CN109529123B - 水凝胶、纳米纤维支架与皮肤细胞层层组装的血管化全层组织工程皮肤及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水凝胶、纳米纤维支架与皮肤细胞层层组装的血管化全层组织工程皮肤及其制备方法，属于高分子材料和生物医用材料技术领域。人工组织工程皮肤包括表皮层和真皮层，其中表皮层是位于真皮层上方的纳米纤维支架与一种种子细胞交替层叠组成。真皮层由下层纳米纤维支架、上层水凝胶支架与三种种子细胞组成，种子细胞分布在纳米纤维支架表面与水凝胶内部及表面。其通过将静电纺丝技术、高分子络合技术与纤维/细胞层‑凝胶层‑纤维/细胞层层自组装技术相结合的方法制备。该具有生物功能的人工组织工程皮肤可用于各种组织的再生和修复，特别是创伤愈合、血管新生并减少疤痕形成等。

Description

水凝胶、纳米纤维支架与皮肤细胞层层组装的血管化全层组 织工程皮肤及其制备方法

技术领域

本发明属于高分子材料和生物医用材料技术领域，具体涉及一种水凝胶、纳米纤维支架与皮肤细胞层层组装的血管化全层组织工程皮肤及其制备方法。

背景技术

皮肤作为人体复杂且最大的器官，具有维持内部器官的生理平衡、保护机体免受感染和破坏、调控水分及体温、触觉等复杂的功能。许多类型损伤，如化学和热烧伤、挫伤和割伤都可导致皮肤受伤并破坏其作为屏障的完整性。对于浅度和小面积损伤，皮肤可以快速自我修复。但是对于深度及大面积开放性创伤(部分或全部真皮甚至皮下组织的缺失)，仅依靠成纤维细胞产生的肉芽组织来填补非常困难，其再表皮化也是临床亟待解决的难题。

目前临床已证明通过组织工程技术制备的人工皮肤，可部分或完全替代自体皮肤移植，成为修复大面积、深度缺损创面最有应用前景的方法之一。目前市售的人工皮肤被美国和欧盟等少数发达国家掌握，产品的类型为：皮肤替代物

和组织工程化皮肤(Dermagraft-

Dermagraft-

等)。虽然在国内人工皮肤的研究取得了一定的进展，也有一些相关项目处于研发阶段，但是在技术水平上与国外相比还有相当的差距，从而导致国内人工皮肤产品的产业化严重滞后，虽有个别产品上市，但是产品单一，无法满足国内巨大市场需求。

无血管化或无毛细血管化的组织工程皮肤在移植后易脱落，不易与患者创面快速结合从而导致移植不成功，在这种情况下大部分的组织工程皮肤只能充当临时覆盖物或皮肤临时替代物的作用而并不能有效地促进伤口愈合以解决目前治疗大面积皮肤损伤地需求。功能性毛细血管是构建可供移植组织工程器官的基础，然而当前国内外尚未构建成功具有基底膜的稳定功能性组织工程毛细血管，功能性组织工程毛细血管的构建也成为限制组织工程的主要障碍。有研究表明：循环纤维细胞(CFs)可稳定毛细血管，调控VECs合成基底膜成份，并与VECs形成间隙连接，具备了毛细血管支持细胞的所有功能；CFs与VECs在三维胶原内共培养后，CFs向VECs趋化并包裹VECs管，形成基底膜，并与VECs形成间隙连接，具备了功能性毛细血管的特征。

当前，在人工组织工程皮肤支架领域，用于皮肤支架制备的材料大致分为两类：一类是天然生物衍生材料，如胶原、壳聚糖、透明质酸、羧甲基壳聚糖及丝素蛋白等。另一类是人工合成生物高分子材料，主要有聚乙交酯、聚己内酯、聚羟基烷酸酯、聚碳酸酯类等聚酯类材料；大多数皮肤支架都是运用生物材料通过静电纺丝技术来制造。虽然由静电纺丝得到的纳米纤维为细胞的黏附和生长提供合适的表面形态，利于细胞在支架上的粘附与生长，然而由静电纺丝制备的皮肤支架由于孔径太小，不利于细胞在深度方向上的迁移、增殖，且难以实现细胞在纤维支架上分布的有效调控，这限制了人工皮肤支架在皮肤损伤医学治疗领域中的应用。

