CN102973981B - 促进骨缺损修复的可降解三维纤维支架的制备方法 - Google Patents

Abstract

促进骨缺损修复的可降解三维纤维支架的制备方法涉及一种基于静电纺丝技术的纳米纤维支架材料的制备方法。它是将可降解、无免疫源性，但不能诱导成骨的生物材料聚羟基丁酸戊酸共聚酯（PHBV）、水溶性好，可促进支架更快降解的聚氧乙烯（PEO）和具有骨传导能力但需要一定载体的纳米级羟基磷灰石（nHA）结合起来，通过静电纺丝的方法，得到直径为纳米级的电纺纤维薄膜，通过裁剪和折叠最终得到多层棒状可降解三维支架材料。经动物实验证实该支架生物相容性好，降解速度适宜，可实现大尺寸骨缺损的修复。

Description

促进骨缺损修复的可降解三维纤维支架的制备方法

技术领域

本发明涉及的是一种促进骨缺损修复的可降解三维纤维支架的制备方法，属于组织工程技术领域。

背景技术

骨是一种令人讶异而又真实的纳米复合体，是一种复杂的高度分化的结缔组织。它不仅为机体提供机械支撑，也是机体各种矿物质的源泉，尤其是钙和磷。骨是一种动态组织的代表，拥有独特的自我再生和重塑能力，在人的一生中骨可以生长到一定的长度而没有任何伤疤产生。虽然骨有再生和重塑能力，但是其再生能力仅在缺损部位很小时发挥作用，大尺寸的骨重建仍然是临床面临的一个难题。当缺损非常大，骨不能自愈，那么就需要骨移植物来帮助修复骨功能。临床上治疗骨缺损的方法主要是骨移植，包括自体骨移植、同源异体骨移植、异种骨移植，但是这些方法均存在一定的局限性，不能达到满意的治疗效果。

自体骨移植被视为治疗骨缺损的金标准，原则上包括骨再生所需的所有关键因素：一种骨引导性的支架，骨诱导性和血管化的生长因子，成骨潜能的细胞。然而，骨移植物移植在临床中的应用体现出一些极大的不便。首先自体骨移植需要从患者非负荷区域（尤其是容易获取部位如髂骨嵴）收集供体骨，移植到缺损部位，成功率虽有提高，但是自体骨移植获取的移植物远不能满足骨移植的需求。此外，患者自身所能提供给受损部位的替代物经常不能达到满意的效果，会导致随后的骨移植物发生骨折，10年内的骨折率高达60%，这与一系列的生物学过程有关，例如破骨细胞引起的骨吸收、微骨折的增加、皮质骨和松质骨中骨密度的下降。加之获取自体骨会导致严重的供体部位病变，病变程度取决于取材部位以及手术技术。

同源异体骨和异种骨移植虽然避免了供体部位病变，但是也存在一系列的安全隐患。目前的同源异体骨和异种骨移植物主要来源于骨库中的人类尸体或动物提供的骨移植物，容易引发病毒或细菌感染、移植后受体部位的免疫反应等。

一些无机的生物活性材料也被临床上用来填充骨缺损部位，以期达到骨再生的效果。例如磷酸钙陶瓷以及生物活性玻璃等。此类骨替代物来源广泛，避免了供体不足及病变，也不存在免疫反应，且这些材料本身有很好的骨传导性，常用于小缺损填充以及整形外科手术。但是这种材料由于自身的缺点，如物理机械性能不理想、脆性大、不易被吸收，骨诱导作用弱等，在大尺寸骨缺损治疗上应用比较少，存在一定的局限性。

静电纺丝技术得到的超细纤维比表面积大，孔隙率高，连通性好，形态结构与天然细胞外基质类似，可以为细胞生长提供良好的环境。聚羟基丁酸戊酸共聚酯（PHBV）作为一种可降解，无免疫源性，生物相容性良好的生物材料受到广泛关注，PHBV电纺纤维更是被用做组织工程支架来研究细胞成骨、成软骨特性。但是目前的研究中，PHBV电纺纤维直径一般在微米级，降解速率不高，难以与成骨速率匹配，并且膜状电纺纤维缺乏足够的强度，因此电纺纤维应用于骨缺损修复的研究仍停留在体外细胞实验阶段。

