CN109999227B - 一种基于丝素蛋白和甲壳素混纺纳米纤维嵌入式水凝胶软骨仿生支架的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于丝素蛋白和甲壳素混纺纳米纤维嵌入式水凝胶软骨仿生支架的制备方法及应用。本发明利用桑蚕丝制备再生丝素蛋白，提纯工业级甲壳素，将丝素蛋白溶液和甲壳素溶液混合并通过静电纺丝技术制备混纺纳米纤维膜，经乙醇梯度交联后，由混纺纳米纤维制得短纤维，混合短纤维和丝素蛋白溶液后，经交联剂交联后冷冻成型，得到海绵状软骨仿生支架。尤其是纳米短纤维的嵌入提高了支架材料的压缩强度和生物相容性。本发明构筑了一种生物相容性好，免疫排斥反应低，组成成分与天然软骨基质相似的仿生支架；且材料来源广泛，成本低，制备工艺简单，可用于构建组织工程软骨，修复软骨退变，具有良好的临床应用前景。

Description

一种基于丝素蛋白和甲壳素混纺纳米纤维嵌入式水凝胶软骨 仿生支架的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及软骨组织工程用支架制备技术领域，特别涉及一种基于丝素蛋白和甲壳素混纺纳米纤维嵌入式水凝胶软骨仿生支架的制备方法。
背景技术
由于创伤、肿瘤、各种关节炎疾病引起的骨软骨缺损给病人及其家属带来了巨大的痛苦及沉重的经济负担,严重影响病人的生活质量。目前临床上治疗关节骨软骨缺损一般采用软骨下骨微骨折、自体或异体骨软骨移植以及异种骨软骨移植。软骨移植会造成新的创伤，易引发并发症，异种骨软骨移植还容易引起疾病传播。因此都不能被广泛应用。
近年来组织工程的发展使生物相容性好、具有仿生结构的生物材料逐渐应用到临床骨软骨的治疗。支架的成分和微观结构的构建是材料能否产生良好的新生软骨的关键之一。
软骨根据缺损的厚度分为三种类型：部分厚度缺损，全层缺损和骨软骨缺损(缺损延伸到软骨下骨区域)。不论何种缺损，其最终会发展为软骨全层的缺损。研究表明，成熟软骨细胞不含有血管和神经组织，因此不具有自身修复缺损的能力。软骨全层缺损修复的关键在于原位募集间充质干细胞。间充质干细胞到达缺损部位并被诱导成软骨分化，分泌细胞外基质形成软骨陷窝。间充质干细胞被诱导成软骨分化的因素可能与细胞外基质环境、创伤区软骨分泌的特殊细胞因子有关。在天然软骨的形成过程中，II型胶原作为有机模板，糖胺聚糖等多糖填充其中，成就软骨的弹性和耐摩擦性。但胶原的力学强度低，降解速率高，严重限制了其应用。蚕丝丝素蛋白不仅机械性能明显优于胶原，且具有良好的生物相容性及可降解性，并且容易获得。甲壳素由乙酰氨基葡糖构成，与糖胺聚糖的构成相似。这种结构为仿生合成和自组装制备新型生物材料提供了分子化学基础。
中国专利“一种用于软骨修复的复合支架及其制备方法”(公开号： 108926744A)公开了一种用于软骨修复的复合支架及其制备方法和应用前景。该方法以丝素蛋白、纳米微晶纤维素、水为原料，并加入造影剂二氧化锰，制备了一种可以与MRI(磁共振成像)技术联用的气凝胶复合支架。但二氧化锰具有一定的体内毒性，该复合支架的生物安全性有待探究。
中国专利“一种丝素蛋白-透明质酸复合凝胶的快速制备方法”(公开号：106492279A)公开了一种利用丝素蛋白和透明质酸快速制备复合凝胶的方法，具体是由桑蚕和野蚕生丝经过脱胶、溶解、透析、浓缩制得丝素蛋白溶液，再将其与透明质酸溶液混合，在交联剂的作用下制成复合凝胶。该复合凝胶可以结合丝素蛋白和透明质酸的优点，优势互补。该方法侧重于复合水凝胶的制备。
