CN103028145A - 一种丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架及制备与应用:将三维丝素蛋白支架1/2~3/4高度部分分别在氯化钙乙醇溶液、无水乙醇、磷酸氢二钾水溶液、去离子水中浸泡;重复上述操作1~15次,取最后经去离子水浸泡的丝素支架于氯化钙乙醇溶液中浸泡5~30min后用去离子水浸泡3~10min,使三维丝素蛋白支架预钙化;再将预钙化部分的三维丝素蛋白支架浸泡于仿生钙离子缓冲液中,在37℃下恒温培养4~8天,获得所述丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架;本发明预钙化过程中丝素支架能够获得羟基磷灰石晶体成核的位点,通过将支架在仿生钙离子缓冲液中培养,在支架的孔道表面形成均匀分散的弱结晶纳米羟基磷灰石。
Description
(一)技术领域
本发明涉及可用于骨软骨修复的双层支架材料的制备方法,特别涉及一种丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架及制备方法和应用,即一种以丝素蛋白为基质材料仿生构建结构一体化的用于骨软骨修复的双层支架材料的方法。
(二)背景技术
由于交通事故、运动创伤、各种关节炎疾病引起的骨软骨缺损给病人及其家属带来了巨大的痛苦及沉重的经济负担,不仅影响病人的生活质量,还增加了社会压力。目前临床上治疗关节骨软骨缺损一般采用自体骨软骨移植及异体或异种骨软骨移植。前者来源有限且造成新的损伤点,后者存在疾病的风险。因此都不能被广泛应用。
近年来组织工程的发展使生物相容性好、具有仿生结构的生物材料逐渐应用到临床骨软骨的治疗。然而,传统方法制备的单一结构的骨软骨修复材料已被证明不利于骨软骨的修复,而模拟骨软骨天然多层结构构建的组织工程支架材料逐渐成为研究热点,并取得较好的修复效果。
骨软骨包括表面的软骨层和软骨下骨层,研究表明,软骨下骨的再生和重建对于软骨的再生和修复至关重要。软骨下骨为天然骨组织,其无机成分主要为磷灰石,有机成分主要为胶原。在天然骨的形成过程中,胶原作为有机模板,磷灰石晶体在其纤维束表面及纤维束间成核、生长,形成骨组织。作为骨主要有机组成的胶原被广泛研究,并被应用于修复非承重骨软骨及骨组织,但其低力学强度及高降解速率严重限制其应用。蚕丝丝素蛋白不仅机械性能明显优于胶原,具有良好的生物相容性及可降解性,并且容易获得。同时,丝素蛋白系由富含天冬氨酸的β-折叠片层结构组成的酸性蛋白,其层侧面伸展出的-COOH是天然的磷灰石矿化模板,这种结构为仿生合成和自组装制备新型生物材料提供了分子化学基础.
传统的丝素基骨材料中丝素与羟基磷灰石复合早期采用的是共混法(如中国专利2005 10040925.X 名为“一种丝素羟基磷灰石复合材料及其制备方法”和中国专利2009 10096783.7 名为“羟基磷灰石/丝素蛋白复合多孔支架材料的制备方法),即将合成好的羟基磷灰石与丝素蛋白混合,制成凝胶或粉体后再用冷冻干燥的方法制得具有三维多孔结构的支架材料。这种方法的缺点是复合的羟基磷灰石含量有限,如果含量太高会降低支架的强度。近几年有采用共沉淀法或称化学沉积法(如中国专利2008 10052328.2名为“一种纳米相羟基磷灰石/丝素蛋白复合材料的制备方法”,中国专利2011 110119414.2 名为“一种含有柞蚕丝素的纳米骨仿生材料及其制备方法”等),即在丝素蛋白溶液中混入钙盐和磷酸盐,在一定的pH值条件下搅拌,形成丝素和磷灰石的混合体系。 Biomaterials (2010) 2848–2856 中先用共沉淀法在丝素中加入磷灰石粉末,再将该杂合粉末混到丝素中经冻干制得复合支架。这类方法的优点是可以调控支架体系中磷灰石的量。 但其缺点是 难以形成弱结晶的羟基磷灰石,虽可以获得足够的钙源,但是骨诱导性和骨传导性较差,从而应用受到较大的限制。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种仿生构建一体化丝素蛋白骨软骨双层生物材料及制备方法和应用,即克服传统的共混法,现有的共沉淀法或称化学沉积法中的不足,综合利用仿生方法和一体化构建观念,提供一种新的仿生构建一体化丝素基骨软骨双层生物材料的方法。
本发明采用的技术方案是:
