CN113584012B - 一种ga-t细胞及其制备方法以及在白血病和抗gvhd中的应用 - Google Patents

一种ga-t细胞及其制备方法以及在白血病和抗gvhd中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种GA‑T细胞及其制备方法以及在白血病和抗GVHD中的应用，该GA‑T细胞由内到外顺次为细胞内层、第1明胶层、第1海藻酸钠层、……、第n明胶层、第n海藻酸钠层，其中n为大于等于1的自然数。本申请中GA‑T能够有效地缓解小鼠GVHD的临床表现，并且发挥较好的肿瘤杀伤作用。临床上由于供体和受体的人类白细胞抗原(Human Leukocyte Antigen,HLA)不匹配而导致的可用供体骨髓不足。异体来源的T细胞的分选扩增十分容易获取，GA‑T也就解决了供体骨髓不足的问题，在实现免疫隔离的同时发挥肿瘤杀伤作用。

Description

一种GA-T细胞及其制备方法以及在白血病和抗GVHD中的应用
技术领域
本发明涉及一种GA-T细胞及其制备方法以及在白血病和抗GVHD中的应用。
背景技术
细胞治疗包括植入或输送活细胞并维持其在患者中的存活，以治疗某种疾病。细胞治疗的优势在于提供了能够调节其功能、感知和响应其环境的复杂生物实体。细胞的迁移和增殖能力、治疗药物的提供以及细胞间的相互作用是可以被调控的，以应对各种病理中的持续挑战，包括糖尿病、白血病、实体瘤、脊髓损伤以及自身免疫和神经退行性疾病。
白血病有四种主要类型：急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia，ALL)，急性髓细胞性白血病(acute myelocytic leukemia，AML)，慢性淋巴细胞性白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)和慢性粒细胞白血病(chronic myelogenousleukemia，CML)。异基因造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)是目前临床根治血液系统恶性肿瘤的主要方法。移植的供体T细胞通过促进宿主免疫系统重建介导移植物抗白血病(graft-versus-leukemia，GVL)效应，但是供体T细胞在发挥GVL效应同时，也参与了威胁生命的严重并发症—移植物抗宿主疾病(graft-versus-hostdisease，GVHD)。目前GVHD仍是移植失败引起死亡的主要原因，是移植的首要障碍，特别是急性GVHD(acute GVHD，aGVHD)。
免疫隔离(immune-isolation)技术是将需要移植的细胞或组织包被于选择透过性膜微囊中，移植物与宿主免疫系统隔离，有效避免异体移植的免疫排斥反应。目前该技术已用于糖尿病、神经变性疾病、心血管疾病等多种疾病的治疗研究。常用的微囊化材料是生物相容性的，包括明胶(gelatin)、海藻酸钠(alginate)、壳聚糖(chitosan)、多聚赖氨酸(poly-L-lysine，PLL)、透明质酸(hyaluronic acid)等。
层层(layer-by-layer，LBL)自组装技术使带负电的阴离子聚合物与带正电的阳离子聚合物通过静电相互作用形成多层材料薄膜的微囊。各种带电物质，如多价离子、低聚物、蛋白质和带电粒子可被用作胶囊的包被材料。多种材料间的相互作用为精确控制LBL自组装性能以及精确调节胶囊壁的厚度提供了发展前景。通过物理化学等方法控制LBL多层膜的结合或整合营养因子等方法调节细胞层的功能，这些细胞随后可用于移植治疗实验。
传统的细胞包被技术如微流体技术、电喷雾技术包封形成多细胞包被的微囊系统体积较大，体内输注易引起血管阻塞，不适用于血液疾病的治疗。
利用LBL自组装技术制备出的微囊粒径较小，机械强度高且微囊表面光滑圆整。囊壁是半通透性膜，允许氧、营养、代谢产物和小分子蛋白质自由穿过，具有免疫活性的大分子物质如免疫细胞、分子量大于71KD的葡聚糖分子和免疫球蛋白IgG(分子量150KD)等不能通过，从而保护囊壳内组织或细胞不被免疫系统攻击。细胞因子如IL-2(分子量15KD)、IFN-γ(分子量16.3KD)、TNF-α(分子量25KD)等，多数分子量不超过60KD，可自由穿过微囊。
上述背景技术是为了便于理解本申请，并非是申请本申请之前已向普通公众公开的公知技术。
发明内容
基于上述问题，一方面，本申请提供一种GA-T细胞，该GA-T能够有效地缓解小鼠GVHD的临床表现，并且发挥较好的肿瘤杀伤作用。临床上由于供体和受体的人类白细胞抗原(Human Leukocyte Antigen,HLA)不匹配而导致的可用供体骨髓不足。异体来源的T细胞的分选扩增十分容易获取，GA-T也就解决用供体骨髓不足的问题，在实现免疫隔离的同时发挥肿瘤杀伤作用。
一种GA-T细胞，该GA-T细胞由内到外顺次为细胞内层、第1明胶层、第1海藻酸钠层、……、第n明胶层、第n海藻酸钠层，其中n为大于等于1的自然数。
在本申请的一个或多个具体的实施方式中，所述细胞内层为T细胞。
在本申请的一个或多个具体的实施方式中，所述T细胞为同种异体来源T细胞。
在本申请的一个或多个具体的实施方式中，所述n＝2。
在本申请的一个或多个具体的实施方式中，所述明胶为由羧基化学转换为氨基的改性明胶。