尽管有关软骨仿生支架及丝素蛋白水凝胶的研究和专利很多，但目前仍没有将由静电纺丝得到的混纺纳米纤维膜制得纳米短纤维，混合丝素蛋白溶液，制备海绵状软骨仿生支架的报道。
发明内容
本发明目的是提供一种基于丝素蛋白和甲壳素混纺纳米纤维嵌入式水凝胶软骨仿生支架的制备方法，利用静电纺丝制备丝素蛋白/甲壳素的混纺纳米纤维膜，并由混纺纳米纤维膜制备纳米短纤维，在丝素蛋白溶液中添加纳米短纤维以增加支架的孔隙率和压缩强度，并模拟天然软骨细胞外基质的成分，提供了一种新的仿生构建丝素基软骨生物材料的方法。
本发明的另一目的是提供上述制备方法获得的软骨仿生支架在制备修复软骨退变的组织工程软骨中的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
第一方面，提供一种基于丝素蛋白和甲壳素混纺纳米纤维嵌入式水凝胶软骨仿生支架的制备方法，包括如下步骤：
(1)丝素蛋白制备：以桑蚕茧为原料，经脱胶、溶解、透析，获得截留液，将截留液在-50℃真空连续干燥48小时可得到再生丝素蛋白；
(2)甲壳素的纯化：工业级甲壳素经酸碱溶液反复洗涤提纯烘干后得到纯化的甲壳素；
(3)丝素蛋白/甲壳素混纺纳米纤维的制备：步骤(2)中纯化的甲壳素和步骤(1)中制备的再生丝素蛋白分别溶于六氟异丙醇(HFIP)溶剂，按1:10-1:1 (w/w)的比例混合，混合溶液通过静电纺丝得到混纺纳米纤维膜，并干燥至溶剂完全挥发，经梯度乙醇交联后，用纯水清洗除去残留的乙醇，然后用混纺纳米纤维膜制备纳米短纤维，真空冷冻干燥后可长期保存；
(4)基于丝素蛋白和甲壳素混纺纳米纤维嵌入式水凝胶软骨仿生支架的制备：①将步骤(1)制备的再生丝素蛋白复溶于水得到丝素蛋白水溶液，再加入步骤(3)制备的混纺短纤维，混匀后加入交联剂乙二醇二缩水甘油醚(EGDE)，得到短纤维丝素蛋白悬浊液；②将溶液倒入模具，冷冻定型，解冻后，即可得到基于丝素蛋白和甲壳素混纺纳米纤维嵌入式水凝胶软骨仿生支架。
优选地，步骤(1)所述再生丝素蛋白制备方法为：a)脱胶：将桑蚕茧放入沸腾的浓度为5g/L的碳酸钠(Na2CO3)溶液中，按每升浓度为5g/L的碳酸钠溶液中加入1g桑蚕茧的比例，煮沸30分钟，捞出，去离子水漂洗一次；再次在与上步等体积的沸腾的浓度为2.12g/L的Na2CO3溶液中煮沸30分钟，捞出，去离子水漂洗，得到棉絮状蚕丝，浸入与上步等体积的去离子水中浸泡两次，每次15分钟，50℃烘箱烘干；b)溶丝：将步骤a)烘干的脱胶蚕丝溶于 60℃9.3M溴化锂(LiBr)溶液，每克蚕丝需5mL溶液；c)透析：将步骤b) 含丝素蛋白的混合液用截留分子量为14kDa的透析袋进行透析，去离子水作为透析液，连续透析4天，透析液20倍体积于被透析蛋白溶液，并每天换一次，去除溶液中的溴化锂成分，获得截留液，截留液-50℃环境下连续真空冻干48 小时，获得冻干的再生丝素蛋白。
优选地，步骤(2)所述甲壳素的纯化为：a)碱纯化：按每克甲壳素浸泡在25mL 7％(w/v)的氢氧化钠溶液中24h，过滤得到第一次纯化的甲壳素a，用蒸馏水冲洗3遍去除残留氢氧化钠；b)酸纯化：将甲壳素a浸泡在3％的盐酸中24h，过滤得到第二次纯化的甲壳素b，蒸馏水冲洗3遍，去除残留盐酸； c)反复步骤a和步骤b一次，得到第三次纯化的甲壳素c；d)盐漂白干燥：将甲壳素c置于42mL 0.03M的亚氯酸钠溶液中80℃加热6h，过滤后，蒸馏水冲洗3次，50℃干燥一天。