尽管目前有很多研究者研制开发了多种人工组织工程皮肤，多数基质为胶原凝胶或海绵，目前并没有任何通过纯天然高聚物来制备纳米纤维支架、水凝胶并结合层层自组装技术应用于血管化组织工程全层皮肤的相关文献与专利报道，申请号为“201510631809.9”与“201610793440.6”的专利分别报道了一种高强度高韧性水凝胶纳米纤维的制备方法与一种海藻酸钠水凝胶支架构建的组织工程皮肤，但并没有进行创面愈合效果的相关研究。申请号为“201610499353.X”与“201611008057.1”的专利分别报道了一种微纳米复合双层皮肤支架及其制备方法与一种柔性人工皮肤及其制备方法，但并无显著改善细胞在组织内分布与创面愈合促进效果的相关研究。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种水凝胶、纳米纤维支架与皮肤细胞层层组装的血管化全层组织工程皮肤及其制备方法。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了一种水凝胶、纳米纤维支架与皮肤细胞层层组装的血管化全层组织工程皮肤，材料组成包括多层皮肤细胞层、多层多孔且具有三维结构的纳米纤维支架和单层水凝胶层；

该组织工程皮肤的结构自上而下由表皮层和真皮层组成：

表皮层是由位于真皮层上方的纳米纤维支架与一种种子细胞交替层叠组成，种子细胞分布在纳米纤维支架表面与相邻纳米纤维支架的层间；

真皮层由位于下层的纳米纤维支架、位于上层的水凝胶层及三种种子细胞组成，种子细胞分布在纳米纤维支架表面以及水凝胶层的内部及表面；其中，水凝胶层的内部和表面分别接种一种细胞，纳米纤维支架的表面接种另一种细胞。

优选地，表皮层的一种种子细胞为角质形成细胞；真皮层的三种种子细胞分别为循环纤维细胞、血管内皮细胞及成纤维细胞，其中，水凝胶层的内部及表面接种的两种细胞为循环纤维细胞和血管内皮细胞，纳米纤维支架表面接种的一种细胞为成纤维细胞。

进一步优选地，所述纳米纤维支架由聚己内酯和β-环糊精及蛋白制备而成。

更进一步优选地，β-环糊精中包络I型胶原/明胶。

进一步优选地，纳米纤维支架的透氧率为50％～60％，纳米纤维支架中的纳米纤维的直径为200～600nm。

优选地，水凝胶的厚度为0.5～1mm，平衡溶胀率为200％～300％。

本发明还公开了上述的水凝胶、纳米纤维支架与皮肤细胞层层组装的血管化全层组织工程皮肤的制备方法，包括步骤：

1)制备血管内皮细胞、循环纤维细胞与角质形成细胞；

1)制备血管内皮细胞、循环纤维细胞与角质形成细胞；

2)将角质形成细胞与多层纳米纤维支架共培养；

其中，步骤2)包括步骤：

21)以培养皿作为接收器，通过静电纺丝法制备纳米纤维支架；

22)将角质形成细胞接种在培养皿中；

23)重复步骤21)和22)，直至完成设定的接种层数；

24)在培养皿中，将纳米纤维支架与细胞进行共培养，制得表皮膜片；

3)将血管内皮细胞、循环纤维细胞与单层水凝胶层进行共培养；

4)将成纤维细胞与单层纳米纤维支架共培养；

其中，步骤4)包括步骤：

41)以培养皿作为接收器，通过静电纺丝法制备纳米纤维支架；

42)将成纤维细胞接种在培养皿中进行共培养；

5)将步骤3)中培养制得产物铺于4)中培养得到的产物上；

其中，步骤5)包括步骤：

6)在步骤5)制得的产物表面叠加步骤2)中制备的表皮膜片，共培养7天后形成水凝胶、纳米纤维支架与皮肤细胞层层组装的血管化全层组织工程皮肤。

优选地，在步骤21)与步骤41)中，静电纺丝法制备纳米纤维支架的具体操作如下：在超净工作台中进行操作；其中，静电纺丝过程中施加的直流电压为 10～35kV；静电纺丝过程中针头与培养皿的距离为5～20cm；静电纺丝过程中注射器由注射泵以0.5～2.0mL/h的速度驱动；静电纺丝过程中环境温度为5～35℃；静电纺丝过程中环境相对湿度为20％～80％；静电纺丝的时间为1～5min。