在本申请的一个或多个具体的实施方式中，所述T细胞为经无菌分离、磁珠分选及体外扩增的T细胞。
本申请还提供一种上述GA-T细胞的制备方法。
一种GA-T细胞的制备方法，包括以下步骤：
①T细胞悬液处理形成单细胞悬液；
②加入明胶溶液；
③孵育，使明胶吸附在T细胞表面，形成第一层明胶包被；
④加入藻酸盐溶液，明胶与藻酸盐通过静电沉积作用紧密结合，形成第一层藻酸盐包被；
⑤重复步骤②-④，重复次数为n，其中n为大于等于1的自然数。
在本申请的一个或多个具体的实施方式中，T细胞为经无菌分离、磁珠分选及体外扩增的T细胞；。
在本申请的一个或多个具体的实施方式中，n＝2。
在本申请的一个或多个具体的实施方式中，所述②中，以1mL计，1×106个的单细胞悬液中，明胶溶液中明胶加入量为0.0001-0.1g，所述④中，以1mL计，1×106个的单细胞悬液中，藻酸盐溶液中藻酸盐加入量为0.0001-0.1g。
在本申请的一个或多个具体的实施方式中，所述②中，以1mL计，1×106个的单细胞悬液中，明胶溶液中明胶加入量为0.001-0.004g，所述④中，以1mL计，1×106个的单细胞悬液中，藻酸盐溶液中藻酸盐加入量为0.001-0.004g。
在本申请的一个或多个具体的实施方式中，所述③中，孵育时间为2-60min。
在本申请的一个或多个具体的实施方式中，所述③中，孵育时间为5-30min。
在本申请的一个或多个具体的实施方式中，所述明胶为由羧基化学转换为氨基的改性明胶。
本申请采用多聚阳离子的A型明胶和多聚阴离子的藻酸盐通过LBL自组装技术形成的纳米膜薄，可以为单个T细胞提供一种精细的微环境，从而单个调节其增殖、分化、细胞因子分泌、细胞间相互作用等功能。
本申请还提供一种上述GA-T细胞在制备白血病和/或抗GVHD的药物中的应用。
一种GA-T细胞在制备白血病和/或抗GVHD的药物中的应用。
发明原理及有益效果：
明胶是一种无毒的天然生物大分子，由动物皮肤、骨骼和结缔组织中的胶原蛋白衍生的生物活性多肽组成。A型明胶的等电点(IP)为7-9，生理pH值下带正电荷。明胶在本发明中被用来模拟细胞外基质，为包被的细胞提供了生物相容性环境。
藻酸盐是从藻类中纯化得到的天然多糖，具有极佳的生物相容性和生物降解性。能够作为外层阴离子包被材料，在多种细胞包被技术中被应用。可在体内和体外维持最佳的细胞活力水平，此外，所得的胶囊膜可渗透葡萄糖和氧气等小分子，并且阻隔大分子接触。
明胶和海藻酸钠属于天然的可降解材料，不影响细胞的存活率。
本申请通过无菌分离分选出正常C57BL/6小鼠脾脏中T细胞，流式细胞术鉴定T细胞分选效率，加入活化剂和营养物质促进T细胞的扩增，在细胞培养箱内分装培养T细胞，用于本申请GA-T的制备。
本申请通过化学反应，将天然A型明胶的羧基转换为氨基来制备改性的阳离子明胶，使明胶表面带正电荷。通过轻吹、混合孵育、离心、洗涤等步骤将改性明胶吸附在带负电荷的T细胞表面，明胶再与天然的藻酸盐通过静电沉积作用紧密结合。本申请具较佳实施例中三、四层再重复明胶、藻酸盐的包被，形成四层包被的纳米薄膜。
本申请保证了GA-T的最佳活力和包被率。GA-T经过四层包被(明胶(Gelatin)-藻酸盐(Alginate)-明胶-藻酸盐)后形成形态相对光滑的囊壳，GA-T的最外层囊壳在96h内逐渐降解。并且GA-T具有与免疫细胞相似的电位，增殖能力、以及抗CD3的抗体结合能力。此外，GA-T具备比常规T细胞更强的机械硬度，在反复六次3000-4000rpm离心力的作用下仍能保持良好的细胞活力。
本申请对原代的包被T细胞生物相容性，可渗透的，机械强度和生理稳定性以及免疫调节功能进行系统研究。在移植后的初始阶段，单个包被的T细胞能够通过免疫隔离来避免宿主对异体细胞(即T细胞)的排斥反应。
本申请的应用前景在于利用纳米包被技术对健康供体的T淋巴细胞进行大规模的制备，进行同种异体肿瘤患者的抗肿瘤治疗。利用免疫隔离新理念与纳米生物材料包被免疫细胞新技术预防血液肿瘤在移植治疗中的GVHD。
本申请建立了GVHD动物模型以及GVHD联合AML的动物模型。GA-T显著改善了接受异体移植小鼠的GVHD临床表现，接受GA-T移植的宿主小鼠体重60天内恢复至正常水平，肝脏、结肠以及皮肤等靶器官的病理组织正常。体外研究证明了GA-T能够有效抑制混合淋巴细胞反应，实现了免疫隔离的功能。与此同时，明胶和海藻酸钠的包被不影响GA-T所分泌的TNF-α和IFN-γ细胞因子水平，通过这些细胞因子释放的细胞毒作用能够有效杀伤髓样单核白血病细胞WEHI-3B。
AML小鼠体内的WEHI-3B细胞在接受GA-T移植27天后被GA-T细胞清除，并且外周血和脾脏中的CD4/CD8比例显著低于非包被的常规T细胞移植组。CD4+Th细胞亚群与GVHD相关，CD8+CTL在GVL中发挥十分重要作用，对GVHD的诱导弱于CD4+Th细胞。可见CD4+细胞和CD8+在GVHD病程及GVL效应中的作用不同，证明了本发明制备的GA-T细胞为控制GVHD发生，同时保留GVL效应。GA-T细胞与髓样单核白血病细胞WEHI-3B共培养24h后，虽然CD69的表达略低于非包被的常规T细胞组，但CD107a的表达无显著差异。CD69可在所有激活的T细胞上快速瞬时表达，而CD107a是刺激后CD8+T细胞脱粒的标志。因此，GA-T对肿瘤细胞所产生的细胞毒作用不低于常规的免疫细胞。
