CN107823704A - 一种牙周组织再生修复膜及其制备方法 - Google Patents

一种牙周组织再生修复膜及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医学工程技术领域，特别是牙周受损组织修复材料制备技术领域，公开了一种牙周组织再生修复膜及其制备方法。所述的牙周组织再生膜为双层多孔网状结构，由聚氧化乙烯、聚乙烯醇、Ⅰ型胶原、羟基磷灰石和改性海藻酸钠组成。该种牙周组织再生膜免疫原性低，生物相容性和诱导修复能力优良，且对受损牙周组织具的再生有明显的促进作用。

Description

一种牙周组织再生修复膜及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医学工程技术领域，特别是牙周受损组织修复材料制备技术领域，公开了一种牙周组织再生修复膜及其制备方法。
背景技术
牙周组织结构复杂，包括牙龈、牙周膜、牙骨质和牙槽骨，在患有牙周炎等感染性疾病时可发生结缔组织基质和细胞的破坏，由此使牙周膜细胞的纤维附着丧失，牙槽骨吸收，最终导致牙齿缺失。目前，常规的牙周炎治疗尚不能完全修复缺失牙周组织，而组织工程技术的不断研究正在为临床治疗提高新的方向。一般情况下，完成牙周组织缺失的重建与修复，首先要完成牙周膜、牙骨质、牙槽骨及牙龈的再生，其中种子细胞、诱导因子及支架材料是必不可少的重要因素，在完成体外细胞培养后，就需要借助适合的诱导因子调节细胞的活动和定向分化，并利用生物学支架形成三维空间结构，以促进进一步的诱导修复。
诱导组织再生( guided tissue regeneration，GTR)技术是在牙周局部炎症控制的前提下利用外科方法在牙龈瓣和牙槽骨之间放置屏障膜，以隔离牙龈上皮细胞和周围结缔组织向根面生长，并诱导牙周膜细胞优先在根面上增殖，以达到牙周新附着形成的目的。目前，多种组织工程技术包括可吸收或不可吸收材料制备的屏障膜、诱导细胞增殖与定向分化的细胞因子的使用，以及包括干细胞在内的各种种子细胞使用的探索，都为提高牙周组织再生治疗成功率积累了丰富的研究资料。然而现有的治疗技术效果局限，除了在一些非常局限狭窄的骨下袋缺损或下颌磨牙II 度根分叉病外，在各种重度牙周炎的治疗中并没有达到理想的结果，牙骨质-牙周膜界面结构仍无法形成。由此可见，简单屏障显然还不能实现牙周组织的再生重建。
发明内容
本发明的目的在于针对现有的牙周受损修复材料缺乏诱导修复能力的不足，提供一种牙周组织再生修复膜及其制备方法，该牙周组织再生修复膜免疫原性低，材料来源丰富，具有良好的生物相容性和可降解性能，且具有诱导组织修复能力。且该种再生修复膜所采用的基质为生物可降解材料，可以在组织修复完成后降解成对人体无害的小分子随人体循环排除体外。
为实现上述目的，本发明的技术方案为一种牙周组织再生修复膜，所述的牙周组织再生修复膜为双层多孔网状结构，按重量份数计由聚氧化乙烯10-40份、聚乙烯醇10-50份、Ⅰ型胶原10-15份、羟基磷灰石0.1-0.5份和改性海藻酸钠2-10份组成。
优选的，所述的聚氧化乙烯、聚乙烯醇的分子量均为1×106购于美国Sigma-Aldrich公司，所述的Ⅰ型胶原的分子量为1×105 Da，购于日本Dai gang Biomaterial公司，所述的羟基磷灰石其特征在于，其粒径分布为100-200 nm。
更进一步的，所述的改性海藻酸钠为环形RGD短肽改性海藻酸钠，具体的制备步骤为：称取一定量的海藻酸钠溶解于蒸馏水中配制成质量浓度为3%的海藻酸钠溶液，然后加入2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.4，然后按摩尔比M海藻酸钠：M环形RGD短肽=1.5:1加入环形RGD短肽，常温下搅拌8h后，放入透析袋（截留分子量mW=20000）中透析3-4天，然后置于冷冻干燥机中-80℃冷冻干燥，即得环形RGD短肽改性海藻酸钠；
为实现上述目的，本发明的另一技术方案为：一种牙周组织再生修复膜的制备方法，所述的制备方法通过以下步骤实现：（1）纤维膜材料的制备、（2）牙周组织再生膜的纺丝。
进一步的，所述纤维膜材料的制备具体步骤为：