优选地，在步骤22)与步骤42)中，相对于纳米纤维支架的面积，细胞接种的数量为1×10⁴～2×10⁴个细胞/cm²。

优选地，在步骤6)之后，还包括对制备的水凝胶、纳米纤维支架与皮肤细胞层层组装的血管化全层组织工程皮肤进行杀菌后密封包装及冷冻保藏的操作。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供的水凝胶、纳米纤维支架与皮肤细胞层层组装的血管化全层组织工程皮肤，其包括多层纳米纤维支架与单层水凝胶层，纳米纤维支架多孔且具有三维结构，为细胞的黏附和生长提供合适的表面形态，利于细胞的粘附与生长，且可模拟天然皮肤基底膜结构为表、真皮层提供屏障作用；水凝胶层交联网络中含有的大量水分可以很好供给细胞养分，同时结合下层的纳米纤维支架，可以调节细胞的生长和分化，因此该复合支架可以更好地模拟细胞生长所需的三维培养空间，更有利于角质形成细胞与表皮基底层细胞的培养和功能维持。同时，角质形成细胞分成多层，与纳米纤维支架交替层叠，这使得细胞在整个人工组织工程皮肤中的分布更为均匀。循环纤维细胞(CFs)可稳定毛细血管，调控VECs合成基底膜成份，并与VECs形成间隙连接，具备了毛细血管支持细胞的所有功能，因此可构建具有生物活性的血管化组织工程皮肤替代物。动物实验证明，该人工组织工程皮肤可以显著改善细胞在组织内分布，促进创面愈合。如此，该具有生物活性的人工血管化组织工程皮肤可用于各种组织的再生和修复，特别是创伤愈合、减少疤痕形成、皮肤再生等。

附图说明

图1为本发明制备人工血管化全层组织工程皮肤的结构示意图；

图2-1为本发明制备的组织工程皮肤的真皮层实物图；

图2-2为本发明制备的全层组织工程皮肤的实物图；

图3-1为血管内皮细胞(VECs)与循环纤维细胞(CFs)混合培养于 PCL-collagen纳米纤维支架上的扫描电镜图；

图3-2为血管内皮细胞(VECs)与循环纤维细胞(CFs)混合培养于 PCL-collagen纳米纤维支架上的共聚焦显微镜图；

图4为本发明的人工血管化组织工程皮肤与其他不同组别材料作用于小香猪创面后的愈合试验结果；

图5-1为本发明的人工组织工程皮肤覆盖创面至21d后的Masson染色图，；

图5-2为与皮肤接触的创缘组织的Masson染色图；

图5-3为与皮肤接触的创缘组织处的HLA-ABC(人组织相容性抗原) -vimentin免疫荧光染色结果。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。

本发明将静电纺丝技术、高分子络合技术与纤维/细胞层-凝胶层-纤维/细胞层层自组装技术相结合，制备具有良好的可塑性及适宜的力学特性、高度孔隙度的三维立体结构及生物功能性的血管化组织工程皮肤，该纳米支架可调控生物降解速率，适合用于皮肤再生组织工程。本发明通过静电纺丝技术，使聚己内酯-β-CD- 胶原/明胶纳米纤维支架在纳米级水平加工为适合角质形成细胞生长分化的互相贯通的多孔三维微观结构，并可根据需要包被各种细胞因子或药物，还利用层层自组装(LBL)技术进行纤维-细胞层层叠加，从多个方面促进细胞的附着和生长，提高细胞治疗的效率。同时，结合循环纤维细胞、血管内皮细胞在水凝胶内形成血管，与成纤维细胞与纤维支架的层层叠加形成血管化真皮层。基于上述理由，本发明结和水凝胶、纳米纤维基质材料和皮肤细胞技术提供一种有生物学活性的生物材料，该生物材料可用于各种组织的再生和修复，特别是创伤愈合、减少疤痕形成、皮肤再生等。