优选地，步骤(3)中丝素蛋白/甲壳素混纺纳米纤维的制备：步骤(2)中纯化的甲壳素和步骤(1)中制备的再生丝素蛋白分别溶于六氟异丙醇(HFIP) 获得澄清透明的溶液，然后将两者混合，混合液中丝素蛋白和甲壳素的混合比例为1:10-1:1(w/w)，丝素蛋白的含量为1-10％(w/w)。
优选地，步骤(3)中静电纺丝的参数为：灌注速度为0.5-2.0mL/h，高压直流电源的电压为15-20kV，针头到接收板的距离为10-25cm，环境温度为 15-30℃，湿度为30-60％。
优选地，步骤(3)所述梯度乙醇交联的条件为：100％乙醇浸泡10分钟， 90％乙醇浸泡10分钟，70％乙醇浸泡10分钟。
优选地，步骤(3)中制备纳米短纤维的方法为机械球磨法或超声均质法，球磨的条件优选为：200-2000转/分钟，10-20分钟，均质的条件优选为3000-8000 转/分钟，总均质时间5-30分钟。
优选地，步骤(4)所述步骤①EGDE加入的量与丝素蛋白溶液中丝素蛋白的质量成正比，即每克丝素蛋白加入EGDE 5-20mmol，获得丝素蛋白浓度为 1-10％(w/v)，丝素蛋白和短纤维比例为10:1-1：1(w/w)的悬浊液。
优选地，步骤(4)所述的悬浊液转移至自制定向冷冻模具，冷冻定型12-28 小时，支架形状由模具形状决定，将模具取出室温下解冻，得到丝素蛋白/甲壳素纳米纤维嵌入式水凝胶软骨仿生支架。
第二方面，提供上述基于丝素蛋白和甲壳素混纺纳米纤维嵌入式水凝胶软骨仿生支架在制备人工软骨材料、关节软骨修复材料中的应用。
与现有技术相比，本发明方法的优势主要体现在：
(1)本发明所述基于丝素蛋白和甲壳素混纺纳米纤维嵌入式水凝胶软骨仿生支架具有三维多孔结构，且弹性回复性能良好。
(2)本发明制备的基于丝素蛋白和甲壳素混纺纳米纤维嵌入式水凝胶软骨仿生支架的细胞学实验研究表明，支架没有细胞毒性，并具有良好的生物相容性，有利于细胞的粘附、增殖。
(3)本发明制备的基于丝素蛋白和甲壳素混纺纳米纤维嵌入式水凝胶软骨仿生支架具有海绵状外形，含水量高，可向支架内加入各种需要的细胞因子或抗炎药物以达到促进组织再生或炎症治疗作用。
附图说明
图1是实施例1、2、3制备的基于丝素蛋白和甲壳素混纺纳米纤维嵌入式水凝胶软骨仿生支架结构示意图。
图2是基于丝素蛋白和甲壳素纳米纤维的场发射扫描电镜图，图A&D是实施例1制备的基于丝素蛋白和甲壳素纳米纤维的场发射扫描电镜图，图B&E是实施例2制备的基于丝素蛋白和甲壳素纳米纤维的场发射扫描电镜图，图C&F 是实施例3制备的基于丝素蛋白和甲壳素纳米纤维的场发射扫描电镜图。
图3是实施例1制备的基于丝素蛋白和甲壳素混纺纳米纤维嵌入式水凝胶软骨仿生支架场发射扫描电镜图，A&C为支架径向方向截面图，B&D为支架水平方向截面图。
图4是实施例1制备的基于丝素蛋白和甲壳素混纺纳米纤维嵌入式水凝胶软骨仿生支架弹性回复性能示意图。