（1）再生膜内层纺丝液制备：按配方比将聚氧化乙烯，Ⅰ型胶原溶解于蒸馏水中，待两者均完全溶解后按配方比加入羟基磷灰石，搅拌6-8小时，即得再生膜内层纺丝液，再生膜内层纺丝液中聚氧化乙烯的含量为10%，Ⅰ型胶原的含量为5%；
2）再生膜外层材料制备：按配方比将聚乙烯醇，改性海藻酸钠依次加入蒸馏水中溶解，即得再生膜外层纺丝液，再生膜外层中聚乙烯醇的含量为10%，改性海藻酸钠的含量为2%。
更进一步的，所述牙周组织再生修复膜的纺丝具体如下：
① 将再生膜内层纺丝液加入到静电纺丝设备中的注射器中，静置30-60 min，排尽注射器的空气；连接辊筒接收器和纺丝喷头间的电线，调节辊筒接收器和纺丝喷头间的距离为15-25 cm；接通高压电源，调节至15~25 kV，启动注射泵，注射泵的输出速度调节至0.8-1.5 mL/h，启动辊筒接收器接收纺丝，辊筒接收器的转速设置为200~350 rpm；待射器内的再生膜内层纺丝液完全输出后，关闭高压电源。
②将注射器更换为装有再生膜外层纺丝液的注射器置30-60 min，排尽注射器的空气；连接辊筒接收器和纺丝喷头间的电线，调节辊筒接收器和纺丝喷头间的距离为10-15m；接通高压电源，调节至20~25 kV，启动注射泵，注射泵的输出速度调节至0.2-0.5mL/h，启动辊筒接收器接收纺丝，辊筒接收器的转速设置为200~3250 rpm；待射器内的再生膜外层纺丝液完全输出后，关闭高压电源。将纺丝膜从辊筒接收器中取下，即得一种牙周组织再生修复膜。
本发明的有益效果为：
（1）本发明通过同轴静电纺丝技术，制备出一种具用双层多孔网状结构的牙周组织再生修复膜，该种修复纤维膜具有良好的三维网状结构利于细胞的在其表面黏附和生长，从而加快新生组织的生长；
（2）本发明通过静电纺丝所制得的牙周组织再生修复膜，因为其具有双层的多孔网络结构，内层由聚氧化乙烯、Ⅰ型胶原和纳米级羟基磷灰石组成，具有良好的组织相容性，有利于牙周受损部位的细胞识别，促进伤口的愈合 ；外层由聚乙烯醇和改性海藻酸钠组成，具有良好的贴附性能和吸液性能，能有效的吸收损伤渗液的同时能保持再生膜的黏附能力。此外经环形RGD修饰的海藻酸钠因具有RGD短肽序列使再生膜与组织的结合点增加，有利于受损部位的修复；
（3）本发明通过将纳米级的羟基磷灰石添加到牙周组织再生修复膜当中，使其的力学性能加强的同时，还使其表面的活性位点增多有利于牙周受损部位的细胞黏附到再生修复膜上面生长，有助于受损部位的修复再生。
附图说明
图1为实施例1～3和对比例进行吸液性能检测的结果对比图，
图2为实施例1～3和对比例进行细胞毒性评价实验的结果对比图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明按如下步骤制备得到一种牙周组织再生修复膜：
（1）纤维膜材料的制备：
①再生膜内层纺丝液制备：按配方比将聚氧化乙烯，Ⅰ型胶原溶解于蒸馏水中，待两者均完全溶解后按配方比加入羟基磷灰石，搅拌6-8小时，即得再生膜内层纺丝液，再生膜内层纺丝液中聚氧化乙烯的含量为10%，Ⅰ型胶原的含量为5%；
②再生膜外层材料制备：按配方比将聚乙烯醇，改性海藻酸钠依次加入蒸馏水中溶解，即得再生膜外层纺丝液，再生膜外层中聚乙烯醇的含量为10%，改性海藻酸钠的含量为2%。
（2）牙周组织再生膜的纺丝：
① 将再生膜内层纺丝液加入到静电纺丝设备中的注射器中，静置30-60 min，排尽注射器的空气；连接辊筒接收器和纺丝喷头间的电线，调节辊筒接收器和纺丝喷头间的距离为15-25 cm；接通高压电源，调节至15~25 kV，启动注射泵，注射泵的输出速度调节至0.8-1.5 mL/h，启动辊筒接收器接收纺丝，辊筒接收器的转速设置为200~350 rpm；待射器内的再生膜内层纺丝液完全输出后，关闭高压电源。
②将注射器更换为装有再生膜外层纺丝液的注射器置30-60 min，排尽注射器的空气；连接辊筒接收器和纺丝喷头间的电线，调节辊筒接收器和纺丝喷头间的距离为10-15m；接通高压电源，调节至20~25 kV，启动注射泵，注射泵的输出速度调节至0.2-0.5mL/h，启动辊筒接收器接收纺丝，辊筒接收器的转速设置为200~3250 rpm；待射器内的再生膜外层纺丝液完全输出后，关闭高压电源。将纺丝膜从辊筒接收器中取下，即得一种牙周组织再生修复膜。
