CN108992711B - 一种内层经过修饰的双层人工小口径血管的制备方法 - Google Patents

一种内层经过修饰的双层人工小口径血管的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种内层经过修饰的双层人工小口径血管的制备方法，其特征在于，将羧基化的介孔硅分散到NaOH中，得到MSN；将其分散于MES和NaCl的混合溶液中，搅拌后加入EDC、PEG及NHS，获得MSN‑PEG；将其分散在肝素溶液中得到MSN‑PEG‑Heparin；将其分散在HFIP中，得到分散液；分别制备内、外层纺丝液，并纺丝制成血管支架即可。本发明可用于血管再生治疗，制备方法简单，同时内层经过MSN‑PEG‑Heparin修饰并且降解速度快，促进内皮细胞的生长与黏附，与新生内膜的再生速率相匹配，外层PU降解速度慢，使制备的管状支架在体内较长期维持具有良好的力学性能。

Description

一种内层经过修饰的双层人工小口径血管的制备方法
技术领域
本发明涉及一种具有不同降解速率的内外层的人工血管的制备方法技，特别涉及一种具有MSN-PEG-Heparin修饰内层的人造血管的制备方法。
背景技术
心血管疾病是导致高死亡率的常见疾病。小口径(<6mm)的人造血管在冠状动脉及外周血管等血管疾病的治疗上具有广泛的需求，但小口径血管在应用方面仍然存在许多问题。人造小血管移植不能快速内皮化容易造成内膜增厚，血管狭窄和血栓形成，因此造成小口径人造血管长期通畅率低。有关小口径人造血管的研究主要集中在两个方面：一是提高支架的材料的血液相容性和生物相容性，提高血管的通畅率；二是人造血管通过促进人造血管表面快速内皮化提供抗血栓形成的天然屏障。
静电纺丝技术制备的纳米纤维表面有孔隙适合细胞生长，并且能负载各种功能化药物促进细胞增殖分化，但由于纤维之间连接致密，如果整个材料降解较慢，细胞无法长入材料，无法及时形成内膜层，从而容易引起血栓，内膜增生等，无法为长期通畅提供前期保障。如果整个支架材料降解过快时，由于组织再生是一个较长期的过程，而材料在组织再生过程早期降解过快会引起组织再生过程后期中无法提供足够的力学支撑，血液容易在力学薄弱处形成湍流，从而引发动脉瘤。迄今为止，采用静电纺丝技术制备拥有不同降解速度的内外层，并且内层经过 MSN-PEG-Heparin修饰的人工小口径血管的没有报道。因此，通过此种技术制备出的一种内层降解速率与内皮层再生速率相匹配和外层能能长期保持力学性能复合血管支架，将具有巨大的经济效益。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种具有不同降解速率的内外层，并且内层经过MSN-PEG-Heparin修饰的复合人工小口径血管的制备方法。
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案是：一种内层经过修饰的双层人工小口径血管的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)：将羧基化的介孔硅(MSNs-COOH)超声分散到NaOH中，搅拌后离心，得到的MSN用水洗涤多次；
步骤2)：将MSN分散于MES和NaCl的混合溶液中，搅拌后加入EDC、 PEG及NHS，混合物溶液在室温下搅拌后，将产物用水洗涤多次并离心后获得 MSN-PEG；
步骤3)：将制备的MSN-PEG分散在肝素溶液中并搅拌，离心后得到 MSN-PEG-Heparin；
步骤4)：将MSN-PEG-Heparin分散在HFIP中，然后超声处理分散均匀，得到MSN-PEG-Heparin分散液；
步骤5)：制备内层纺丝液：将纺丝液聚合物溶解在MSN-PEG-Heparin分散液中；
步骤6)：制备外层纺丝液：将PU溶解在HFIP中；
步骤7)：将内层纺丝液、外层纺丝液依次用静电纺丝技术来制造血管支架，得到内层经过MSN-PEG-Heparin修饰的复合双层人工小口径血管。
优选地，所述步骤1)中NaOH的当量浓度为0.01N；搅拌时间为10min；离心时间为20min；MSN用水洗涤3次。
优选地，所述步骤2)中MES和NaCl的混合溶液中MES的浓度为0.05M， NaCl的浓度为0.5M；第一次的搅拌时间为1h；EDC的浓度为0.12M；PEG的浓度为2mg/mL；MSN-PEG中PEG与MSN的质量比为0.1:1～0.1:1.5；NHS的浓度为0.06M；第二次的搅拌时间为16h；洗涤次数为3次。
优选地，所述步骤3)中肝素溶液的质量浓度为15％，搅拌时间为24h； MSN-PEG与肝素溶液的质量体积比为0.1:1～0.1:1.5(g：L)。
优选地，所述步骤4)中HFIP的浓度为3mg/mL；超声处理时间为30min。
优选地，所述步骤5)中的纺丝液聚合物采用PLGA、PLLA和PLCL中的任意一种与胶原蛋白或真丝的混合物。