图5是实施例1制备的基于丝素蛋白和甲壳素混纺纳米纤维嵌入式水凝胶软骨仿生支架(3％SF-NFs)接种骨髓间充质干细胞(BMSCs)后的检测，以未加入丝素蛋白/甲壳素混纺纳米短纤维的纯丝素水凝胶(3％SF)作为对照组。(A) 接种24h后检测细胞在支架上的粘附情况:(a)3％SF,(b)3％SF-NFs,(B)CCK-8 测试支架浸出液的细胞毒性，(C)CCK-8试剂盒测试支架接种BMSCs的增殖情况，(D)BMSCs细胞在3％SF和3％SF-NFs支架上培养1、2、3周后免疫荧光染色结果，活细胞Calcein-AM(绿色)染色，死细胞PI(红色)染色，比例尺＝100μm。
图6是实施例1制备的基于丝素蛋白和甲壳素混纺纳米纤维嵌入式水凝胶软骨仿生支架在大鼠股骨胫骨头沟软骨全层缺损模型中的应用。制备大鼠股骨胫骨头沟软骨全层缺损模型后，将不同的软骨仿生支架移植在软骨全层缺损中，以未移植软骨仿生支架不采取治疗措施为对照组，术后6周(6W)和12周(12W) 收获样本。图中所示分别为未治疗对照组(Control)，丝素蛋白/甲壳素纳米纤维嵌入式水凝胶软骨仿生支架组(ExpA)，负载TGF-β1生长因子的丝素蛋白/甲壳素纳米纤维嵌入式水凝胶软骨仿生支架组(ExpB)。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
以下实施例所使用的甲壳素是购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，为工业级。
【实施例1】
(1)以桑蚕茧为原料得到再生丝素蛋白，提纯工业级甲壳素(阿拉丁)，按丝素蛋白：纯化的甲壳素＝6:1的比例称取再生丝素蛋白和纯化的甲壳素，将两者分别溶于有机溶剂HFIP，搅拌至澄清透明，混合两种溶液，保持丝素蛋白的最终浓度为6％(w/w)。
(2)混合溶液通过静电纺丝获得混纺纳米纤维，静电纺丝的条件为电压 16kV，流速0.8mL/h，铝箔平板接收器与针头距离15cm，相对温度和相对湿度分别为25℃和50％，所得混纺纳米纤维膜在真空干燥箱中干燥3天以去除残留的HFIP，该纳米纤维膜的场发射扫描电镜图如图2A&D所示。经乙醇梯度交联后增加其水不溶性，梯度乙醇交联条件为：100％乙醇浸泡10分钟，90％乙醇浸泡10分钟，70％乙醇浸泡10分钟。纯水清洗3次除去乙醇，制得水不溶性的丝素蛋白/甲壳素混纺纳米纤维。
(3)将混纺纳米纤维膜用球磨机球磨成短纤维，球磨条件为500转/分钟，15 分钟。液氮迅速冷冻，然后-50℃真空环境下连续冻干24小时，制得丝素蛋白/ 甲壳素混纺纳米短纤维。
(4)按再生丝素蛋白：短纤维＝3:1的比例称取再生丝素蛋白和短纤维，即称取提取的丝素蛋白30mg配制成丝素蛋白溶液，加入冻干的纳米短纤维10mg，并加入配制好的1mmol/mL乙二醇二缩水甘油醚EGDE悬浊液，保持溶液体系为1000μL，丝素蛋白溶液的浓度以3％(w/v)计。涡旋充分混匀,注入模具中。立即放入-20℃冷冻24h，室温下解冻后，加入等体积无水乙醇静置10min，将支架取出，即可得到丝素蛋白/甲壳素纳米纤维嵌入式水凝胶软骨仿生支架。该支架的场发射扫描电镜图如图3所示，A&C为支架纵切面的形貌，B&D为支架横截面形貌，从支架的横截面观察，支架呈多孔海绵状，近似六边形形貌，孔与孔之间的孔壁有洞相通，纳米短纤维交叉其中，从支架的纵切面观察，支架的孔洞有方向性，且该支架弹性回复性能良好(图4)。