本发明通过化学反应对A型明胶改性后，开创性地应用于免疫细胞(T细胞)的包被，明胶能够模拟细胞外基质环境，所带的正电荷能够稳定地附着于免疫细胞表面，最外层的藻酸盐是常见的包被材料，能够阻隔大分子的接触。GA-T的囊壁是半通透性膜，允许氧、营养、代谢产物和小分子蛋白质自由穿过，具有免疫活性的大分子物质如免疫细胞、分子量大于71KD的葡聚糖分子和免疫球蛋白IgG(分子量150KD)等不能通过，从而保护囊内组织或细胞不被免疫系统攻击。细胞因子如IL-2(分子量15KD)、IFN-γ(分子量16.3KD)、TNF-α(分子量25KD)等，多数分子量不超过60KD，可自由穿过微囊。明胶和藻酸盐属于天然的生物可降解材料，避免了在体内蓄积毒性的副作用。
名称术语解释
GA-T–本申请中，GA-T中G是明胶英文gelatin的缩写，A是海藻酸钠的英文alginate的缩写，T指T细胞。
附图说明
图1为本申请实施例5不同浓度的阳离子明胶和海藻酸钠包被效果图；
图2为本申请实施例6不同孵育时间的细胞活力图；
图3为本申请实施例7Hoechst-PI染色检测GA-T细胞存活图；
图4为本申请实施例8扫描电镜观察GA-T表面形态；
图5为本申请实施例9酶联免疫吸附测定(ELISA)细胞因子分泌水平图；
图6为本申请实施例10电位检测图；
图7为本申请实施例11CFSE检测GA-T的增殖能力图；
图8为本申请实施例12流式检测GA-T的抗体结合能力图；
图9为本申请实施例13测试GA-T细胞的物理应力；
图10为本申请实施例14激光共聚焦显微镜观察图；
图11为本申请实施例14微分干涉显微镜结果图；
图12为本申请实施例15荧光显微镜观察包被材料的降解图；
图13为本申请实施例16移植后各组小鼠GVHD评分结果图；
图14为本申请实施例16体重变化图；
图15为本申请实施例16生存时间和存活率图；
图16为本申请实施例17移植后d27天各组小鼠实拍图片；
图17为本申请实施例17移植后各组小鼠GVHD评分结果图；
图18为本申请实施例17移植后各组小鼠生存曲线图；
图19为本申请实施例17光学显微镜下观察病理结果图；
图20为本申请实施例17动物活体荧光成像图；
图21为本申请实施例18流式细胞仪检测移植后d7天，受体小鼠脾脏中供体T细胞比例图；
图22为本申请实施例19流式细胞仪检测移植后各组小鼠T细胞亚群比例图；
图23为本申请实施例20混合淋巴细胞反应结果图；
图24为本申请实施例21GA-T对肿瘤细胞的细胞毒作用图；
图25为本申请实施例21GA-T与肿瘤细胞共培养的流式检测结果图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明作进一步说明。
本申请中，CCK-8法检测细胞活力的方法为：
将包被后的细胞加入10(V/V)％RPMI培养基(2mM L-谷氨酰胺，10％FCS/FBS和100U/mL青霉素/链霉素)接种在96孔板中(100μL/孔)。将培养板放在培养箱中预培养12小时(37℃，5％CO2)。取出培养板，向每孔加入10μl CCK8溶液，将培养板在培养箱内孵育，在孵育的4小时内用酶标仪测定在450nm处的吸光度。其中，mM表示毫摩尔/L。
本申请中，统计方法采用GraphPad Prism软件进行分析，数据以均值±标准差表示，两组间和多组间显著性检验分别采用T检验和单因素方差分析。表示P<0.05为有统计学意义。
本申请中，流式细胞术的检测样品制备为：数据中所标记的CD3、CD4、CD8、CD45.2、H2Kb、CD69以及CD107a均为膜蛋白。细胞处理计数后，用细胞洗涤液(含2％BSA的PBS)重悬细胞，使细胞浓度为1×107/mL。空白对照管不加抗体，待测样本管分别加入说明书用量的靶标抗体，充分混匀，至4℃孵育30min，孵育期间每隔10min晃动一下反应管，使细胞和抗体充分反应。加入适量细胞洗涤液，1500rpm离心5min，弃上清，反复洗涤2次。使用200μL细胞洗液重悬细胞。十色流式细胞仪上机检测。
实施例1
①PBMC的制取：无菌条件下，取正常C57BL/6小鼠脾脏。在35mm无菌培养皿中放入4-5mL淋巴细胞分离液。小鼠脾脏置于无菌培养皿中，在200目细胞筛网上用5mL注射器针芯轻轻研磨过滤。把悬有脾脏细胞的滤液立即转移到15mL离心管中，覆盖200-500μL的RPMI培养基(保持液面分界明显)。室温，800g离心30min。吸出淋巴细胞层，再加入10mL RPMI培养基，颠倒洗涤。室温，250g离心10min收集细胞。无血清的RPMI重悬计数，调节成所需细胞数备用；台盼蓝染色，计数活细胞数。得到外周血单个核细胞即PBMC。
②磁珠分选：将①制取的PBMC经磁珠分选(每107个细胞中加入100μL MACS缓冲液(用于细胞分选的磁珠))重悬，与CD3 T细胞阴性分选的磁珠孵育15分钟，洗涤(300g/10min)后用分离缓冲液重悬，标记的细胞悬液加入分选柱，再以缓冲液洗脱3次，标记的细胞被分离，收集未标记的T细胞。得到原代T细胞。
