要原因。
随着生物工程技术和纳米技术高速发展,基于血管工程、纳米技术和干细胞技术交叉学科下研制的可降解纳米人造血管应运而生。这类人工血管需要有良好的力学性能,适合的降解速率,并且具有生物活性,可以吸引宿主细胞参与重建并有能力与宿主再生组织融为一体。静电纺丝技术可以排列纳米纤维以组成纳米支架,其间距在(50nm-800nm),可以充分模仿组织的细胞外基质的形态学,从而模拟细胞所熟悉的生长环境,文献报道基于此技术制造的纳米血管的机械特性可以和人体血管相媲美,因其具有降解特性,这类移植物支架最终可被自体组织所取代。
目前常用于电纺制作纳米血管的材料有聚乳酸(PLA)、聚己内酯(聚己酸内酯)、左旋聚乳酸(PLLA)等多种有机材料。有学者在动物实验中发现PLA制作血管支架在移植术后第1周管腔出现少量内皮细胞,管壁出现少量平滑肌细胞,术后第12周管壁分层更清晰,ECM已形成,PLA降解,血管形态近似自体血管。但文献报道单纯混合PLA、PLLA材料电纺制作血管支架因降解速率和组织生成替代的速率不一致长期观察后发现支架破裂或动脉瘤产生,我们在前期研究中发现,聚己酸内酯和PLLA高分子聚合物混纺制作而成的纳米纤维由于排列过于致密,降解速率较慢,移植于大鼠体内后早期很少有平滑肌细胞进入支架内层参与重建,因而难以达到令人满意的材料降解-组织重建平衡。而这一技术难题的解决对于人造血管在移植后在体内高血流高脉冲压力长期保持稳定至关重要。因此,寻求可以提高人工血管生物亲和性和细胞通透性的材料至关重要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述不足,提供一种基于纳米技术的小口径人工血管的制备方法。该制备方法可以使得人工血管的顺应性极大改善,从而使血管降解速率与组织重建速率基本保持一致,以及提高人工血管的力学稳定性。
本发明解决上述问题采用如下技术方案:
一种基于纳米技术的小口径人工血管的制备方法,包括以下步骤:将丝素和聚己酸内酯溶解于六氟异丙醇制成纺丝溶液,该纺丝溶液中聚己酸内酯和丝素的质量百分比浓度分别为5%和8%,采用静电纺丝技术,在直径为1~1.2mm的圆柱形棒状接收屏上,电纺制成管壁厚度为130μm~170μm的纳米纤维血管。
作为优选,将纳米纤维血管进一步处理,通过肝素与聚乙二醇二胺共价结合方法,将肝素结合于纳米纤维血管的纳米微丝上,实现纳米纤维血管的肝素化处理。
具体操作步骤如下:
1)将纳米纤维血管浸入酒精含量为70%去离子水酒精,浸泡时间2~8分钟;
2)将上一步所得的纳米纤维血管浸入去离子水,浸泡时间10~30分钟;
3)将上一步所得的纳米纤维血管浸入摩尔浓度为0.01mol/L氢氧化钠溶液,浸泡时间5~15分钟;
4)将上一步所得的纳米纤维血管浸入磷酸盐缓冲液,浸泡时间12~18分钟;
5)将上一步所得的纳米纤维血管浸入去离子水,浸泡时间12~18分钟;
6)将上一步所得的纳米纤维血管浸入加入EDH-suflo-N-羟基琥珀酰亚胺溶液,浸泡时间10~30分钟;
7)将上一步所得的纳米纤维血管浸入磷酸盐缓冲液,浸泡时间12~18分钟;
8)将上一步所得的纳米纤维血管再次浸入磷酸盐缓冲液,浸泡时间12~18分钟;
9)将上一步所得的纳米纤维血管浸入EDH-N-羟基琥珀酰亚胺-肝素钠溶液,浸泡时间10~30分钟;
10)将上一步所得的纳米纤维血管浸入磷酸盐缓冲液,浸泡时间12~18分钟;
11)将上一步所得的纳米纤维血管浸入甘氨酸浓度为0.1mol/L的甘氨酸磷酸盐酸缓冲液,甘氨酸磷酸盐酸缓冲液为甘氨酸溶入磷酸盐酸缓冲液而构成的混合溶液,浸泡时间12~18分钟;
12)将上步所得的纳米纤维血管浸入磷酸盐缓冲液,磷酸盐缓冲液2℃~6℃保持,浸泡时间12~18分钟,至此完成纳米纤维血管的肝素化处理;