(5)以未加入丝素蛋白/甲壳素混纺纳米短纤维的纯丝素水凝胶(3％SF)为对照组，丝素蛋白/甲壳素纳米短纤维嵌入式水凝胶软骨仿生支架(3％SF-NFs) 为实验组，将骨髓间充质干细胞(BMSCs)与对照组、实验组支架共培养24h 后，细胞在支架上的分布情况如图5A所示，所有支架均有软骨细胞粘附，但细胞集聚粘附于不规则表面，特别是由纳米短纤维积聚形成的褶皱、小孔和栅栏状表面，很少有软骨细胞粘附在光滑的孔壁上，由此可见添加有丝素蛋白/甲壳素纳米短纤维的支架比纯丝素水凝胶支架更有利于细胞粘附。CCK-8试剂盒检测结果表明支架无细胞毒性(图5B)，此外，随着共培养的时间的增加，细胞增殖明显(图5C)。BMSCs细胞在各组支架上培养1,2和3周后，进行细胞活死染色实验，荧光共聚焦观察(图5D)，共聚焦显微镜结果显示所有支架上都有活细胞生长，支架具有支持细胞粘附和生长的能力，且添加有丝素蛋白/甲壳素纳米短纤维的支架上软骨细胞数量和增殖速度高于纯丝素水凝胶支架。
(6)制备大鼠股骨胫骨头沟软骨全层缺损模型，以未移植软骨仿生支架不采取治疗措施为对照组(Control)，将丝素蛋白/甲壳素纳米纤维嵌入式水凝胶软骨仿生支架(ExpA)和负载TGF-β1生长因子的丝素蛋白/甲壳素纳米纤维嵌入式水凝胶软骨仿生支架(ExpB)移植在大鼠股骨胫骨头沟软骨全层缺损中，术后6周和12周收获样本，如图6所示，6周和12周的Control组标本缺损区，除了薄层致密瘢痕组织外，没有新生软骨组织填充。6周的ExpA和ExpB组标本，均有新生透明软骨状组织填充，但新生组织未充满整个缺损，新生组织与缺损区周围软骨有明显界限，组织表面不光滑，有小凹陷和裂缝。术后12周，ExpA 和ExpB组新的软骨状组织表面光滑并充满缺损区，且与周围软骨没有明显边界。同理，可采用物理负载或化学接枝等方式将地塞米松、姜黄素等抗炎药物负载至支架内以达到炎症治疗作用。
实施例2
(1).以桑蚕茧为原料得到再生丝素蛋白，提纯工业级甲壳素(阿拉丁)，按丝素蛋白：纯化的甲壳素＝7:1的比例称取丝素蛋白和纯化的甲壳素，将两者分别溶于有机溶剂HFIP，搅拌至澄清透明，混合两种溶液，保持丝素蛋白的最终浓度为7％(w/w)。
(2).混合溶液通过静电纺丝获得混纺纳米纤维，静电纺丝的条件为电压 16kV，流速0.8mL/h，铝箔平板接收器与针头距离15cm，相对温度和相对湿度分别为25℃和50％，所得混纺纳米纤维膜在真空干燥箱中干燥3天以去除残留的HFIP，该纳米纤维膜的场发射扫描电镜图如图2B&E所示。经乙醇梯度交联后增加其水不溶性，梯度乙醇交联条件为：100％乙醇浸泡10分钟，90％乙醇浸泡10分钟，70％乙醇浸泡10分钟。纯水清洗3次除去乙醇，制得水不溶性的丝素蛋白/甲壳素混纺纳米纤维。
(3).将混纺纳米纤维膜用匀浆机制备成短纤维，匀浆条件为5000rpm，时间 30分钟。液氮迅速冷冻，然后-50℃真空环境下连续冻干24小时，制得丝素蛋白/甲壳素混纺纳米短纤维。
(4)按再生丝素蛋白：短纤维＝2:1的比例称取再生丝素蛋白和短纤维，即称取提取的丝素蛋白20mg配制成丝素蛋白溶液，加入冻干的纳米短纤维10mg，并加入配制好的1mmol/mL乙二醇二缩水甘油醚EGDE悬浊液，保持溶液体系为1000μL，丝素蛋白溶液的浓度以2％(w/v)计，涡旋充分混匀,注入模具中。立即放入-20℃冷冻24h，室温下解冻后，加入等体积无水乙醇静置10min，将支架取出，即可得到丝素蛋白/甲壳素纳米纤维嵌入式水凝胶软骨仿生支架。
实施例3