更优选地，所述纺丝液聚合物采用PLGA与胶原蛋白的混合物，PLGA与胶原蛋白的质量比为8：2；PLGA和胶原蛋白在MSN-PEG-Heparin分散液中的总质量浓度为10％；MSN-PEG-Heparin的质量与PLGA和胶原蛋白的总量的比为 0.01:1～0.03:1。
优选地，所述步骤6)中PU在HFIP中的质量浓度为8％。
优选地，所述步骤7)中内层纺丝液电纺的推进速度为0.8～1.5mL/h；外层纺丝液电纺的推进速度为1～2mL/h；内层纺丝液与外层纺丝液的纺丝时间比为 1:5～3:4。
本发明通过静电纺丝技术制备纤维内包裹MSN-PEG-Heparin的功能化纳米纤维作为与支架内层，起到抗凝及促进内皮化的目的，外层由PU纳米纤维组成，以提供长期的力学支撑。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：载有MSN-PEG-Heparin的 PLGA/COL纳米纤维组成的支架具有优良的生物相容性与降解性能，能对内皮细胞的黏附、增殖、迁移有良好的促进作用，并且在前期起到良好的抗凝作用，内层在两个月内完全降解更有利于内皮细胞在人工支架内迅速增殖与迁移，从而快速实现内皮化。外层由PU纳米纤维组成，有良好的生物相容性以及力学性能，能在组织再生过程中提供良好的力学支撑，这种具有能快速实现内皮化和生物力学性能的功能化组织工程血管的制备为研究小口径血管支架在体内移植保持长期通畅提供了一种有效且简单的制备方法。本发明简单高效，价格低廉，且具有良好的生物相容性、血液相容性以及良好的力学性能，在体内无炎症反应，可用于心脑血管类疾病的再生治疗，具有极好的应用前景。
附图说明
图1为实施例1中载PEG与heparin的介孔纳米硅(A)、载有 MSN-PEG-Heparin的单根纤维(B)、PC/MSN-PEG-Heparin纤维膜(C)及复合双层人工小口径血管(D)的电镜图的对比图；
图2为实施例1制备的复合双层人工小口径血管的内层在不同时间的降解后的纤维膜表面形态；其中，A为15天，B为30天，C为45天；
图3为实施例1制备的复合双层人工小口径血管内、外层在体内生物相容性的对比图；其中，A、B、C为内层，D、E、F为外层。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
实施例1
一种内层经过MSN-PEG-Heparin修饰的复合双层人工小口径血管的制备方法：
(1)将40mg羧基化的介孔硅(MSNs-COOH)超声分散到20mL0.01N NaOH 中，搅拌10分钟后离心20分钟，并将MSN用水洗涤3次；然后，MSN分别分散于10mL0.05M MES和0.5MNaCl混合溶液中，搅拌1小时后加入0.12M EDC， 2mg/mL PEG和0.06M NHS。混合物溶液在室温下搅拌16小时。最后产物水洗涤3次离心后获得MSN-PEG；
(2)将制备的40mg MSN-PEG分散在10mL 15％肝素溶液中并搅拌24小时。离心后得到MSN-PEG-Heparin；
(3)将(2)中制备的MSN-PEG-Heparin分散在HFIP(3mg/mL)中，然后超声处理30分钟以确保均匀分散；
(4)制备内层纺丝溶液，将PLGA与丝素蛋白混合，然后将两者混合比例为8/2(w/w)的溶解在(3)中制备的分散液中，浓度为10％；
(5)制备外层纺丝液，将PU溶解在HFIP中，浓度为8％；
(6)用静电纺丝技术来制造血管支架，内层用(4)制备的纺丝溶液纺丝1 小时，外层用(5)中制备的纺丝液纺丝四小时。带可调电压输出的电压电源，注射泵和旋转收集器，纺丝，得到经过内层经过MSN-PEG-Heparin修饰的双层功能化人工血管。
实施例2
一种内层经过MSN-PEG-Heparin修饰的复合双层人工小口径血管的制备方法：
(1)将40mg羧基化的介孔硅(MSNs-COOH)超声分散到20mL0.01N NaOH 中，搅拌10分钟后离心20分钟，并将MSN用水洗涤3次；然后，MSN分别分散于10mL0.05M MES和0.5MNaCl混合溶液中，搅拌1小时后加入0.12M EDC， 2mg/mL PEG和0.06M NHS。混合物溶液在室温下搅拌16小时。最后产物水洗涤3次离心后获得MSN-PEG；
(2)将制备的40mg MSN-PEG分散在10mL 15％肝素溶液中并搅拌24小时。离心后得到MSN-PEG-Heparin；
(3)将(2)中制备的MSN-PEG-Heparin分散在HFIP(3mg/mL)中，然后超声处理30分钟以确保均匀分散；
(4)制备内层纺丝溶液，将PLGA与胶原蛋白混合，然后将两者混合比例为8/2(w/w)的溶解在(3)中制备的分散液中，浓度为10％；
(5)制备外层纺丝液，将PU溶解在HFIP中，浓度为8％；
(6)用静电纺丝技术来制造血管支架，内层用(4)制备的纺丝溶液纺丝1 小时，外层用(5)中制备的纺丝液纺丝四小时。带可调电压输出的电压电源，注射泵和旋转收集器，纺丝，得到经过内层经过MSN-PEG-Heparin修饰的双层功能化人工血管。