一种丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架,所述丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架按如下方法制备:(1)丝素蛋白溶液的制备:以桑蚕蚕丝为原料,经脱胶、溶解、透析,获得截留液a,将截留液a或截留液a的浓缩液过滤或离心,取滤液或上层离心液得到丝素蛋白溶液,并用水将丝素蛋白溶液质量浓度调整至50~100mg/ml;(2)三维丝素蛋白支架的制备:在模具内注入粒径为100~500μm的氯化钠颗粒,再在氯化钠颗粒表面快速注入步骤(1)制备的丝素蛋白溶液,推压模具使氯化钠颗粒密实并排出丝素蛋白溶液及少许氯化钠与丝素蛋白溶液形成的气体,将模具在4~70℃下放置2~50h进行交联,然后去除模具,获得交联材料,将交联材料用水清洗后冷冻干燥,优选在水中浸洗2~20h,洗去支架中的氯化钠颗粒,再将支架在30~70℃条件下烘干,获得三维丝素蛋白支架;所述加入模具中氯化钠与丝素蛋白溶液的体积比为1:0.5~2;所述模具为一端封闭且封闭面带有透气孔的筒体,筒体的另一端开口并设有带活塞的推杆,所述透气孔的孔径小于或等于氯化钠颗粒的粒径,优选为50~ 500μm;(3)丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架的制备:将步骤(2)获得的三维丝素蛋白支架插入PE发泡棉中并使三维丝素蛋白支架1/2~3/4高度部分露出PE发泡棉制成浮漂模具,室温下将浮漂模具按下述步骤漂浮在溶液上使露出的三维丝素蛋白支架浸泡在相应溶液中进行预钙化和矿化处理,从而制备双层支架:①将上述浮漂模具漂浮在氯化钙乙醇溶液上使露出的三维丝素蛋白支架浸泡5~30min后,再漂浮于无水乙醇中浸泡3~10min;②取出步骤①经无水乙醇浸泡的浮漂模具漂浮在磷酸氢二钾水溶液中使露出的三维丝素蛋白支架浸泡5~30min后,再漂浮于去离子水中浸泡3~10min;③重复步骤①和②1~15次,取最后经去离子水浸泡的浮漂模具漂浮于氯化钙乙醇溶液中浸泡5~30min后用去离子水浸泡3~10min,使露出浮漂模具1/2~3/4高度部分的三维丝素蛋白支架预钙化;④将步骤③的浮漂模具漂浮于仿生钙离子缓冲液上并使露出的三维丝素蛋白支架浸泡于仿生钙离子缓冲液中,在37℃下恒温培养4~8天进行钙化,去除漂浮模具,获得所述丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架;所述仿生钙离子缓冲液的质量组成为:仿生钙离子缓冲液以1L计,NaCl为9.642g、NaHCO3为0.426g、KCl为0.27g、K2HPO4.3H2O为0.2772g、MgCl2.6H2O为0.3732g、1M HCl水溶液 45.6mL、CaCl2.2H2O为0.441g、Na2SO4.10H2O为0.0852g、NH2C(CH2OH)3为7.3416g。
进一步,步骤(3)所述步骤①和步骤③中氯化钙乙醇溶液的浓度均为0.05~2mol/L。
进一步,步骤(3)所述步骤②中磷酸氢二钾溶液的浓度为0.05~2mol/L。
进一步,步骤(3)所述在将步骤(2)获得的三维丝素蛋白支架插入PE发泡棉前,先将三维丝素蛋白支架切成4~10mm的厚度,再用体积浓度75%的乙醇水溶液浸泡6~12h。
进一步,步骤④所述步骤③的浮漂模具漂浮于仿生钙离子缓冲液上,在37℃下恒温培养4~6天进行钙化。
进一步,步骤(1)所述截留液a的浓缩液制备方法为:将透析后的透析袋放入质量浓度20~60%的聚乙二醇水溶液中,静置1~10h进行浓缩,取截留液a的浓缩液;所述聚乙二醇平均分子量1000~10000。
进一步,步骤(1)所述截留液a或截留液a的浓缩液过滤或离心方法为下列之一:a)将截留液a或截留液a的浓缩液于4℃、3000~6000g条件下离心5~20min,弃去沉淀,取上层溶液即为所述的丝素蛋白溶液;b)将截留液a或截留液a的浓缩液用孔径为2~20μm的滤器过滤,去除不溶性颗粒,滤液即为所述的丝素蛋白溶液。
进一步,步骤(1)所述丝素蛋白溶液的制备方法为:a)脱胶:将100g桑蚕蚕丝放入4~8L的2M碳酸钠水溶液中,90~100℃水浴20~60min,纯水清洗,该过程重复3次,脱去丝胶蛋白,留下丝素蛋白,将丝素蛋白在20~ 60℃烘干,获得干燥后的丝素蛋白;b)溶解:将上述干燥后的丝素蛋白溶于9~11M的溴化锂水溶液中,55~65℃水浴30~ 300min至丝素蛋白充分溶解,获得含丝素蛋白的混合液;所述干燥后的丝素蛋白与溴化锂水溶液的质量体积比为0.1~ 0.2:1(每毫升溴化锂水溶液中加入干燥后的丝素蛋白0.1~ 0.2g);c)透析:将含丝素蛋白的混合液用截留分子量1000~20000道尔顿的透析袋进行透析,用10倍混合液体积的无菌去离子水作为透析液在3天透析10~12次,去除溶液中的溴化锂成分,获得截留液a,将截留液a在3500rpm下离心10min,取上清液在-80~-120℃冷冻干燥2~3天,获得冻干的丝素蛋白,取冻干的丝素蛋白用去离子水在2~10℃下溶解2~5天配制成50~100mg/ml的丝素蛋白溶液。
进一步,步骤(2)所述模具可以是一端封闭且封闭面带有透气孔,另一端带有推压装置的各种形状的管材或柱体、盒体模具,优选所述模具由一次性溶量注射器的筒体和带有活塞的推杆制作成,是将一次性溶量注射器的筒体针座这一端烧结封闭并在封闭面上开凿有通孔制成的所述的模具筒,所述的通孔孔径为50~500μm,优选100~400μm、孔距为2~4mm,所述的带有活塞的推杆与所述的模具筒配合。