(1).以桑蚕茧为原料得到再生丝素蛋白，提纯工业级甲壳素(阿拉丁)，按丝素蛋白：纯化的甲壳素＝8:1的比例称取丝素蛋白和纯化的甲壳素，将两者分别溶于有机溶剂HFIP，搅拌至澄清透明，混合两种溶液，保持丝素蛋白的最终浓度为8％(w/w)。
(2).混合溶液通过静电纺丝获得混纺纳米纤维，静电纺丝的条件为电压 16kV，流速0.8mL/h，铝箔平板接收器与针头距离15cm，相对温度和相对湿度分别为25℃和50％，所得混纺纳米纤维膜在真空干燥箱中干燥3天以去除残留的HFIP，该纳米纤维膜的场发射扫描电镜图如图2C&F所示。经乙醇梯度交联后增加其水不溶性，梯度乙醇交联条件为：100％乙醇浸泡10分钟，90％乙醇浸泡10分钟，70％乙醇浸泡10分钟。纯水清洗3次除去乙醇，制得水不溶性的丝素蛋白/甲壳素混纺纳米纤维。
(3).将混纺纳米纤维膜用球磨机球磨成短纤维，球磨条件为500转/分钟，15 分钟。液氮迅速冷冻，然后-50℃真空环境下连续冻干24小时，制得丝素蛋白/ 甲壳素混纺纳米短纤维。
(4).按再生丝素蛋白：短纤维＝3:1的比例称取再生丝素蛋白和短纤维，即称取提取的丝素蛋白30mg配制成丝素蛋白溶液，加入冻干的纳米短纤维10mg，并加入配制好的1mmol/mL乙二醇二缩水甘油醚EGDE悬浊液，保持溶液体系为1000μL，丝素蛋白溶液的浓度以3％(w/v)计。涡旋充分混匀,注入模具中。立即放入-20℃冷冻24h，室温下解冻后，加入等体积无水乙醇静置10min，将支架取出，即可得到丝素蛋白/甲壳素纳米纤维嵌入式水凝胶软骨仿生支架。

Claims (10)

1.一种基于丝素蛋白和甲壳素混纺纳米纤维嵌入式水凝胶软骨仿生支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）丝素蛋白制备：以桑蚕茧为原料，经脱胶、溶解、透析，获得截留液，将截留液在-50℃真空连续干燥48小时可得到再生丝素蛋白；
（2）甲壳素的纯化：工业级甲壳素经酸碱溶液反复洗涤提纯烘干后得到纯化的甲壳素；
（3）丝素蛋白/甲壳素混纺纳米纤维的制备：步骤（2）中纯化的甲壳素和步骤（1）中制备的再生丝素蛋白分别溶于六氟异丙醇溶剂，按1:10-1:1（w/w）的比例混合，混合溶液通过静电纺丝得到混纺纳米纤维膜，并干燥至溶剂完全挥发，经梯度乙醇交联后，用纯水清洗除去残留的乙醇，然后用混纺纳米纤维膜制备纳米短纤维，真空冷冻干燥后可长期保存；
（4）基于丝素蛋白和甲壳素混纺纳米纤维嵌入式水凝胶软骨仿生支架的制备：①将步骤（1）制备的再生丝素蛋白复溶于水，得到丝素蛋白水溶液，再加入步骤（3）制备的混纺短纤维，混匀后加入交联剂乙二醇二缩水甘油基乙醚，得到短纤维丝素蛋白悬浊液；
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将溶液倒入模具，冷冻定型，解冻后，即可得到基于丝素蛋白和甲壳素混纺纳米纤维嵌入式水凝胶软骨仿生支架。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述再生丝素蛋白制备方法为：a）脱胶：将桑蚕茧放入沸腾的浓度为5 g/L的碳酸钠（Na2CO3）溶液中，按每升浓度为5g/L的碳酸钠溶液中加入1g桑蚕茧的比例，煮沸30分钟，捞出，去离子水漂洗一次；再次在与上步等体积的沸腾的浓度为2.12 g/L的Na2CO3溶液中煮沸30分钟，捞出，去离子水漂洗，得到棉絮状蚕丝，浸入与上步等体积的去离子水中浸泡两次，每次15分钟，50℃烘箱烘干；b）溶丝：将步骤a）烘干的脱胶蚕丝溶于60℃ 9.3M溴化锂（LiBr）溶液，每克蚕丝需5mL溶液；c）透析：将步骤b）含丝素蛋白的混合液用截留分子量为14 kDa的透析袋进行透析，去离子水作为透析液，连续透析4天，透析液20倍体积于被透析蛋白溶液，并每天换一次，去除溶液中的溴化锂成分，获得截留液，截留液-50℃环境下连续真空冻干48小时，获得冻干的再生丝素蛋白。