Claims (9)

1.一种内层经过修饰的双层人工小口径血管的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)：将羧基化的介孔硅超声分散到NaOH中，搅拌后离心，得到的MSN用水洗涤多次；
步骤2)：将MSN分散于MES和NaCl的混合溶液中，搅拌后加入EDC、PEG及NHS，混合物溶液在室温下搅拌后，将产物用水洗涤多次并离心后获得MSN-PEG；
步骤3)：将制备的MSN-PEG分散在肝素溶液中并搅拌，离心后得到MSN-PEG-Heparin；
步骤4)：将MSN-PEG-Heparin分散在HFIP中，然后超声处理分散均匀，得到MSN-PEG-Heparin分散液；
步骤5)：制备内层纺丝液：将纺丝液聚合物溶解在MSN-PEG-Heparin分散液中；
步骤6)：制备外层纺丝液：将PU溶解在HFIP中；
步骤7)：将内层纺丝液、外层纺丝液依次用静电纺丝技术来制造血管支架，得到内层经过MSN-PEG-Heparin修饰的复合双层人工小口径血管。
2.如权利要求1所述的内层经过修饰的双层人工小口径血管的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中NaOH的当量浓度为0.01N；搅拌时间为10min；离心时间为20min；MSN用水洗涤3次。
3.如权利要求1所述的内层经过修饰的双层人工小口径血管的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中MES和NaCl的混合溶液中MES的浓度为0.05M，NaCl的浓度为0.5M；第一次的搅拌时间为1h；EDC的浓度为0.12M；PEG的浓度为2mg/mL；MSN-PEG中PEG与MSN的质量比为0.1∶1～0.1∶1.5；NHS的浓度为0.06M；第二次的搅拌时间为16h；洗涤次数为3次。
4.如权利要求1所述的内层经过修饰的双层人工小口径血管的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中肝素溶液的质量浓度为15％，搅拌时间为24h；MSN-PEG与肝素溶液的质量体积比为0.1g∶1L～0.1g∶1.5L。
5.如权利要求1所述的内层经过修饰的双层人工小口径血管的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中HFIP的浓度为3mg/mL；超声处理时间为30min。
6.如权利要求1所述的内层经过修饰的双层人工小口径血管的制备方法，其特征在于，所述步骤5)中的纺丝液聚合物采用PLGA、PLLA和PLCL中的任意一种与胶原蛋白或真丝的混合物。
7.如权利要求6所述的内层经过修饰的双层人工小口径血管的制备方法，其特征在于，所述纺丝液聚合物采用PLGA与胶原蛋白的混合物，PLGA与胶原蛋白的质量比为8∶2；PLGA和胶原蛋白在MSN-PEG-Heparin分散液中的总质量浓度为10％；MSN-PEG-Heparin的质量与PLGA和胶原蛋白的总量的比为0.01∶1～0.03∶1。
8.如权利要求1所述的内层经过修饰的双层人工小口径血管的制备方法，其特征在于，所述步骤6)中PU在HFIP中的质量浓度为8％。
9.如权利要求1所述的内层经过修饰的双层人工小口径血管的制备方法，其特征在于，所述步骤7)中内层纺丝液电纺的推进速度为0.8～1.5mL/h；外层纺丝液电纺的推进速度为1～2mL/h；内层纺丝液与外层纺丝液的纺丝时间比为1∶5～3∶4。
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