③小鼠T细胞体外扩增培养:将②得到的原代T细胞以1×106mL种植到10(V/V)％RPMI培养基(2mM L-谷氨酰胺，10％FCS/FBS和100U/mL青霉素/链霉素)内。添加小鼠T细胞-活化剂CD3/CD28(3μg/mL)。加入30U/mL rIL-2，在37℃的CO2培养箱中培养。观察细胞大小和形状。当细胞密度超过2.5×106细胞/mL或培养基变成黄色时，将培养液分装到含有30U/mL rIL-2的培养基中，密度恢复为0.5-1×106细胞/mL。得扩增培养的T细胞悬液。
实施例2明胶材料的改性-羧基化学转换为氨基
取2mL乙二胺(EDA)、1.0g 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和50mL的2wt％的A型明胶溶液，将EDA、EDC加入A型明胶溶液中，用5M HCl调pH至5.0，边反应边搅拌，反应温度为37℃，反应时间18小时。反应后，将反应混合物用透析袋透析，纯水作为透析液，每6h更换一次透析液。冷冻干燥透析袋内的溶液，得到改性后的阳离子明胶。
本实施例中，A型明胶等电点为
Figure BDA0003243162190000083
Sigma-Aldrich，USA，A型明胶溶液为磷酸盐缓冲液体系的明胶溶液。
实施例3
取实施例2制取的改性后的阳离子明胶，常温下用生理盐水配制不同浓度的阳离子明胶溶液，调PH到7.3-7.5。不同浓度的阳离子明胶溶液如下表1，配制用的生理盐水为0.9wt％氯化钠无菌水溶液。
表1不同浓度的阳离子明胶溶液表
Figure BDA0003243162190000081
配制后的阳离子明胶溶液用0.22μm滤膜过滤除菌后待用。
常温下用生理盐水配制不同浓度的海藻酸钠溶液，调PH到7.3-7.5。不同浓度的海藻酸钠溶液见下表2，配制用的生理盐水为0.9wt％的生理盐水。
表2不同浓度的海藻酸钠溶液表
Figure BDA0003243162190000082
Figure BDA0003243162190000091
表2配制的海藻酸钠溶液用0.22μm滤膜过滤除菌后待用。
用异硫氰酸荧光素(FITC)标记海藻酸钠，标记方法为：将1.8％，w/v海藻酸钠溶解在2-N-嘛啉基乙磺酸(2-(N-morpholino)ethanesulfonic，MES)缓冲液中，调节pH值至4.7，与9mM的1-乙基-3[3-二甲氨丙基]碳二盐酸盐(1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride，EDC)和9mM的-羟基磺酸琥珀酰亚胺(N-hydroxysulfosuccinimide，Sulfo-NHS)混合，活化海藻酸钠的羰基。在室温下搅拌2小时后，加入2mM异硫氰酸荧光素，室温下避光搅拌18小时。最后溶液用1M氯化钠溶液和蒸馏水分别避光透析24小时，然后冷冻干燥。标记FITC后的海藻酸钠溶液按照表2的对应浓度比例配制，见下表3。
表3不同浓度的标记海藻酸钠溶液表
Figure BDA0003243162190000092
实施例4
将实施例1制得的扩增培养的T细胞悬液用DPBS缓冲液洗涤，去除残存蛋白。再用DPBS缓冲液离心洗涤(1500rpm，5min)，计数后重悬为1×106个/mL的单细胞悬液，取1mL加入6孔板中，再加入1mL的表1任一的胶液，轻轻混匀，多次轻吹保证均匀分散，然后置于恒温摇床培养箱摇晃混匀(200rpm)3min，再继续孵育10min(每隔2min轻微振荡一次)，使胶液中的改性后的阳离子明胶吸附在带负电的细胞表面。孵育后的细胞悬液转移至15mL离心管，离心(2000rpm,5min)，洗去多余的改性后的阳离子明胶，再加入5mLDPBS洗涤，去除未吸附的明胶。反复洗涤2次。随后向细胞悬液中加入1mL表2任一的海藻酸钠溶液，按照如上方法同样包被、离心和洗涤。两种包被步骤各重复一次，即形成细胞-明胶-海藻酸钠-明胶-海藻酸钠的单细胞包被GA-T。
实施例5
将实施例1制得的扩增培养的T细胞悬液用DPBS缓冲液洗涤(1500rpm，5min)，去除残存蛋白。再计数后用DPBS缓冲液重悬为1×106个/mL的单细胞悬液，取1mL加入6孔板中，再加入1mL的表1任一的胶液，轻轻混匀，多次轻吹保证均匀分散，然后置于恒温摇床培养箱摇晃混匀(200rpm)3min，再继续孵育10min(每隔2min轻微振荡一次)，使胶液中的改性后的阳离子明胶吸附在带负电的细胞表面。孵育后的细胞悬液转移至15mL离心管，离心(2000rpm,5min)，洗去多余的改性阳离子明胶，再加入5mLDPBS洗涤，去除未吸附的明胶。反复洗涤2次。随后向细胞悬液中加入1mL海藻酸钠溶液，按照如上方法同样包被、离心和洗涤。两种包被步骤各重复一次，即形成细胞-明胶-海藻酸钠-明胶-标记海藻酸钠的单细胞包被GA-T。
本实施例中，包被时，最外一层的海藻酸钠采用的1mL海藻酸钠溶液采用的为表3任一的标记海藻酸钠溶液，其余层的海藻酸钠采用的1mL海藻酸钠溶液采用的为表2任一的海藻酸钠溶液。
包被后的单细胞GA-T产品用流式细胞术检测FITC荧光的比例来确定包被效率，结果见下表4和图1。
表4不同浓度的阳离子明胶和海藻酸钠包封效果表(单位：％)
Figure BDA0003243162190000101
Figure BDA0003243162190000111
从表4和图1可以看出，用不同浓度的明胶(0.1％，0.2％，0.3％，0.4％)与海藻酸钠(0.15％，0.2％，0.25％，0.3％，0.4％)包被后的单细胞包被GA-T产品，从包被率来看，0.2％明胶、0.25％海藻酸钠溶液取得的包被率较高，包被效率高达90％以上。