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述甲壳素的纯化为：a）碱纯化：按每克甲壳素浸泡在25mL 7%（w/v）的氢氧化钠溶液中24h，过滤得到第一次纯化的甲壳素a，用蒸馏水冲洗3遍去除残留氢氧化钠；b）酸纯化：将甲壳素a浸泡在3%的盐酸中24h，过滤得到第二次纯化的甲壳素b，蒸馏水冲洗3遍，去除残留盐酸；c）反复步骤a和步骤b一次，得到第三次纯化的甲壳素c；d）盐漂白干燥：将甲壳素c置于42mL 0.03M的亚氯酸钠溶液中80℃加热6h，过滤后，蒸馏水冲洗3次，50℃干燥一天。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中丝素蛋白/甲壳素混纺纳米纤维的制备：步骤（2）中纯化的甲壳素和步骤（1）中制备的再生丝素蛋白分别溶于六氟异丙醇（HFIP）获得澄清透明的溶液，然后将两者混合，混合液中丝素蛋白和甲壳素的混合比例为1:10-1:1（w/w），丝素蛋白的含量为1-10%（w/w）。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中静电纺丝的参数为：灌注速度为0.5-2.0mL/h，高压直流电源的电压为15-20kV，针头到接收板的距离为10-25cm，环境温度为15-30℃，湿度为30-60%。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述梯度乙醇交联的条件为：100%乙醇浸泡10分钟，90%乙醇浸泡10分钟，70%乙醇浸泡10分钟。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中制备纳米短纤维的方法为机械球磨法或超声均质法，球磨的条件为：200-2000转/分钟，10-20分钟，均质的条件优选为3000-8000转/分钟，总均质时间5-30分钟。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）所述步骤① EGDE加入的量与丝素蛋白溶液中丝素蛋白的质量成正比，即每克丝素蛋白加入EGDE 5-20mmol，获得丝素蛋白浓度为1-10%（w/v），丝素蛋白和短纤维比例为10:1-1:1（w/w）的悬浊液；所述的悬浊液转移至自制定向冷冻模具，冷冻定型12-28小时，支架形状由模具形状决定，将模具取出室温下解冻，得到丝素蛋白/甲壳素纳米纤维嵌入式水凝胶软骨仿生支架。
9.权利要求1-8任意一项所述的制备方法制得的基于丝素蛋白和甲壳素混纺纳米纤维嵌入式水凝胶软骨仿生支架。
10.权利要求9所述的基于丝素蛋白和甲壳素混纺纳米纤维嵌入式水凝胶软骨仿生支架在制备人工软骨材料中的应用。
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