进一步,步骤(2)所述三维丝素蛋白支架的制备方法推荐为:将粒径200~500μm的氯化钠颗粒加入模具套筒中,再加入50~100mg/ml的丝素蛋白溶液,套上带有活塞的推杆,以1~3cm/s的推进速度将带有活塞的推杆推入丝素蛋白溶液后立即推压,直至不再有水气排出为止,即所述的丝素蛋白溶液渗透入氯化钠颗粒直至通孔处,将模具依次在4℃下放置36h,室温放置6h,60℃放置1h进行交联,然后去除模具,获得交联材料,将交联材料在室温下于去离子水中浸泡2~20h,更换去离子水5~10次,取出交联材料冻干或在30~70℃条件下烘干,获得三维丝素蛋白支架;所述加入模具中氯化钠与丝素蛋白溶液的体积比为1:1~1.5;所述模具是由一次性溶量注射器的筒体和带有活塞的推杆制作成,是将一次性溶量注射器的筒体针座这一端烧结封闭并在封闭面上开凿有通孔制成的所述的模具筒,所述的通孔孔径为100~300μm、孔距为2~4mm,所述的带有活塞的推杆与所述的模具筒配合。
所述丝素蛋白支架矿化的方法参照(Zhao et al., Tissue Engineering Part A., 2011,5-6: 765-776) ,将丝素蛋白支架材料浸于仿生钙离子缓冲液中,在37℃的恒温培养箱中矿化4~8天,在多孔丝素蛋白支架的孔道表面组装出一层具有纳米结构的羟基磷灰石。
仿生方法是一种在温和条件下开发新型生物材料的有效方法。研究表明,在仿生钙离子缓冲液中,羟基磷灰石能够沉积于蚕丝纤维表面,因此可将丝素蛋白作为模板,调节羟基磷灰石纳米晶体的矿化。在仿生矿化过程中,丝素蛋白的某些功能基团(如羧基 )对磷灰石的异相成核起着重要作用。
本发明方法构建的丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架上层(即未钙化的三维丝素蛋白支架层)为软骨层,厚度为1~4mm,下层(即钙化后的丝素蛋白-羟基磷灰石层)为软骨下骨层,厚度为3~8mm,该双层支架的层与层间形成无缝有机连接。
本发明涉及所述丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架在制备人工骨材料、关节骨软骨修复材料或牙周组织再生引导膜材料中的应用。
本发明还提供所述的丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架的两层,即上层的软骨层(未矿化的三维丝素蛋白支架层)和下层的软骨下骨层(矿化的丝素蛋白-羟基磷灰石层)在修复大鼠颅骨缺损中的应用。
与现有技术相比,本发明方法的有益效果主要体现在:
(1)本发明制备的丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架具有三维多孔结构,利于细胞粘附,营养通透;
(2)本发明预钙化过程中,丝素蛋白支架能够获得足够的钙源,并且表面的磷灰石/磷钙盐层可以对支架材料起到补强作用,且提供了在仿生钙离子缓冲液中矿化过程中羟基磷灰石晶体成核所需要的位点;
(3)矿化过程采用仿生矿化法,通过将支架在仿生钙离子缓冲液中培养,在支架的孔道表面形成均匀分散的纳米羟基磷灰石,为新骨组织再生提供钙源。
(4)本发明所述丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架的两层应用于大鼠颅骨缺损修复的研究结果表明,所述支架具有很好的生物相容性、骨诱导性,骨修复效果良好。
(四)附图说明
图1 丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架模拟图,A为未矿化的三维丝素蛋白层,B为矿化的丝素蛋白-羟基磷灰石层。
图2 实施例3制备的丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架照片,a为丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架一体图,b为支架中未经矿化三维丝素蛋白层经冰冻切片制成的丝素蛋白薄片,c为支架中经两步矿化后的丝素蛋白-羟基磷灰石层薄片。
图3 实施例2制备的丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架的两层切开后分别做的X射线衍射图,a对应未矿化的三维丝素蛋白层 ,b对应矿化的丝素蛋白-羟基磷灰石层。
图4丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架的两层切开后分别做的FT-IR图,a对应未矿化的三维丝素蛋白层 ,b对应矿化的丝素蛋白-羟基磷灰石层。
图5丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架的两层切开后分别做的扫描电镜(SEM)图:a未矿化的三维丝素蛋白层放大50倍的SEM图、b未矿化的三维丝素蛋白层放大10K倍的SEM图,c矿化的丝素蛋白-羟基磷灰石层放大50倍的SEM图、d对应矿化的丝素蛋白-羟基磷灰石层放大10K倍的SEM图。