实施例6
将实施例1制得的扩增培养的T细胞悬液用DPBS缓冲液洗涤(1500rpm，5min)，去除残存蛋白。再计数后用DPBS缓冲液重悬为1×106个/mL的单细胞悬液，取1mL加入6孔板中，再加入1mL的表1的胶液2(0.2％)，轻轻混匀，多次轻吹保证均匀分散，然后置于恒温摇床培养箱摇晃混匀(200rpm)3min，再继续孵育，使胶液中的改性后的阳离子明胶吸附在带负电的细胞表面。孵育后的细胞悬液转移至15mL离心管，离心(2000rpm,5min)，洗去多余的改性阳离子明胶，再加入5mLDPBS洗涤，去除未吸附的明胶。反复洗涤2次。随后向细胞悬液中加入1mL表2的海藻酸钠溶液3(0.25％)，按照如上方法同样包被、离心和洗涤。两种包被步骤各重复一次，即形成细胞-明胶-海藻酸钠-明胶-海藻酸钠的单细胞包被GA-T。
本实施例中，继续孵育的孵育时间分别为5min、10min、20min或30min，其中，每一―再继续孵育”时间中，每隔2min轻微振荡一次。
将包被的单细胞包被GA-T产品用CCK-8法检测细胞活力，结果见图2。
图2显示，孵育10min细胞活力最佳，孵育20min以后细胞活力明显下降
Figure BDA0003243162190000112
*p<0.05,**p<0.01
实施例7Hoechst-PI染色检测GA-T细胞存活
本实施例的包被的GA-T细胞来源于实施例6中胶液2(0.2％)、海藻酸钠溶液3(0.25％)、孵育时间10min制取的细胞-明胶-海藻酸钠-明胶-海藻酸钠的单细胞包被GA-T。
收集单细胞包被GA-T，细胞数量在1×106个以内，用PBS洗涤细胞两次。用1mL染色缓冲液将细胞重悬，加入10μL Hoechst33342染色液，轻轻混匀后4℃避光孵育10分钟。加入5-10μL避光孵育PI染色液，轻轻混匀后4℃避光孵育5-10分钟，用PBS洗涤重悬细胞。用荧光显微镜观察，流式细胞仪在激发波长350nm和460nm处检测Hoechst和PI的表达比例，分析包被后GA-T的存活情况，常规的非包被T细胞作为对照。结果见图3。
图3中，Hoechst-PI染色，蓝色表示为正常细胞，红色表示坏死细胞。通过荧光显微镜观察以及流式细胞术检测，GA-T与常规非包被T细胞的存活率相近，没有显著差异。
实施例8扫描电镜观察GA-T表面形态
本实施例的包被的GA-T细胞来源于实施例6中胶液2(0.2％)、海藻酸钠溶液3(0.25％)、孵育时间10min制取的细胞-明胶-海藻酸钠-明胶-海藻酸钠的单细胞包被GA-T。
将单细胞包被GA-T离心洗涤弃上清，加入5(V/V)％戊二醛(0.1MPBS稀释)固定30min，按照35(V/V)％，50(V/V)％，75(V/V)％，95(V/V)％，100(V/V)％的乙醇梯度脱水，其中95(V/V)％和100(V/V)％乙醇脱水两次。脱水后的样品转移至六甲基二硅氮烷HMDS：100(V/V)％乙醇为1：2的溶液中，静置20min，再转移到六甲基二硅氮烷HMDS：100(V/V)％乙醇为2：1的新鲜溶液中静置20min。最后将样品转移到100(V/V)％HMDS中20min，通风处内过夜。用离子溅射仪对待测包被的GA-T细胞进行喷金处理镀膜，通过扫描电子显微镜观察待测包被的GA-T细胞的表面形态，常规的非包被T细胞作为对照。
结果见图4，图4显示，常规T细胞表面有许多微绒毛，GA-T外层形成相对光滑的囊壳。
实施例9酶联免疫吸附测定(ELISA)细胞因子分泌水平
本实施例的包被的GA-T细胞来源于实施例6中胶液2(0.2％)、海藻酸钠溶液3(0.25％)、孵育时间10min制取的细胞-明胶-海藻酸钠-明胶-海藻酸钠的单细胞包被GA-T。
收集单细胞包被GA-T，加入10(V/V)％RPMI培养基接种在96孔板中(1×105个/孔)，在37℃，5(V/V)％的CO2的培养箱中培养，于48h、96h收集细胞上清样本。将样本和标准品(100μL/孔)加入抗体包被的ELISA夹心孔内，加入生物素化抗体工作液(50μL/孔)，用微量震荡仪充分混匀，封板胶纸封住反应孔，室温孵育120min。每孔加入350μL洗涤液，静置30s后甩干液体，洗涤4次。加入酶结合工作液(100μL/孔)，封板室温孵育30min。洗板四次后加入显色剂100μL/孔，避光室温孵育10-20min。加入终止液100μL/孔，混匀后即刻测量450nm处的OD值。常规的非包被T细胞作对照。
结果见图5，酶联免疫吸附剂测定(ELISA)检测显示，经CD3/CD28刺激后，GA-T包被不影响96h内TNF-α，IL-2和IFN-γ的分泌水平
Figure BDA0003243162190000121
实施例10电位检测
本实施例的包被的GA-T细胞来源于实施例6中胶液2(0.2％)、海藻酸钠溶液3(0.25％)、孵育时间10min制取的细胞-明胶-海藻酸钠-明胶-海藻酸钠的单细胞包被GA-T。
取包被前的细胞样品以及每层包被后的样品：细胞，细胞-明胶，细胞-明胶-海藻酸钠，细胞-明胶-海藻酸钠-明胶，细胞-明胶-海藻酸钠-明胶-海藻酸钠。用马尔文纳米粒度电位仪测量整个包被过程中GA-T表面电位变化情况，结果见图6。
从图6可知，四层包被后，GA-T表面电位与包被前(即正常T细胞)相比没有显著变化