如图1所示，将角质形成细胞接种于聚己内酯-β-CD/胶原纳米纤维支架，借助层层自组装技术进行纳米纤维支架-细胞层层叠加形成表皮膜片，将血管内皮细胞与循环纤维细胞接种于水凝胶内形成血管，并在其下层纳米纤维支架内接种成纤维细胞，从而形成人工血管化组织工程皮肤。

角质形成细胞、循环纤维细胞与血管内皮细胞分离培养方法

实施例1、角质形成细胞分离纯化

取包皮采用无菌PBS反复清洗数次PBS液液澄清。去除筋膜等其他组织后剪成条状；加入Dispase，置于4℃冰箱消化过夜。将消化过夜的包皮置于37℃复温，取出后分离表皮、真皮，将分离得到的表皮置于PBS中清洗。分离得到的表皮加入胰酶(含EDTA)于37℃消化。消化液经滤网过滤，收集滤液离心。PBS 清洗后采用K-SFM培养基重悬细胞，以1×10⁵/cm²细胞密度将细胞进行接种，置于37℃培养箱中培养。2天后首次换液，以后每3天换液一次。

实施例2、循环纤维细胞分离纯化

向L tube内加人淋巴细胞分离液，离心至下层，采用PBS稀释血，向L tube 中加入稀释后的血，离心分层。弃去上层血浆，将白膜层吸出加入至离心管，加入PBS稀释后离心，重复以上步骤3次。随后采用PBS重悬，进行细胞计数，以1×10⁶/mL密度接种于培养皿中。

实施例3、血管内皮细胞分离纯化

将购买Sciencell的HUVEC细胞株在37℃条件下复苏，接种于100mm培养皿中，待细胞长满后，采用胰酶消化传代。

实施例4、一种聚己内脂-β-CD-胶原/明胶纳米纤维支架的制备方法

在超净工作台内，将聚己内酯(PCL)溶解至质量比为1:(1～3)的N,N-二甲基甲酰胺—二氯甲烷混合溶液中，配置成质量浓度为8％的聚己内酯溶液；向聚己内酯溶液中加入β-CD，使得β-CD的质量分数为0.1-1％，加热至50～70℃，搅拌均匀，搅拌时间为6～12小时，得聚己内酯-β-CD溶液；其中，β-CD中可以预先包络有胶原/明胶。

在超净工作台内，将获得的聚己内酯-β-CD-胶原/明胶溶液吸入静电纺丝设备的带金属针头的塑料注射器。注射器针头与作为收集器的培养皿相距10cm，施加的直流电压为20千伏。注射器由注射泵以1.0mL/h的速度驱动，环境温度为 25℃，相对湿度40％，静电纺丝时间为3-5min，获得纳米纤维支架，该纳米纤维支架被接收在培养皿中。

实施例5、一种聚己内脂-β-CD胶原/明胶纳米纤维支架的制备方法

参照实施例4的方法，其中，聚己内酯-β-CD-胶原/明胶溶液中，聚己内酯的质量浓度为4％；β-CD的质量浓度为0.02-0.1％；针头与培养皿的距离为20cm，施加的直流电压为10千伏；注射器由注射泵以2.0mL/h的速度驱动，环境温度为35℃，相对湿度为20％，静电纺丝时间为5min。

实施例6、一种聚己内脂-β-CD-胶原/明胶纳米纤维支架的制备方法

参照实施例4的方法，其中，聚己内酯-β-CD-胶原/明胶溶液中，聚己内酯的质量浓度为12％；β-CD的质量浓度为0.2-1％；针头与培养皿的距离为5cm，施加的直流电压为35千伏；注射器由注射泵以0.5m L/h的速度驱动，环境温度为5℃，相对湿度为80％，静电纺丝时间为1min。