发明内容

技术问题：本发明的目的在于提供一种促进骨缺损修复的可降解三维纤维支架的制备方法，是以PHBV为基质，掺杂聚氧乙烯（PEO）和纳米级羟基磷灰石（nHA）的可降解三维纤维支架材料的制备方法，并成功应用于骨缺损修复中。此可降解三维纤维支架具有高孔隙率和连通性，与细胞外基质结构类似，有利于细胞的粘附和增殖。nHA均匀地分散在PHBV纳米纤维中，PEO的掺入促进了整个支架的降解速率，与成骨速率相匹配，该三维支架用于骨缺损修复效果显著。

技术方案：本发明的促进骨缺损修复的可降解三维纤维支架的制备方法，首先选取生物材料聚羟基丁酸戊酸共聚酯PHBV、水溶性可促进支架降解的聚氧乙烯PEO和具有骨传导能力但需要载体的纳米级羟基磷灰石nHA为原料，在三氟乙醇TFE溶剂中分别溶解PHBV、PEO和nHA，将PHBV、PEO溶液和nHA溶液充分混合得到PHBV-PEO-nHA静电纺丝溶液，通过静电纺丝方法制备PHBV/PEO-nHA复合纳米纤维膜，然后通过裁剪和折叠得到多层棒状三维支架，用做大尺寸骨缺损修复的植入材料；其中，PHBV、PEO、nHA的比例为：6:4:1~1.5。

所述PHBV/PEO-nHA静电纺丝溶液的质量百分浓度为2%，最佳掺杂比为PHBV:PEO=6:4，nHA添加量的质量百分含量为PHBV-PEO混合物的10~15%。

nHA的掺入是通过超声和搅拌的方法实现的，首先将PHBV和PEO与溶剂TFE用磁力搅拌器搅拌90~120分钟至溶解，同时nHA加入三氟乙醇TFE中超声90~120分钟至完全分散，然后两者混合，磁力搅拌30~60分钟，得到均匀的静电纺丝溶液。

三维支架的获得是通过将PHBV-PEO-nHA纳米纤维薄膜裁剪成等腰梯形，其中等腰梯形的高度和下底宽度由骨缺损的尺寸决定，以金属棒为轴，金属棒直径的选取根据手术对象的骨髓腔直径而定，沿下底将薄膜卷起，形成仿天然骨结构的多层棒状三维支架。

有益效果：本发明优点在于用简便易行的方法得到降解速率与成骨速率相匹配的三维纤维支架PHBV/PEO-nHA，且成本低廉；材料表现出良好的生物相容性，在动物实验中无免疫排斥反应；仿生的三维纤维支架结构和成分与天然骨类似，有效促进骨缺损部位的愈合。

具体实施方式

本发明提供的以PHBV为基质的促进骨缺损修复的可降解三维纤维支架的制备方法包括以下步骤：

首先选取生物材料聚羟基丁酸戊酸共聚酯PHBV，其水溶性好，可促进支架整体降解速率的聚氧乙烯PEO和具有骨传导能力但需要载体的纳米级羟基磷灰石nHA为原料，通过静电纺丝方法制备PHBV复合纳米纤维膜，然后通过裁剪和折叠得到多层棒状三维纤维支架，用做大尺寸骨缺损修复的植入材料。

可降解纳米纤维薄膜的获得是将PHBV和PEO以一定比例混合，溶解于三氟乙醇（TFE）溶剂中，通过静电纺丝的方法实现的，PHBV和PEO比例的选取是通过制备不同配比（PHBV:PEO=9:1,8:2,7:3,6:4,5:5）的纳米纤维，经过降解实验和细胞相容性实验，从而得到降解速度适宜细胞相容性好的最佳配比。

nHA的掺入是通过超声和搅拌的方法实现的，首先将PHBV和PEO与溶剂TFE用磁力搅拌器搅拌90分钟至溶解，同时nHA加入TFE中超声90分钟至完全分散，然后两者混合，磁力搅拌30分钟，得到均匀的静电纺丝溶液。

可降解三维纤维支架的获得是通过将PHBV/PEO-nHA纳米纤维薄膜裁剪成所需大小的等腰梯形，以一定直径的金属棒为轴，沿下底将薄膜卷起，形成中空多层棒状三维纤维支架，与骨结构类似。