Figure BDA0003243162190000131
实施例11CFSE检测GA-T的增殖能力
本实施例的包被的GA-T细胞来源于实施例6中胶液2(0.2％)、海藻酸钠溶液3(0.25％)、孵育时间10min制取的细胞-明胶-海藻酸钠-明胶-海藻酸钠的单细胞包被GA-T。
将GA-T或常规的非包被T细胞用染色工作液重悬，至细胞浓度大约107/mL。在37℃培养箱中孵育20分钟，离心后去上清，用PBS洗涤细胞1-2次，加入10(V/V)％RPMI培养基，将细胞接种在24孔板内(1×106个/孔)，添加小鼠T细胞-活化剂CD3/CD28(3μg/mL)。加入30U/mL rIL-2，在37℃培养箱中培养48h。收集细胞，用Anti-CD3-PE孵育30min，标记T细胞，离心洗涤，用流式细胞仪检测CD3和CFSE的表达情况(收集培养前0h的细胞，标记CD3作为空白对照)。结果见图7。
图7显示，经CD3/CD28刺激后，CFSE检测CD3+GA-T与常规CD3+T细胞增殖能力没有显著差异。
实施例12流式检测GA-T的抗体结合能力
本实施例的包被的GA-T细胞来源于实施例6中胶液2(0.2％)、海藻酸钠溶液3(0.25％)、孵育时间10min制取的细胞-明胶-海藻酸钠-明胶-海藻酸钠的单细胞包被GA-T。
将GA-T或常规的非包被T细胞加入含10(V/V)％RPMI培养基的6孔板内(1×106个/ml)预培养6h，吸取细胞离心洗涤，加入ANTI-CD3标记CD3，4℃孵育30min，离心洗涤后流式细胞仪上机检测。结果见图8
图8显示，GA-T与普通T细胞具有相同的anti-CD3结合能力
Figure BDA0003243162190000132
实施例13测试GA-T细胞的物理应力
本实施例的包被的GA-T细胞来源于实施例6中胶液2(0.2％)、海藻酸钠溶液3(0.25％)、孵育时间10min制取的细胞-明胶-海藻酸钠-明胶-海藻酸钠的单细胞包被GA-T。
收集包被GA-T或常规的非包被T细胞加入1.5mL的EP管内(约1×106)，采用不同的离心速度(1000rpm，1500rpm，2000rpm，3000rpm，4000rpm)产生的不同物理应力处理样本，反复六次。再用10(V/V)％RPMI培养基重悬细胞，接种到96孔板中(10μL/孔)，在37℃培养箱中培养12h，CCK-8法检测各组的细胞活力。结果见图9。
图9显示，用不同的离心速度(1000rpm，1500rpm，2000rpm，3000rpm，4000rpm)产生的不同物理应力处理常规T细胞与GA-T，每次离心5min，反复6次。通过CCK-8法检测细胞活力，与常规T细胞相比，GA-T具备一定的机械强度，能够显著减轻2000-4000rpm产生的物理破坏力。*p<0.05,****p<0.01
Figure BDA0003243162190000141
实施例14激光共聚焦与微分干涉
本实施例的包被的GA-T细胞来源于实施例5中胶液2(0.2％)、海藻酸钠溶液3(0.25％)、孵育时间10min制取的细胞-明胶-海藻酸钠-明胶-标记FITC海藻酸钠的单细胞包被GA-T。
标记FITC的包被GA-T离心分离，洗涤缓冲液(50mL PBS+50μl Tween)洗涤后计数，吸取约1×106个GA-T离心弃上清，加入固定液室温固定15min，离心洗涤弃上清，再加入100μL 4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)染色液，室温避光孵育30min。用洗涤缓冲液(500μl/管)洗涤；重悬离心后，吸弃上清，每管留20-30μl的上清，将细胞吹匀后，滴于载玻片上，涂抹均匀后，自然风干；再滴上一小滴防淬灭封片剂，小心取出盖玻片，细胞朝下，轻轻叩于封片剂上。在激光共聚焦显微镜下观察细胞的表面荧光(激发波长358nm和488nm)。微分干涉显微镜拍摄不同视野的图像，使用ImageJ软件分析GA-T包被膜的厚度，常规的非包被T细胞作为对照。
激光共聚焦显微镜观察结果见图10，图10中a-e的结果显示，包被后的GA-T细胞表面荧光。
微分干涉显微镜见图11，图11显示，使用ImageJ软件分析GA-T细胞的微分干涉显微镜图像，测量包被膜厚度在500nm范围内。
实施例15荧光显微镜观察包被材料的降解
本实施例的包被的GA-T细胞来源于实施例5中胶液2(0.2％)、海藻酸钠溶液3(0.25％)、孵育时间10min制取的细胞-明胶-海藻酸钠-明胶-标记FITC海藻酸钠的单细胞包被GA-T。
标记FITC的包被GA-T以1×106mL种植到含10(V/V)％RPMI培养基的培养瓶内，加入30U/mL rIL-2，在37℃的CO2培养箱中培养。于0h、24h、48h和96h取出培养瓶，荧光显微镜在激发波长495nm处观察荧光材料的表达情况，任取5个视野并拍照。结果见图12。
图12显示，GA-T最外层海藻酸钠在96h内的降解。
实施例16GVHD模型
本实施例的包被的GA-T细胞来源于实施例6中胶液2(0.2％)、海藻酸钠溶液3(0.25％)、孵育时间10min制取的细胞-明胶-海藻酸钠-明胶-海藻酸钠的单细胞包被GA-T。
8-10周SPF级近交系C57BL/6作为供体鼠，8-10周SPF级近交系Balb/C作为受体鼠。
本实施例中制备GA-T所需的T细胞均来源于C57BL/6供体鼠。