实施例7

(1)利用层层自组装技术(LBL技术)在聚己内脂-β-CD-胶原/明胶纳米纤维支架表面接种成纤维细胞进行共培养

在超净工作台内，参照实施例4～6的方法，制备被接收在60mm培养皿中的纳米纤维支架；将成纤维细胞接种在具有纳米纤维支架的培养皿中，接种的细胞密度为1×10⁴～1×10⁵细胞/mL，将培养皿放置在37℃CO₂培养箱培养。通过培养后可以形成单层纳米纤维支架-成纤维细胞复合物。

(2)利用层层自组装技术(LBL技术)在聚己内脂-β-CD-胶原/明胶纳米纤维支架表面交替接种角质形成细胞进行层层三维共培养

在超净工作台内，参照实施例4～6的方法，制备被接收在60mm培养皿中的纳米纤维支架；将实施例1获得的角质形成细胞接种在具有纳米纤维支架的培养皿中，接种的细胞密度为1×10⁴～1×10⁵细胞/mL；然后再将该培养皿作为纳米纤维支架的接收器进行静电纺丝，静电纺丝结束后再进行细胞接种，如此，每层接种细胞至5层。因为整个过程发生在培养基表面，细胞在组装工程中一直保持水合状态，总共有5层细胞/纳米纤维交替的层层叠加成三维结构。将培养皿放置在37℃CO₂培养箱培养，加入K-SFM补充培养基；继续培养1-2周以形成一种层层自组装形成的人工表皮膜片。

实施例8

参照实施例7(2)的制备方法，其中，培养皿的直径为100mm，每层接种的细胞的数量为1×10⁶个细胞，总共接种20层。

实施例9水凝胶-细胞复合物制备

采用三维胶原混合VECs和CFs两种细胞，三维胶原制备方法如下：M199 培养基中加入NaHCO₃与L-Glutamic，混合Collagen Type I后，用NaOH调节 PH，置于冰上备用。

配制Basal Medium混合培养基，将VECs及CFs消化后采用Basal Medium 混合培养基重悬，细胞悬液与三维胶原混合后，铺展于纤维支架上，置于37℃孵育。

实施例10全层组织工程皮肤的制备

将实施例7(1)中制备的接种有成纤维细胞的纤维支架置于实施例9所制备细胞-三维胶原混合物下方，随后将实施例7(2)中制备的表皮膜片叠加于细胞- 三维胶原混合物上方，将此三层复合物置于37℃孵育，补液待用。分别对真皮层与全层皮肤进行图像采集(图2-1与图2-2)。

实施例11

实施例10所制备的层层自组装形成的人工血管化组织工程皮肤，通过环氧乙烷杀菌后密封包装，包装袋中具有冷冻保护剂，包装后冷冻保存；包装后的工程皮肤可以冷冻在-78～82℃的冰箱中，也可以冷冻在液氮中。

实施例12

将血管内皮细胞与循环纤维细胞接种于聚己内酯-β-环糊精纳米纤维支架上共培养3天后，采用戊二醛溶液在4℃下固定过夜后，用PBS清洗，经过一系列乙醇梯度脱水后进行真空冷冻干燥，干燥6h后进行真空喷碳处理，利用场发射扫描电镜观察细胞在纤维表面的生长情况。

图3-1为血管内皮细胞(VECs)与循环纤维细胞(CFs)混合培养于 PCL-collagen纳米纤维支架上的扫描电镜图，图3-2为其共聚焦显微镜图。结果显示，共培养的细胞围成管腔状，管腔直径可达到5-20μm的要求。

实施例13

选取2个月龄左右的巴马小型香猪，体重15-20kg。雌雄各半，SPF级，由第四军医大学动物中心提供。按随机数字表法将其随机分为模型组与对照组，每组4只，共四组(阴性对照组，阳性对照组，人工表皮膜片覆盖组，人工组织工程皮肤覆盖组)，每组动物术前12h禁食。进行2％戊巴比妥钠肌注麻醉，背部备皮，碘伏消毒背部皮肤，铺无菌巾单。在每头猪背部正中线两侧分别切取2个直径3cm深达肌肉筋膜的圆形全层皮肤缺损创面，每头猪背部8个创面。