图6 实施例6中大鼠骨髓间充质干细胞(rat BMSCs)分别在未矿化的三维丝素蛋白层(a)和矿化的丝素蛋白-羟基磷灰石层(b)上培养7天时的细胞形态的扫描电镜图。
图7 实施例6中大鼠骨髓间充质干细胞(rat BMSCs)分别在未矿化的三维丝素蛋白层(SF)和矿化的丝素蛋白-羟基磷灰石层(SF-HAp)上培养7天内的增殖结果图。
图8 实施例7中将未矿化的三维丝素蛋白层和矿化的丝素蛋白-羟基磷灰石层分别移植入经颅骨缺损造模的SD大鼠头颅缺损处术后16周的组织学染色照片:(a)、(b)为HE染色结果照片,(c)、(d)为SO染色结果照片;(a)、(c)为植入未矿化的三维丝素蛋白层染色结果照片,(b)、(d)为植入矿化丝素蛋白-羟基磷灰石层染色结果照片。
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此:
本发明所述模具的具体制备方法推荐为所述模具由一次性溶量注射器的筒体和带有活塞的推杆制作成,是将一次性溶量注射器的筒体针座这一端烧结封闭并在封闭面上开凿有通孔制成的所述的模具筒,所述的通孔孔径为50~500μm、孔距为2~ 4mm,所述的带有活塞的推杆与所述的模具筒配合。
所述浮漂模具的制备方法:将PE棉材质用打孔器打出所需孔径的圆孔,以此作为浮漂模具。
实施例1:
丝素蛋白溶液的制备:a)脱胶:将100g桑蚕蚕丝(浙江华芝丝绸有限责任公司,5A级)放入5L的2M碳酸钠水溶液中,96℃水浴30min,纯化水清洗,该过程重复3次,脱去丝胶蛋白,留下丝素蛋白,将丝素蛋白在50℃烘干,获得70g干燥后的丝素蛋白,备用;b)溶解:将上述干燥后的丝素蛋白以质量体积比0.2:1溶于9.3M的溴化锂(LiBr)水溶液中,60℃水浴90min至丝素蛋白充分溶解,获得含丝素蛋白和少量不溶性颗粒组成的混合液;c)透析:将混合液用再生纤维素透析袋(截留分子量4000道尔顿)透析,用10倍混合液体积的无菌纯化水在3d透析12次,去除溶液中的LiBr离子,获得截留液a;d)浓缩:将透析后的透析袋放入4倍体积的质量浓度50%聚乙二醇(PEG,分子量7000)水溶液,室温静置浓缩5h,取截留液b,即获得截留液a的浓缩液;e)将截留液b在水平转子5000g,4℃,离心10min,除去底部的未溶解丝素蛋白和溴化锂中可能存在不溶性颗粒,取上清液在-80℃冷冻干燥2-3天,获得冻干的丝素蛋白。
实施例2:丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架
(1)丝素蛋白溶液:取实施例1方法冻干后的丝素蛋白100mg,用去离子水在4℃溶解3天,配制成50mg/ml的丝素蛋白溶液2ml。
(2)模具制作:用1ml一次性容量注射器5个(外径均为6.5mm),包括注射器的筒体和带有活塞的推杆,作为模具;并且将一次性溶量注射器的筒体针座这一端烧结封闭并在封闭面上开凿有通孔制成的所述的模具筒,孔径和氯化钠颗粒相当(即45~50μm),孔距2 mm。
(3)材料压缩:先将预先研碎的颗粒大小为45~50μm 的NaCl 颗粒0.28g(0.2ml)倒入模具,再加入0.2ml步骤(1)丝素蛋白溶液。以1cm/s的推进速率快速推入溶液,立即推压,使水和少量气体从另一端的小孔排出,直至不再有水气排出为止。
(4)交联:将步骤(3)的模具依次在4℃放置36h,常温(20~28℃)放置6小时,60℃放置 1小时进行交联,解除模具的小孔端,将交联材料推入去离子水中浸泡2天,期间换水5 次,交联材料与单蒸水的体积比为1:100。取出交联材料在-110℃冻干12h,获得三维丝素蛋白支架,厚度8mm,直径4.5mm。
(5)丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架的制备:将步骤(4)制得的三维丝素蛋白支架切成4mm厚度,用50ml体积浓度75%乙醇水溶液浸泡8小时灭菌,同时准备0.05mol/L的氯化钙乙醇溶液和0.05mol/L的磷酸氢二钾水溶液(经高温高压灭菌)。将PE发泡棉制成带有4.5mm直径圆孔的浮漂模具,再将上述三维丝素蛋白支架插入模具的圆孔中,使三维丝素蛋白支架下端1/2部分露出浮漂模具,室温(28℃)下将浮漂模具按下述步骤漂浮在溶液上使露出的三维丝素蛋白支架浸泡在相应溶液中进行预钙化和矿化处理,制得骨软骨双层支架:①将浮漂模具漂浮在100ml上述氯化钙乙醇溶液上,并使露出浮漂模具的三维丝素蛋白支架浸泡10min,取出浮漂模具,再漂浮在100ml无水乙醇中,使露出的三维丝素蛋白支架浸泡5min;②取出步骤①经无水乙醇浸泡的浮漂模具漂浮在100ml上述磷酸氢二钾水溶液中使露出的丝素蛋白支架浸泡10min,取出模具漂浮在100ml去离子水中使露出的丝素蛋白支架浸泡5min;③重复步骤①和②1次,取最后经去离子水处理的浮漂模具,漂浮于100ml上述氯化钙乙醇溶液中使露出的三维丝素蛋白支架浸泡10min,取出模具漂浮在100ml去离子水中使露出的三维丝素蛋白支架浸泡5min,使露出浮漂模具的三维丝素蛋白支架预钙化;④取步骤③的浮漂模具漂浮于500ml仿生钙离子缓冲液中,使露出模具的三维丝素蛋白支架浸泡于仿生钙离子缓冲液中,在37℃的恒温培养箱中静置4天进行矿化。