CN101596327A

CN101596327A - 一种三维丝素蛋白多孔支架材料的制备方法

Info

Publication number: CN101596327A
Application number: CN 200910089283
Authority: CN
Inventors: 曹传宝; 张兴华
Original assignee: Beijing Institute of Technology BIT
Current assignee: Beijing Institute of Technology BIT
Priority date: 2009-07-13
Filing date: 2009-07-13
Publication date: 2009-12-09
Anticipated expiration: 2029-07-13
Also published as: CN101596327B

Abstract

本发明是一种三维丝素蛋白多孔支架材料的制备方法，涉及生物材料领域，特别涉及到组织工程支架领域。本发明是将体积浓度为2％～50wt％的丝素蛋白水溶液置于容器中，然后在20℃～80℃不断搅拌的情况下在丝素溶液中加入氯化钠，其中氯化钠颗粒的质量(单位为克)与丝素溶液的体积(单位为ml)比为1～20∶1。丝素溶液经凝胶、静置、沉淀后，取沉淀部分，继续搅拌将沉淀物混合均匀，然后将其放入所需形状的模具中，烘干。最后经蒸馏水洗去支架中的氯化钠，即得到具有三维多孔结构的丝素支架材料。本方法不使用任何有机溶剂，简单有效，所制备的丝素多孔支架具有可控的孔隙率及孔径大小，高度相通的孔结构以及可降解性。

Description

一种三维丝素蛋白多孔支架材料的制备方法

技术领域

本发明是一种三维丝素蛋白多孔支架材料的制备方法，涉及生物材料领域，特别涉及到组织工程支架领域。

背景技术

丝素蛋白是从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白，因其具有优良的理化性能和生物相容性，近年来丝素蛋白在生物医用材料方面的研究和应用得到了广泛的关注。而随着组织工程的兴起以及组织工程对多孔材料的需求，制备可用于组织工程的丝素支架材料得到了越来越多的重视。

1987年美国自然科学基金工程理事会在生物工程研讨会上提出了组织工程概念，即“应用工程学和生命学的原理和方法来了解正常的和病理的哺乳类动物的组织结构-功能的关系，并研制生物组织代用品，用于修复、维持和改善人体组织的功能”。组织工程的基本原理和方法是，将体外培养的高浓度组织细胞扩增后吸附于一种生物相容性良好，并可被人体逐步降解吸收的细胞外基质(ECM)材料上，形成细胞-生物材料复合物。该材料可为细胞提供生存的三维空间，有利于细胞获得足够的营养物质，进行新陈代谢，使细胞按预制形态的三维支架生长；然后将这种复合体植入机体所需部位。种植的细胞在生物支架降解吸收过程中，继续增生繁殖，形成了新的具有原来特殊功能和形态的相应组织和器官，从而可达到修复组织外形和功能重建的目的。理想的组织工程支架材料或细胞载体应具有以下条件：①良好的生物相容性；②适宜的生物降解性；③有效的表面活性；④一定的可塑性；⑤具有三维多孔结构。组织在体内常为三维空间构型，给细胞的生长提供了适宜的营养条件和空间条件，有利于组织发挥特定的生理功能。因此，植入物的设计应主要考虑载体材料的空间构型，如孔的尺寸、孔之间的连通性、材料内部的表面积等。开孔材料表面可以比普通的材料表面更有利于细胞伪足的攀附，增加细胞层与基底材料之间的物理作用力。基底材料上的开孔有利于水分、无机盐以及其它营养物质和细胞代谢产物的运输和交换，从而更有利于细胞的正常生长和生理代谢。为了进行多层细胞的体外培养，如何制备三维多孔结构的细胞载体材料已成为材料科学研究的热点。目前，应用在组织工程中的主要结构形式有纤维支架和多孔泡沫两种。

丝素蛋白作为天然生物蛋白，以其优异的生物相容性，低炎症反应性和良好的力学性能，受到生物材料界广泛的研究。在生物医学领域，丝素作为手术缝合线已有几百年的历史，在人造皮肤，人造韧带，人造骨，人造血管，药物缓释材料以及酶固定化材料方面已取得了一系列的基础研究成果，显示了巨大的应用潜力。由于丝素蛋白支链有细胞生长和黏附因素，且可以通过再生制得纳米级到微米级的蛋白纤维，与体内组织结构相似，因此在组织工程领域也得到广泛的研究。

专利“不溶性丝素蛋白薄膜及丝素蛋白管的制备”(专利号为03131142.3)中高浓度(浓度大于50wt％)的丝素蛋白水溶液的制备方法为：把蚕丝加入到Na₂CO₃水溶液中，Na₂CO₃水溶液的浓度为0.5％(W/W)，然后将上述溶液在100℃条件下煮60min，以除去蚕丝外部的丝胶蛋白，将煮过的丝素蛋白用蒸馏水三次洗涤后干燥，获得纯的丝素蛋白。然后将丝素蛋白加入到CaCl₂、H₂O和CH₃CH₂OH的三元溶液中，在80℃条件下溶解40min，其中CaCl₂、H₂O和CH₃CH₂OH的摩尔比为1∶8∶2。然后将三元溶液装入透析袋室温下用蒸馏水透析三天，以除去溶液中的氯化钙和乙醇。把三元溶液进行过滤，然后得到纯净的丝素蛋白水溶液；然后将纯丝素蛋白水溶液在60℃下温和搅拌一段时间，浓缩得到浓度大于50wt％的高浓度的丝素蛋白溶液。