阴性对照组，单层油纱覆盖创面；

阳性对照：自体全皮回植；

人工表皮膜片组：人工表皮膜片移植，创面以凡士林油纱覆盖，加压包扎；

全层血管化组织工程皮肤组：全层血管化组织工程皮肤移植，创面以凡士林油纱覆盖，加压包扎。

依照分组，将覆盖材料按照创面大小剪裁，覆盖创面，取材时间以各组动物的创面愈合时间为准。在创面形成后在不同周期对创面愈合情况进行实时监控，利用图像分析软件分析创面治疗前后照片，愈合率大于90％即判定为愈合。实验结果展示在图4中；结果显示，不同处理方式对于创面愈合得效果存在明显差异，与阴性对照组(常规纱布覆盖组)和其它组别相比，经本发明制备的人工血管化组织工程皮肤处理的创面愈合后再上皮化程度更高，说明该材料对于创面愈合的促进效果最佳。

实施例14

在实施例13的基础上，在创面完全愈合后取新生组织(带创缘部分)，经石蜡包埋、切片，采用masson染色检测。在创面完全愈合后取新生组织(带创缘部分)，经石蜡包埋、切片后进行烘片、脱蜡、梯度入水，漂洗后，依次采用R1， R2，R3，R4液进行染色(碧云天染色试剂盒)，中性树胶封片，采用荧光显微镜观察组织内胶原纤维、血管与其他皮肤结构。

检测结果展示在图5-1、图5-2中，Masson染色结果显示，本发明制备的人工组织工程皮肤具有优良的体内降解性能，并且在材料植入后有新生血管生成。实验结果证实：本发明制备的人工组织工程皮肤在同一植入周期内具有更好的体内降解性能，且纤维内部可观察到新生血管生成。

实施例15

将与组织工程皮肤接触的组织用PBS清洗3次；采用4％甲醛溶液(溶于PBS) 固定30min，干燥5min；随后采用PBS清洗3次；并用0.5％TRITON X-100渗透20min，随后用PBS进行清洗；分别采用HLA，Vimentin与DAPI对细胞在室温下进行染色，用PBS清洗来移除未结合的染色液，封片进行共聚焦观察。实验结果展示在图5-3中，其中，红色为标记的人源细胞，绿色为标记的内源性成纤维细胞，细胞核采用DAPI染色标记为蓝色。结果表明：本发明所述人工全层组织工程皮肤在体生物相容性良好，不引起炎症反应，与内源性细胞存在相互作用。

综上所述，本发明首次利用细胞与纳米纤维层层叠加技术，以CFs和VECs 构建功能性毛细血管，通过联合培养制备具有功能性毛细血管化的、并有良好力学性能的组织工程全层皮肤，最终形成可供临床使用的血管化组织工程皮肤。该血管化组织工程皮肤可适用于II、III度创面、深度烧伤残余创面、供皮区、植皮区、摩擦损伤创面、机械损伤创面、溃疡或糖尿病难愈性创面等，能迅速封闭创伤创面，降低感染风险及防止脏器外露，明显改善皮肤愈合质量。不仅有望解决目前深度及大面积开放性创面的治疗难题，极大推动组织工程皮肤的进展及产业化发展，还将为实现其他组织工程器官的毛细血管化提供理论及技术依据。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种水凝胶、纳米纤维支架与皮肤细胞层层组装的血管化全层组织工程皮肤，其特征在于，材料组成包括多层皮肤细胞层、多层多孔且具有三维结构的纳米纤维支架和单层水凝胶层；

该组织工程皮肤的结构自上而下由表皮层和真皮层组成：

表皮层是由位于真皮层上方的纳米纤维支架与一种种子细胞交替层叠组成，种子细胞分布在纳米纤维支架表面与相邻纳米纤维支架的层间；

真皮层由位于下层的纳米纤维支架、位于上层的水凝胶层及三种种子细胞组成，种子细胞分布在纳米纤维支架表面以及水凝胶层的内部及表面；其中，水凝胶层的内部和表面接种两种细胞，纳米纤维支架的表面接种另一种细胞；