本发明提供的可降解三维纤维支架用于骨缺损修复包括以下步骤：

⑴静电纺丝得到的PHBV/PEO-nHA纳米纤维膜经过加工得到三维棒状支架；

⑵建立兔桡骨临界缺损模型，植入步骤1得到的可降解三维纤维支架。

实例：

1.PHBV加入溶剂三氟乙醇（TFE）中，通过磁力搅拌器搅拌至完全溶解，为了得到纳米级纤维，获得与骨再生速率相匹配的降解速率，加入了另一种生物材料聚氧乙烯（PEO），PHBV与PEO质量比为9:1,8:2,7:3,6:4,5:5；

2.nHA加入TFE中，超声90分钟，使nHA均匀分散在TFE中，nHA添加量为PHBV/PEO的10%（质量百分含量）；

3.步骤1，2得到的溶液混合搅拌均匀，得到终浓度为2%的静电纺丝溶液；

4.将纺丝溶液加入20毫升的注射器中，注射器针头为平口，内径为0.5毫米，注射器固定在推进泵上，推进速度设为5毫升/小时，高压直流电源正极接注射器针头，负极接收集器（滚轴转速为2500转/分钟），电压为12千伏，收集距离为25厘米，2小时后将得到的PHBV纳米纤维膜取下，30度真空干燥24小时得到可降解PHBV/PEO-nHA复合电纺纤维膜；

5.将得到的五种不同配比的PHBV/PEO纤维膜浸泡在模拟体液中进行降解实验，每2周称重测量质量损失，扫描电镜（SEM）拍照观察形貌变化，发现随PEO量的增加降解速率加快。

6.将得到的五种不同配比的PHBV/PEO纤维膜进行细胞培养实验，通过检测细胞活力发现随PEO的量增加细胞增殖减慢，结合步骤5得到的数据，选定PHBV:PEO质量比为6:4的纤维薄膜为降解和细胞相容性最佳的材料。

7.将所制备的6:4的PHBV/PEO-nHA纤维膜裁剪成上底1.5厘米，下底2.5厘米，高10厘米的等腰梯形，以直径2毫米的金属棒为轴沿下底将薄膜卷起，形成中空多层棒状三维支架，支架长2.5厘米，直径约0.3厘米，碘伏浸泡灭菌备用，

8.在新西兰大白兔左前肢建立桡骨缺损模型，将PHBV材料植入骨缺损处。

9.每4周拍X片查看骨缺损部位修复效果。

Claims (1)

1.一种促进骨缺损修复的可降解三维纤维支架的制备方法，其特征在于：首先选取生物材料聚羟基丁酸戊酸共聚酯PHBV、水溶性可促进支架降解的聚氧乙烯PEO和具有骨传导能力但需要载体的纳米级羟基磷灰石nHA为原料，在三氟乙醇TFE溶剂中分别溶解PHBV、PEO和nHA，将PHBV、PEO溶液和nHA溶液充分混合得到PHBV-PEO-nHA静电纺丝溶液，通过静电纺丝方法制备PHBV/PEO-nHA复合纳米纤维膜，然后通过裁剪和折叠得到多层棒状三维支架，用做大尺寸骨缺损修复的植入材料；其中，PHBV、PEO、nHA的质量比例为：6:4:1～1.5；

所述PHBV/PEO-nHA静电纺丝溶液的质量百分浓度为2％，最佳掺杂质量比为PHBV:PEO＝6:4，nHA添加量的质量百分含量为PHBV-PEO混合物的10～15％；

nHA的掺入是通过超声和搅拌的方法实现的，首先将PHBV和PEO与溶剂TFE用磁力搅拌器搅拌90～120分钟至溶解，同时nHA加入三氟乙醇TFE中超声90～120分钟至完全分散，然后两者混合，磁力搅拌30～60分钟，得到均匀的静电纺丝溶液；

三维支架的获得是通过将PHBV-PEO-nHA纳米纤维薄膜裁剪成等腰梯形，其中等腰梯形的高度和下底宽度由骨缺损的尺寸决定，以金属棒为轴，金属棒直径的选取根据手术对象的骨髓腔直径而定，沿下底将薄膜卷起，形成仿天然骨结构的多层棒状三维支架。