去除浮漂模具,获得所述丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架,上层(未矿化,即三维丝素蛋白层,下同)厚度2mm,下层(矿化,即丝素蛋白-羟基磷灰石层,下同)厚度2mm。模拟图见图1所示,两层的X射线衍射测试结果见图3所示,矿化4天,明显有弱结晶的羟基磷灰石生成,如图3(b)中的两个尖峰。傅氏转换红外线光谱(FT-IR)分析见图4所示,a为未经矿化的丝素蛋白层,b为矿化4天制得的丝素蛋白-羟基磷灰石层,表明羟基磷灰石与丝素蛋白通过P-O键共价结合。
仿生钙离子缓冲液以1L计,NaCl(9.642g)、NaHCO3(0.426g)、KCl(0.27g)、K2HPO4.3H2O (0.2772)、MgCl2.6H2O (0.3732g)、1M HCl(45.6mL)、CaCl2.2H2O(0.441g)、Na2SO4.10H2O(0.0852g)、NH2C(CH2OH)3 (Tris, 7.3416g)。
实施例3:丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架
(1)丝素蛋白溶液:取实施例1制备的丝素蛋白用去离子水在4℃溶解3天,配制成60mg/ml的丝素蛋白溶液15ml。
(2)模具制作:用4个10ml一次性容量注射器(外径为16.5mm),包括注射器的筒体和带有活塞的推杆,作为模具;并且将一次性溶量注射器的筒体针座这一端烧结封闭并在封闭面上开凿有通孔制成的所述的模具筒,孔径和氯化钠颗粒相当(150~200μm),孔距3mm。
(3)材料压缩:先将预先研碎的颗粒大小为150~200μm的NaCl 颗粒2.8g(2ml)倒入每个模具,再分别加入步骤(1)制备的3ml丝素蛋白溶液,以3cm/s的推进速率推入溶液,立即推压,使水和少量气体从另一端的小孔排出,直至不再有水气排出为止。
(4)交联:将步骤(3)的模具依次在4 °C放置36h,常温6小时,60°C 放置1小时进行交联,解除模具的小孔端,将交联材料推入去离子水中浸泡2天,期间换水6次,交联材料与去离子水的体积比为1:150。取出交联材料在-110℃冻干12h,获得三维丝素蛋白支架,厚度10mm,直径14.5mm,照片见图2中的a所示。
(5)丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架的制备:将步骤(4)制得的三维丝素蛋白支架切成5mm厚度,用150ml体积浓度75%乙醇水溶液浸泡12小时灭菌,同时准备1mol/L的氯化钙乙醇溶液和1mol/L的磷酸氢二钾水溶液(经高温高压灭菌)。
将PE发泡棉制成带有14.5mm直径圆孔的浮漂模具,再将上述预处理后的三维丝素蛋白支架插入模具的圆孔中,使三维丝素蛋白支架下端3/4部分露出浮漂模具,室温(28℃)下将浮漂模具按下述步骤漂浮在溶液上使露出的三维丝素蛋白支架浸泡在相应溶液中进行预钙化和矿化处理,制得骨软骨双层支架:①将浮漂模具漂浮在100ml上述氯化钙乙醇溶液上,并使露出浮漂模具的丝素蛋白支架浸泡25min,取出浮漂模具,再漂浮在100ml无水乙醇中,使露出的丝素蛋白支架浸泡10min;②取出步骤①经无水乙醇浸泡的浮漂模具漂浮在100ml上述磷酸氢二钾水溶液中使露出的丝素蛋白支架浸泡25min,取出模具漂浮在100ml去离子水中使露出的丝素蛋白支架浸泡10min;③重复步骤①和②2次,取最后经去离子水处理的浮漂模具,漂浮于100ml上述氯化钙乙醇溶液中使露出的丝素蛋白支架浸泡25min,取出模具漂浮在100ml去离子水中使露出的丝素蛋白支架浸泡10min,使露出浮漂模具的丝素蛋白支架预钙化;④取步骤③的浮漂模具漂浮于2.5L仿生钙离子缓冲液(配方同实施例2)中,使露出模具的丝素蛋白支架浸泡于仿生钙离子缓冲液中,在37℃的恒温培养箱中静置4天进行矿化,然后更换仿生钙离子缓冲液重复矿化4天。去除浮漂模具,获得所述丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架,上层厚度1.2mm,下层厚度3.8mm。该丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架照片见图2所示,a为丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架一体图, b为支架中未经矿化三维丝素蛋白层经冰冻切片制成的丝素蛋白薄片,c为支架中经两步矿化后的丝素蛋白-羟基磷灰石层薄片。该丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架的两层的扫描电镜照片见图5所示,a、b对应未矿化的三维丝素蛋白层 ,c、d对应矿化的丝素蛋白-羟基磷灰石层,可以看出三维丝素蛋白层具有多孔结构,孔壁光滑,孔径为100~300μm;片状的羟基磷灰石颗粒形成于支架的孔壁上,颗粒的厚度约为50nm。表面经该矿化方法制得的羟基磷灰石晶体颗粒尺寸为纳米级。