丝素蛋白不仅拥有优异的生物相容性，而且价廉易得，使得丝素蛋白受到更为广泛的关注，更利于商业化生产。目前已通过各种不同的方法，包括静电纺丝，冷冻干燥，盐沥滤，气体致孔等方法获得了丝素蛋白多孔支架材料，所获得的支架材料具有均一稳定的多孔结构和机械性能。但这些方法制备丝素蛋白多孔支架，基本上都需要冷冻干燥步骤才能使丝素蛋白成型，比较繁琐；而且制备过程也需要用到六氟异丙醇、甲醇等有机溶剂，可能导致支架带有毒性。2005年Kim UJ等人报道了一种不使用任何有机溶剂，完全从丝素蛋白水溶液中制备丝素多孔支架的盐沥滤法，我们在经过多次重复后发现，用这种方法不能有效地制备丝素多孔支架，因为在洗盐的过程中丝素凝胶也会一起溶解掉。因此，寻找一种简单可行，又安全可靠的制备丝素多孔支架材料的方法对于组织工程来说具有非常重大的意义。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种三维丝素多孔支架材料的制备方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

制备高浓度的丝素蛋白水溶液同专利“不溶性丝素蛋白薄膜及丝素蛋白管的制备”(专利号为03131142.3)，即白厂丝经脱胶、溶解、透析、抽滤、浓缩得到高浓度(浓度大于50wt％)的丝素蛋白水溶液，其制备步骤次序为：

(1)将氯化钠用不同孔径大小的筛子预先进行分级，分成大小不等的氯化钠颗粒；

(2)将高浓度的丝素蛋白水溶液配制成不同浓度(2％～50wt％)的丝素溶液，然后将丝素溶液置于容器中；

(3)丝素溶液在加热(20℃～80℃)、搅拌的条件下加入氯化钠颗粒；氯化钠颗粒的质量(单位为克)与丝素溶液的体积(单位为ml)比为1～20∶1；

(4)上述丝素溶液凝胶，然后静置直到丝素凝胶沉淀完全，去掉上面澄清液，留下沉淀部分，并搅拌均匀；

(5)将上述沉淀部分放入所需形状的模具中，烘干；

(6)将烘干的样品连同模具一起浸入蒸馏水中直到支架中的氯化钠完全溶解，即得到具有三维多孔结构的丝素支架材料。

对所制备的丝素多孔支架的各种性能进行了表征和研究，用扫描电子显微镜观察其微观形貌，用傅立叶变换红外光谱，X射线衍射测定材料中丝素蛋白的结构，并对材料进行了孔隙率，吸水性，力学性能及降解性能的分析。实验结果表明：这种方法所制备的丝素支架材料具有粗糙的孔壁及高度相通的孔结构。通过调节氯化钠颗粒的质量与丝素溶液的体积比，得到不同孔隙率的支架材料。体外酶降解实验结果表明，这种丝素多孔支架在蛋白酶XIV的作用下可以降解，支架的降解速度与支架的孔隙率及PBS中蛋白酶的含量有关，孔隙率越大，蛋白酶的含量越多，支架的降解速度也越快。最后通过在丝素多孔支架上培养人成骨肉瘤细胞(MG-63)研究材料的细胞相容性，发现MG-63细胞在这种丝素多孔支架上能够很好的粘附和增殖，细胞增殖速度快，三周后就连成片，说明这种丝素多孔支架具有良好的细胞相容性，可望用做各种组织工程支架材料

有益效果

1.这种制备方法不使用任何有机溶剂，避免了支架毒性问题；

2.这种制备方法不需要冷冻干燥，简化了工艺条件，降低了成本；

3.所制备的丝素多孔支架的形状可以是任意的，其形状完全取决于“模具”；

4.所制备的丝素多孔支架具有可控的孔隙率和孔径大小，高度相通的孔结构以及可降解性，其孔隙率、吸水性以及力学性能可以通过调整氯化钠颗粒的质量与丝素溶液的体积比值来进行调整，孔径大小可以通过氯化钠颗粒的大小来控制，因此，用这种方法制备的丝素多孔支架可以满足不同组织工程，如皮肤、骨、软骨、肺、等组织工程对支架材料的不同需求。

附图说明

图1是本发明制备三维丝素多孔支架的流程图；

图2是本发明制备的丝素蛋白多孔支架的宏观图；

图3是不同浓度的丝素蛋白溶液所形成的丝素多孔支架形貌的扫描电镜图，(氯化钠颗粒的质量与丝素溶液的体积比为2∶1，其中丝素溶液的浓度(wt％)分别为：a：5％、b：10％、c：15％、d：20％)；