实施例1
本发明按上述方法制备一种牙周组织再生修复膜，其中聚氧化乙烯的用量为10份、聚乙烯醇的用量为10份、Ⅰ型胶原的用量为10份、羟基磷灰石的用量为0.1份，改性海藻酸钠的用量为2份。其中牙周组织再生膜的纺丝的步骤中：组织再生膜内层的纺丝步骤中，辊筒接收器和纺丝喷头间的距离为15cm；高压电源调节为15kV，注射泵的输出速度调节为0.8mL/h，辊筒接收器的转速设置为200rpm；组织再生膜外层的纺丝步骤中，辊筒接收器和纺丝喷头间的距离为15cm；高压电源调节为15kV，注射泵的输出速度调节为0.5mL/h，辊筒接收器的转速设置为200rpm。
实施例2
本发明按上述方法制备一种牙周组织再生修复膜，其中聚氧化乙烯的用量为40份、聚乙烯醇的用量为50份、Ⅰ型胶原的用量为15份、羟基磷灰石的用量为0.5份，改性海藻酸钠的用量为10份。其中牙周组织再生膜的纺丝的步骤中：组织再生膜内层的纺丝步骤中，辊筒接收器和纺丝喷头间的距离为15cm；高压电源调节为15kV，注射泵的输出速度调节为0.8mL/h，辊筒接收器的转速设置为200rpm；组织再生膜外层的纺丝步骤中，辊筒接收器和纺丝喷头间的距离为15cm；高压电源调节为15kV，注射泵的输出速度调节为0.5mL/h，辊筒接收器的转速设置为200rpm。
实施例3
本发明按上述方法制备一种牙周组织再生修复膜，其中聚氧化乙烯的用量为25份、聚乙烯醇的用量为35份、Ⅰ型胶原的用量为12.5份、羟基磷灰石的用量为0.35份，改性海藻酸钠的用量为6份。其中牙周组织再生膜的纺丝的步骤中：组织再生膜内层的纺丝步骤中，辊筒接收器和纺丝喷头间的距离为15cm；高压电源调节为15kV，注射泵的输出速度调节为0.8mL/h，辊筒接收器的转速设置为200rpm；组织再生膜外层的纺丝步骤中，辊筒接收器和纺丝喷头间的距离为15cm；高压电源调节为15kV，注射泵的输出速度调节为0.5mL/h，辊筒接收器的转速设置为200rpm。
实施例4
对比例：一种牙周组织特异性细胞外基质ECM（参考申请号：201410230942.9 一种牙周组织特异性细胞外基质ECM的制备方法及其应用实施例1制备所得）
实验组1～3：为实施例1～3所得的一种牙周组织再生修复膜。
（1）吸液性能的检测
将上述实施例1～3所制备的一种牙周组织再生修复膜与对比例进行吸液性能评价实验，将已知质量（W）的5×5 cm的样品置于培养皿内。加入预热至（37±1）℃的生理盐水，生理盐水的添加量为供试材料的40倍，± 0.5g，移入培养箱内，在（37±1）℃下保持30min，然后用镊子夹持样品一角或一端，悬垂30s，称量，此时样品重量为W1，吸水倍率=（W1-W）/W，每组样品设置5个平行样，实验结果如图1示。
可以看到通过本发明所公开的方法所制得的一种牙周组织再生修复膜施例1～3的吸液性能明显较对比例要高，实施例2的吸液性能为对比例的4.21倍，吸液比重为9.87，说明本发明所制得的牙周组织再生修复膜具有良好的吸液性能。
（2）细胞毒性的检测
将上述实施例1～3所制备的一种牙周组织再生修复膜与对比例进行细胞毒性评价实验（按国标GB/T 16886.5-2003进行实验），对比实施例1~3和对比例对。实验结果如图2示。
细胞毒性检测结果显示实施例1~3在与上皮细胞共培养1天和7天后其对应的细胞相对增殖率均在85%以上，证明其具有良好的细胞形容性，而对比例与上皮细胞共培养1天和7天后其对应细胞相对增殖率均在80%左右。此外，共培养时间的延长实施例1~3的相对相比增殖率均有明显提高，证明采用本发明所公开的制备方法所制得的牙周组织再生修复膜具有促进上皮细胞的生长，有利于受损部位的修复。
（3）急性毒性评价和体外溶血评价。
测试方法：
急性毒性评价方法：按GB/T 16886.11-2011《医疗器械生物学评价 第11部分：全身毒性试验》中的急性毒性检测方法进行检测。