其中,EDH-suflo-N-羟基琥珀酰亚胺溶液的制作过程如下:
以PH为5.5的0.5mmol/L2-(N-吗啉)乙磺酸作为缓冲液配制含量分别为20mg/ml聚乙二醇二胺、20mg/ml碳化二亚胺、10mg/mlN-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液,震荡混匀。
EDH-N-羟基琥珀酰亚胺-肝素钠溶液的制作过程如下:
以PH为5.5的0.5mmol/L2-(N-吗啉)乙磺酸作为缓冲液配置含量分别为20mg/ml肝素钠、20mg/ml碳化二亚胺、10mg/mlN-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液,震荡混匀,每1mlEDH-N-羟基琥珀酰亚胺-肝素钠溶液中加入110μL摩尔浓度为0.01mol/L的氢氧化钠使溶液PH为7,混匀溶液。
作为优选,将肝素化处理后的纳米纤维血管进一步处理,将机械生长因子与肝素共价结合,制成复合机械生长因子的肝素化纳米纤维血管,具体操作步骤如下:
i)将纳米纤维血管浸入机械生长因子浓度为20ng/ml的机械生长因子-磷酸盐缓冲液混合溶液,机械生长因子-磷酸盐缓冲液混合溶液2℃~6℃保持,浸泡时间18~30小时;
ii)将上一步所得的纳米纤维血管浸入磷酸盐缓冲液,混匀溶液,磷酸盐缓冲液2℃~6℃保持,浸泡时间12~18分钟。至此,纳米纤维血管的机械生长因子化完成。
利用本发明的制备方法获得的人工血管,达到组织工程学提出的高组织相容性、高孔隙率、可塑性、可降解性要求。
此外,可以应用机械生长因子及肝素修饰血管支架,获得复合机械生长因子的肝素化纳米纤维血管。
相应的,本发明提供了一种小口径人工血管,它由上述基于纳米技术的小口径人工血管的制备方法获得。
所述的小口径人工血管,它的成分是丝素和聚己酸内酯溶解于六氟异丙醇制成的纺丝溶液,该纺丝溶液中聚己酸内酯和丝素的质量百分比浓度分别为5%和8%。
本发明与现有技术相比,具有以下优点和效果:
采用静电纺丝技术及生物可降解材料制作模拟自体血管基质微环境的新型血管支架,并选择丝素,达到组织工程学提出的高组织相容性、高孔隙率、可塑性、可降解性要求,使血管支架降解速率与组织重建速率基本保持一致以此提高支架的力学稳定性,保证了移植后在体内高血流高脉冲压力长期保持稳定。
应用细胞活性因子(机械生长因子)及具有抗凝活性的药物(肝素)修饰血管支架,克服以往细胞修饰血管支架在工艺上的复杂性和组织相容性较差的缺陷,加强其在原位血管重建中的干细胞吸引及诱导分化作用,促进支架血管组织学和功能的重建。
附图说明
图1是本发明实施例1中制备纳米纤维血管的结构示意图。
其中,1为直流高压静电发生器、2为微量注射器、3为圆柱形棒状接收屏,21为容纳注射液的针筒、22为设置于针筒内的活塞推杆、23为设置于针筒端部的针头。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明,以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。
实施例1制作具有纳米结构的丝素/PCL小口径纳米纤维血管
1)聚己酸内酯及丝素溶解于六氟异丙醇(HFIP),制成用于电纺纳米纤维血管的纺丝溶液,该纺丝溶液中聚己酸内酯和丝素的质量百分比浓度分别为5%和8%,静电纺丝设备包括直流高压电发生器、微量注射器、圆柱形棒状接收屏和动力装置,其中,动力装置驱动圆柱形棒状接收屏转动,微量注射器的针头接直流高压电发生器的正极电源,圆柱形棒状接收屏接地线,圆柱形棒状接收屏接地线。圆柱形棒状接收屏直径为1~1.2mm,将纺丝溶液放入微量注射器内,设置微量注射器的注射速度为1ml/小时,注射量为0.15ml,调节圆柱形棒状接收屏的转数为400转/分钟,直流高压电发生器提供15kV电压,实现静电纺丝过程,最终制造出管壁厚度为150μm左右的纳米纤维血管;