图4是不同NaCl添加量时所制备的丝素多孔支架形貌的扫描电镜图，(丝素溶液浓度为10％，其中氯化钠颗粒的质量与丝素溶液的体积比为：a：1∶1、b：3∶2、c：2∶1、d：5∶2)。

具体实施方式

高浓度丝素蛋白水溶液的制备方法同专利“不溶性丝素蛋白薄膜及丝素蛋白管的制备”(专利号为03131142.3)，然后测定浓缩后的丝素蛋白溶液的浓度，并配制不同浓度的丝素蛋白水溶液(2％～50wt％)，以备后续使用。

实施例1

氯化钠过200目筛。将浓度为2wt％的丝素溶液20ml加热到60℃，温和搅拌的同时，加入20g氯化钠。丝素溶液凝胶后，静置使丝素凝胶沉淀完全，去掉上面澄清液，留下沉淀部分。继续搅拌将沉淀物混合均匀，然后将沉淀物放入模具中，烘干。将烘干的样品连同容器一起浸入到蒸馏水中直到支架中的氯化钠完全溶解，最后得到三维丝素多孔支架材料，其孔隙率为98.1％。

实施例2

重复实施例1的方法，其中丝素溶液的体积为40ml，氯化钠的质量为20g，最后得到的三维丝素多孔支架材料，其孔隙率为99.3％。

实施例3

重复实施例1的方法，其中丝素溶液的浓度为50wt％、体积为100ml，氯化钠的质量为10g，最后得到的三维丝素多孔支架材料，其孔隙率为69.4％。

实施例4

重复实施例1的方法，其中丝素溶液的浓度为50wt％、体积为150ml，氯化钠的质量为10g，最后得到的三维丝素多孔支架材料，其孔隙率为89.3％。

实施例5

重复实施例1的方法，其中丝素溶液的浓度为50wt％、体积为200ml，氯化钠的质量为10g，最后得到的三维丝素多孔支架材料，其孔隙率为99.2％。

实施例6

重复实施例1的方法，其中丝素溶液的浓度为5wt％、体积为40ml，氯化钠的质量为20g，最后得到的三维丝素多孔支架材料，其孔隙率为97.6％，形貌的扫描电镜图如图3(a)所示。

实施例7

重复实施例1的方法，其中丝素溶液的浓度为10wt％、体积为20ml，氯化钠的质量为20g，最后得到的三维丝素多孔支架材料，其孔隙率为79.2％，形貌的扫描电镜图如图4(a)所示。

实施例8

重复实施例1的方法，其中丝素溶液的浓度为10wt％、体积为30ml，氯化钠的质量为20g，最后得到的三维丝素多孔支架材料，其孔隙率为91.5％，形貌的扫描电镜图如图4(b)所示。

实施例9

重复实施例1的方法，其中丝素溶液的浓度为10wt％、体积为40ml，氯化钠的质量为20g，最后得到的三维丝素多孔支架材料，其孔隙率为94.6％，形貌的扫描电镜图如图3(b)和图4(c)所示。

实施例10

重复实施例1的方法，其中丝素溶液的浓度为10wt％、体积为50ml，氯化钠的质量为20g，最后得到的三维丝素多孔支架材料，其孔隙率为98.7％，形貌的扫描电镜图如图4(d)所示。

实施例11

重复实施例1的方法，其中丝素溶液的浓度为15wt％、体积为40ml，氯化钠的质量为20g，最后得到的三维丝素多孔支架材料，其孔隙率为92.4％，形貌的扫描电镜图如图3(c)所示。

实施例12

重复实施例1的方法，其中丝素溶液的浓度为20wt％、体积为40ml，氯化钠的质量为20g，最后得到的三维丝素多孔支架材料，其孔隙率为88.0％，形貌的扫描电镜图如图3(d)所示。

实施例13

重复实施例1的方法，其中丝素溶液的浓度为30wt％、体积为40ml，氯化钠的质量为20g，最后得到的三维丝素多孔支架材料，其孔隙率为79.2％。

实施例14

重复实施例1的方法，其中丝素溶液的浓度为40wt％、体积为40ml，氯化钠的质量为20g，最后得到的三维丝素多孔支架材料，其孔隙率为68.5％。

Claims

1.一种三维丝素蛋白多孔支架材料的制备方法，其特征在于：

(2)将高浓度的丝素蛋白水溶液配制成不同浓度的丝素溶液，然后将丝素溶液置于容器中；

(3)丝素溶液在加热、搅拌的条件下加入氯化钠颗粒；

(5)将上述沉淀部分放入所需形状的模具中，烘干；

2.根据权利要求1所述的一种三维丝素蛋白多孔支架材料的制备方法，其特征在于：步骤(2)中丝素溶液的浓度为2％～50wt％。

3.根据权利要求1所述的一种三维丝素蛋白多孔支架材料的制备方法，其特征在于：步骤(3)中丝素溶液的加热温度为20℃～80℃。

4.根据权利要求1所述的一种三维丝素蛋白多孔支架材料的制备方法，其特征在于：步骤(3)中氯化钠颗粒的质量(单位为g)与丝素溶液的体积(单位为ml)比为1～20∶1。