实施例4:丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架
(1)丝素蛋白溶液: 80mg/ml丝素蛋白溶液12ml的制备同实施例3。
(2)模具制作:用5个5ml聚丙烯材料的一次性容量注射器(外径为13.5mm),包括注射器的筒体和带有活塞的推杆,作为模具;并且将一次性溶量注射器的筒体针座这一端烧结封闭并在封闭面上开凿有通孔制成的所述的模具筒,孔径和氯化钠颗粒相当,孔距3mm。
(3)材料压缩:先将预先研碎的颗粒大小为50~100μm 的NaCl 颗粒2.8g(2ml)倒入模具,再加入步骤(2)制备的2ml丝素蛋白溶液,以2cm/s的推进速率推入溶液,立即推压,使水和少量气体从另一端的小孔排出,直至不再有水气排出为止。
(4)交联:将步骤(3)的模具依次在4 °C放置36h,常温(28℃)放置6小时,60°C 放置1小时进行交联,解除模具的小孔端,将交联材料推入去离子水中浸泡2天,期间换水5次,交联材料与去离子水的体积比为1:200。取出交联材料在-110℃冻干12h,获得三维丝素蛋白支架,厚度12mm,直径12.5mm。
(5)丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架的制备:将步骤(4)制得的三维丝素蛋白支架切成6mm厚度,用200ml体积浓度75%乙醇水溶液浸泡12小时灭菌,同时准备2mol/L的氯化钙乙醇溶液和2mol/L的磷酸氢二钾水溶液(经高温高压灭菌)。将PE发泡棉制成带有12mm直径圆孔的浮漂模具,再将上述预处理后的三维丝素蛋白支架插入模具的圆孔中,使三维丝素蛋白支架下端1/2部分露出浮漂模具,室温(28℃)下将浮漂模具按下述步骤漂浮在溶液上使露出的三维丝素蛋白支架浸泡在相应溶液中进行预钙化和矿化处理,制得骨软骨双层支架:①将浮漂模具漂浮在50ml上述氯化钙乙醇溶液上,并使露出浮漂模具的三维丝素蛋白支架浸泡20min,取出浮漂模具,再漂浮在50ml无水乙醇中,使露出的三维丝素蛋白支架浸泡10min;②取出步骤①经无水乙醇浸泡的浮漂模具漂浮在50ml上述磷酸氢二钾水溶液中使露出的三维丝素蛋白支架浸泡20min,取出模具漂浮在50ml去离子水中使露出的三维丝素蛋白支架浸泡10min;③重复步骤①和②1次,取最后经去离子水处理的浮漂模具,漂浮于50ml上述氯化钙乙醇溶液中使露出的三维丝素蛋白支架浸泡20min,取出模具漂浮在50ml去离子水中使露出的三维丝素蛋白支架浸泡10min,使露出浮漂模具的三维丝素蛋白支架预钙化;④取步骤③的浮漂模具漂浮于2L仿生钙离子缓冲液(配方同实施例2)中,使露出模具的三维丝素蛋白支架浸泡于仿生钙离子缓冲液中,在37℃的恒温培养箱中静置7天进行矿化,第4天时更换仿生钙离子缓冲液。去除浮漂模具,获得所述丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架,上层厚度3mm,下层厚度3mm。
实施例5:丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架
(1)丝素蛋白溶液:取实施例2方法冻干后的丝素蛋白用去离子水在4℃溶解4天,配制成100mg/ml的丝素蛋白溶液3ml。
(2)模具制作:用4个2ml一次性容量注射器(外径为10mm),包括注射器的筒体和带有活塞的推杆,作为模具;并且将一次性溶量注射器的筒体针座这一端烧结封闭并在封闭面上开凿有通孔制成的所述的模具筒,孔径和氯化钠颗粒相当,孔距3mm。
(3)材料压缩:先将预先研碎的颗粒大小为100~200μm的NaCl 颗粒0.56g(0.4ml)倒入模具,再加入步骤(2)制备的0.6ml丝素蛋白溶液,以3cm/s的推进速率推入溶液,立即推压,使水和少量气体从另一端的小孔排出,直至不再有水气排出为止。
(4)交联:将步骤(3)的模具依次在4 °C放置36h,常温(28℃)放置6小时,60°C放置 1小时进行交联,解除模具的小孔端,将材料推入去离子水中浸泡2天,期间换水5次,交联材料与单蒸水的体积比为1:100。取出交联材料在-110℃冻干12h,获得三维丝素蛋白支架,厚度6mm,直径8.5mm。