2)取出裹有纳米纤维血管的圆柱形棒状接收屏,置于真空干燥箱,过夜;
3)将圆柱形棒状接收屏放入70%的去离子水溶酒精10分钟,用镊子小心取出,干燥5分钟,切割成为长度在0.5cm~3cm之间的纳米纤维血管,放置于离心管中备用。
实施例2纳米纤维血管的肝素化处理
通过肝素与聚乙二醇二胺共价结合方法,将肝素结合于纳米纤维血管的纳米微丝上,实现纳米纤维血管的肝素化处理。
具体操作步骤如下:
1)将纳米纤维血管放置于离心管,加入70%去离子水酒精2ml,室温摇匀机上作用5分钟;
2)弃取前液,离心管内加入去离子水2ml,摇匀机作用5分钟×4次;
3)弃取前液,离心管内加入当量浓度为0.01N的氢氧化钠(NaOH)2ml,摇匀机作用10分钟,以提高纳米纤维血管材料表面的羧基量;
4)弃取前液,离心管内加入磷酸盐缓冲液2ml,摇匀机作用5分钟×3次;
5)弃取前液,离心管内加入去离子水2ml,摇匀机作用5分钟×3次;
6)弃取前液,离心管内加入EDH-suflo-N-羟基琥珀酰亚胺溶液2ml,室温摇匀机上作用2小时;
7)弃取前液,离心管内加入磷酸盐缓冲液2ml,摇匀机作用5分钟×3次;
8)弃取前液,离心管内加入磷酸盐缓冲液2ml,摇匀机作用5分钟×3次;
9)弃取前液,离心管内加入EDH-N-羟基琥珀酰亚胺-肝素钠溶液2ml,室温摇匀机上作用2小时;
10)弃取前液,离心管内加入磷酸盐缓冲液2ml,摇匀机作用5分钟×3次;
11)弃取前液,加入新鲜配制的甘氨酸浓度为0.1mol/L的甘氨酸磷酸盐酸缓冲液2ml,(甘氨酸磷酸盐酸缓冲液为甘氨酸溶入磷酸盐酸缓冲液而构成的混合溶液,用于与未作用的N-羟基琥珀酰亚胺分子结合),室温摇匀机上作用30分钟;
12)弃取前液,离心管内加入磷酸盐缓冲液2ml,摇匀机作用5分钟×3次。磷酸盐缓冲液4℃保持,此步为止肝素化完成。
实施例3制备复合机械生长因子的肝素化纳米纤维血管
将上述初步肝素化的纳米纤维血管通过表面共价结合方法,将机械生长因子与肝素共价结合。
具体操作步骤如下:
1)将纳米纤维血管放置于离心管,加入具有机械生长因子浓度为20ng/ml的机械生长因子-磷酸盐缓冲液混合溶液,4℃摇匀机上作用24小时。
2)弃取前液,离心管内加入磷酸盐缓冲液2ml,摇匀机作用5分钟×3次。磷酸盐缓冲液4℃保持,此步为止机械生长因子化完成。
本实施例中,EDH-suflo-N-羟基琥珀酰亚胺溶液的制备过程如下:
以PH为5.5的0.5mmol/L2-(N-吗啉)乙磺酸作为缓冲液配制含量分别为20mg/ml聚乙二醇二胺、20mg/ml碳化二亚胺、10mg/mlN-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液,震荡混匀2分钟。
EDH-N-羟基琥珀酰亚胺-肝素钠的溶液的制备过程如下::以PH为5.5的0.5mmol/L2-(N-吗啉)乙磺酸作为缓冲液配置含量分别为20mg/ml肝素钠、20mg/ml碳化二亚胺、10mg/mlN-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液,震荡混匀30分钟,每1mlEDH-N-羟基琥珀酰亚胺-肝素钠溶液中加入110μL1N氢氧化钠使溶液PH为7,混匀溶液。
本实施例中所使用部分材料来源和制备方法说明如下:
1)2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液(MES缓冲液,PH5.5),由美国Sigma-Aldrich公司提供。
2)聚己酸内酯(Polycaprolactone,PCL),分子量2000,由美国Polysciences公司提供。
3)六氟异丙醇(1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol,HFIP),由美国Aladdin公司提供。
4)聚乙二醇二胺,由美国Sigma-Aldrich公司提供。
5)碳化二亚胺(EDC),由美国Sigma-Aldrich公司提供。
6)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),由美国Sigma-Aldrich公司提供。
7)肝素钠,分子量5000-10000,由美国Sigma-Aldrich公司提供。
8)机械生长因子(MGF,MechanoGrowthFactor),起源于胰岛素生长因子1(IGF-1),是IGF-1基因经过不同剪切而衍生的,由美国Sigma-Aldrich公司提供。
9)磷酸盐缓冲液,调配如下:
NaCl8.0g,KCl0.2g,KH2PO40.24g,Na2HPO4×12H2O3.628g,溶于800ml蒸馏水中,用盐酸调pH值为7.4,蒸馏水定容至1000ml,高压灭菌,室温保存。
10)EDH-suflo-N-羟基琥珀酰亚胺溶液的制备过程如下:
以PH为5.5的0.5mmol/L2-(N-吗啉)乙磺酸作为缓冲液配制含量分别为20mg/ml聚乙二醇二胺、20mg/ml碳化二亚胺、10mg/mlN-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液,震荡混匀2分钟。
11)EDH-N-羟基琥珀酰亚胺-肝素钠的溶液的制备过程如下:
以PH为5.5的0.5mmol/L2-(N-吗啉)乙磺酸作为缓冲液配置含量分别为20mg/ml肝素钠、20mg/ml碳化二亚胺、10mg/mlN-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液,震荡混匀30分钟,每1mlEDH-N-羟基琥珀酰亚胺-肝素钠溶液中加入110μL1N氢氧化钠使溶液PH为7,混匀溶液。
本说明书中所描述的以上内容仅仅是对本发明所作的举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例作各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代,只要不偏离本发明说明书的内容或者超越本权利要求书所定义的范围,均应属于本发明的保护范围。
Claims (11)
1.一种基于纳米技术的小口径人工血管的制备方法,其特征在于,其包括步骤:将丝素和聚己酸内酯溶解于六氟异丙醇制成纺丝溶液,该纺丝溶液中聚己酸内酯和丝素的质量百分比浓度分别为5%和8%,采用静电纺丝技术,在直径为1~1.2mm的圆柱形棒状接收屏上电纺制成纳米纤维血管。
2.根据权利要求1所述的基于纳米技术的小口径人工血管的制备方法,其特征在于:所述的纳米纤维血管的管壁厚度为130μm~170μm。
3.根据权利要求1所述的基于纳米技术的小口径人工血管的制备方法,其特征在于:将纳米纤维血管进一步处理,通过肝素与聚乙二醇二胺共价结合方法,将肝素结合于纳米纤维血管的纳米微丝上,实现纳米纤维血管的肝素化处理。
4.根据权利要求3所述的基于纳米技术的小口径人工血管的制备方法,其特征在于:通过下述步骤进行纳米纤维血管肝素化处理:
将纳米纤维血管浸入酒精含量为70%去离子水酒精,浸泡时间2~8分钟;
将上一步所得的纳米纤维血管浸入去离子水,浸泡时间10~30分钟;
将上一步所得的纳米纤维血管浸入摩尔浓度为0.01mol/L氢氧化钠溶液,浸泡时间5~15分钟;
将上一步所得的纳米纤维血管浸入磷酸盐缓冲液,浸泡时间12~18分钟;
将上一步所得的纳米纤维血管浸入去离子水,浸泡时间12~18分钟;
将上一步所得的纳米纤维血管浸入加入EDH-suflo-N-羟基琥珀酰亚胺溶液,浸泡时间10~30分钟;
将上一步所得的纳米纤维血管浸入磷酸盐缓冲液,浸泡时间12~18分钟;
将上一步所得的纳米纤维血管再次浸入磷酸盐缓冲液,浸泡时间12~18分钟;
将上一步所得的纳米纤维血管浸入EDH-N-羟基琥珀酰亚胺-肝素钠溶液,浸泡时间10~30分钟;
将上一步所得的纳米纤维血管浸入磷酸盐缓冲液,浸泡时间12~18分钟;
将上一步所得的纳米纤维血管浸入甘氨酸浓度为0.1mol/L的甘氨酸磷酸盐酸缓冲液,浸泡时间12~18分钟;
将上步所得的纳米纤维血管浸入磷酸盐缓冲液,磷酸盐缓冲液2℃~6℃保持,浸泡时间12~18分钟,完成纳米纤维血管的肝素化处理。
5.根据权利要求4所述的基于纳米技术的小口径人工血管的制备方法,其特征在于:所述的EDH-suflo-N-羟基琥珀酰亚胺溶液的制作过程如下:
以PH为5.5的0.5mmol/L2-(N-吗啉)乙磺酸作为缓冲液配制含量分别为20mg/ml聚乙二醇二胺、20mg/ml碳化二亚胺、10mg/mlN-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液,震荡混匀;
所述的EDH-N-羟基琥珀酰亚胺-肝素钠溶液的制作过程如下:
以PH为5.5的0.5mmol/L2-(N-吗啉)乙磺酸作为缓冲液配置含量分别为20mg/ml肝素钠、20mg/ml碳化二亚胺、10mg/mlN-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液,震荡混匀,每1mlEDH-N-羟基琥珀酰亚胺-肝素钠溶液中加入110μL摩尔浓度为0.01mol/L的氢氧化钠使溶液PH为7.0,混匀溶液。
6.根据权利要求3所述的基于纳米技术的小口径人工血管的制备方法,其特征在于:将肝素化处理后的纳米纤维血管进一步处理,将机械生长因子与肝素共价结合,制成复合机械生长因子的肝素化纳米纤维血管。
7.根据权利要求3所述的基于纳米技术的小口径人工血管的制备方法,其特征在于:该制备方法还包括以下步骤:
将纳米纤维血管浸入机械生长因子浓度为20ng/ml的机械生长因子-磷酸盐缓冲液混合溶液,机械生长因子-磷酸盐缓冲液混合溶液2℃~6℃保持,浸泡时间18~30小时;
将上一步所得的纳米纤维血管浸入磷酸盐缓冲液,混匀溶液,磷酸盐缓冲液2℃~6℃保持,浸泡时间12~18分钟。
8.一种小口径人工血管,其特征在于:其是根据权利要求1所述的制备方法制得。
9.一种小口径人工血管,其特征在于:制备该人工血管的成分是丝素和聚己酸内酯溶解于六氟异丙醇制成的纺丝溶液,该纺丝溶液中聚己酸内酯和丝素的质量百分比浓度分别为5%和8%。
10.权利要求1所述的制备方法的应用,其特征在于:利用该方法获得人工血管具有组织工程学的高组织相容性、高孔隙率、可塑性和可降解性。
11.根据权利要求10所述的应用,其特征在于:应用机械生长因子及肝素修饰血管支架,获得复合机械生长因子的肝素化纳米纤维血管。
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
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