表皮层的一种种子细胞为角质形成细胞；真皮层的三种种子细胞分别为循环纤维细胞、血管内皮细胞及成纤维细胞，其中，水凝胶层的内部及表面接种的两种细胞为循环纤维细胞和血管内皮细胞，纳米纤维支架表面接种的一种细胞为成纤维细胞。

2.如权利要求1所述的水凝胶、纳米纤维支架与皮肤细胞层层组装的血管化全层组织工程皮肤，其特征在于，所述纳米纤维支架由聚己内酯、β-环糊精及蛋白制备而成。

3.如权利要求2所述的水凝胶、纳米纤维支架与皮肤细胞层层组装的血管化全层组织工程皮肤，其特征在于，β-环糊精中包络Ⅰ型胶原/明胶。

4.如权利要求1所述的水凝胶、纳米纤维支架与皮肤细胞层层组装的血管化全层组织工程皮肤，其特征在于，纳米纤维支架的透氧率为50％～60％，纳米纤维支架中的纳米纤维的直径为200～600nm。

5.如权利要求1所述的水凝胶、纳米纤维支架与皮肤细胞层层组装的血管化全层组织工程皮肤，其特征在于，水凝胶层的厚度为0.5～1mm，平衡溶胀率为200％～300％。

6.权利要求1～5任一项所述的水凝胶、纳米纤维支架与皮肤细胞层层组装的血管化全层组织工程皮肤的制备方法，其特征在于，包括步骤：

1)制备血管内皮细胞、循环纤维细胞与角质形成细胞；

2)将角质形成细胞与多层纳米纤维支架共培养；

其中，步骤2)包括步骤：

21)以培养皿作为接收器，通过静电纺丝法制备纳米纤维支架；

22)将角质形成细胞接种在培养皿中；

23)重复步骤21)和22)，直至完成设定的接种层数；

24)在培养皿中，将纳米纤维支架与细胞进行共培养，制得表皮膜片；

3)将血管内皮细胞、循环纤维细胞与单层水凝胶层进行共培养；

4)将成纤维细胞与单层纳米纤维支架共培养；

其中，步骤4)包括步骤：

41)以培养皿作为接收器，通过静电纺丝法制备纳米纤维支架；

42)将成纤维细胞接种在培养皿中进行共培养；

5)将步骤3)中培养制得产物铺于步骤4)中培养得到的产物上；

6)在步骤5)制得的产物表面叠加步骤2)中制备的表皮膜片，经共培养直至形成水凝胶、纳米纤维支架与皮肤细胞层层组装的血管化全层组织工程皮肤。

7.如权利要求6所述的水凝胶、纳米纤维支架与皮肤细胞层层组装的血管化全层组织工程皮肤的制备方法，其特征在于，在步骤21)与步骤41)中，静电纺丝法制备纳米纤维支架的具体操作如下：

在超净工作台中进行操作，静电纺丝过程中施加的直流电压为10～35kV；静电纺丝过程中针头与培养皿的距离为5～20cm；静电纺丝过程中注射器由注射泵以0.5～2.0mL/h的速度驱动；静电纺丝过程中环境温度为5～35℃；静电纺丝过程中环境相对湿度为20％～80％；静电纺丝的时间为1～5min。

8.如权利要求7所述的水凝胶、纳米纤维支架与皮肤细胞层层组装的血管化全层组织工程皮肤的制备方法，其特征在于，

在步骤22)与步骤42)中，相对于纳米纤维支架的面积，细胞接种的数量为1×10⁴～2×10⁴个细胞/cm²。

9.如权利要求7所述的水凝胶、纳米纤维支架与皮肤细胞层层组装的血管化全层组织工程皮肤的制备方法，其特征在于，在步骤6)之后，还包括对制备的水凝胶、纳米纤维支架与皮肤细胞层层组装的血管化全层组织工程皮肤进行杀菌后密封包装及冷冻保藏的操作。

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