(5)丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架的制备:将步骤(4)制得的三维丝素蛋白支架切成5mm厚度,用50ml体积浓度75%乙醇水溶液浸泡12小时灭菌,同时准备0.2mol/L的氯化钙乙醇溶液,和0.2mol/L的磷酸氢二钾水溶液(经高温高压灭菌)。将PE发泡棉制成带有8.5mm直径圆孔的浮漂模具,再将上述三维丝素蛋白支架插入模具的圆孔中,使三维丝素蛋白支架下端2/3部分露出浮漂模具,室温(28℃)下将浮漂模具按下述步骤漂浮在溶液上使露出的三维丝素蛋白支架浸泡在相应溶液中进行预钙化和矿化处理,制得骨软骨双层支架:①将浮漂模具漂浮在100ml上述氯化钙乙醇溶液上,并使露出浮漂模具的三维丝素蛋白支架浸泡15min,取出浮漂模具,再漂浮在100ml无水乙醇中,使露出的三维丝素蛋白支架浸泡8min;②取出步骤①经无水乙醇浸泡的浮漂模具漂浮在100ml上述磷酸氢二钾水溶液中使露出的三维丝素蛋白支架浸泡15min,取出模具漂浮在100ml去离子水中使露出的三维丝素蛋白支架浸泡8min;③重复步骤①和②1次,取最后经去离子水处理的浮漂模具,漂浮于100ml上述氯化钙乙醇溶液中使露出的三维丝素蛋白支架浸泡15min,取出模具漂浮在100ml去离子水中使露出的三维丝素蛋白支架浸泡8min,使露出浮漂模具的三维丝素蛋白支架预钙化;④取步骤③的浮漂模具漂浮于1L仿生钙离子缓冲液(配方同实施例2)中,使露出模具的三维丝素蛋白支架浸泡于仿生钙离子缓冲液中,在37℃的恒温培养箱中静置6天进行矿化,在第4天时更换仿生钙离子缓冲液。去除浮漂模具,获得所述丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架,上层厚度1.5mm,下层厚度3.5mm。
实施例6 丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架的应用
将大鼠骨髓间充质干细胞(rat BMSCs,提供地:浙江大学干细胞与组织工程中心,即浙江省组织工程和再生医学技术重点实验室)分别在实施例3制备的丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架的上层(即未矿化的三维丝素蛋白层)和下层(即矿化的丝素蛋白-羟基磷灰石层)上,37℃培养,7天时细胞粘附在支架上的形态扫描电镜图见图6所示,7天内细胞增殖检测结果见图7所示。结果说明大鼠骨髓间充质干细胞在该双层支架的两层上均能很好的粘附,并且呈现出明显的增殖趋势,进而说明该双层支架具有很好的细胞相容性。
实施例7
将实施例3制备的丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架的下层(即经矿化制得的丝素蛋白-羟基磷灰石层)切成1mm厚度,进行颅骨修复实验,研究其骨再生性能,并且将样品支架的上层(即未矿化的三维丝素蛋白层)作为对照。
将上述1mm厚度丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架的下层植入经颅骨缺损造模的SD大鼠头颅缺损处,术后16周进行组织学染色,见图8所示。图8中,(a)、(b)为HE染色结果照片,(c)、(d)为SO染色结果照片;(a)、(c)为对照组结果照片,(b)、(d)为实验组即植入矿化丝素支架组染色结果照片。
结果表明:该双层支架的两层均具有良好的组织相容性,两层均有一定的骨诱导性能,且软骨下骨层(即矿化的丝素蛋白-羟基磷灰石层)较软骨层(即未矿化的三维丝素蛋白层)具有更好的骨再生性能。
Claims (9)
1.一种丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架,其特征在于所述丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架按如下方法制备:(1)丝素蛋白溶液的制备:以桑蚕蚕丝为原料,经脱胶、溶解、透析,获得截留液a,将截留液a或截留液a的浓缩液过滤或离心,取滤液或上层离心液得到丝素蛋白溶液,并用水将丝素蛋白溶液质量浓度调整至50~100mg/ml;(2)三维丝素蛋白支架的制备:将粒径为100~500μm的氯化钠颗粒装入模具中,再加入步骤(1)制备的丝素蛋白溶液,推压模具的推压装置使氯化钠颗粒密实并排出气体,将模具在4~70℃下放置2~50h进行交联,然后去除模具,获得交联材料,将交联材料用水清洗后冷冻干燥,获得三维丝素蛋白支架;所述加入模具中氯化钠与丝素蛋白溶液的体积比为1:0.5~2;所述模具为一端封闭且封闭面带有透气孔的筒体,筒体的另一端开口并设有带活塞的推杆;(3)丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架的制备:将步骤(2)获得的三维丝素蛋白支架插入PE发泡棉中并使三维丝素蛋白支架1/2~3/4高度部分露出PE发泡棉制成浮漂模具,室温下将浮漂模具按下述步骤漂浮在溶液上使露出的三维丝素蛋白支架浸泡在相应溶液中进行预钙化和矿化处理,从而制备双层支架:①将上述浮漂模具漂浮在氯化钙乙醇溶液上使露出的三维丝素蛋白支架浸泡5~30min后,再漂浮于无水乙醇中浸泡3~10min;②取出步骤①经无水乙醇浸泡的浮漂模具漂浮在磷酸氢二钾水溶液中使露出的三维丝素蛋白支架浸泡5~30min后,再漂浮于去离子水中浸泡3~10min;③重复步骤①和②1~15次,取最后经去离子水浸泡的浮漂模具漂浮于氯化钙乙醇溶液中浸泡5~30min后用去离子水浸泡3~10min,使露出浮漂模具1/2~3/4高度部分的三维丝素蛋白支架预钙化;④将步骤③的浮漂模具漂浮于仿生钙离子缓冲液上并使露出的三维丝素蛋白支架浸泡于仿生钙离子缓冲液中,在37℃下恒温培养4~8天进行钙化,去除漂浮模具,获得所述丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架;所述仿生钙离子缓冲液的质量组成为:仿生钙离子缓冲液以1L计,NaCl为9.642g、NaHCO3为0.426g、KCl为0.27g、K2HPO4.3H2O为0.2772g、MgCl2.6H2O为0.3732g、1M