受体鼠于移植前4-7天腹腔注射白消安25mg/kg，移植前2-3天腹腔注射环磷酰胺120mg/kg。饲养期间饮用含硫酸庆大霉素(3.2×105U/L)与红霉素(250mg/L)的灭菌水。
移植当天，颈椎脱位法处死C57BL/6供鼠，0.1(V/V)％新洁尔灭浸泡3min，在超净台内无菌条件下从供体鼠中取出骨髓细胞：剪去股骨、胫骨干骺端，用1mL注射器抽取RPMI培养液反复冲洗骨髓腔制备单细胞悬液；再采用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，预冷的无菌PBS洗涤2次，无血清的RPMI重悬计数，调成所需细胞数备用；台盼蓝染色，计数活细胞数。
GA-T与常规T细胞来源表达CD45.2的普通C57BL/6，移植的骨髓细胞来源于表达CD45.1的突变型C57BL/6。
将GA-T联合骨髓细胞进行尾静脉移植(骨髓：1×107，脾细胞：2×107)，骨髓移植组和正常组(注射PBS)作为对照。尾静脉移植的终体积控制在200μL左右。每隔3天(从移植前一周开始，直至小鼠死亡)，称重，统计体重变化，结果见图14。观察小鼠有无体重下降、腹泻和脱毛，有无弓背、耸毛、活动度差等精神表现，计算生存时间和存活率，结果见图15。按照下表5进行GVHD临床评分，结果见图13。
表5GVHD临床症状严重度等级评分标准
评分标准 0分 1分 2分
体重丢失 10％ ＞10％且＜25％ ＞25％
身体姿势 正常 仅在休息时躬身 严重躬身影响活动
活动 正常 轻到中度下降 静止不动
毛纹理 正常 轻到中度波皱 严重波皱
皮毛完整性 正常 爪子或尾部皮肤脱落 大面积皮肤裸露
腹泻 正常 轻到中度腹泻 严重腹泻
图13显示，接受GA-T移植组的小鼠的GVHD评分显著降低。#p<0.05,##p<0.01,
###P<0.001 vs Non-encap
Figure BDA0003243162190000151
图14显示，接受GA-T移植组的小鼠在27d后体重逐渐恢复至正常水平。#p<0.05,
##p<0.01,###P<0.001 vs Non-encap
Figure BDA0003243162190000161
图15显示，接受GA-T移植组的小鼠生存率显著提高。****P<0.001 vs Non-encap
Figure BDA0003243162190000162
Figure BDA0003243162190000163
实施例17
本实施例的包被的GA-T细胞来源于实施例6中胶液2(0.2％)、海藻酸钠溶液3(0.25％)、孵育时间10min制取的细胞-明胶-海藻酸钠-明胶-海藻酸钠的单细胞包被GA-T。
AML联合GVHD模型建立：
使用荧光素酶转染的WEHI-3B细胞(WEHI-3B-luc)来观察肿瘤在受体Balb/c小鼠体内的进展。
8-10周SPF近交系C57BL/6作为供体鼠，8-10周SPF近交系Balb/C作为受体鼠。
受体鼠于移植前4-7天腹腔注射白消安25mg/kg，移植前2-3天腹腔注射环磷酰胺120mg/kg。饲养期间饮用含硫酸庆大霉素(3.2×105U/L)与红霉素(250mg/L)的灭菌水。
移植前一天每只Balb/c受体鼠尾静脉注射3×105个WEHI-3B-luc细胞。
移植当天，颈椎脱位法处死C57BL/6供鼠，0.1(V/V)％新洁尔灭浸泡3min，在超净台内无菌条件下从供体鼠中取出骨髓细胞：剪去股骨、胫骨干骺端，用1mL注射器抽取RPMI培养液反复冲洗骨髓腔制备单细胞悬液；再采用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，预冷的无菌PBS洗涤2次，无血清的RPMI重悬计数，调成所需细胞数备用；台盼蓝染色，计数活细胞数。
GA-T与常规T细胞来源表达CD45.2的普通C57BL/6，移植的骨髓细胞来源于表达CD45.1的突变型C57BL/6。
将GA-T联合骨髓细胞进行尾静脉移植(骨髓：1×107，脾细胞：2×107)，骨髓移植组和正常组(注射PBS)作为对照。尾静脉移植的终体积控制在200μL左右。
每隔3天(从移植前一周开始，直至小鼠死亡)，观察小鼠临床表现并拍照，结果如图16，按照表5进行GVHD临床评分，结果如图17，计算生存时间和存活率，结果如图18。
取濒死的小鼠的肝、肠和皮肤组织，用4％多聚甲醛固定液固定，石蜡切片，HE染色，光学显微镜下观察结果如图19。
图16显示，接受常规移植的T细胞组即模型组小鼠出现掉毛，皮肤脱落，活动力下降等表现，接受GA-T移植小鼠无显著的病理改变。
图17显示接受GA-T移植组的AML小鼠的GVHD评分显著降低。###P<0.001 vs Non-encap+WEHI3B
Figure BDA0003243162190000171
图18显示接受GA-T移植组的AML小鼠生存率显著提高。**P<0.01 vs Non-encap+WEHI3B
Figure BDA0003243162190000172
图19显示，常规T细胞与GA-T两组小鼠的肝脏、结肠以及皮肤的病理图片。HE染色可见模型组小鼠肝脏汇管区和肝血窦内有大量淋巴细胞浸润，血管之间形成纤维间隔，肝血窦有扩张及淤血。结肠黏膜上皮细胞排列紊乱，部分细胞破裂损伤甚至脱落，大量炎性细胞浸润，隐窝结构消失。皮肤角质层出现过度角化，颗粒层和棘层增厚，棘突过度延长并伴有大量炎性细胞浸润。