体外溶血评价方法：将2 mL血液于1000×g离心5min，去除上层清液，加入适量PBS溶液（pH=7.4），缓慢摇匀，将红细胞清洗三次后再以1000×g离心 5 min，取下层红细胞悬液用PBS溶液配制成16%的红细胞悬浮液。取50μL上述红细胞悬浮液，分别加入1 mL蒸馏水、PBS溶液和1mg/mL的样品浸提液溶液中，分别设为阳性对照组、阴性对照组和试验组，轻轻混匀后在37℃下孵育1 h，将各组样品于1000×g离心5 min，取上清液200μL加入96孔板中，每组3个平行样，在540nm波长下测试其吸光度，重复试验3次。根据测得的吸光度，由公式（1）计算各试验的溶血率（Y）：
Y(%) = （A-A0）/(A100-A0) ×100 （1）
评价结果如表1所示：
表1 急性毒性评价和体外溶血评价结果
实施例1 实施例2 实施例3
急性毒性评价 正常，无症状 正常，无症状 正常，无症状
体外溶血评价 0.33% 0.25% 0.11%
从上表结果可知，实施例1~3所制得的牙周组织再生修复膜均无急性毒性，体外溶血均符合溶血率合格标准，证明本发明所制备的一种牙周组织再生修复膜具有良好的生物安全性。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定；对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举；凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种牙周组织再生修复膜，其特征在于，所述的牙周组织再生修复膜为双层多孔网状结构，按重量份数计由聚氧化乙烯10-40份、聚乙烯醇10-50份、Ⅰ型胶原10-15份、羟基磷灰石0.1-0.5份和改性海藻酸钠2-10份组成。
2.根据权利要求1所述的一种牙周组织再生修复膜，其特征在于，所述的改性海藻酸钠为环形RGD短肽修饰的海藻酸钠。
3.根据权利要求2所述的一种牙周组织再生修复膜，其特征在于，所述环形RGD短肽修饰的海藻酸钠的制备方法具体如下：称取一定量的海藻酸钠溶解于蒸馏水中配制成质量浓度为3%的海藻酸钠溶液，然后加入2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.4，然后按摩尔比M海藻酸钠：M环形RGD短肽=1.5:1加入环形RGD短肽，常温下搅拌8h后，放入透析袋（截留分子量mW=20000）中透析3-4天，然后置于冷冻干燥机中-80℃冷冻干燥，即得环形RGD短肽改性海藻酸钠。
4.权利要求1~3任一项所述的牙周组织再生修复膜的制备方法，其特征在于，所述的制备方法通过以下步骤实现：（1）纤维膜材料的制备，（2）牙周组织再生修复膜的纺丝。
5.根据权利要求4所述的一种牙周组织再生修复膜的制备方法，其特征在于，所述纤维膜材料的制备具体步骤为：
（1）再生膜内层纺丝液制备：按配方比将聚氧化乙烯，Ⅰ型胶原溶解于蒸馏水中，待两者均完全溶解后按配方比加入羟基磷灰石，搅拌6-8小时，即得再生膜内层纺丝液，再生膜内层纺丝液中聚氧化乙烯的含量为10%，Ⅰ型胶原的含量为5%；
（2）再生膜外层材料制备：按配方比将聚乙烯醇，改性海藻酸钠依次加入蒸馏水中溶解，即得再生膜外层纺丝液，再生膜外层中聚乙烯醇的含量为10%，改性海藻酸钠的含量为2%；
所述牙周组织再生修复膜的纺丝具体步骤为：
（1）将再生膜内层纺丝液加入到静电纺丝设备中的注射器中，静置30-60 min，排尽注射器的空气；连接辊筒接收器和纺丝喷头间的电线，调节辊筒接收器和纺丝喷头间的距离为15-25 cm；接通高压电源，调节至15~25 kV，启动注射泵，注射泵的输出速度调节至0.8-1.5 mL/h，启动辊筒接收器接收纺丝，辊筒接收器的转速设置为200~350 rpm；待射器内的再生膜内层纺丝液完全输出后，关闭高压电源，
（2）将注射器更换为装有再生膜外层纺丝液的注射器置30-60 min，排尽注射器的空气；连接辊筒接收器和纺丝喷头间的电线，调节辊筒接收器和纺丝喷头间的距离为10-15m；接通高压电源，调节至20~25 kV，启动注射泵，注射泵的输出速度调节至0.2-0.5mL/h，启动辊筒接收器接收纺丝，辊筒接收器的转速设置为200~3250 rpm；待射器内的再生膜外层纺丝液完全输出后，关闭高压电源，将纺丝膜从辊筒接收器中取下，即得一种牙周组织再生修复膜。
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