HCl水溶液 45.6mL、CaCl2.2H2O为0.441g、Na2SO4.10H2O为0.0852g、NH2C(CH2OH)3为7.3416g。
2.如权利要求1所述丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架,其特征在于所述步骤①和步骤③中氯化钙乙醇溶液的浓度均为0.05~2mol/L。
3.如权利要求1所述丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架,其特征在于所述步骤②中磷酸氢二钾溶液的浓度为0.05~2mol/L。
4.如权利要求1所述丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架,其特征在于步骤(3)所述在将步骤(2)获得的三维丝素蛋白支架插入PE发泡棉前,先将三维丝素蛋白支架切成4~10mm的厚度,再用体积浓度75%的乙醇水溶液浸泡6~12h。
5.如权利要求1所述丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架,其特征在于步骤④所述步骤③的浮漂模具漂浮于仿生钙离子缓冲液上,在37℃下恒温培养4~6天进行钙化。
6.如权利要求1所述丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架,其特征在于步骤(1)所述丝素蛋白溶液的制备方法为:a)脱胶:将100g桑蚕蚕丝放入4~8L的2M碳酸钠水溶液中,90~100℃水浴20~60min,纯水清洗,该过程重复3次,脱去丝胶蛋白,留下丝素蛋白,将丝素蛋白在20~ 60℃烘干,获得干燥后的丝素蛋白;b)溶解:将上述干燥后的丝素蛋白溶于9~11M的溴化锂水溶液中,55~65℃水浴30~ 300min至丝素蛋白充分溶解,获得含丝素蛋白的混合液;所述干燥后的丝素蛋白与溴化锂水溶液的质量体积比为0.1~ 0.2:1;c)透析:将含丝素蛋白的混合液用截留分子量1000~20000道尔顿的透析袋进行透析,用10倍混合液体积的无菌去离子水作为透析液在3天透析10~12次,去除溶液中的溴化锂成分,获得截留液a,将截留液a在3500rpm下离心10min,取上清液在-80~ -120℃冷冻干燥2~3天,获得冻干的丝素蛋白,取冻干的丝素蛋白用去离子水在2~10℃下溶解2~5天配制成50~100mg/ml的丝素蛋白溶液。
7.如权利要求1所述丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架,其特征在于步骤(2)所述模具由一次性溶量注射器的筒体和带有活塞的推杆制作成,是将一次性溶量注射器的筒体针座这一端烧结封闭并在封闭面上开凿有通孔制成的所述的模具筒,所述的通孔孔径为50~500μm、孔距为2~4mm,所述的带有活塞的推杆与所述的模具筒配合。
8.如权利要求1所述丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架,其特征在于步骤(2)所述三维丝素蛋白支架的制备方法为:将粒径200~500μm的氯化钠颗粒加入模具套筒中,再加入50~100mg/ml的丝素蛋白溶液,套上带有活塞的推杆以1~3cm/s的推进速度将带有活塞的推杆推入丝素蛋白溶液后立即推压,直至排出所有水气为止,将模具依次在4℃下放置36h,室温放置6h,60℃放置1h进行交联,然后去除模具,获得交联材料,将交联材料在室温下于去离子水中浸泡2~20h,更换去离子水5~10次,取出交联材料冻干或在30~70℃烘干,获得三维丝素蛋白支架;所述加入模具中氯化钠与丝素蛋白溶液的体积比为1:1~1.5;所述模具是由一次性溶量注射器的筒体和带有活塞的推杆制作成,是将一次性溶量注射器的筒体针座这一端烧结封闭并在封闭面上开凿有通孔制成的所述的模具筒,所述的通孔孔径为100~300μm、孔距为2~ 4mm,所述的带有活塞的推杆与所述的模具筒配合。
9.一种权利要求1~8之一所述丝素蛋白基一体化骨软骨双层支架在制备人工骨材料、关节骨软骨修复材料或牙周组织再生引导膜材料中的应用。
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