动物活体成像：
各组受体小鼠移植后使用异氟烷麻醉。荧光素底物(D-luciferin，150mg/kg体重，PBS中含5mg/mL)腹腔内注射，15分钟后进行成像，观察全身发光信号强度。每周测定一次。数据以单位面积光子计数显示和分析，结果如图20。
图20显示，动物活体荧光成像追踪荧光标记的WEHI-3B髓样单核白血病细胞，GA-T移植组保持与T细胞移植相同的肿瘤杀伤效果。
实施例18
取实施例17中移植后第7天的各组小鼠，每组任意3只，处死后获得脾脏，按照实施例1中―PBMC的制取”获得PBMC。标记CD45.2与H2Kb，4℃孵育30min后离心洗涤，流式细胞仪上机检测，结果如图21。
图21显示，GA-T与模型组的脾脏中均表现出相近的CD45.2+T细胞比例。
实施例19
取实施例17中濒死受体小鼠的脾脏，按照实施例1中―PBMC的制取”获得PBMC。用EDTA抗凝管收集外周血，外周血中加入3-5倍体积的红细胞裂解液，常温避光孵育10分钟，加入PBS洗涤两次(1500rpm,5min)，得到外周血PBMC。分别标记CD3与CD4、CD8，4℃孵育30min后离心洗涤，流式细胞仪上机检测，结果如图22。
图22显示了外周血与脾脏淋巴细胞亚群变化情况。GA-T组CD4/CD8的比例显著低于接受常规T细胞移植的模型组。#p<0.05,##p<0.01,vs Non-encap
Figure BDA0003243162190000173
实施例20混合淋巴细胞反应
本实施例的包被的GA-T细胞来源于实施例6中胶液2(0.2％)、海藻酸钠溶液3(0.25％)、孵育时间10min制取的细胞-明胶-海藻酸钠-明胶-海藻酸钠的单细胞包被GA-T。
收集包被的GA-T细胞或常规的非包被T细胞(1×105个细胞/孔)接种到96孔板，加入经放射线照射(30Gy)的异体Balb/c小鼠的脾细胞(1×104个细胞/孔)，在37℃，5(V/V)％CO2，分别孵育24h，48h，72h和96h。培养最后2h，加入10μL CCK-8，四小时以内用酶标仪450nm波长读出OD值。细胞生存能力以OD值表达。每个实验设3个复孔。
结果如图23显示，将GA-T或常规T细胞与异种Balb/C来源的脾细胞共培养，GA-T显著降低了72h以后的混合淋巴细胞反应。#p<0.05,vs Non-encap
Figure BDA0003243162190000181
实施例21GA-T对肿瘤细胞的细胞毒作用
本实施例的包被的GA-T细胞来源于实施例6中胶液2(0.2％)、海藻酸钠溶液3(0.25％)、孵育时间10min制取的细胞-明胶-海藻酸钠-明胶-海藻酸钠的单细胞包被GA-T。
常规T细胞、包被的GA-T细胞和WEHI-3B肿瘤细胞于37℃，5％的CO2的培养箱中培养24h，将常规T细胞或GA-T细胞接种到Transwell小室(0.4μm)的上室中，WEHI-3B肿瘤细胞接种到下室进行共培养。共培养6h、12h、24h、48h之后，51Cr释放法检测GA-T细胞和常规T细胞对WEHI-3B髓样单核白血病细胞的细胞毒作用。收集共培养24h的GA-T细胞和常规T细胞，流式细胞术检测CD69和CD107a的表达。结果如图24和25。
图24显示，GA-T在共培养48h后对WEHI-3B的细胞毒作用与常规T细胞无显著差异
Figure BDA0003243162190000182
图25显示，与WEHI-3B共培养24h后，GA-T细胞CD69的表达略低于常规T细胞，CD107a的表达无显著差异。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种GA-T细胞的制备方法，包括以下步骤：
①T细胞悬液处理形成单细胞悬液；
②加入明胶溶液，置于恒温摇床培养箱摇晃混匀；所述明胶为由羧基化学转换为氨基的改性明胶，且为A型明胶；以1mL计，1×106个的单细胞悬液中，明胶溶液中明胶浓度为0.1%-0.3%（w/v）；
③孵育，使明胶吸附在T细胞表面，形成第一层明胶包被；
④加入藻酸盐溶液，明胶与藻酸盐通过静电沉积作用紧密结合，形成第一层藻酸盐包被；以1mL计，1×106个的单细胞悬液中，藻酸盐溶液中藻酸盐浓度为0.2-0.3%（w/v）；
⑤重复步骤②-④，重复次数为n，其中n=2。
2.根据权利要求1所述的GA-T细胞的制备方法，其特征在于，所述②中，以1mL计，1×106个的单细胞悬液中，明胶溶液中明胶浓度为0.2%（w/v）；所述④中，以1mL计，1×106个的单细胞悬液中，藻酸盐溶液中藻酸盐的浓度为0.25%。
3.根据权利要求1所述的GA-T细胞的制备方法，其特征在于，所述②中，置于恒温摇床培养箱以200rpm摇晃混匀3min。
4.根据权利要求3所述的GA-T细胞的制备方法，特征在于，所述③中，孵育时间为5-30min，期间每隔2min轻微振荡一次。
5.根据权利要求1至4任一项所述的GA-T细胞的制备方法，特征在于，所述T细胞为经无菌分离、磁珠分选及体外扩增的T细胞。
6.如权利要求1至5任一所述的GA-T细胞的制备方法得到的GA-T细胞在制备白血病和/或抗GVHD的药物中的应用。
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